Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Индукция дневных циркадных фазовых сдвигов с помощью хемогенетических и спектральных подходов

295 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71594

⸱

12 июня 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Section on Light and Circadian Rhythms, National Institute of Mental Health (NIMH), National Institutes of Health (NIH)

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании вводятся хемогенетические и фиолетовые методы, основанные на фиолетовом свете, обеспечивающие надёжное дневное циркадное фазовое сдвиг.

Аннотация

У млекопитающих циркадные фазовые сдвиги в дневное время ограничены снижением фотической реакции супрахиазматического ядра (SCN), что ограничивает возможность экспериментального управления циркадными часами в этот период. Надёжные методы индуцирования дневных фазовых сдвигов необходимы для изучения механизмов циркадной пластичности и фотической энтрейнментации. Описаны комплементарные генетические и спектральные стратегии, позволяющие обеспечить надёжную, временно точную манипуляцию циркадными часами в течение дня. Первый подход, в настоящее время ограниченный мышами, использует химогенетическую стратегию, включающую внутривитреальную доставку дизайнерских рецепторов, исключительно активируемых дизайнерскими препаратами (DREADD), для селективной активации внутренне фоточувствительных ганглиозных клеток сетчатки (ipRGC). Этот подход позволяет контролируемо активировать ретиногипоталамический путь и вызывает воспроизводимые дневные фазовые сдвиги независимо от условий окружающего освещения. Второй подход использует оптическую стимуляцию, специфичную для длины волны, как неинвазивную альтернативу. Воздействие фиолетового света использует спектральную чувствительность ipRGC для снижения блока деполяризации и обеспечения устойчивой активации, обеспечивая надёжную фазовую сброс в субъективный день. Этот метод широко применим во всех системах млекопитающих и не требует генетической манипуляции или фармакологического вмешательства. Подробные протоколы предоставляются для подготовки экспериментов, времени стимуляции, валидации фазовых сдвигов с помощью локомоторной активности и оценки активации нейронов с помощью иммуногистохимии c-Fos. Ключевые аспекты, включая циркадное время, параметры стимула и экспериментальные контрольные элементы, изложены для облегчения воспроизводимости. Вместе эти подходы предоставляют универсальные и экспериментально управляемые инструменты для индуцирования дневных циркадных фазовых сдвигов и позволяют непосредственно исследовать механизмы, лежащие в основе дневной циркадной реакции.

Введение

Супрахиазматическое ядро (SCN), главные циркадные часы мозга млекопитающих, координирует важные ежедневные ритмы физиологии и поведения, включая циклы сна и бодрствования и схемы питания. Для поддержания выравнивания с внешней средой SCN получает прямой фотический вход от по своей сути фоточувствительных ганглиозных клеток сетчатки (ipRGC), которые передают информацию о свете сетчатки для синхронизации внутренних циркадных ритмов с солнечнымднём 1,2.

Определяющей чертой циркадных систем у разных организмов является фазозависимая реакция: один и тот же стимул, доставляемый в разные циркадные времена, может вызывать заметно разные эффекты. У млекопитающих ночной свет надёжно вызывает фазовые сдвиги часов SCN, тогда как экспозиция в субъективный день вызывает мало или вовсе не приводит ксбросу 3,4. Эта очевидная дневная нечувствительность постоянно наблюдается как в in vivo, так и в in vitro препаратах, где попытки имитировать фотический вход не приводят к значимым фазовымсдвигам 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 .

Дневная нечувствительность объясняется, по крайней мере частично, недостаточным стимулом сетчатки для запуска механизмов фазового сброса, наряду с циркадными механизмами гейтинга внутри SCN. В соответствии с этой идеей, ipRGC не обладают равномерной реакцией при фотопических условиях; Подмножество входит в блок деполяризации, ограничивая устойчивый потенциал действияпри стрельбе 17,18,19. Это физиологическое ограничение может снижать эффективность традиционной фотической стимуляции в течение дня. Преодоление этого ограничения позволило бы напрямую проверить пластичность дневных часов — фазу, традиционно считавшуюся огнеупорной к сбросе фотики.

