Генерация транс-митохондриальных кибридов на основе тромбоцитов пациентов с мтДНК: эффективный протокол оптимизации отбора колоний и функциональной валидации

Краткое содержание

Мы описываем оптимизированный протокол генерации транс-митохондриальных кибридов из тромбоцитов пациентов с мтДНК, делая акцент на параметрах роста и изоляции колоний. Этот подход позволяет изучать варианты митохондриальной ДНК на переменных уровнях гетероплазмы в общем ядерном фоне для количественной оценки их функциональной значимости для ферментативной активности цепочки транспорта электронов и интегрированной дыхательной емкости.

Аннотация

Генерация клеточных линий трансмитохондриальных кибридов представляет собой золотой стандарт для определения патогенности, позволяя проводить биохимический анализ специфического варианта митохондриальной ДНК (mtDNA), представляющего интерес, на высоких и низких процентах (уровнях гетероплазмы) в рамках идентичного фона мтДНК и ядерного генома. Исторически процесс генерации кибридов был утомительным и плохо эффективным. Здесь мы описываем высокоэффективный и результативный протокол создания транс-митохондриальных линий кибридных клеток путём слияния человеческих тромбоцитов со стандартной линейкой остеосаркомы 143B для создания изогенного ядра с истощением мтДНК (клеток^{Rho 0} ). Клеточные изоляты захватывают данный геном митохондриальной ДНК, представляющий интерес, чтобы установить стабильные клеточные линии с разной степенью гетероплазмы или сравнить дивергентные эффекты различных митохондриальных гаплогрупп. Поскольку кибриды у пациентов с митохондриями может быть сложнее установить с помощью стандартных протоколов, нынешняя методология сосредоточена на выделении вариантов мтДНК, где нарушена активность цепи транспорта электронов. Здесь мы демонстрируем, что методы отбора колоний сокращают время и улучшают выход при образовании высокоуровневых гетероплазматных мтДНК-мутантных линий кибридов. Представлен кейс-стади генерации кибридов для варианта неизвестного значения в MT-ND1, m.3985G>A (p.E227K). Мы анализируем эффективность процесса генерации кибридов с помощью этого протокола и проводим функциональные исследования с помощью высокоразрешающей респирометрии. Высокоуровневая гетероплазма MT-ND1 m.3985G>A, сгенерированные по этому протоколу, имеют нарушенное комплексное I-зависимое митохондриальное дыхание по сравнению с дикой контролью, что свидетельствует о том, что m.3985G>A вероятно, патогенен.

Введение

Установление патогенности мутаций митохондриальной ДНК (mtDNA) сложно из-за их редкости, гетероплазмы, включающей различные уровни мутировавшихся и диких геномов мтДНК в различных тканях, разнообразных патофизиологических механизмов и сложных взаимодействий с фонами ядерного^генома 1,2,3,4 . По этим причинам трансмитохондриальные клеточные линии остаются золотым стандартом для установления патогенности вариантов мтДНК, где «кибриды» представляют собой слияние ядра одной клетки с митохондриями другой^{клетки 5,6,7,8,9,10} (Рисунок 1). Линии клеток кибрида содержат изогенный ядерный фон и митохондрии с определённым процентом гетероплазмы для исследуемого варианта^{мтДНК 11,12}. Таким образом, функциональные анализы, такие как респирометрия (с помощью полярографии) или активность ферментов транспорта электронов (с помощью спектрофотометрии) могут проводиться в линиях кибрида с уровнем гетероплазмы от 0% до 100%, чтобы определить потенциальные патогенные эффекты конкретного варианта мтДНК, а также относительное влияние митохондриальных гаплогрупп, которые могут различаться между линиями^{кибрида 1}. Другие типы клеток могут использоваться для изучения патогенности и лучше всего дополнять генерацию кибридов и функциональный анализ, поскольку у каждого типа клеток есть свои преимущества и недостатки. Фибробласты пациента напрямую происходят от пациента, но ограничены наследственной гетероплазмой и не имеют изогенного ядерного контроля для устранения ядерных генных эффектов. Редактирование мтДНК становится всё более популярным, но страдает от нецелевого редактирования и ограниченного редактируемого участка в^{mtDNA 13}. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) можно дифференцировать для изучения влияния мутации на разные типы клеток, такие как нейроны и клетки сетчаточных ганглиев, но индукция плюрипотентности может привести к потере интересующего варианта mtDNA или к появлению дополнительных de novo ^{вариантов 14}. Исследование Cybrid предполагает создание более искусственной системы, основанной на ядерном фоне раковой клеточной линии (классически остеосаркома 143B), но классически хорошо развивается, что делает её удобной для использования в высокопроизводительных скрининговых исследованиях кандидатов на вмешательства. Ограничения для генерации кибридов с высоким уровнем гетероплазмы включают качество тромбоцитов, стартовую гетероплазму и селективные недостатки мутантных митохондрий, которые подробно обсуждаются в данном протоколе.

