Методическая статья

Приготовление децеллюляризированных трансплантатов периферических нервов человека с использованием гидроксида натрия и дезоксихолата натрия

22 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71578

⸱

1 сентября 2026 г.

 ,  ,  , 
1R&D Center, L&C BIO Co., Ltd.

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описан стандартизированный метод децеллюляризации с применением щелочных реагентов, который сочетает обработку гидроксидом натрия с системой смены растворов с использованием перистальтического насоса для создания децеллюляризированных трансплантатов периферических нервов человека с эффективным удалением клеток и сохранением архитектуры нативного внеклеточного матрикса.

Аннотация

Повреждения периферических нервов часто требуют использования трансплантатов, обеспечивающих структурное направление для регенерации аксонов. Хотя аутологичная пересадка нерва остается клиническим золотым стандартом, ее применение ограничено заболеваемостью в донорской зоне и ограниченным количеством доступных тканей. Эти ограничения привели к растущему интересу к децеллюляризированным трансплантатам периферических нервов человека как к альтернативному биоматериалу для регенерации нервов. Однако широко используемые протоколы децеллюляризации на основе детергентов могут нарушать архитектуру внеклеточного матрикса (ВКМ) и оставлять цитотоксические остатки, которые могут ухудшить качество трансплантата. В данной статье описан стандартизированный протокол подготовки децеллюляризированных трансплантатов периферических нервов человека с использованием метода децеллюляризации с щелочной поддержкой. Процедура начинается с обработки гидроксидом натрия (NaOH) для обеспечения эффективного разрушения клеток, за которой следует мягкая обработка дезоксихолатом натрия (SDC), удаляющая оставшиеся клеточные и иммуногенные компоненты при сохранении нативной организации ВКМ. Эта стратегия ограничивает воздействие детергентов, поддерживая при этом сохранность архитектуры нативного ВКМ. Рабочий процесс включает подготовку донорского нерва, контролируемую обработку NaOH, последующую мягкую обработку SDC и интенсивное промывание в условиях непрерывного обмена растворов с использованием системы с перистальтическим насосом для облегчения удаления остаточных реагентов. Дополнительные этапы постобработки внедрены для поддержания структурной целостности и подготовки трансплантатов к окончательной упаковке и стерилизации. Эффективность децеллюляризации оценивается с помощью гистологического анализа и количественного определения остаточной ДНК, а сохранность структуры ВКМ исследуется с помощью сканирующей электронной микроскопии. Отсутствие остаточного SDC и биосовместимость обработанных трансплантатов были подтверждены тестами на цитотоксичность. Данный протокол предлагает практический подход к созданию децеллюляризированных трансплантатов периферических нервов человека для исследований в области регенерации периферических нервов и трансляционных приложений.

Введение

Повреждения периферических нервов могут привести к тяжелым функциональным нарушениям и остаются серьезной клинической проблемой в регенеративной медицине и реконструктивной хирургии. Регенерация сегментарных дефектов нерва требует использования материалов для трансплантации, которые не только перекрывают зазор в месте повреждения, но и обеспечивают структурное направление и биохимические сигналы для поддержки регенерации аксонов и реиннервации. Аутологичная пересадка нерва широко считается клиническим золотым стандартом, поскольку она сохраняет архитектуру естественного внеклеточного матрикса (ECM) и обеспечивает благоприятную микросреду для регенерации нерва1,2. Однако ее клиническое применение ограничено ограниченным наличием донорской ткани, необходимостью дополнительных хирургических вмешательств и заболеваемостью в области забора донорского материала3,4. Эти ограничения стимулировали разработку альтернативных материалов для трансплантации, в частности, децеллюляризированных трансплантатов периферических нервов, которые сохраняют архитектуру естественного ECM при минимизации иммуногенных клеточных компонентов5,6,7,8.