Описаны две взаимодополняющие методологии, позволяющие обеспечить устойчивое фазовое сдвиг циркадных часов в течение субъективного дня. Первый подход использует хемогенетическую стратегию для селективной активации ipRGC независимо от условий окружающего освещения. В частности, мыши Opn4Cre/ + получают внутривитреальные инъекции аденоассоциированного вируса (AAV), кодирующего возбуждающий дизайнерский рецептор, исключительно активируемый дизайнерскими препаратами (DREADD), hM3Dq, в Cre-зависимом виде. Введение клозапина-N-оксида (CNO) в циркадное время 4 (CT4) вызывает импульсное воздействие ipRGC, обеспечивая устойчивую активацию ретиногипоталамическогопути 19. Фазовые сдвиги количественно измеряются с помощью записей локомоторной активности, а молекулярная активация внутри SCN оценивается с помощью иммуногистохимии c-Fos.

Второй подход использует оптическую стимуляцию, специфичную по длине волны, как неинвазивную стратегию для более широкой применимости. Дикие мыши подвергаются воздействию фиолетового света (385 нм) в циркадное время 6 (CT6), в середине субъективного дня. Фиолетовый свет создаёт сниженный блок деполяризации и поддерживает устойчивую активацию ipRGC по сравнению с синим или белымсветом 19. Фазовые сдвиги количественно оцениваются, как описано выше.

Оба подхода направлены на усиление сигнализации, управляемой ipRGC, для SCN, тем самым преодолевая сниженную фотическую реакцию, характерную для субъективного дня. Вместе эти методологии предоставляют надёжные, экспериментально управляемые стратегии управления циркадными часами в фазе, традиционно устойчивой к сбросу фотики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных были одобрены и выполнены в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу и использованию животных Национального института психического здоровья (NIMH) (ASP-SLCR-01). Были предприняты все усилия для минимизации боли и уменьшения количества используемых животных. Используемые исследовательские инструменты перечислены в Таблице материалов.