Хотя генерация кибридов является золотым стандартом для функционального определения патогенности вариантов мтДНК, немногие лаборатории создают кибриды для изучения митохондриальных^{заболеваний} 9,10,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Вместо этого создаётся больше кибридов для изучения рака и^{возраста 28,29} лет. Здесь мы используем клиническое исследование пациентов с подозреваемым заболеванием митохондрий для демонстрации стратегий оптимизации, разработанных для облегчения генерации кибридов из тромбоцитов пациентов с мтДНК, включая процессы отбора и клеточные препараты, необходимые для установления клеточных линий кибрида с высоким и низким уровнем гетероплазмы для целевого варианта мтДНК. В частности, мы демонстрируем методологию создания линий кибридных клеток для субъединицы комплекса I (CI) MT-ND1 варианта m.3985G>A, в ходе которой проводим биохимические исследования, демонстрирующие патогенную природу этого варианта. Рисунок 2 показывает хронологию генерации кибридов, где основные методологические этапы включают методы слияния, отбора и изоляции для получения отдельных колоний.

Протокол

Тромбоциты крови были получены согласно исследованию IRB Детской больницы Филадельфии (CHOP) 08-6177.

1. Подготовка тромбоцитов

1. День 1: Забирайте кровь в трубки с кислотным цитратом и декстрозой при заборе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь должна быть немедленно нанесена на ротатор. В идеале тромбоциты собирают максимум через 4 часа после забора крови.
2. Запишите объём крови. Рекомендуется объём крови 5–6 мл.
3. Центрифуга крови при 200 × г в течение 20 минут при 12 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование при 12 °C сохраняет целостность образца и предотвращает активацию тромбоцитов.
4. Перенесите супернатант (плазму) в новую центрифугную трубку.
5. Запишите объём плазмы.
6. Центрифугуйте плазму при 1500 × г в течение 20 минут при 12 °C.
7. Запишите оценочный объём гранул тромбоцитов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком много тромбоцитов может быть громоздким в этом протоколе. После слияния, при покрытии клеток^{Rho 0} и тромбоцитов, избыток тромбоцитов может прилипать к дну колбы и препятствовать присоединению клеток^{Rho 0} . Рекомендуется использовать менее 50 мкл объёма гранул тромбоцитов для сраяния. Избыточные тромбоциты можно заморозить, расщепив тромбоциты следующим этапом.
8. Удалите супернатант.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если гранула большая, её удаление можно провести аспирацией. Количество тромбоцитов у пациентов иногда резко сокращается и не сильно липкое. В таком случае используйте пипетку для медленного удаления плазмы.
9. Если продолжать с новыми тромбоцитами, суспензируйте гранулу в 1 мл модификации Spinner из минимально необходимой среды Eagle's Medium (SMEM) и перенесите в микроцентрифуговую трубку.
10. При заморозке ре-суспензировать гранулы (тромбоциты) в 1,05 мл SMEM и 450 мкл раствора заморозки тромбоцитов (350 мкл сыворотки плода крупного рогатого скота [FBS] + 100 мкл диметилсульфоксида [DMSO]).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тромбоциты некоторых пациентов нестабильны во время процедуры замораживания, и высокомутантный кибрид не может быть получен после замораживания. Рекомендуется использовать свежий препарат.
11. Если клетки^{Rho 0} не готовы вовремя, установите тромбоциты при 37 °C с лёгким встряхиванием при 60 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конечном итоге лучше совместить готовность тромбоцитов и клеток^Rho 0 одновременно. Не рекомендуется ждать больше 2 часов.

