Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Приготовление децеллюляризированных трансплантатов периферических нервов человека с использованием гидроксида натрия и дезоксихолата натрия

165 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71578

⸱

1 сентября 2026 г.

 ,  ,  , 
1R&D Center, L&C BIO Co., Ltd.

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описан стандартизированный метод децеллюляризации с применением щелочных реагентов, который сочетает обработку гидроксидом натрия с системой смены растворов с использованием перистальтического насоса для создания децеллюляризированных трансплантатов периферических нервов человека с эффективным удалением клеток и сохранением архитектуры нативного внеклеточного матрикса.

Аннотация

Повреждения периферических нервов часто требуют использования трансплантатов, обеспечивающих структурное направление для регенерации аксонов. Хотя аутологичная пересадка нерва остается клиническим золотым стандартом, ее применение ограничено заболеваемостью в донорской зоне и ограниченным количеством доступных тканей. Эти ограничения привели к растущему интересу к децеллюляризированным трансплантатам периферических нервов человека как к альтернативному биоматериалу для регенерации нервов. Однако широко используемые протоколы децеллюляризации на основе детергентов могут нарушать архитектуру внеклеточного матрикса (ВКМ) и оставлять цитотоксические остатки, которые могут ухудшить качество трансплантата. В данной статье описан стандартизированный протокол подготовки децеллюляризированных трансплантатов периферических нервов человека с использованием метода децеллюляризации с щелочной поддержкой. Процедура начинается с обработки гидроксидом натрия (NaOH) для обеспечения эффективного разрушения клеток, за которой следует мягкая обработка дезоксихолатом натрия (SDC), удаляющая оставшиеся клеточные и иммуногенные компоненты при сохранении нативной организации ВКМ. Эта стратегия ограничивает воздействие детергентов, поддерживая при этом сохранность архитектуры нативного ВКМ. Рабочий процесс включает подготовку донорского нерва, контролируемую обработку NaOH, последующую мягкую обработку SDC и интенсивное промывание в условиях непрерывного обмена растворов с использованием системы с перистальтическим насосом для облегчения удаления остаточных реагентов. Дополнительные этапы постобработки внедрены для поддержания структурной целостности и подготовки трансплантатов к окончательной упаковке и стерилизации. Эффективность децеллюляризации оценивается с помощью гистологического анализа и количественного определения остаточной ДНК, а сохранность структуры ВКМ исследуется с помощью сканирующей электронной микроскопии. Отсутствие остаточного SDC и биосовместимость обработанных трансплантатов были подтверждены тестами на цитотоксичность. Данный протокол предлагает практический подход к созданию децеллюляризированных трансплантатов периферических нервов человека для исследований в области регенерации периферических нервов и трансляционных приложений.

Введение

Повреждения периферических нервов могут привести к тяжелым функциональным нарушениям и остаются серьезной клинической проблемой в регенеративной медицине и реконструктивной хирургии. Регенерация сегментарных дефектов нерва требует использования материалов для трансплантации, которые не только перекрывают зазор в месте повреждения, но и обеспечивают структурное направление и биохимические сигналы для поддержки регенерации аксонов и реиннервации. Аутологичная пересадка нерва широко считается клиническим золотым стандартом, поскольку она сохраняет архитектуру естественного внеклеточного матрикса (ECM) и обеспечивает благоприятную микросреду для регенерации нерва1,2. Однако ее клиническое применение ограничено ограниченным наличием донорской ткани, необходимостью дополнительных хирургических вмешательств и заболеваемостью в области забора донорского материала3,4. Эти ограничения стимулировали разработку альтернативных материалов для трансплантации, в частности, децеллюляризированных трансплантатов периферических нервов, которые сохраняют архитектуру естественного ECM при минимизации иммуногенных клеточных компонентов5,6,7,8.

Эффективность децеллюляризированных нервных трансплантатов сильно зависит от процесса децеллюляризации. Традиционные методы обычно основаны на использовании детергентных реагентов, таких как Triton X-100 и дезоксихолат натрия (SDC), которые удаляют клеточные компоненты путем сольватации липидных мембран9,10,11. Однако длительное воздействие этих детергентов может нарушить микроструктуру внеклеточного матрикса (ECM) и оставить остаточные цитотоксические вещества, которые отрицательно влияют на жизнеспособность клеток и результаты регенерации12,13. В Consequently, активно исследуются альтернативные стратегии децеллюляризации, которые позволяют эффективно удалять клетки, сохраняя при этом целостность ECM14. Щелочная децеллюляризация с использованием гидроксида натрия (NaOH) стала потенциальным альтернативным подходом, поскольку экстремальные значения pH могут эффективно разрушать клеточные компоненты, нуклеиновые кислоты и липиды15,16,17. Тем не менее, неконтролируемое воздействие сильных щелочных сред может нарушить целостность ECM, что подчеркивает важность точно контролируемых условий обработки16,18.

