Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Идентификация потенциальных биомаркеров, связанных с митохондриями, для Ligustri Lucidi Fructus при диабетической нефропатии

57 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71592

⸱

15 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Pharmaceutical and Food Engineering, Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Shanxi Key Laboratory of Integrative Systemic Regulation for Qi-Blood Homeostasis, 2College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Диабетическая нефропатия (ДН) сопровождается митохондриальной дисфункцией. С помощью транскриптомики, сетевой фармакологии и машинного обучения мы определили CAT, FABP1, MAOA и MAOB в качестве потенциальных митохондриальных биомаркеров действия Ligustri Lucidi Fructus. У мышей линии db/db LLF повышал экспрессию CAT и MAOA, что служит основанием для дальнейшего изучения механизмов действия.

Аннотация

Митохондриальная дисфункция и избыточный окислительный стресс внутри митохондрий являются ключевыми патологическими факторами, вызывающими повреждение почечных канальцев при диабетической нефропатии (ДН). Несмотря на то, что Ligustri Lucidi Fructus (LLF) традиционно используется для лечения ДН, задействованные механизмы, особенно те, которые связаны с митохондриальными генами и путями, остаются малоизученными. В данном исследовании использовался анализ дифференциальной экспрессии набора данных GSE142025 для идентификации дифференциально экспрессируемых генов (ДЭГ), связанных с ДН. Характерные гены были отобраны путем перекрестного сопоставления результатов четырех моделей машинного обучения. Гены, которые продемонстрировали значительную дифференциальную экспрессию и согласованные паттерны экспрессии в обоих наборах данных, были дополнительно оценены с помощью анализа рабочих характеристик приемника (ROC-кривых). Гены с площадью под кривой (AUC) > 0,7 в обоих наборах данных были определены как потенциальные биомаркеры. Были проведены функциональный анализ обогащения, анализ иммунной инфильтрации, построение сети и молекулярный докинг. Модель мыши с ДН использовалась для оценки уровня глюкозы в крови, содержания микроальбумина в моче, гистопатологии и экспрессии потенциальных биомаркеров методом RT-qPCR. Экспрессия CAT и MAOA была значительно повышена in vivo. Потенциальные биомаркеры были обогащены в путях, связанных с функцией рибосом, деградацией валина, лейцина и изолейцина, взаимодействиями цитокин-цитокиновый рецептор и пероксисомами. Они отрицательно коррелировали с CD8+ T-клетками и активированными тучными клетками и положительно коррелировали с активированными NK-клетками и наивными B-клетками. Таксифолин, бета-ситостерол и эриодиктиол показали энергию связывания ниже -5 kcal/mol с потенциальными биомаркерами. CAT и MAOA являются перспективными кандидатами, требующими дальнейшего изучения механизмов их действия.

Введение

Диабетическая нефропатия (ДН), являющаяся ведущей причиной терминальной стадии почечной недостаточности во всем мире, представляет собой одно из наиболее распространенных осложнений сахарного диабета. Патологически она характеризуется избыточным накоплением внеклеточного матрикса как в гломерулярном, так и в тубулярном отделах, а также утолщением и склерозом внутрипочечных кровеносных сосудов2. ДН обычно сопровождается протеинурией и гипертензией3. Ее развитие тесно связано с повреждением эндотелиальных клеток сосудов, усиленным воспалительным ответом и повышенным окислительным стрессом вследствие длительной гипергликемии4. Заболеваемость ДН растет во всем мире, особенно среди лиц среднего и пожилого возраста с сахарным диабетом. По мере прогрессирования заболевания оно может привести к терминальной почечной недостаточности и даже к сердечно-сосудистым осложнениям, что значительно ухудшает качество жизни и прогноз пациентов5. Несмотря на успехи в диагностических и терапевтических подходах к ДН, ранние и точные потенциальные биомаркеры для диагностики остаются труднодоступными, а эффективные стратегии лечения для обращения патологических процессов все еще отсутствуют. Следовательно, существует острая необходимость в разработке новых таргетных противонефропатических препаратов.

Митохондрии имеют решающее значение для биоэнергетики клетки, синтеза метаболических предшественников, гомеостаза кальция, продукции активных форм кислорода (АФК), иммунного сигналинга и апоптоза — всех процессов, которые необходимы для поддержания стабильности клеток и организма в целом6. Являясь энергетическими станциями клетки, митохондрии играют ключевую роль в таких фундаментальных процессах, как гликолиз, цикл трикарбоновых кислот и окислительное фосфорилирование7. Ожирение нарушает цикл Кребса и работу митохондриальной дыхательной цепи, что приводит к митохондриальной дисфункции и усилению продукции АФК. Повышенный уровень АФК в митохондриальной дыхательной цепи может вызвать окислительный стресс, который усиливает воспалительную реакцию, связанную с ожирением, и стимулирует апоптоз8. Современные исследования подчеркивают значительную роль митохондриальной дисфункции в патогенезе и прогрессировании диабетической нефропатии (ДН), включая нарушения энергетического обмена, избыточную генерацию АФК и усиление сигналов апоптоза9. Хроническая митохондриальная дисфункция ускоряет прогрессирование заболевания почек10. Таким образом, улучшение функции митохондрий может стать важной стратегией защиты от ДН.