2. Подготовка ячеек ^{Rho 0}

1. Используйте либо свежеразмороженные клетки остеосаркомы 143B^{Rho 0} , либо клетки^{Rho 0} , которые росли почти до слияния.
   ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется использовать клетки^{Rho 0} , которые росли в инкубаторе почти до слияния. Можно использовать свежеразмороженные клетки^{Rho 0} , и рекомендуется использовать замороженный флакон с клетками^{Rho 0} с высокой плотностью клеток. Дайте клеткам прикрепиться в течение двух и более часов до слияния.
2. Помой колбу T75 5 мл PBS.
3. Добавьте 1 мл трипсина-ЭДТА 0,25%, чтобы покрыть клетки^{Rho 0} .
4. Инкубировать 5 минут при 37 °C.
5. После покачивания фляжки промыйте дно фляжки 5 мл SMEM.
6. Соберите клетки^{Rho 0} в коническую трубку объёмом 15 мл.
7. Центрифугу при 200 × г в течение 5 минут для концентрации и измерения количества клеток.
8. Удалите супернатант и снова суспензируйте в 1 мл SMEM.
9. Считай клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале для каждого слияния должно быть 1,5 миллиона клеток; однако успешные слияния были проведены всего с 30 000 клеток.
10. Аликвотируйте 1,5 миллиона клеток в 1,5 микроцентрифугных трубок и увеличите объём до 1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно имейте дополнительную трубку «имитационного синтеза». Эта трубка будет содержать только клетки^{Rho 0} и будет использоваться для управления процессом отбора.
11. Центрифугуйте тромбоциты при 1700 × г в течение 15 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки^{Rho 0} чувствительны к низким температурам.
12. Удалите супернатант из тромбоцитов.
13. Добавьте 1 мл клеток^{Rho 0} поверх гранулы тромбоцитов.
14. Центрифугуйте клетки^{Rho 0} и тромбоциты при 200 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.

3. Слияние

1. Удалите супернатант из клеток^{Rho 0} и тромбоцитарную гранулу.
2. Добавьте 150 мкл буфера слияния (50% полиэтиленгликоль [ПЭГ]/10% ДМСО) и тритурируйте в течение 90 секунд для повторной суспензии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые гранулы довольно липкие, их нужно перемешивать и разбивать вручную, помимо пипетирования вверх и вниз. Записывайте, липкая ли пуля.
3. Добавьте 12 мл среды Cybrid (DMEM) + 10% FBS + 50 мкг/мл уридина в колбу T75.
4. Добавьте 1 мл сросшихся тромбоцитов и клетки^{Rho 0} в колбу.
5. Клетки инкубируются при 37 °C с 5%_CO2 при высокой влажности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы роста клеток находятся в таких условиях.

4. Рост

1. День 2: Удалите медиа Cybrid и добавьте свежие 12 мл среды Cybrid + 10% FBS + 50 мкг/мл уридина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки^{Rho 0} включают мтДНК примерно через неделю.
2. День 5: Удалите медиа Cybrid и добавьте свежие 12 мл среды Cybrid + 10% FBS + 50 мкг/мл уридина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки^Rho 0 находятся на 80% слияния, разделите их на две колбы.