1. Хемогенетическая стратегия

  1. Интравитреальная инъекция адено-ассоциированного вируса у мышей Opn4Cre/ +
    1. Очистить и стерилизовать стереотаксичную стадию и все хирургические инструменты с использованием соответствующих процедур стерилизации. Установите инъекционный аппарат и прикрепите стеклянную капиллярную иглу.
    2. Обезболить мышь с помощью изофлурана. Установите расход кислорода примерно на 1,5 л/мин. Отрегулируйте изофлуран до 3%–5% для индукции и уменьшите до 1–3% для поддержания на протяжении всей процедуры.
    3. Проверьте адекватную анестезию с помощью защитки пальца. Считаем, что животное полностью анестезиировано, когда отмены или рефлекса вздрагивания не наблюдается.
    4. Положите мышь на грелку, чтобы поддерживать температуру тела на протяжении всей процедуры.
    5. Вытяните стеклянные капиллярные иглы. Иглы маркировались на расстоянии ~1,5 мм от кончика тонким маркером под стереомикроскопом для обеспечения равномерной глубины проникновения.
    6. Аккуратно надавите на нижнее веко тупыми щипцами, чтобы слегка выпячить глазное яблоко и обнажать спинной лимбус. Используя дорсальный подход, вводите иглу касательной к поверхности глаза и проникайте склеру на 0,5–1 мм позади лимба, избегая васкуляризированных областей лимба.
    7. Введите иглу в стекловидную камеру на заранее заданную глубину. Немного отстраняйте, чтобы снизить внутриглазное давление и предотвратить закупорку кончика иглы тканями.
    8. Вводите общий объём 1,5 мкл раствора AAV (при 2,4 x 1013 ГХ/мл), подаём в виде пяти последовательных инъекций по 300 нл каждая (со скоростью 50 нл/с). Сделайте паузу на 5 секунд между инъекциями, чтобы обеспечить диффузию и минимизировать рефлюкс. После финальной инъекции подождите 30 секунд, прежде чем медленно убирать иглу. Повторите ту же процедуру в противоположном глазу, используя идентичные параметры, стараясь минимизировать травму и рефлюкс.
    9. Введите кетопрофен (10 мг/кг, подкожно) сразу после операции.
    10. Дайте мышам восстановиться как минимум 2 недели, чтобы обеспечить адекватную экспрессию вируса, прежде чем перевести их в психическое учреждение.
  2. Активность на управлении колёсами и администрирование CNO (рисунок 1A)
    1. Содержать мышей по отдельности в клетках с ходовыми колёсами. Фиксируйте активность движения колеса с помощью автоматизированной системы сбора данных.
    2. Заведённые мыши в цикле светло-темнота 12:12 в течение 4–7 дней. Подтвердите стабильность энтрейна, а затем переведите животных в постоянную темноту (DD).
    3. Определите начало активности с помощью программного обеспечения для анализа. Определим начало активности как CT12 у ночных грызунов. Рассчитывайте CT4 соответственно.
    4. На восьмой день при DD мышам делают внутрибрюшинные инъекции CNO (1 мг/кг) или физиологического раствора в CT4 при тусклом красном свете.
    5. Возвращайте животных в их домашние клетки и содержате их в постоянной темноте. Фиксируйте двигательную активность непрерывно в течение 8 дней.
    6. Определить начало активности и провести регрессионный анализ в периодах до и после инъекций. Рассчитайте фазовые сдвиги как разницу между проецируемым и наблюдаемым началом активности.
  3. Иммуногистохимия SCN c-Fos после химогенетической активации
    1. Приучение мышей к циклу свет-тьма 12:12 и выпуск в постоянную темноту. На второй день в DD проводите CNO на CT6. Перфузия животных через 30 минут после инъекции.
      Примечание: CT4 использовался в поведенческих экспериментах для минимизации вероятности расширения эффектов CNO в субъективную ночь, поскольку CNO может оставаться активным несколько часов. В отличие от этого, CT6 применялся для экспериментов с иммунокрашиванием с целью оценки острых эффектов CNO на циркадные часы, при этом животным перфузировались через 30 минут после инъекции.
    2. Вскрытие мозга и постфиксация 4% параформальдегида за ночь при 4 °C. Криопротектор в сахарозе 30%, пока ткань не опустится. Корональное сечение при 40 мкм.
    3. Инкубировать срезы в блокирующем растворе, затем провести инкубацию первичных антител ночью при 4 °C. Промывать и инкубировать вторичными антителами в течение 1 часа. Контрморилка с помощью DAPI и монтажных секций.
    4. Получайте изображения с помощью одинаковых настроек микроскопа. Обрабатывайте изображения с помощью программного обеспечения для анализа. Идентифицировать регионы, инфицированные AAV, по mCherry-положительным клеткам.

2. Спектральная стратегия

  1. Перенесите мышей дикого типа в центр поведения и поместите их индивидуально в клетки с ходовыми колёсами, как описано выше. Держите животных в постоянной темноте (DD) для мониторинга свободной циркадной активности.
  2. На 8-й день в DD, в циркадное время 6 (CT6), снимите клетку из светонепроницаемого шкафа и подвергите мышь 15-минутному световому импульсу.
  3. Подвергайте мышей либо синему световому импульсу (λmax = 470 нм; 1,8 × 1014–2,2 × 1014 фотонов/см 2/с), либо фиолетовому импульсу (λmax = 385 нм; 1,45 × 1014–3,3 × 1014 фотон/см2/с), измеряя интенсивность в центре и на всех четырёх углах клетки на уровне глаз животного.
  4. При обоих условиях длины волны держите мышей в их домашних клетках с удаленными верхняками. Разместить клетки прямо под фиксированным источником света так, чтобы центр светового луча был выровнен с центром клетки для обеспечения равномерного освещения.
  5. Немедленно возвращайте клетки в исходное положение в постоянной темноте после освещения. Продолжайте запись активности при движении колесо без перерыва для анализа фазовых сдвигов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мыши Opn4Cre/+, экспрессирующие AAV-DREADD, получавшие физиологический раствор в CT4, не проявили значительного фазового смещения активности движения колёс (n = 5; Рисунок 1B). В отличие от этого, введение CNO при CT4 приводило к значительной фазовой задержке начала активности (средние ± SEM: 5,03 ± 0,48 h; n = 5; Рисунок 1C, D), демонстрируя, что активация DREADD в это циркадное время меняет ритмы ло...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Результаты показывают, что активация ipRGC в субъективный день может вызывать циркадные фазовые сдвиги у мышей — время, обычно характеризующееся снижением чувствительности к фотической стимуляции. Химогенетический подход позволил селективно активировать ipRGC независимо от внешнего света и обеспечивал устойчивые фазовые задержки в поведении при движении колеса. Эта активация также вызывала острую экспрессию c-Fos в SCN, подтверждая активацию центрального циркадного кардиостимулятора. Эти...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