Эффективность децеллюляризированных нервных трансплантатов сильно зависит от процесса децеллюляризации. Традиционные методы обычно основаны на использовании детергентных реагентов, таких как Triton X-100 и дезоксихолат натрия (SDC), которые удаляют клеточные компоненты путем сольватации липидных мембран9,10,11. Однако длительное воздействие этих детергентов может нарушить микроструктуру внеклеточного матрикса (ECM) и оставить остаточные цитотоксические вещества, которые отрицательно влияют на жизнеспособность клеток и результаты регенерации12,13. В Consequently, активно исследуются альтернативные стратегии децеллюляризации, которые позволяют эффективно удалять клетки, сохраняя при этом целостность ECM14. Щелочная децеллюляризация с использованием гидроксида натрия (NaOH) стала потенциальным альтернативным подходом, поскольку экстремальные значения pH могут эффективно разрушать клеточные компоненты, нуклеиновые кислоты и липиды15,16,17. Тем не менее, неконтролируемое воздействие сильных щелочных сред может нарушить целостность ECM, что подчеркивает важность точно контролируемых условий обработки16,18.

В данной работе представлен стандартизированный протокол децеллюляризации трансплантатов периферических нервов человека с помощью щелочного раствора, включающий систему непрерывного обмена растворов с использованием перистальтического насоса. По сравнению с традиционными методами статического погружения, этот динамический процесс обеспечивает постоянный обмен растворов, что облегчает удаление клеточного дебриса и остаточных реагентов. В статье приведена пошаговая визуальная демонстрация всего рабочего процесса, включая подготовку донорского нерва, контролируемую щелочную децеллюляризацию и непрерывный обмен растворов с помощью системы с перистальтическим насосом. Полученные трансплантаты были оценены с помощью гистологического анализа, количественного определения остаточной ДНК и сканирующей электронной микроскопии (SEM) для подтверждения эффективной децеллюляризации и сохранения ультраструктуры внеклеточного матрикса (ECM). Обеспечивая четкую визуализацию критических технических этапов, данная статья предлагает четко определенную основу для подготовки децеллюляризированных нервных трансплантатов и последующего масштабирования процесса.

Протокол

Donated human peripheral nerves were obtained from a U.S. tissue bank under an exclusive agreement with L&C BIO and in compliance with the regulations of the American Association of Tissue Banks (AATB) and the U.S. Food and Drug Administration (FDA). Donor information, including age and sex, medical histories, and serological test results, was provided with the tissues and reviewed and approved by a certified medical director. Upon receipt, all tissues underwent incoming inspection, including verification of donor screening, serological testing, and testing for relevant pathogens; only tissues that met the predefined acceptance criteria were used in this study. All procedures involving human specimens were conducted in accordance with the principles of the Declaration of Helsinki. As no human subjects were directly recruited or involved in this study, a separate Institutional Review Board (IRB) approval number was not issued.

1. Prepare the solutions (Day 1)

  1. Prepare 0.25 N sodium hydroxide (NaOH) solution by dissolving 10 g of NaOH in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
  2. Prepare 4% sodium deoxycholate (SDC) solution by dissolving 40 g of SDC in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
  3. Transfer each prepared solution into sterile glass bottles.
    CAUTION: Handle sodium deoxycholate (SDC) inside a chemical fume hood. Wear appropriate personal protective equipment, including gloves, a laboratory coat, and eye protection, to prevent inhalation and skin contact.

2. Prepare the peripheral nerve segments for decellularization

  1. Disinfect the outer surface of the packaged raw peripheral nerve and open the package aseptically.
  2. Rinse the peripheral nerve several times with sterile distilled water.
  3. Remove residual adipose tissue, connective tissue, unnecessary branches, and damaged nerve tissue using sterile scissors and forceps. Rinse the peripheral nerve again with sterile distilled water.
  4. Cut the peripheral nerve into segments measuring 2–5 cm in length. Classify the prepared segments into three length groups: 2–3 cm, >3–4 cm, and >4–5 cm.
    NOTE: Process each length group separately because different IPA, NaOH, and SDC treatment durations are applied according to nerve segment length, as summarized in Table 1.

3. Set up the peristaltic pump system

  1. Attach chemically resistant silicone tubing of sufficient length to both ends of the chromatography column.
  2. Connect one end of the tubing to the peristaltic pump.
  3. Connect the free ends of the tubing to a 1 L glass bottle containing isopropyl alcohol (IPA) using pump tubing to establish a closed-loop circulation system.
    NOTE: Secure all tubing connections firmly, as pressure and vibration from the peristaltic pump may cause the tubing to disconnect from the column or bottle.