5. Отбор

1. День 8: Удалите материал и промыйте клетки 5 мл PBS.
2. Удалите PBS и добавьте 1 мл трипсина.
3. Накройте дно колбы трипсином и инкубуйте 5 минут при 37 °C.
4. Добавьте 5 мл среды Cybrid + 10% FBS + 50 мкг/мл уридина.
5. Считай клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отбор должен начинаться с 10% слияния, то есть 125 000 клеток в чашке Петри T75 или обработанной с помощью тканевых культур. Рекомендуется использовать чашки Петри, если предпочитается метод отбора колонии. Используйте T75, если используете метод разбавления.
6. Добавьте 125 000 ячеек в соответствующий контейнер и добавьте остальную часть объёма до 12 мл с помощью медиа Selection (DMEM).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Селективные среды предназначены для разделения сросшихся клеток 143B с митохондриями от клеток^{Rho 0} . Клетки^{Rho 0} требуют пирувата и уридина для выживания. Диализованный FBS не содержит пирувата и уридина и следует использовать только для отбора. Если возможно, используйте два разных медиа для селекции. Один должен быть на 10% диализованном FBS, а другой — менее ограничивающим рост, например, 20% диализованного FBS + 50 мкг/мл уридина. Параллельно для тяжелых мутантов предлагается менее ограничивающая среда отбора.
7. Заморозьте оставшиеся клетки в двух криовиалах с 1 мл раствора для замораживания в каждую.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это ячейки предварительного отбора, и разные варианты можно попробовать позже.
8. Меняйте носители через день примерно неделю.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки^{Rho 0} будут плавать при смерти и смываются после смены среды. Используйте «имитации» слиятельных клеток, чтобы определить, когда отбор завершён (больше клеток в колбе нет). Эта колба будет полностью пустой, потому что все ячейки^{Rho 0} будут смыты. Рекомендуется подождать ещё день, даже когда фляга пуста, потому что сросшиеся клетки могут обеспечить питательные вещества в среде, помогая другим клеткам^{Rho 0} сохраняться в колбе. Если клетки вырастают до слияния более 20%, разделяйте и перепластинывайте клетки. Дальнейший рост замаскирует отбор.

6. Метод роста селекции колонии

1. Выращивайте колонии до тех пор, пока они не станут видимы глазом, с помощью Cybrid media + 20% FBS + 50 мкг/мл уридина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наклоните тарелку и поднимите её к свету. Колонии выглядят как облачные круги. Под микроскопом между колониями не должно быть много фоновых клеток.
2. Обведите независимые, не перекрывающиеся колонии с маркером на дне фляжки, держа их к свету.
3. Используйте P20 для одновременного соскреба (механически нарушающих клеток, прикреплённых к дну колбы) и одновременно вдых 20 мкл внутри нарисованного круга, чтобы поместить ячейки из выбранной колонии в кончик P20.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ручное соскребание отсоединяет клетки, а поднимание 20 мкл — это собирание ячеек в кончике пипетки.
4. Поместить каждую колонию в отдельную колодцу в плите на 96 колодцах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Преимущество этого метода в том, что клетки 143B хорошо растут вместе, поэтому проблем с ростом не должно возникнуть и результат будет быстрее. Недостаток в том, что население может быть смешанным.

7. Метод роста с разбавлением

1. Когда слияние клеток достигает 75% в среде Cybrid + 20% FBS + 50 мкг/мл уридина, промывайте клетки 5 мл PBS.
2. Удалите PBS и добавьте 1 мл трипсина.
3. Накройте дно колбы трипсином и инкубуйте 5 минут при 37 °C.
4. Добавьте 5 мл среды Cybrid + 20% FBS + 50 мкг/мл уридина.
5. Считай клетки.
6. Добавьте 1 × 10⁵ клеток в 20 мл среды Cybrid + 20% FBS + 50 мкг/мл уридина до 50 мл конической трубки 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это 5000 ячеек/мл, что будет составлять 500 элементов в 100 мкл при покрытии в пластине с 96 ячелинами.
7. Приготовьте коническую трубку объёмом 50 мл с разбавлением в 100 раз (200 мкл из трубки 1 на 20 мл среды Cybrid + 20% FBS + 50 мкг/мл уридина).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это примерно 5 ячеек на каждую скважину.
8. Приготовьте коническую трубку 3 объемом 50 мл с разбавкой 1:1 (10 мл из трубки 2 в 10 мл среды Cybrid + 20% FBS + 50 мкг/мл уридина).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это примерно 2,5 клетки на одну скважину.
9. Приготовьте коническую трубку 4 объемом 50 мл с разбавением 1:1 (10 мл трубки 3 в 10 мл среды Cybrid + 20% FBS + 50 мкг/мл уридина).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это примерно одна ячейка на каждую скважину.
10. Пластинчатые трубки 2, 3 и 4 в пластинах с 96 лунками по 100 мкл каждая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно смешайте клетки перед подачкой. Трудно проверить день игры, чтобы понять, есть ли по одной ячейке в каждой скважине, потому что клетки должны опуститься на дно и прикрепиться. Преимущество этого метода в том, что одна клетка вырастает в колонию, что гарантирует отсутствие смешанного фона. Недостаток в том, что тяжёлые мутанты могут не выжить в изоляции.
11. На следующий день вычеркните колодцы, в которых явно больше одной ячейки на каждую скважину.
12. Через несколько дней проверьте колодцы ещё раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии должны быть, и особенно заметно, есть ли отдельные клетки у краев колодцев. Если колоний несколько, удаляйте эти колодцы. Если ячейки нет, удалите колодец.