В данной работе представлен стандартизированный протокол децеллюляризации трансплантатов периферических нервов человека с помощью щелочного раствора, включающий систему непрерывного обмена растворов с использованием перистальтического насоса. По сравнению с традиционными методами статического погружения, этот динамический процесс обеспечивает постоянный обмен растворов, что облегчает удаление клеточного дебриса и остаточных реагентов. В статье приведена пошаговая визуальная демонстрация всего рабочего процесса, включая подготовку донорского нерва, контролируемую щелочную децеллюляризацию и непрерывный обмен растворов с помощью системы с перистальтическим насосом. Полученные трансплантаты были оценены с помощью гистологического анализа, количественного определения остаточной ДНК и сканирующей электронной микроскопии (SEM) для подтверждения эффективной децеллюляризации и сохранения ультраструктуры внеклеточного матрикса (ECM). Обеспечивая четкую визуализацию критических технических этапов, данная статья предлагает четко определенную основу для подготовки децеллюляризированных нервных трансплантатов и последующего масштабирования процесса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Donated human peripheral nerves were obtained from a U.S. tissue bank under an exclusive agreement with L&C BIO and in compliance with the regulations of the American Association of Tissue Banks (AATB) and the U.S. Food and Drug Administration (FDA). Donor information, including age and sex, medical histories, and serological test results, was provided with the tissues and reviewed and approved by a certified medical director. Upon receipt, all tissues underwent incoming inspection, including verification of donor screening, serological testing, and testing for relevant pathogens; only tissues that met the predefined acceptance criteria were used in this study. All procedures involving human specimens were conducted in accordance with the principles of the Declaration of Helsinki. As no human subjects were directly recruited or involved in this study, a separate Institutional Review Board (IRB) approval number was not issued.

1. Prepare the solutions (Day 1)

  1. Prepare 0.25 N sodium hydroxide (NaOH) solution by dissolving 10 g of NaOH in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
  2. Prepare 4% sodium deoxycholate (SDC) solution by dissolving 40 g of SDC in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
  3. Transfer each prepared solution into sterile glass bottles.
    CAUTION: Handle sodium deoxycholate (SDC) inside a chemical fume hood. Wear appropriate personal protective equipment, including gloves, a laboratory coat, and eye protection, to prevent inhalation and skin contact.

2. Prepare the peripheral nerve segments for decellularization

  1. Disinfect the outer surface of the packaged raw peripheral nerve and open the package aseptically.
  2. Rinse the peripheral nerve several times with sterile distilled water.
  3. Remove residual adipose tissue, connective tissue, unnecessary branches, and damaged nerve tissue using sterile scissors and forceps. Rinse the peripheral nerve again with sterile distilled water.
  4. Cut the peripheral nerve into segments measuring 2–5 cm in length. Classify the prepared segments into three length groups: 2–3 cm, >3–4 cm, and >4–5 cm.
    NOTE: Process each length group separately because different IPA, NaOH, and SDC treatment durations are applied according to nerve segment length, as summarized in Table 1.

3. Set up the peristaltic pump system

  1. Attach chemically resistant silicone tubing of sufficient length to both ends of the chromatography column.
  2. Connect one end of the tubing to the peristaltic pump.
  3. Connect the free ends of the tubing to a 1 L glass bottle containing isopropyl alcohol (IPA) using pump tubing to establish a closed-loop circulation system.
    NOTE: Secure all tubing connections firmly, as pressure and vibration from the peristaltic pump may cause the tubing to disconnect from the column or bottle.

4. Delipidize the peripheral nerve

NOTE: Unless otherwise indicated, perform all solution-exchange steps at room temperature (20–25 °C) using a peristaltic pump set to 90–186 mL/min, depending on the tubing configuration. Maintain the selected flow rate constant throughout each processing run.