Ligustri Lucidi Fructus (LLF) представляет собой сушеные спелые плоды семейства Luteaceae, которые известны своими питательными свойствами для печени и почек, а также способностью затемнять волосы и улучшать зрение. Был идентифицирован природный гетерополисахарид, экстрагированный из LLF, который проявил потенциал в защите почек от фиброза11. В последние годы растет интерес к применению LLF при лечении диабетической нефропатии (ДН), при этом были продемонстрированы значительные ренопротективные эффекты11,12,13. Кроме того, была подробно изучена и подтверждена сложная взаимосвязь между LLF и митохондриями. В частности, исследование показало, что LLF оказывает благотворное воздействие путем модуляции функции митохондрий через активацию сигнального пути AMPK14. Этот механизм эффективно защищает митохондрии от повреждений, вызванных окислительным стрессом. Данные результаты дополнительно подчеркивают важную роль LLF в поддержании клеточного энергетического метаболизма и повышении устойчивости клеток к окислительному стрессу. Тем не менее, точный терапевтический механизм, особенно в отношении восстановления функции митохондрий, остается недостаточно изученным.

Целью данного исследования было выяснение биологических механизмов, лежащих в основе терапевтического эффекта LLF на митохондриальную функцию при диабетической нефропатии (ДН). С помощью биоинформатических инструментов был проведен поиск в общедоступных базах данных для идентификации потенциальных биомаркеров, связанных с ренопротекторным действием LLF, с интеграцией транскриптомных данных и информации об активных компонентах. Дальнейший анализ, включающий изучение иммунной инфильтрации, связь с клиническими признаками, модификацию м6A РНК, функциональный обогатительный анализ, построение регуляторной сети и молекулярный докинг, показал, что эти потенциальные биомаркеры играют ключевую роль в регуляции митохондриальной функции при лечении ДН. Валидация in vivo дополнительно подтвердила их значимость. Этот комплексный анализ углубляет наше понимание механизмов воздействия LLF при ДН и создает прочную основу для разработки новых терапевтических мишеней на базе коррекции митохондриальной дисфункции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Сбор данных
Матрица экспрессии генов и соответствующие клинические данные для наборов данных GSE142025 и GSE96804, относящихся к диабетической нефропатии (ДН), были получены из базы данных Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)15. Обучающая выборка (GSE142025) включала образцы тканей почек 27 пациентов с ДН и девять контрольных образцов, секвенирование которых проводилось с использованием платформы GPL20301. Валидационная выборка (GSE96804) состояла из данных секвенирования 41 пациента с ДН и 20 контрольных образцов, обработанных с помощью платформы GPL17586. Оба набора данных сосредоточены на тканях почек; набор данных GSE96804 специально исследует клубочек — основной фильтрационного звено почки (Рисунок 1). Набор данных GSE142025 (обучающая выборка) включает образцы всей ткани почек и обеспечивает обширный обзор транскриптомного ландшафта ДН. С другой стороны, набор данных GSE96804 (валидационная выборка) сфокусирован конкретно на ткани клубочков, которая является основным местом повреждения при гломерулярной фильтрации. Поскольку эти два набора данных не объединялись напрямую из-за различий в платформах и типах тканей, коррекция эффекта партии не применялась. Вместо этого валидация между наборами данных проводилась независимо. Гены с согласованными направленными изменениями и площадью под кривой (AUC) более 0,7 в обоих наборах данных были выбраны в качестве надежных кандидатов, что подтверждает возможность обобщения результатов для различных отделов почек.

В общей сложности 1 136 генов, связанных с митохондриями (MRGs), были извлечены из базы данных MitoCarta3.0 (https://www.broadinstitute.org/mitocarta). Активные ингредиенты LLF были определены с помощью базы данных Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP) (http://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php) на основе пороговых значений биодоступности при пероральном приеме (OB) ≥30% и лекарственности (DL) ≥0,18. Впоследствии потенциальные гены-мишени для активных компонентов были предсказаны с использованием базы данных Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/).

Анализ дифференциальной экспрессии
Анализ дифференциальной экспрессии GSE142025 (ДН против контроля) проводили с помощью пакета limma (v3.54.1), при этом критерии значимости были установлены как P.adj < 0.05 и |log2FoldChange| > 0.516 . Для визуализации графиков «вулкан» (volcano plots) и тепловых карт использовали пакеты ggplot2 (v 3.3.6) и ComplexHeatmap (v 2.14.0) соответственно17,18. Было выполнено пересечение дифференциально экспрессируемых генов (DEGs), генов, связанных с метаболизмом (MRGs), и потенциальных генов-мишеней активных ингредиентов; перекрывающиеся гены были определены как гены-кандидаты. Сеть, связывающую активные ингредиенты и гены-кандидаты, построили с помощью программного обеспечения Cytoscape (v 3.9.0)19.