4. Delipidize the peripheral nerve

NOTE: Unless otherwise indicated, perform all solution-exchange steps at room temperature (20–25 °C) using a peristaltic pump set to 90–186 mL/min, depending on the tubing configuration. Maintain the selected flow rate constant throughout each processing run.

  1. Open one end of the chromatography column and partially fill the column with the IPA solution to ensure that the nerve tissue remains immersed immediately after insertion.
  2. Using sterile forceps, gently grasp the outer tissue at one end of a single prepared peripheral nerve segment. Avoid directly compressing or grasping the main body of the nerve. Carefully lower the nerve segment into the solution within the column.
  3. Using the forceps, gently straighten the nerve segment and position it longitudinally, parallel to the direction of fluid flow. Ensure that the segment is not folded, coiled, or pressed against the inner wall of the column or the outlet filter.
  4. Close the column and position it at a slight upward incline toward the outlet, with the outlet placed slightly higher than the inlet. This orientation helps prevent the nerve segment from settling against either end filter, particularly the outlet filter.
    NOTE: Process one peripheral nerve segment per column per procedure. No additional physical fixation device is required. The natural buoyancy of the nerve tissue and the relatively gentle fluid flow help maintain the segment in a suspended and extended position. Inspect the tissue position during processing and gently reposition it with sterile forceps if it adheres to the column wall, filter, or itself.
  5. Connect the IPA solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 1.5 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 2 h for segments measuring >3–4 cm, or 2.5 h for segments measuring >4–5 cm.
  6. Drain the solution from the column.
  7. Add 40 mL of sterile distilled water to the column. Gently invert or shake the column five times to wash the peripheral nerve.
  8. Repeat steps 4.6 and 4.7 for a total of five washes.
  9. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 5.1.
    NOTE: Minimize air bubbles inside the column to promote efficient solution exchange. Adjust the peripheral nerve segment as needed to keep it suspended in the solution and prevent it from adhering to the inner wall of the column or filter.

5. Perform the first decellularization (Day 2)

  1. Connect the 0.25 N NaOH solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
  2. Drain the solution from the column.
  3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
  4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 6.1.

6. Perform the second decellularization (Day 3)

  1. Connect the 4% (w/v) SDC solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
  2. Drain the solution from the column.
  3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
  4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 7.1.

7. Sterilize the decellularized peripheral nerve (Day 4)

  1. Remove a small volume of distilled water from the column. Carefully retrieve the decellularized peripheral nerve while keeping it suspended in the remaining liquid.
  2. Package the peripheral nerve together with sterile distilled water.
  3. Sterilize the packaged peripheral nerve by gamma irradiation at a dose of 25 kGy.
    NOTE: Do not completely drain the distilled water from the column. Keep the nerve segment suspended in a sufficient volume of the remaining liquid to prevent it from adhering to the inner wall of the column and to facilitate gentle handling without allowing the liquid to overflow.

Результаты

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing is shown in Figure 2A. Trimming and segmenting of the nerve were illustrated in Figure 2B–D. After completion of the process, the peripheral nerve maintained its overall morphology without visible structural disruption (Figure 2E).

Histological evaluation of the decellularization is shown in Figure 3. Hematoxylin and eosin (H&E) staining of the native peripheral nerve revealed abundant nuclei, whereas nuclei were largely absent in the decellularized samples (Figure 3A). Quantification of residual DNA, expressed as ng DNA/mg of dry tissue, demonstrated a substantial reduction in DNA content following decellularization (Figure 3B).

Ultrastructural analysis using scanning electron microscopy (SEM) is presented in Figure 4. The fibrous organization of the extracellular matrix (ECM) remained clearly visible after decellularization, indicating preservation of the native ECM architecture (Figure 4).