Авторы благодарят членов SLCR при NIMH и Tri-Lab по биологии мышей Университета Джонса Хопкинса за полезные обсуждения. Источники финансирования: грант Национального института психического здоровья  ZIAMH002964 (S.H.)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AAV2-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherryAddgene44361Cre-зависимый вирусный вектор, кодирующий возбудительный DREADD (hM3Dq), соединенный с mCherry для селективной активации ipRGC
Anti-c-Fos антитело (кролика моноклональное)Cell Signaling Technology2250SПервичное антитело, использующееся для обнаружения c-Fos в качестве маркера нейронной активации
Anti-tdTomato антитело (козье)LSBioLS-C340696Первичное антитело, использующееся для обнаружения экспрессии mCherry/tdTomato репортера
Синий LED драйверThorlabsLEDD1BБлок питания для управления интенсивностью и выходом синего LED
Источник синего LED светаThorlabsM470L5LED источник, излучающий свет синего цвета (λmax ≈ 470 нм) для фотичской стимуляции
Программное обеспечение ClockLabActimetricsВерсия 6.0.53Программное обеспечение для получения и анализа данных циркадной локомоторной активности
Клозапин-N-оксид (CNO)Sigma-AldrichC0832-5MGЛиганд, используемый для активации DREADD рецепторов hM3Dq in vivo
DAPIInvitrogen62248Флуоресцентное ядерное окрашивание для маркировки клеточных ядер
Донкее анти-козье Alexa Fluor 555InvitrogenA21432Флуоресцентное вторичное антитело для обнаружения первичных козьих антител
Донкее анти-кроличе Alexa Fluor 488InvitrogenA21206Флуоресцентное вторичное антитело для обнаружения первичных кроличьих антител
Fluoromount-GInvitrogen00-4958-02Монтажное средство, используемое для сохранения флуоресценции в тканевых секциях
Программное обеспечение ImageJ (Fiji)NIHВерсия 2.16.0/1.54gОткрытое программное обеспечение для обработки изображений и количественного анализа
Opn4cre мышиThe Jackson LaboratryRRID:IMSR_JAX:035925Мыши, используемые для хемогенетической активации
Фиолетовый LED драйверMightexSLA-1000-2Блок питания для управления выходом фиолетового LED
Источник фиолетового LED светаMightexBLS-LCS-0385-04-22LED источник, излучающий фиолетовый свет (λmax ≈ 385 нм) для длино-волновой специфической стимуляции
Дикого типа мышиThe Jackson LaboratryJackson штамм #101043Мыши, используемые для эксперимента с фиолетовым светом