Функциональный анализ обогащения и построение сети белок-белковых взаимодействий (PPI)
Анализ обогащения по Gene Ontology (GO) и Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) для исследуемых генов-кандидатов был выполнен с использованием пакета clusterProfiler (v 4.6.2) для изучения их биологических функций и связанных с ними сигнальных путей (P.adjust < 0.05). Затем список генов-кандидатов был введен в базу данных STRING (https://cn.string-db.org/) для получения данных о белок-белковых взаимодействиях (уровень достоверности ≥ 0.4), после чего с помощью Cytoscape (v 3.9.0) была построена сеть PPI20.

Машинное обучение
Четыре алгоритма машинного обучения, включая случайный лес (RF), k-ближайших соседей (KNN), метод частичных наименьших квадратов (PLS) и метод опорных векторов с радиально-базисной функцией ядра (SVM), были реализованы с помощью пакета caret (v6.0-93) на основе набора данных GSE142025. В качестве предикторов использовались гены-кандидаты, выявленные в ходе предыдущего анализа, а в качестве целевой переменной — статус заболевания (DN или контроль). Для модели KNN была применена 10-кратная перекрестная проверка с использованием функции trainControl при tuneLength = 10. Модель RF была построена с использованием 20 деревьев (ntree = 20); модели PLS и SVM были настроены согласно параметрам, реализованным в исходном рабочем процессе caret.

Распределения остатков модели оценивали с помощью пакета DALEX (v2.4.3). Затем была проведена оценка переменных на основе перестановок с использованием функции variable_importance пакета DALEX, где в качестве функции потерь была указана среднеквадратическая ошибка (RMSE). Полученное значение dropout_loss представляет собой RMSE, полученное после перестановки соответствующей переменной21,22. В исходном аналитическом рабочем процессе были сохранены переменные со значением dropout loss < 0.281 для всех моделей, а гены, общие для всех четырех моделей, были определены как консенсусные гены-признаки для последующей валидации.

Четыре модели машинного обучения использовались преимущественно для приоритизации признаков, а не для построения окончательного клинического классификатора. Соответственно, диагностическая разделительная способность впоследствии оценивалась на уровне отдельных генов с помощью ROC-анализа как в открывающем, так и в валидационном наборах данных.

Идентификация потенциальных биомаркеров
В наборах данных GSE142025 и GSE96804 различия в экспрессии исследуемых генов между образцами с диабетической нефропатией (ДН) и контрольными образцами оценивали с помощью критерия Вилкоксона. Для анализа рабочих характеристик приемника (ROC-кривых) отбирали только те гены, которые имели значимую дифференциальную экспрессию (P < 0.05) и согласованные тенденции экспрессии в обоих наборах данных. Для построения ROC-кривых и расчета площади под кривой (AUC) использовали пакет pROC (v1.18.0); гены, демонстрирующие AUC > 0.7 в обоих наборах данных, классифицировали как потенциальные биомаркеры23.

Анализ обогащения наборов генов (GSEA)
Биологические функции и сигнальные пути, связанные с кандидатными биомаркерами, были дополнительно изучены с помощью GSEA на наборе данных GSE142025. Сначала с использованием пакета psych (v2.2.9) был проведен корреляционный анализ Спирмена кандидатных биомаркеров со всеми остальными генами.24Коэффициенты корреляции были рассчитаны и ранжированы (от высокого к низкому). В качестве эталонного набора генов использовался c2.cp.kegg.v2023.1.Hs.symbols.gmt из базы данных молекулярных сигнатур (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/). Затем с помощью пакета clusterProfiler (v4.6.2) был проведен анализ GSEA для оценки обогащения ранжированных генов в фоновом наборе генов. Была применена поправка на множественное тестирование. посредством метод FDR и скорректированные P-значения (обозначенные как P.adjust) считались значимыми, если < 0.05.

Анализ модификации m6A
Для исследования модификаций метилирования РНК потенциальных биомаркеров использовалась база данных SRAMP (http://www.cuilab.cn/sramp/) для предсказания сайтов модификации m6A в последовательностях биомаркеров с акцентом на высокодостоверные позиции в их вторичных структурах. Затем с помощью базы данных ENCORI (https://starbase.sysu.edu.cn/) были идентифицированы белки, модифицированные m6A, которые взаимодействуют с потенциальными биомаркерами; для скрининга ключевых белков использовался параметр |HepG2 (shRNA)| > 1. Впоследствии использовалась база данных RPISeq (http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/) для предсказания вероятности взаимодействий между ключевыми белками и потенциальными биомаркерами. Последовательности РНК обоих компонентов были загружены в формате простого текста для получения оценок предсказания классификаторами RF и SVM. Взаимодействие считалось значимым, если оценка превышала 0,525. Анализ SRAMP проводился с порогом «High» для предсказания сайтов m6A в режиме «Transcript» и с параметрами по умолчанию. Для анализа в ENCORI использовалась функция взаимодействия «miRNA-mRNA» с параметром «HepG2 (shRNA)» > 1. Анализ RPISeq проводился с использованием классификатора RF с параметрами по умолчанию; значения > 0,5 указывали на положительное взаимодействие. Данные результаты являются вычислительными предсказаниями, а не экспериментальными доказательствами модификации m6A или РНК-белковых взаимодействий в тканях почек. Критерий HepG2 shRNA был получен из предварительно рассчитанных наборов данных ENCORI и может не отражать специфическую регуляцию в почках.

