Методическая статья

Кардиоонкологическая модель антрациклин-индуцированной кардиотоксичности на иммунокомпетентных мышах с опухолями молочной железы

6 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71633

⸱

1 октября 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1INSERM UMR-S 942 MASCOT, Cardiovascular Biomarkers, Pathophysiology, and Therapeutic Strategies - CIRCUS, Paris Cité University, 2Medical and Surgical Intensive Care Unit, University Hospital Avicenne, AP-HP

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Клинически релевантные мышиные модели кардиотоксичности, вызванной антрациклинами, встречаются редко. В данной работе предлагается модель с использованием иммунокомпетентных мышей с опухолью, получающих противораковую терапию, что имитирует клинические протоколы лечения пациентов с раком.

Аннотация

Недавнее обновление Европейского общества кардиологов, касающееся доклинических моделей сердечной дисфункции, связанной с противоопухолевой терапией, подчеркивает острую необходимость в более репрезентативных и трансляционных моделях in vivo. Особо отмечается необходимость разработки моделей с использованием иммунокомпетентных животных с опухолями, включая несколько линий и оба пола, чтобы более точно воспроизвести гетерогенность, наблюдаемую в клинических популяциях. В связи с этим была создана клинически значимая модель антрациклин-индуцированной кардиотоксичности (AIC) у животных с опухолями молочной железы. В зависимости от генетического фона мышей, клетки 4T1Luc (200k клеток) или клетки PY8119 (200k клеток) вводились подкожно в нижнюю молочную железу самцам и самкам мышей Balb/c или C57Bl/6J соответственно. Рост опухоли контролировали с помощью биолюминесценции и пальпации. Когда опухолевая масса стала определяться при пальпации (через 2 недели после инъекции опухолевых клеток), животным начинали противоопухолевое лечение доксорубицином. Толерантность мышей к доксорубицину зависела от линии. Функцию сердца оценивали до начала протокола (исходный уровень) и еженедельно в дальнейшем с помощью ультразвукового исследования сердца у мышей, находящихся под кетаминовой анестезией. Кардиотоксичность определяли как снижение фракционного сокращения левого желудочка как минимум на 10% от исходного уровня, при абсолютном значении <50% и частоте сердечных сокращений >300 BPM. Протокол оказался воспроизводимым с успехом развития опухоли 99% и выживаемостью мышей >80%. Кардиотоксичность наблюдалась у >90% пролеченных мышей с опухолью и при применении доксорубицина.

Введение

Кардиоонкология направлена на улучшение сердечно-сосудистых исходов у пациентов с раком до, во время и после химиотерапии. Доклинические модели сыграли огромную роль в более глубоком понимании взаимодействия между этими двумя заболеваниями. Недавно в исследовании, изменившем парадигму, было замечено, что у мышей, предрасположенных к спонтанным полипам кишечника, после инфаркта миокарда и периода сердечной недостаточности (СН) развивалось большее количество таких опухолей, что продемонстрировало прямое влияние сердечно-сосудистого события на рост опухоли1. С тех пор во многих исследованиях сообщалось о схожих результатах для различных типов опухолей и линий мышей, при этом часто упоминались конкретные молекулярные пути или белки, что подкрепляет концепцию о том, что прогрессирование рака провоцируется сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ)2,3,4,5.

И наоборот, влияние рака на риск развития сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) изучается уже несколько десятилетий. Эпидемиологические данные показывают, что люди, пережившие рак, чаще страдают ССЗ как из-за общих факторов риска этих двух заболеваний, так и из-за известной различной токсичности противоопухолевых методов лечения6,7,8,9,10. В доклинических исследованиях обычно использовались модели кахексии, индуцированной раком, для выявления специфических мишеней, модуляция которых у людей могла бы улучшить долгосрочные сердечно-сосудистые исходы11,12,13,14. Однако можно утверждать, что такие модели вряд ли отражают типичную клиническую ситуацию, поскольку пациенты часто получают лечение до развития этого терминального онкологического синдрома, хотя предполагается, что общая кахексия по-прежнему вносит значительный вклад в общую смертность от рака15.