Assessment of residual detergent and cytocompatibility is shown in Figure 5. Residual SDC levels were minimal following the washing steps (Figure 5A). Cytotoxicity testing showed no significant cytotoxic response in cultured cells exposed to the decellularized peripheral nerve grafts (Figure 5B).

figure-results-1
Figure 1: Schematic workflow for the preparation of decellularized human peripheral nerve grafts. Donated human peripheral nerve segments are first prepared by trimming and segmenting to remove surrounding connective tissue. The nerve segments then undergo delipidization using IPA-based solution exchange (Day 1). Sequential decellularization is performed using NaOH (Day 2) and SDC (Day 3) under continuous solution exchange in a peristaltic pump-driven system. The processed grafts are subsequently packaged and sterilized (Day 4) to obtain decellularized peripheral nerve grafts. Abbreviations: IPA = isopropanol; NaOH = sodium hydroxide; SDC = sodium deoxycholate. Please click here to view a larger version of this figure.

figure-results-2
Figure 2: Representative images of the peripheral nerve processing workflow. (A) Peristaltic pump-driven solution exchange system used for delipidization, decellularization, and washing. (B) Donated human peripheral nerve before trimming. (C) Peripheral nerve during trimming. (D) Peripheral nerve after trimming and segmenting. (E) Peripheral nerve after completion of the entire decellularization process. Please click here to view a larger version of this figure.

figure-results-3
Figure 3: Evaluation of decellularization efficiency. (A) Representative hematoxylin and eosin (H&E)-stained images of native and decellularized human peripheral nerve tissues showing reduced cellular components after decellularization. Scale bars = 100 µm. (B) Quantification of residual DNA content in native and decellularized nerve tissues, expressed as ng DNA/mg of dry tissue. Data are presented as mean ± SD (n = 3). *p < 0.05. Please click here to view a larger version of this figure.

figure-results-4
Figure 4: Scanning electron microscopy (SEM) analysis of nerve microarchitecture. Representative SEM images of native (left) and decellularized (right) human peripheral nerve tissues showing preserved extracellular matrix architecture following the decellularization process. Scale bars = 2 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

figure-results-5
Figure 5: Evaluation of residual detergent and cytotoxicity. (A) Chromatograms of the SDC standard (left) and extracts from decellularized nerve grafts (right) used to assess residual detergent. The red box indicates the region corresponding to the SDC retention time (~3.2 min). (B) Cytotoxicity assessment of extracts from decellularized nerve grafts using L929 fibroblasts following ISO 10993-5 guidelines. Representative images after 48 h incubation show the reagent control, extract from decellularized nerve grafts, negative control, and positive control groups. Scale bars = 50 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

Nerve segment length (cm)IPA treatment (h)NaOH treatment (h)SDC treatment (h)
2–31.566
>3–4288
>4–52.51010

Table 1: Length-specific processing durations for peripheral nerve segments within the range evaluated in this study.

Обсуждение

В данном исследовании представлен стандартизированный протокол децеллюляризации с применением щелочных реагентов для создания децеллюляризированных трансплантатов периферического нерва человека для регенерации периферических нервов. Протокол объединяет предварительную обработку донорского нерва, контролируемую химическую децеллюляризацию и систему смены растворов с использованием перистальтического насоса в четко определенный рабочий процесс, что обеспечивает эффективное удаление клеточных и иммуногенных компонентов при сохранении нативной архитектуры ECM.

Ключевой особенностью данного метода является сочетание щелочной обработки с сокращением времени воздействия детергентов. Традиционные протоколы на основе детергентов, такие как метод Сонделл (3% Triton X-100 и 4% SDC) и метод Хадсона (сульфобетаин-10, сульфобетаин-16 и Triton X-200), опираются на длительную многоэтапную обработку детергентами для достижения эффективной децеллюляризации9,10. Хотя эти подходы эффективно удаляют клеточные компоненты, длительное воздействие детергентов может нарушить целостность внеклеточного матрикса (ВКМ) и привести к остаточной цитотоксичности, связанной с детергентами19,20,21. В отличие от них, настоящий протокол включает использование NaOH для усиления удаления клеток при ограничении воздействия SDC, что снижает общую нагрузку детергентами и способствует сохранению нативной архитектуры ВКМ.