Анализ иммунной инфильтрации
Для оценки пропорций 22 типов иммунных клеток в контрольных образцах и образцах с ДН из набора GSE142025 был применен алгоритм CIBERSORT, а визуализация была выполнена с помощью тепловой карты, созданной с использованием пакета ggplot2 (v3.3.6)26. CIBERSORT запускали с использованием сигнатурной матрицы LM22, 1000 перестановок и отключенной квантильной нормализацией (как рекомендуется для данных микрочипов). Для дальнейшего анализа были отобраны образцы с p < 0.05 по результатам CIBERSORT. CIBERSORT оценивает фракции иммунных клеток на основе экспрессии в общем объеме ткани почки, что не позволяет разделить инфильтрацию по компартментам (например, гломерулярную и тубулоинтерстициальную), а также отличить инфильтрирующие лейкоциты от резидентных иммунных клеток. Таким образом, сообщаемые корреляции относятся к уровню ткани и должны быть подтверждены пространственными методами. Корреляционный анализ Спирмена между иммунными клетками с дифференциальным содержанием и потенциальными биомаркерами проводили с использованием пакета psych.

Построение сетей и молекулярный докинг
МикроРНК (miRNAs), взаимодействующие с потенциальными биомаркерами, были предсказаны с использованием базы данных miRNet (https://www.mirnet.ca). Затем с помощью баз данных TarBase (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/tarbase) и starbase (http://starbase.sysu.edu.cn/) были предсказаны длинные некодирующие РНК (lncRNAs), мишенями которых являются выявленные микроРНК. Для построения сети были выбраны lncRNAs, общие для обеих баз данных. После этого с помощью программного обеспечения Cytoscape была построена регуляторная сеть lncRNA-miRNA-mRNA. Потенциальные активные ингредиенты, воздействующие на потенциальные биомаркеры, были отобраны для построения сети «активный ингредиент — биомаркер». Кроме того, активные ингредиенты, потенциальные биомаркеры и пути, выявленные с помощью GSEA, были внесены в Cytoscape для создания сети «активный ингредиент — биомаркер — путь».

Для оценки аффинности связывания между потенциальными активными ингредиентами и кандидатными биомаркерами был проведен анализ молекулярного докинга. 3D-структуры белков-биомаркеров были получены из банка данных белков Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB, https://www.rscb.org/pdb) в формате PDB. 2D-структуры потенциальных активных ингредиентов были извлечены в формате SDF из базы данных PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Молекулярный докинг выполняли с использованием платформы CB-Dock (http://clab.labshare.cn/cb-dock/php/blinddock.php). Значение энергии связывания менее -5 kcal/mol указывало на сильную аффинность связывания27.

Подготовка и аутентификация Ligustri Lucidi Fructus
В данном случае Ligustri Lucidi Fructus (LLF) представляет собой высушенные спелые плоды Ligustrum lucidum W. T. Aiton (Oleaceae). Ботанический материал был аутентифицирован в соответствии с Фармакопеей Китая; гербарные образцы № 20240506, 20240911, 20241103 были депонированы в Университете традиционной китайской медицины провинции Шаньси.

Для приготовления отвара 200 g соответствующих требованиям ломтиков LLF замачивали в 1,000 mL дистиллированной воды в течение 30 мин при комнатной температуре. Смесь доводили до интенсивного кипения, затем томили на слабом огне в течение 60 мин. Собирали фильтрат, а оставшийся растительный материал повторно кипятили с еще 1,000 mL дистиллированной воды в течение 60 мин. Два полученных фильтрата объединяли, фильтровали, центрифугировали и концентрировали при пониженном давлении до достижения конечной концентрации стока 1 g сырого лекарственного вещества/mL (общий объем 100 mL). Приготовленный отвар хранили при 4 °C для краткосрочного использования или при −20 °C для длительного хранения. Качество LLF и полученного отвара строго проверяли и подтверждали в соответствии со стандартами Фармакопеи Китайской Народной Республики для обеспечения надежности и воспроизводимости экспериментов.

Для качественной идентификации была проведена тонкослойная хроматография. Вкратце: соответствующий объем приготовленного отвара центрифугировали, а супернатант экстрагировали метанолом. После фильтрации раствор образца и раствор стандартного образца specnuezhenide наносили на одну и ту же пластину с силикагелем G. После проявления, высушивания и осмотра под ультрафиолетовым светом пятно раствора образца по цвету и положению совпало с пятном стандартного соединения, что подтвердило наличие характерного биоактивного компонента LLF.