  1. Open one end of the chromatography column and partially fill the column with the IPA solution to ensure that the nerve tissue remains immersed immediately after insertion.
  2. Using sterile forceps, gently grasp the outer tissue at one end of a single prepared peripheral nerve segment. Avoid directly compressing or grasping the main body of the nerve. Carefully lower the nerve segment into the solution within the column.
  3. Using the forceps, gently straighten the nerve segment and position it longitudinally, parallel to the direction of fluid flow. Ensure that the segment is not folded, coiled, or pressed against the inner wall of the column or the outlet filter.
  4. Close the column and position it at a slight upward incline toward the outlet, with the outlet placed slightly higher than the inlet. This orientation helps prevent the nerve segment from settling against either end filter, particularly the outlet filter.
    NOTE: Process one peripheral nerve segment per column per procedure. No additional physical fixation device is required. The natural buoyancy of the nerve tissue and the relatively gentle fluid flow help maintain the segment in a suspended and extended position. Inspect the tissue position during processing and gently reposition it with sterile forceps if it adheres to the column wall, filter, or itself.
  5. Connect the IPA solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 1.5 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 2 h for segments measuring >3–4 cm, or 2.5 h for segments measuring >4–5 cm.
  6. Drain the solution from the column.
  7. Add 40 mL of sterile distilled water to the column. Gently invert or shake the column five times to wash the peripheral nerve.
  8. Repeat steps 4.6 and 4.7 for a total of five washes.
  9. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 5.1.
    NOTE: Minimize air bubbles inside the column to promote efficient solution exchange. Adjust the peripheral nerve segment as needed to keep it suspended in the solution and prevent it from adhering to the inner wall of the column or filter.

5. Perform the first decellularization (Day 2)

  1. Connect the 0.25 N NaOH solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
  2. Drain the solution from the column.
  3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
  4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 6.1.

6. Perform the second decellularization (Day 3)

  1. Connect the 4% (w/v) SDC solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
  2. Drain the solution from the column.
  3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
  4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 7.1.

7. Sterilize the decellularized peripheral nerve (Day 4)

  1. Remove a small volume of distilled water from the column. Carefully retrieve the decellularized peripheral nerve while keeping it suspended in the remaining liquid.
  2. Package the peripheral nerve together with sterile distilled water.
  3. Sterilize the packaged peripheral nerve by gamma irradiation at a dose of 25 kGy.
    NOTE: Do not completely drain the distilled water from the column. Keep the nerve segment suspended in a sufficient volume of the remaining liquid to prevent it from adhering to the inner wall of the column and to facilitate gentle handling without allowing the liquid to overflow.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данном исследовании представлен стандартизированный протокол децеллюляризации с применением щелочных реагентов для создания децеллюляризированных трансплантатов периферического нерва человека для регенерации периферических нервов. Протокол объединяет предварительную обработку донорского нерва, контролируемую химическую децеллюляризацию и систему смены растворов с использованием перистальтического насоса в четко определенный рабочий процесс, что обеспечивает эффективное удаление клеточных и иммуногенных компонентов при ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

This work was supported by the Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) grant funded by the Korea Government (MOTIE) (P0011947, Korea-Czech Bilateral Co-funding R&D Projects).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BT100-1L Многоканальный перистальтический насосLonger PumpBT100-1LИспользуется для обеспечения непрерывной циркуляции и смены растворов в процессе делипидизации, децеллюляризации и промывки.
Хроматографическая колонка Econo-Column, 2,5 × 10 cmBio-Rad737-2512Используется для фиксации сегментов периферического нерва во время непрерывной смены растворов.
Изопропиловый спирт (IPA)Daejeong Chemicals5035-4410Используется для делипидизации ткани периферического нерва.
Трубка для насоса Masterflex Tygon E-LFLThermo Scientific06440-16Используется для соединения перистальтического насоса, хроматографической колонки и резервуаров с растворами для обеспечения непрерывной циркуляции растворов.
Дезоксихолат натрия (SDC)Sigma-Aldrich30970-100GИспользуется в качестве детергента на втором этапе децеллюляризации для удаления остаточных клеточных компонентов.
Гидроксид натрия, NaOHDuksan1636Для разрушения клеток.