Другим критически важным аспектом данного протокола является система обмена растворов с приводом от перистальтического насоса. В отличие от методов на основе перфузии, которые могут создавать внутреннее давление на ткань и приводить к риску структурного повреждения21, эта система обеспечивает непрерывный контролируемый обмен растворов внутри хроматографической колонки. Эффективность данного подхода подтверждается многочисленными аналитическими результатами. Гистологический анализ и количественное определение остаточной ДНК подтвердили эффективное удаление клеточных компонентов, а анализ СЭМ продемонстрировал сохранение нативной архитектуры ВКМ. Кроме того, низкие уровни остаточного SDC и благоприятные результаты цитосовместимости подтвердили биосовместимость полученного трансплантата. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что данный протокол позволяет достичь баланса между эффективной децеллюляризацией и сохранением структуры.

Для минимизации процедурной вариабельности и поддержания контролируемых условий обработки критически важны несколько технических этапов. Во-первых, необходим осторожный подход к сегменту нерва при обрезке, переносе и промывке. Ткань периферического нерва подвержена механическим повреждениям, и чрезмерное сжатие, складывание или натяжение могут нарушить внутреннюю структуру и ухудшить сохранность внеклеточного матрикса (ECM)19,20. Таким образом, на протяжении всей процедуры ткани следует содержать во влажном состоянии и обрабатывать бережно. Во-вторых, равномерный обмен раствором внутри колонки является ключевым определяющим фактором эффективности процесса. Необходимо свести к минимуму количество пузырьков воздуха внутри колонки; ткань должна оставаться полностью погруженной и взвешенной в растворе, не прилипая к стенке колонки или фильтру. Адгезия ткани может привести к неравномерному обмену раствора, что снизит эффективность промывки и вызовет неоднородное воздействие реагентов для обработки21,22. В-третьих, система с перистальтическим насосом должна работать стабильно на протяжении всей процедуры. Для делипидизации, децеллюляризации и промывки требуется непрерывная циркуляция, поэтому все соединения трубок должны быть надежно закреплены, чтобы предотвратить их отсоединение из-за давления или вибрации, создаваемых насосом. При извлечении образца следует избегать полного опорожнения колонки. Поддержание достаточного объема жидкости помогает предотвратить адгезию тканей и способствует их бережному извлечению при сборе.

Сегменты нервов длиной 2–3 cm обрабатывали IPA, NaOH и SDC в течение 1,5, 6 и 6 h соответственно. Сегменты длиной >3–4 cm обрабатывали в течение 2, 8 и 8 h соответственно, а сегменты длиной >4–5 cm — в течение 2,5, 10 и 10 h соответственно. Таким образом, время обработки варьировалось от 1,5 до 2,5 h для делипидизации IPA и от 6 до 10 h для каждого этапа децеллюляризации. Все остальные параметры обработки, включая концентрации реагентов, объемы растворов и процедуры промывки, оставались неизменными для всех групп по длине. В зависимости от конфигурации трубок скорость потока устанавливали в заданном диапазоне и поддерживали постоянной на протяжении всего цикла обработки. Условия обработки в зависимости от длины обобщены в Таблице 1. Корректировки с учетом диаметра нерва, толщины, фасцикулярной структуры, а также клеточного и матриксного состава не оценивались систематически и требуют дальнейшего изучения23,24. Для задач по масштабированию может быть использована многоканальная перистальтическая насосная система для повышения пропускной способности; однако следует тщательно проверить стабильность условий потока во всех каналах для обеспечения равномерности обработки.

Для дальнейшей оптимизации остается несколько аспектов. Хотя данный протокол существенно снижает общее воздействие детергентов, SDC все еще используется; будущие доработки могут быть сосредоточены на минимизации или замене детергентов при сохранении эффективности децеллюляризации и сохранности ECM25,26. Кроме того, ткани периферических нервов по своей природе трудно стандартизировать из-за вариабельности фасцикулярной структуры, диаметра, толщины, а также клеточного и матриксного состава23,24. При крупномасштабном производстве эти различия, наряду с вариациями в загрузке тканей и условиях потока, могут способствовать межсерийной вариабельности. Однако в настоящем исследовании воспроизводимость между донорами и сериями не оценивалась систематически. Следовательно, для установления соответствующих критериев приемки тканей, стандартизации процессов и обеспечения воспроизводимости серий потребуется дальнейшая валидация с использованием тканей от нескольких доноров и независимых производственных серий.