Для количественного контроля качества была проведена детекция методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Анализ выполняли с использованием колонки C18, где в качестве подвижной фазы применяли смесь метанола и воды. Длина волны детектирования была установлена на уровне 224 nm. Содержание specnuezhenide в отваре определяли на основании стандартной кривой. Результаты продемонстрировали стабильный и однородный химический состав приготовленного отвара, что обеспечило постоянное качество препарата на протяжении всего эксперимента с применением животных.

Эксперименты на животных
Двенадцать самцов мышей линии db/db (возраст 8–9 недель), соответствующих стандарту SPF, и шесть контрольных самцов мышей линии db/m того же возраста содержались в SPF-виварии Шаньсийского университета традиционной китайской медицины. Перед началом экспериментов животные проходили период акклиматизации в течение 7 дней при 12-часовом цикле свет/темнота с ad libitum доступ к пище и воде. Исследование было одобрено Комитетом по этике Шаньсийского университета традиционной китайской медицины (номер одобрения 2022DW167). У животных, проявлявших >Животных с потерей массы тела на 20%, в состоянии агонии или при невозможности доступа к пище и воде гуманно усыпляли до достижения запланированной конечной точки исследования. По завершении исследования все оставшиеся мыши были усыплены путем внутрибрюшинного введения пентобарбитала натрия с последующим переломом шейных позвонков в соответствии с протоколами учреждения.

После периода акклиматизации создание модели диабетической нефропатии (ДН) у мышей db/db подтверждалось уровнем глюкозы в крови из хвостовой вены ≥ 16 mmol/L и микроальбуминурией, определяемой по положительному результату теста с тест-полоской на микроальбумин в моче. После успешного создания модели ДН мыши db/db были случайным образом разделены на две группы (n = 6 в каждой группе): группу модели ДН (DN) и группу лечения LLF (Treatment). Кроме того, мыши db/m (n = 6) использовались в качестве контрольной группы (Control). Дозировка была выбрана на основе предыдущих фармакодинамических исследований LLF на диабетических крысах и пересчитана на эквивалентную дозу для человека с использованием нормализации по площади поверхности тела28. Группам Control и DN вводили дистиллированную воду, тогда как группа лечения получала LLF в дозе 3,5 g/kg в течение 8 недель. После 8 недель введения всех мышей усыпляли для сбора сыворотки крови, мочи и тканей почек для последующих анализов.

Показатели крови и мочи
Уровни глюкозы в сыворотке крови анализировали с помощью полностью автоматического биохимического анализатора крови. Концентрацию микроальбумина в моче измеряли в соответствии с инструкцией к набору (Дополнительный файл 1).

Патологическое исследование тканей почек мыши
Ткани почек были подготовлены для гистопатологического исследования. После фиксации в 4% параформальдегиде ткани промывали, дегидратировали, заливали в парафин и нарезали на срезы. Затем проводили окрашивание гематоксилином и эозином (HE), после чего окрашенные срезы изучали под оптическим микроскопом для оценки патологических изменений.

Обратная транскрипция и количественная полимеразная цепная реакция (ОТ-кПЦР)
ОТ-кПЦР использовали для определения экспрессии потенциальных биомаркеров в ткани почек мыши. Тотальную РНК экстрагировали согласно инструкциям производителя, после чего оценивали концентрацию и качество РНК (Таблица 1). кДНК синтезировали из экстрагированной РНК с помощью набора для синтеза кДНК. Амплификацию проводили с использованием пар праймеров, перечисленных в Таблице 1>, используя GAPDH в качестве референсного гена. Относительные уровни экспрессии рассчитывали методом 2−ΔΔCt13,26.

Статистический анализ
Все статистические анализы были проведены с использованием программного обеспечения R (версия 4.2.2) совместно с ПО, необходимым для соответствующих экспериментальных процедур. Если не указано иное, все статистические тесты были двусторонними, а различия считались статистически значимыми при P < 0.05. Анализ дифференциальной экспрессии транскриптома выполнялся с использованием пакета limma. Гены с скорректированным значением P < 0.05 и абсолютным значением log2-кратного изменения более 0,5 были определены как дифференциально экспрессируемые.

Для сравнения экспрессии генов-кандидатов между независимыми образцами с DN и контрольными образцами использовались непараметрические критерии суммы рангов Уилкоксона, где это было указано в исходном аналитическом протоколе. Корреляции между биомаркерами-кандидатами и фракциями иммунных клеток оценивали с помощью ранговой корреляции Спирмена.