Ссылки

  1. Kornfeld T, Vogt PM, Radtke C. Nerve grafting for peripheral nerve injuries with extended defect sizes. Wien Med Wochenschr. 2019;169(9):240-251.
  2. Siemionow M, Brzezicki G. Current techniques and concepts in peripheral nerve repair. Int Rev Neurobiol. 2009;87:141-172.
  3. Hoben GM, et al. Increasing nerve autograft length increases senescence and reduces regeneration. Plast Reconstr Surg. 2018;142(4):952-963.
  4. Gaudin R, et al. Approaches to peripheral nerve repair: Generations of biomaterial conduits yielding to replacing autologous nerve grafts in craniomaxillofacial surgery. Biomed Res Int. 2016;2016:3856262.
  5. Lans J, et al. A systematic review and meta-analysis of nerve gap repair: Comparative effectiveness of allografts, autografts, and conduits. Plast Reconstr Surg. 2023;151(5):814e-827e.
  6. Huang H, et al. A comparative study of acellular nerve xenografts and allografts in repairing rat facial nerve defects. Mol Med Rep. 2015;12(4):6330-6336.
  7. Rana D, et al. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. J Tissue Eng Regen Med. 2017;11(4):942-965.
  8. Zhang Y, et al. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 2010;31(20):5312-5324.
  9. Sondell M, Lundborg G, Kanje M. Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction. Brain Res. 1998;795(1-2):44-54.
  10. Hudson TW, et al. Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration. Tissue Eng. 2004;10(11-12):1641-1651.
  11. Rinker B, et al. Use of processed nerve allografts to repair nerve injuries greater than 25 mm in the hand. Ann Plast Surg. 2017;78(6 Suppl):S292-S295.
  12. Zvarova B, et al. Residual detergent detection method for nondestructive cytocompatibility evaluation of decellularized whole lung scaffolds. Tissue Eng Part C Methods. 2016;22(5):418-428.
  13. Fox DA, Epstein ML, Bass P. Surfactants selectively ablate enteric neurons of the rat jejunum. J Pharmacol Exp Ther. 1983;227(2):538-544.
  14. Singh G, et al. Impact of various detergent-based immersion and perfusion decellularization strategies on the novel caprine pancreas derived extracellular matrix scaffold. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1253804.
  15. Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 2006;27(19):3675-3683.
  16. Tsuchiya T, et al. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 2014;20(12):1028-1036.
  17. Sengyoku H, et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 2018;14(2):94-106.
  18. Jones EM, Cochrane CA, Percival SL. The effect of pH on the extracellular matrix and biofilms. Adv Wound Care (New Rochelle). 2015;4(7):431-439.
  19. Nieto-Nicolau N, et al. Effective decellularization of human nerve matrix for regenerative medicine with a novel protocol. Cell Tissue Res. 2021;384(1):167-177.
  20. Philips C, et al. Qualitative and quantitative evaluation of a novel detergent-based method for decellularization of peripheral nerves. Ann Biomed Eng. 2018;46(11):1921-1937.
  21. Wüthrich T, et al. Development of vascularized nerve scaffold using perfusion-decellularization and recellularization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020;117:111311.
  22. Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011;32(12):3233-3243.
  23. Hopf A, et al. Optimized decellularization protocol for large peripheral nerve segments: Towards personalized nerve bioengineering. Bioengineering (Basel). 2022;9(9):412.
  24. Penkert G. Anatomy of the peripheral nerve system. In: Focal Peripheral Neuropathies: Imaging, Neurological, and Neurosurgical Approaches. Springer; 2014:3-9.
  25. Vasudevan S, et al. Detergent-free decellularized nerve grafts for long-gap peripheral nerve reconstruction. Plast Reconstr Surg Glob Open. 2014;2(8):e201.
  26. García-García ÓD, et al. Comprehensive ex vivo and in vivo preclinical evaluation of novel chemoenzymatic decellularized peripheral nerve allografts. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1162684.
  27. Saheb-Al-Zamani M, et al. Limited regeneration in long acellular nerve allografts is associated with increased Schwann cell senescence. Exp Neurol. 2013;247:165-177.
  28. Kim S, et al. Enhancing peripheral nerve regeneration through NaOH-based decellularization of human nerve tissue. Bioeng Transl Med. 2025;10(6):e70072.
  29. Contreras E, et al. Repair of long nerve defects with a new decellularized nerve graft in rats and in sheep. Cells. 2022;11(24):4074.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Децеллюляризированные нервные трансплантатырегенерация периферических нервовобработка гидроксидом натриявнеклеточный матриксподготовка нервных трансплантатовгистологический анализколичественное определение ДНКсканирующая электронная микроскопиятест на цитотоксичность

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.