Дополнительным ограничением является длина трансплантата. Регенерационная способность снижается по мере увеличения длины трансплантата, и это зависимое от длины ограничение может быть более выраженным при использовании ацеллюлярных аллотрансплантатов нерва, чем при аутотрансплантации3,27. Поскольку ацеллюлярные аллотрансплантаты нерва не содержат жизнеспособных резидентных шванновских клеток, они зависят от миграции и пролиферации шванновских клеток реципиента для поддержки регенерации аксонов27. Saheb-Al-Zamani и др. сообщили, что ограниченная регенерация в длинных ацеллюлярных аллотрансплантатах нерва была связана с повышенным старением шванновских клеток27.

Тем не менее, предыдущее исследование in vivo показало, что децеллюляризированные трансплантаты человеческого нерва, подготовленные с использованием NaOH, способствовали функциональному и структурному восстановлению, сопоставимому с автотрансплантатами, при дефекте седалищного нерва кролика длиной 15 мм28. Контрерас и соавторы также продемонстрировали аксональную регенерацию и функциональное восстановление при использовании децеллюляризированного аллотрансплантата нерва при дефекте малоберцового нерва овцы длиной 70 мм29. Эти исследования подтверждают регенерационный потенциал децеллюляризированных трансплантатов нерва, хотя требуется дальнейшая оценка трансплантатов, приготовленных по данному протоколу, при использовании клинически значимых длин. Применение автотрансплантатов также ограничено доступностью донорского нерва и требует дополнительной процедуры забора, что приводит к появлению второго операционного поля и возникновению осложнений в месте забора донорского материала4. Таким образом, ацеллюлярные аллотрансплантаты нерва могут стать клинически значимой альтернативой в случаях, когда недостаточно аутологичной ткани или когда забор донорского нерва нецелесообразен.

Таким образом, данный протокол представляет собой практическую и адаптируемую основу для подготовки децеллюляризированных трансплантатов периферических нервов. Акцент на сокращении воздействия детергентов, контролируемом обмене растворов и стандартизации процесса способствует как применению в исследовательских целях, так и потенциальному трансляционному использованию для регенерации периферических нервов. Будущие исследования должны быть сосредоточены на дальнейшем развитии методов без использования детергентов, масштабируемости системы и комплексной оценке регенерационной способности in vivo.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

This work was supported by the Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) grant funded by the Korea Government (MOTIE) (P0011947, Korea-Czech Bilateral Co-funding R&D Projects).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BT100-1L Многоканальный перистальтический насосLonger PumpBT100-1LИспользуется для обеспечения непрерывной циркуляции и смены растворов в процессе делипидизации, децеллюляризации и промывки.
Хроматографическая колонка Econo-Column, 2,5 × 10 cmBio-Rad737-2512Используется для фиксации сегментов периферического нерва во время непрерывной смены растворов.
Изопропиловый спирт (IPA)Daejeong Chemicals5035-4410Используется для делипидизации ткани периферического нерва.
Трубка для насоса Masterflex Tygon E-LFLThermo Scientific06440-16Используется для соединения перистальтического насоса, хроматографической колонки и резервуаров с растворами для обеспечения непрерывной циркуляции растворов.
Дезоксихолат натрия (SDC)Sigma-Aldrich30970-100GИспользуется в качестве детергента на втором этапе децеллюляризации для удаления остаточных клеточных компонентов.
Гидроксид натрия, NaOHDuksan1636Для разрушения клеток.