Экспериментальные данные представлены как среднее ± SD. Сравнения между тремя независимыми группами животных проводились с помощью однофакторного дисперсионного анализа при соблюдении условий параметрического анализа. Для апостериорных сравнений использовался критерий наименьшей значимой разности при условии гомогенности дисперсий, тогда как при неоднородности дисперсий применялся T3-тест Даннетта. Исходные фармакодинамические показатели и показатели на 8-й неделе анализировались и представлялись раздельно; выводы о взаимодействии факторов группы и времени не делались. Скрипты R и исходные данные, использованные для биоинформатического анализа и анализа с применением машинного обучения, представлены в Дополнительном файле 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для систематического изучения потенциальных кандидатных биомаркеров, связанных с митохондриями, для оценки LLF при лечении диабетической нефропатии (ДН), мы разработали аналитический рабочий процесс, состоящий из четырех этапов (Рисунок 1)На первом этапе мы интегрировали транскриптомные данные из набора GSE142025 (обучающая выборка, вся почка, n=36) и GSE96804 (валидационная выборка, клубочек, n = 61) с 1 136 генами, связанными с митохондриями, из базы данных MitoCarta 3.0, и 517 прогнозируемыми мишенями...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

LLF представляет собой широко используемый препарат традиционной китайской медицины, применяемый преимущественно для укрепления печени и почек, а также для лечения сахарного диабета и его осложнений. В настоящее время специфических препаратов или методов терапии диабетической нефропатии (ДН) не существует, и ее лечение основывается главным образом на гипогликемической, гиполипидемической и антигипертензивной терапии30,31,32. Одн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотели бы выразить нашу искреннюю благодарность всем частным лицам и организациям, которые поддерживали и помогали нам на протяжении всего этого исследования. Данная работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (№ 81973486 и 82173974), научно-исследовательскими проектами Администрации традиционной китайской медицины провинции Шаньси (№ 2024ZYYA021), профильным проектом Университета китайской медицины Шаньси (№ 2026XK24), а также проектом фонда научных исследований Университета китайской медицины Шаньдун (№ KYZK2024Q13). Мы благодарим доцента Цзиньцин Ли из Университета китайской медицины Шаньси, которая провела аутентификацию ботанического материала.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4% раствор параформальдегида для фиксации тканейSaiyin Biotechnology Co., Ltd.71033600
Абсолютный этанолSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10009218
ГлюкометрSinocare Inc.GA-3
Набор для определения азота мочевины крови (BUN)Nanjing Jianwei Bioengineering InstituteC03-2-1
Мыши C57BLKS/J db/dbChangzhou Cavens Experimental Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2021-0013
Мыши C57BLKS/J db/mChangzhou Cavens Experimental Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2021-0013
ЦентрифугаHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.HI650
ХлоралгидратShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.302-17-0
Cytoscape (v3.9.0)https://cytoscape.org
База данных для предсказания модификаций m6Ahttp://www.cuilab.cn/sramp/
База данных активных ингредиентов традиционной китайской медициныhttp://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php
ENCORI / Starbasehttps://starbase.sysu.edu.cn/
Gene Expression Omnibus (GEO)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Набор для окрашивания гематоксилином и эозином (HE)Servicebio C0105S
Высокоскоростная центрифугаLabnet, USAC2500-R-230V
Инструмент для анализа иммунной инфильтрацииhttps://cibersort.stanford.edu/
Ligustri Lucidi FructusSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20240506
Магнитная мешалкаJintan Zhongtian Instrument Factory, JiangsuT8-1
МикроскопOlympusBX53
МикротомLeica, GermanyRM 2016
Микрообъемный спектрофотометрHangzhou Aosheng Instrument Co., Ltd.Nano-300
miRNethttps://www.mirnet.ca
MitoCarta 3.0https://www.broadinstitute.org/mitocarta
R-пакет для интерпретации моделейhttps://cran.r-project.org/package=DALEX
Платформа для молекулярного докингаhttp://clab.labshare.cn/cb-dock/
ELISA-набор для определения микроальбуминурии у мышейFine TestEM0632
Тест-полоска для определения микроальбуминурии у мышейGuangzhou Huadu Gaoerbao Biotechnology Co., Ltd.20211203
ELISA-набор для определения креатинина в сыворотке крови мышейAbmartAB5990A
MSigDBhttps://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/
Термоциклер для ПЦРRocheRoche LightCycler 480
Программное обеспечение R (v4.2.2) + R-пакетыhttps://www.r-project.org / CRAN/Bioconductor
RCSB PDBhttps://www.rcsb.org
Набор для экстракции РНКBeijing Jumei Biotech Co., Ltd.MF-036-01
RPISeqhttp://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/
Набор для RT-qPCRBeijing Jumei Biotech Co., Ltd.MF949-T
СалидрозидSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20211009
Набор для определения креатинина в сыворотке кровиNanjing Jianwei Bioengineering InstituteC011-2-1
Виварий для SPF-животныхShanxi University of TCM
SRAMPhttp://www.cuilab.cn/sramp/
STRINGhttps://cn.string-db.org/
SwissTargetPredictionhttp://www.swisstargetprediction.ch/
TCMSPhttp://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php
Tezhi PiganSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20210602
Флотирующая ванна для тканейWuhan JunjieJK-6