8. Рост

1. Начинайте с пластины на 96 лунок и перемещайте ячейки на более крупные пластины поэтапно по мере необходимости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки лучше всего растут при высокой плотности, и недостаток переноса клеток может привести к смерти. Всегда оставляйте предыдущую пластину с некоторыми ячейками и отмечайте, из какого источника пришёл, чтобы при необходимости можно было вернуться. Важно, что 143B-клетки погибают и отделяются при перераспределении, поэтому проверяйте эти клетки каждый день.

9. Генетическое подтверждение

1. Центрифугуйте алицитированные клетки при 450 ×г в течение 5 минут.
2. Удалите медиа.
3. Добавьте 5 мкл буфера для экстракции ДНК (50 мМ NaOH).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это число может измениться, если ячеек много. Значительные клеточные гранулы могут содержаться в 10 мкл буфера.
4. Инкубировать при 95 °C в течение 30 минут.
5. Добавьте эквивалентный объём буфера стабилизации ДНК (0,1 м Tris-HCl; pH 8) в буфер экстракции.
6. Проведите полимеразную цепную реакцию (ПЦР) согласно рекомендациям фермента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые мутанты могут использовать рестрикционные ферменты для различия между контрольными и пациентными клетками. Другие точечные мутации невозможно отличить и требуют последовательности. В этом случае важно использовать ПЦР-смеси без красителей для получения качественных результатов. Можно использовать секвенирование Сэнгера и секвенирование следующего поколения. 2,5 мкл ДНК достаточно для реакции 25 мкл.
7. Используйте ПЦР-ампликоны, специфичные для этой мутации, для секвенирования Сэнгера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ПЦР-ампликоны были отправлены для секвенирования Сэнгера. Уровень гетероплазмы мутаций был подтверждён как после расширения клона, так и после функционального анализа.

10. Высокоразрешающая респирометрия с использованием респирометрии высокого разрешения