Ссылки

  1. Kornfeld T, Vogt PM, Radtke C. Nerve grafting for peripheral nerve injuries with extended defect sizes. Wien Med Wochenschr. 2019;169(9):240-251.
  2. Siemionow M, Brzezicki G. Current techniques and concepts in peripheral nerve repair. Int Rev Neurobiol. 2009;87:141-172.
  3. Hoben GM, et al. Increasing nerve autograft length increases senescence and reduces regeneration. Plast Reconstr Surg. 2018;142(4):952-963.
  4. Gaudin R, et al. Approaches to peripheral nerve repair: Generations of biomaterial conduits yielding to replacing autologous nerve grafts in craniomaxillofacial surgery. Biomed Res Int. 2016;2016:3856262.
  5. Lans J, et al. A systematic review and meta-analysis of nerve gap repair: Comparative effectiveness of allografts, autografts, and conduits. Plast Reconstr Surg. 2023;151(5):814e-827e.
  6. Huang H, et al. A comparative study of acellular nerve xenografts and allografts in repairing rat facial nerve defects. Mol Med Rep. 2015;12(4):6330-6336.
  7. Rana D, et al. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. J Tissue Eng Regen Med. 2017;11(4):942-965.
  8. Zhang Y, et al. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 2010;31(20):5312-5324.
  9. Sondell M, Lundborg G, Kanje M. Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction. Brain Res. 1998;795(1-2):44-54.
  10. Hudson TW, et al. Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration. Tissue Eng. 2004;10(11-12):1641-1651.
  11. Rinker B, et al. Use of processed nerve allografts to repair nerve injuries greater than 25 mm in the hand. Ann Plast Surg. 2017;78(6 Suppl):S292-S295.
  12. Zvarova B, et al. Residual detergent detection method for nondestructive cytocompatibility evaluation of decellularized whole lung scaffolds. Tissue Eng Part C Methods. 2016;22(5):418-428.
  13. Fox DA, Epstein ML, Bass P. Surfactants selectively ablate enteric neurons of the rat jejunum. J Pharmacol Exp Ther. 1983;227(2):538-544.
  14. Singh G, et al. Impact of various detergent-based immersion and perfusion decellularization strategies on the novel caprine pancreas derived extracellular matrix scaffold. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1253804.
  15. Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 2006;27(19):3675-3683.
  16. Tsuchiya T, et al. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 2014;20(12):1028-1036.
  17. Sengyoku H, et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 2018;14(2):94-106.
  18. Jones EM, Cochrane CA, Percival SL. The effect of pH on the extracellular matrix and biofilms. Adv Wound Care (New Rochelle). 2015;4(7):431-439.
  19. Nieto-Nicolau N, et al. Effective decellularization of human nerve matrix for regenerative medicine with a novel protocol. Cell Tissue Res. 2021;384(1):167-177.
  20. Philips C, et al. Qualitative and quantitative evaluation of a novel detergent-based method for decellularization of peripheral nerves. Ann Biomed Eng. 2018;46(11):1921-1937.
  21. Wüthrich T, et al. Development of vascularized nerve scaffold using perfusion-decellularization and recellularization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020;117:111311.
  22. Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011;32(12):3233-3243.
  23. Hopf A, et al. Optimized decellularization protocol for large peripheral nerve segments: Towards personalized nerve bioengineering. Bioengineering (Basel). 2022;9(9):412.
  24. Penkert G. Anatomy of the peripheral nerve system. In: Focal Peripheral Neuropathies: Imaging, Neurological, and Neurosurgical Approaches. Springer; 2014:3-9.
  25. Vasudevan S, et al. Detergent-free decellularized nerve grafts for long-gap peripheral nerve reconstruction. Plast Reconstr Surg Glob Open. 2014;2(8):e201.
  26. García-García ÓD, et al. Comprehensive ex vivo and in vivo preclinical evaluation of novel chemoenzymatic decellularized peripheral nerve allografts. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1162684.
  27. Saheb-Al-Zamani M, et al. Limited regeneration in long acellular nerve allografts is associated with increased Schwann cell senescence. Exp Neurol. 2013;247:165-177.
  28. Kim S, et al. Enhancing peripheral nerve regeneration through NaOH-based decellularization of human nerve tissue. Bioeng Transl Med. 2025;10(6):e70072.
  29. Contreras E, et al. Repair of long nerve defects with a new decellularized nerve graft in rats and in sheep. Cells. 2022;11(24):4074.

Перепечатки и разрешения

Теги

Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.