В первых рекомендациях по кардиоонкологии Европейского общества кардиологии (ESC) делается вывод о необходимости дальнейших исследований для лучшего понимания взаимосвязи между раком и сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ)16. В частности, в недавнем обновлении рабочей группы ESC по кардиоонкологии было заявлено, что доклинические исследования имеют первостепенное значение для устранения этого пробела в знаниях, особенно при использовании моделей на животных с опухолями17. Кроме того, необходима более тесная корреляция между доклиническими и клиническими исследованиями, так как большинство современных клинических исследований проводятся с методами противоопухолевой терапии, которые недостаточно изучены в доклинических условиях18.

Антрациклины (AC), такие как доксорубицин (Dox), широко применяются при химиотерапии большого количества солидных и гематологических опухолей. Несмотря на доступность более современных методов терапии, их дешевизна, хорошо задокументированные побочные эффекты и очевидная эффективность приведут к дальнейшему использованию этих препаратов еще на протяжении многих лет19,20. Огромный объем данных свидетельствует о том, что AC вызывают дозозависимую кардиотоксичность, которая проявляется главным образом в виде дисфункции левого желудочка; это является одним из основных ограничивающих факторов их клинического применения в настоящее время и часто вызывает серьезные опасения у кардиоонкологов21,22. Основная часть этих данных получена в ходе исследований рака молочной железы в связи с его высокой частотой встречаемости у людей, однако клинические исследования лимфом, рака легких и лейкозов дают аналогичные результаты23. В связи с этим на протяжении нескольких десятилетий проводятся доклинические исследования с целью изучения патофизиологических механизмов кардиотоксичности, индуцированной антрациклинами (AIC), которые показали, что в этом процессе обычно задействованы окислительный стресс, прямое и косвенное повреждение ДНК, ферроптоз и повреждение митохондрий23,24.

Тем не менее, данные о способах профилактики или лечения AIC на самом деле ограничены. Общепринятые препараты для лечения HF тестировались в клинических исследованиях с противоречивыми результатами, а определить оптимальное время применения немногих потенциальных кандидатов оказалось затруднительно21,23,25,26,27,28. Дексразоксан, препарат, модулирующий обмен железа, показал многообещающие результаты в предотвращении AIC, но в настоящее время не используется систематически21. Введение AC в формах, отличных от свободных в крови (например, инкапсулированных в липосомы), также продемонстрировало многообещающие результаты, однако замена традиционных AC все еще затруднена, частично из-за их стоимости21.

Одним из объяснений данной ситуации является отсутствие клинически релевантных животных моделей для изучения AIC.17У людей доксорубицин вводится постепенно в течение определенного времени. посредством повторные инъекции, при этом большая часть AIC наблюдается в течение первого года после лечения. Однако в литературе отмечается значительная вариативность протоколов работы с животными, что показано в недавно опубликованном обзоре29Классическим примером модели острой кардиотоксичности являются мыши без опухолей, получившие однократную инъекцию доксорубицина (Dox) в дозе 20 мг/кг.30В типичной модели хронической кардиотоксичности во многих исследованиях описывается использование мышей без опухолей, получающих по одной инъекции доксорубицина в дозе 5 мг/кг один раз в неделю до достижения общей кумулятивной дозы 20 мг/кг.29,31Данная модель хронической кардиотоксичности может также наблюдаться у животных с опухолями при той же дозе доксорубицина; однако в литературе подобные случаи встречаются крайне редко.29,32.

Для восполнения этого пробела в знаниях была создана прагматичная и клинически значимая модель иммунокомпетентных мышей с опухолью молочной железы для изучения AIC, а именно на мышах линии Balb/c с опухолью 4T1; также была подтверждена надежность данной модели на мышах линии C57Bl/6J с опухолью PY8119. Последний случай, насколько известно авторам, является первым примером создания кардиоонкологической модели тройного отрицательного рака молочной железы на линии C57Bl/6J. Точное воспроизведение роста опухоли через Количественная оценка биолюминесценции была проведена до введения животным доксорубицина (Dox), который проявил кардиотоксичность, а протокол забора органов был реализован для изучения микроокружения опухоли одновременно с кардиоонкологическим экспериментом. Кроме того, были отмечены результаты, сходные с описанными в литературе данными о чувствительности в зависимости от линии и пола. Ожидается, что данная работа будет способствовать стандартизации и совершенствованию протоколов работы с животными в будущих кардиоонкологических исследованиях, поскольку мыши линии C57Bl/6J представляют высокую ценность благодаря высокому уровню выживаемости в экспериментах по индуцированному инфаркту миокарда (AIC).29.