Ссылки

  1. Hattar S, Liao HW, Takao M, Berson DM, Yau KW. Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science. 2002;295(5557):1065–70.
  2. Jones JR, Simon T, Lones L, Herzog ED. SCN VIP neurons are essential for normal light-mediated resetting of the circadian system. J Neurosci. 2018;38(37):7986–95.
  3. Coursey PJ. Daily light sensitivity rhythm in a rodent. Science. 1960;131:33–35.
  4. Kornhauser JM, Ginty DD, Greenberg ME, Mayo KE, Takahashi JS. Light entrainment and activation of signal transduction pathways in the SCN. Prog Brain Res. 1996;111:133–46.
  5. Ding JM, Weber ET, Faiman LE, Rea MA, Gillette MU. Resetting the biological clock: mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO. Science. 1994;266(5191):1713.
  6. Mintz EM, Gillespie CF, Price KM, Albers HE. Activation of NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus produces light-like phase shifts of the circadian clock in vivo. J Neurosci. 1999;19(12):5124–30.
  7. Shirakawa T, Moore RY. Glutamate shifts the phase of the circadian neuronal firing rhythm in the rat suprachiasmatic nucleus in vitro. Neurosci Lett. 1994;178(1):47–50.
  8. Shibata S, Watanabe A, Hamada T, Ono M, Watanabe S. N-methyl-D-aspartate induces phase shifts in circadian rhythm of neuronal activity of rat SCN in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 1994;267(2):R360–R364.
  9. Asai M, Yamaguchi S, Isejima H, Jonouchi M, Moriya T, et al. Visualization of mPer1 transcription in vitro: NMDA induces a rapid phase shift of mPer1 gene in cultured SCN. Curr Biol. 2001;11(19):1524–27.
  10. Sladek M, Sumova A. Modulation of NMDA-mediated clock resetting in the suprachiasmatic nuclei of mPer2 (Luc) mouse by endocannabinoids. Front Physiol. 2019;10:361.
  11. Shibata S, Moore RY. Neuropeptide Y and optic chiasm stimulation affect suprachiasmatic nucleus circadian function in vitro. Brain Res. 1993;615(1):95–100.
  12. Jones JR, Tackenberg MC, McMahon DG. Manipulating circadian clock neuron firing rate resets molecular circadian rhythms and behavior. Nat Neurosci. 2015;18(3):373–75.
  13. Kim S, McMahon DG. Light sets the brain’s daily clock by regional quickening and slowing of the molecular clockworks at dawn and dusk. Elife. 2021;10:e70137.
  14. de Vries MJ, Treep JA, de Pauw ES, Meijer JH. The effects of electrical stimulation of the optic nerves and anterior optic chiasm on the circadian activity rhythm of the Syrian hamster: involvement of excitatory amino acids. Brain Res. 1994;642(1-2):206–12.
  15. Rusak B, Groos G. Suprachiasmatic stimulation phase shifts rodent circadian rhythms. Science. 1982;215(4538):1407–09.
  16. Duy PQ, Komal R, Richardson ME, Hahm KS, Fernandez DC, et al. Light has diverse spatiotemporal molecular changes in the mouse suprachiasmatic nucleus. J Biol Rhythms. 2020;35(6):576–87.
  17. Liu A, Milner ES, Peng YR, Blume HA, Brown MC, et al. Encoding of environmental illumination by primate melanopsin neurons. Science. 2023;379(6630):376–81.
  18. Milner ES, Do MTH. A population representation of absolute light intensity in the mammalian retina. Cell. 2017;171(4):865–876.e16.
  19. Komal R, Beier C, Nath A, et al. ipRGC properties prevent light from shifting the SCN clock during daytime. Nature. 2026;650(8103):942–50. .
  20. Jewett ME, Rimmer DW, Duffy JF, Klerman EB, Kronauer RE, et al. Human circadian pacemaker is sensitive to light throughout subjective day without evidence of transients. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 1997;273(5):R1800–R1809.
  21. Revell VL, Molina TA, Eastman CI. Human phase response curve to intermittent blue light using a commercially available device. J Physiol. 2012;590(19):4859–68.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Хемогенетическая активацияспектральная стимуляцияретиногипоталамический путьвнутренне светочувствительные ганглиозные клетки сетчаткиактивация DREADDстимуляция фиолетовым светомиммуногистохимия c-Fosлокомоторная активностьциркадная пластичность
Индукция дневных циркадных фазовых сдвигов с помощью хемогенетических и спектральных подходов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.