1. Проводите калибровку воздуха в соответствии с рекомендациями респирометра (например, инструментов Oroboros).
2. Мойте кибриды в термофляге T75 с PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки не должны быть чрезмерно смежными; 70%–80% слияние идеально подходит.
3. Добавьте 1 мл трипсина и инкубуйте 4 минуты.
4. Добавьте 5 мл среды Cybrid и ячейки подсчёта.
5. Добавьте 500 000 клеток в трубку, чтобы центрифугировать при 450 × г в течение 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Номер ячейки и объёмы респирометра соответствуют камере 0,5 мл.
6. Промывайте ячейки с помощью ресуспензии с помощью PBS и снова центрифугой.
7. Суспензировать ячейки в 510 мкл буфера MiR05 и добавить в пустую камеру.
8. После стабилизации добавьте 0,65 мкл дигитонина (50 мг/мл), 0,8 мкл малата (2,5 м) и 2 мкл пирувата (2,5 м).
   ПРИМЕЧАНИЕ: До добавления дигитонина здесь проводится измерение базального дыхания. Все последующие шаги следует выполнять после стабилизации.
9. Добавьте 12 мкл аденозиндифосфата (АДФ) (0,25 м).
10. Добавьте 4 мкл глутамата (2,5 м).
11. Добавьте 12 мкл сукцината (1,25 м).
12. Добавьте 1 мкл олигомицина (1 мг/мл).
13. Добавьте 1 мкл карбонилцианида-p-трифторметоксифенилгидразона [FCCP] (0,2 мМ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Титруйте с множеством добавлений, пока не будет наблюдаться дальнейшее увеличение (обычно 3–5).
14. Добавьте 1 мкл ротенона (2 мм).
15. Добавьте 1 мкл антимицина A (1 мг/мл).
16. Добавьте 0,5 мкл аскорбата (0,8 м) и 0,5 мкл тетраметилфенилендиамина [TMPD] (0,2 м).
17. Откройте камеру с помощью прокладки на 20 минут.
18. Закройте камеру и стабилизируйтесь на 5 минут.
19. Добавьте 22,5 мкл азида (4 м).
20. Собирайте клетки для количественного определения белков с помощью теста на бицинхониновую кислоту (BCA).
21. Выполните расчёты после стабилизации скорости потребления кислорода и нормализуйте по белкам. Базальное дыхание — это стабилизированная скорость потребления кислорода после добавления клеток в камеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все остальные измерения проводятся после указанного субстрата или ингибитора.
22. Рассчитайте_{ОКСФОС ДИ}: (глутамат-антимицин A)/(FCCP-антимицин A).
23. Рассчитайте_{OXPHOS CI+CII}: (Сукцинат-антимицин A)/(FCCP-антимицин A).
24. Рассчитайте_{ETS CI+CII}: (FCCP-антимицин A).
25. Рассчитайте_{ETS CII}: (Ротенон-антимицин A)/(FCCP-антимицин A).
26. Рассчитайте_{LEAK CI+CII}: (олигомицин-антимицин A)/(FCCP-антимицин A).
27. Рассчитайте_{OXPHOS CIV}: (TMPD/ASC-Azide)/(FCCP-антимицин A).
28. Используйте как минимум 4–6 биологических реплик для измерений респирометрии.

Результаты

Чтобы продемонстрировать методологические различия и путь к оптимизации протокола, мы представляем результаты генерации кибридов у одного пациента с подозрением на заболевание митохондрий, у которого есть вариант неизвестного значения (VUS) в MT-ND1 комплекса I (CI) в цепочке переноса электронов. После клинического секвенирования генома мтДНК следующего поколения в нескольких тканях в двух различных лабораториях, одобренных CLIA, единственным вариантом, подозрительным на патоген...

Обсуждение

Здесь мы представляем высокоэффективный протокол для создания транс-митохондриальных клеточных линий из тромбоцитов пациентов с мтДНК. Мы демонстрируем применимость на примере варианта MT-ND1 неопределённого значения, а также важность тщательного рассмотрения параметров роста и отбора. После оптимизации этих основных проблем можно успешно отобрать кибридов с вариантами митохондральной ДНК, которые могут нарушать функцию дыхательных цепей. Этот протокол может использоваться для г...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ADP	Sigma Aldrich	A5285-1G
Антимицин А	Sigma Aldrich	A8674-25MG
Аскорбат	Sigma Aldrich	11140-250G
Азид	Sigma Aldrich	S2002-100G
Диализованная FBS	Fisher Scientific	35071CV
Дигитонин	Sigma Aldrich	D141-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	Среда для цибрид
DMEM	Corning	10-017-CM	Среда для селекции
FBS	Cytiva	SH30910.03
FCCP	Apex Bio	B5004
Глутамат	Sigma Aldrich	G5889-100G
Graphpad Prism	Graphpad
Hybri-Max	Sigma Aldrich	P7306	буфер для фузии
Малямат	Sigma Aldrich	M1000-100G
Буфер MiR05	Oroboros Instruments	60101-01
O2K респиратор	Oroboros Instruments	C-0050
Олигомицин	Sigma Aldrich	O4876-5MG
Пируват	Sigma Aldrich	P2256-100G
Ротенон	Sigma Aldrich	R8875-1G
SMEM	Sigma	M8167
Сукцинат	Sigma Aldrich	S2378-100G
TMPD	Sigma Aldrich	T3134-5G
Трипсин-ЭДТА 0,25%	Thermo Scientific	25200056
Уридин	Sigma Aldrich	U3750-25G