Ссылки

  1. Thipsawat S. Early detection of diabetic nephropathy in patient with type 2 diabetes mellitus: a review of the literature. Diabetes Vasc Dis Res. 2021;18(6):14791641211058856.
  2. Kanwar YS, Sun L, Xie P, Liu FY, Chen S. A glimpse of various pathogenetic mechanisms of diabetic nephropathy. Annu Rev Pathol. 2011;6:395-423.
  3. Santulli G, et al. Prediabetes increases the risk of frailty in prefrail older adults with hypertension: beneficial effects of metformin. Hypertension. 2024;81(7):1637-43.
  4. Jin Q, et al. Oxidative stress and inflammation in diabetic nephropathy: role of polyphenols. Front Immunol. 2023;14:1185317.
  5. Alicic RZ, Rooney MT, Tuttle KR. Diabetic kidney disease: challenges, progress, and possibilities. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12(12):2032-45.
  6. Harrington JS, et al. Mitochondria in health, disease, and aging. Physiol Rev. 2023;103(4):2349-422.
  7. Peña FJ, et al. An integrated overview on the regulation of sperm metabolism (glycolysis-Krebs cycle-oxidative phosphorylation). Anim Reprod Sci. 2022;246:106805.
  8. de Mello AH, Costa AB, Engel JDG, Rezin GT. Mitochondrial dysfunction in obesity. Life Sci. 2018;192:26-32.
  9. Shen Y, et al. Notoginsenoside Fc, a novel renoprotective agent, ameliorates glomerular endothelial cells pyroptosis and mitochondrial dysfunction in diabetic nephropathy through regulating HMGCS2 pathway. Phytomedicine. 2024;126:155445.
  10. Zhang PN, et al. Mitochondrial dysfunction and diabetic nephropathy: nontraditional therapeutic opportunities. J Diabetes Res. 2021;2021:1010268.
  11. Zhang JL, et al. Structural characterization and protective effect against renal fibrosis of polysaccharide from Ligustrum lucidum Ait. J Ethnopharmacol. 2023;302(Pt A):115898.
  12. Luan R, et al. The protective effect of ethyl acetate and n-butanol fractions of wine-steamed Ligustri Lucidi Fructus on diabetic nephropathy in rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:6512242.
  13. Luan R, et al. Pharmacodynamics, pharmacokinetics, and kidney distribution of raw and wine-steamed Ligustri Lucidi Fructus extracts in diabetic nephropathy rats. Molecules. 2023;28(2):791.
  14. Seo HL, et al. Liqustri lucidi Fructus inhibits hepatic injury and functions as an antioxidant by activation of AMP-activated protein kinase in vivo and in vitro. Chem Biol Interact. 2017;262:57-68.
  15. Yan M, et al. Identification of pyroptosis-related genes and potential drugs in diabetic nephropathy. J Transl Med. 2023;21(1):490.
  16. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47.
  17. Gustavsson EK, et al. ggtranscript: an R package for the visualization and interpretation of transcript isoforms using ggplot2. Bioinformatics. 2022;38(15):3844-6.
  18. Gu Z, Eils R, Schlesner M. Complex heatmaps reveal patterns and correlations in multidimensional genomic data. Bioinformatics. 2016;32(18):2847-9.
  19. Shannon P, et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 2003;13(11):2498-504.
  20. Wu T, et al. clusterProfiler 4.0: a universal enrichment tool for interpreting omics data. Innovation (Camb). 2021;2(3):100141.
  21. Dong H, et al. Identification through machine learning of potential immune-related gene biomarkers associated with immune cell infiltration in myocardial infarction. BMC Cardiovasc Disord. 2023;23(1):163.
  22. Pei B, et al. The development of prediction model for cuffed tracheal tube size from the middle finger in pediatrics: a concise and feasible approach. Transl Pediatr. 2023;12(12):2222-31.
  23. Robin X, et al. pROC: an open-source package for R and S+ to analyze and compare ROC curves. BMC Bioinformatics. 2011;12:77.
  24. Robles-Jimenez LE, et al. Worldwide traceability of antibiotic residues from livestock in wastewater and soil: a systematic review. Animals (Basel). 2021;12(1):60.
  25. Wang Y, et al. Bioinformatics analysis combined with clinical sample screening reveals that leptin may be a biomarker of preeclampsia. Front Physiol. 2022;13:1031950.
  26. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^−ΔΔCT method. Methods. 2001;25(4):402-8.
  27. Klejborowska G, et al. Synthesis, anticancer activity and molecular docking studies of N-deacetylthiocolchicine and 4-iodo-N-deacetylthiocolchicine derivatives. Bioorg Med Chem. 2021;32:116014.
  28. Reagan-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB J. 2008;22(3):659-61.
  29. An Y, Duan H. The role of m6A RNA methylation in cancer metabolism. Mol Cancer. 2022;21(1):14.
  30. Mazzieri A, Porcellati F, Timio F, Reboldi G. Molecular targets of novel therapeutics for diabetic kidney disease: a new era of nephroprotection. Int J Mol Sci. 2024;25(7):3969.
  31. Breyer MD, Susztak K. The next generation of therapeutics for chronic kidney disease. Nat Rev Drug Discov. 2016;15(8):568-88.
  32. Leoncini G, et al. Blood pressure reduction and RAAS inhibition in diabetic kidney disease: therapeutic potentials and limitations. J Nephrol. 2020;33(5):949-63.
  33. Pofi R, et al. Diabetic nephropathy: focus on current and future therapeutic strategies. Curr Drug Metab. 2016;17(5):497-502.
  34. Arellano Buendía AS, et al. Immunomodulatory effects of the nutraceutical garlic derivative allicin in the progression of diabetic nephropathy. Int J Mol Sci. 2018;19(10):3107.
  35. Zhang X, Agborbesong E, Li X. The role of mitochondria in acute kidney injury and chronic kidney disease and its therapeutic potential. Int J Mol Sci. 2021;22(20):11253.
  36. Liu Y, et al. DsbA-L interacting with catalase in peroxisome improves tubular oxidative damage in diabetic nephropathy. Redox Biol. 2023;66:102855.
  37. Zhong Y, et al. Jujuboside A ameliorates high fat diet and streptozotocin induced diabetic nephropathy via suppressing oxidative stress, apoptosis, and enhancing autophagy. Food Chem Toxicol. 2022;159:112697.
  38. Zhong Y, et al. Dioscin relieves diabetic nephropathy via suppressing oxidative stress and apoptosis, and improving mitochondrial quality and quantity control. Food Funct. 2022;13(6):3660-73.
  39. Issac PK, et al. Protective effect of morin by targeting mitochondrial reactive oxygen species induced by hydrogen peroxide demonstrated at a molecular level in MDCK epithelial cells. Mol Biol Rep. 2022;49(6):4269-79.
  40. Abo El-Asrar M, Ismail EAR, Elnhrawy AM, Thabet RA. Fatty acid binding protein 1 (FABP1) and fatty acid binding protein 2 (FABP2) as a link between diabetic nephropathy and subclinical atherosclerosis in children and adolescents with type 1 diabetes. J Diabetes Complications. 2023;37(3):108414.
  41. Gholaminejad A, Fathalipour M, Roointan A. Comprehensive analysis of diabetic nephropathy expression profile based on weighted gene co-expression network analysis algorithm. BMC Nephrol. 2021;22(1):245.
  42. Tanaka M, et al. Urinary fatty acid-binding protein 4 is a promising biomarker for glomerular damage in patients with diabetes mellitus. J Diabetes Investig. 2025;16(4):670-9.
  43. Liu Y, et al. Gastric cancer adapts high lipid microenvironment via suppressing PPARG-FABP1 axis after arriving in the lymph node. Redox Biol. 2025;85:103759.
  44. Borús DL, et al. Fatty acid binding protein 1 (FABP1) depletion promotes an oxidative metabolic shift in Caco-2 colorectal cancer cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 2025;1870(7):159661.
  45. Chu Y, et al. Glutathione peroxidase-1 overexpression reduces oxidative stress, and improves pathology and proteome remodeling in the kidneys of old mice. Aging Cell. 2020;19(6):e13154.
  46. Zhang F, et al. Mesenchymal stem cells alleviate rat diabetic nephropathy by suppressing CD103+ DCs-mediated CD8+ T cell responses. J Cell Mol Med. 2020;24(10):5817-31.
  47. Cao Q, et al. Renal F4/80+ CD11c+ mononuclear phagocytes display phenotypic and functional characteristics of macrophages in health and in adriamycin nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2015;26(2):349-63.
  48. Zhou W, et al. The landscape of immune cell infiltration in the glomerulus of diabetic nephropathy: evidence based on bioinformatics. BMC Nephrol. 2022;23(1):303.
  49. Bloch K, Shichman E, Vorobeychik M, Bloch D, Vardi P. Catalase expression in pancreatic alpha cells of diabetic and non-diabetic mice. Histochem Cell Biol. 2007;127(2):227-32.
  50. Zhao Y, et al. Taxifolin attenuates diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic rats. Am J Transl Res. 2018;10(4):1205-10.
  51. Ding S, Wang W, Song X, Ma H. Based on network pharmacology and molecular docking to explore the underlying mechanism of Huangqi Gegen Decoction for treating diabetic nephropathy. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:9928282.
  52. Guo S, et al. Correction: Eriodictyol: a review of its pharmacological activities and molecular mechanisms related to ischemic stroke. Food Funct. 2023;14(10):4949.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Митохондриальная дисфункциядифференциальная экспрессиямодели машинного обученияфункциональный анализ обогащенияиммунная инфильтрациямолекулярный докингфункция рибосом
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.