Преимуществом предлагаемого метода является использование линии C57Bl/6J, которая легко поддается генетическим модификациям, имеет хорошо охарактеризованный геном, доступна по цене и толерантна к высоким кумулятивным дозам AC29,33,34. Если для конкретного исследования с AC требуется нокаут гена, данная модель хорошо подходит для этой цели. Более того, использование тройного негативного рака молочной железы, полученного от этой линии, представляет трансляционный интерес, поскольку женщины с тройным негативным раком молочной железы являются теми пациентами, которые с наибольшей вероятностью получают AC и имеют самый неблагоприятный прогноз35. Использование этой модели, вероятно, расширит знания об AIC именно для таких пациентов.

Преимущество данной модели также заключается в том, что мыши подвергаются предварительному воздействию опухоли, которая может оказывать реальное влияние на сердечно-сосудистое ремоделирование36,37. Кроме того, эта модель занимает промежуточное положение между острыми и полностью хроническими моделями AIC, предоставляя возможность продлить период наблюдения за животными благодаря их высокому уровню выживаемости, что может быть весьма ценным при рассмотрении других циклов AC.

Однако данная модель, вероятно, не является наиболее подходящей для детальной характеристики опухоли в конце протокола из-за прагматичного подхода к инокуляции опухоли. Если это имеет центральное значение для научной гипотезы, следует использовать модифицированный вариант введения опухолевых клеток. Кроме того, инъекция клеток 4T1 мышам линии Balb/c представляет собой общепринятую модель для более онкологического подхода, например, для изучения метастазирования; этот метод здесь не описан, но его следует учитывать, если метастазирование существенно для решаемого научного вопроса38. Данная модель реализуется на взрослых мышах; однако, если целью является изучение AIC в педиатрическом контексте, следует рассмотреть использование более молодых мышей, реакция которых на данный протокол в этой работе не изучалась.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с требованиями местного комитета по этике работы с животными (Lariboisière-Villemin) и были одобрены Министерством высшего образования и исследований Франции (MESRI) под номером протокола APAFIS 46086. При разработке протокола учитывались принципы 3R. Мыши линий Balb/c и C57Bl/6J были приобретены у таких производителей животных, как Janvier Labs или Envigo. Согласно данному протоколу, возраст мышей на момент включения в исследование составлял от 10 до 18 недель, что соответствует молодым взрослым особям, по аналогии с женщинами, страдающими трижды негативным раком молочной железы. Животных содержали группами по 2–5 особей в помещении с 12-часовым циклом свет/темнота и температурой воздуха от 20 °C и 24 °Cи влажностью от 30% до 70%. Вода и корм предоставлялись в свободном доступе ad libitumВ ходе выполнения протокола соблюдались гуманные конечные точки, определенные до начала работы, как описано в Дополнительная таблица 1Для обеспечения безопасности оператора используйте фильтр для изофлурана для сбора отработанного газа. При работе с животными соблюдайте осторожность, на каждом этапе данного протокола используя перчатки и защитные очки. Обращение со всеми опасными материалами должно осуществляться в соответствии с местными нормативными актами учреждения; в данной работе все контаминированные образцы (кровь, иглы, флаконы с доксорубицином и т. д.) утилизировались в контейнеры для биоопасных медицинских отходов. Обзор протокола представлен на Рисунок 1АПеречень используемых реагентов и оборудования приведен в Перечень материалов.

1. Неделя 0: Подготовка клеток и их введение животному

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы описаны для клеток 4T1Luc и были идентичны при использовании клеток PY8119. Тем не менее, процедуру следует адаптировать для каждой клеточной линии в соответствии с рекомендациями производителя. Для оптимизации протокола один человек может заниматься подготовкой клеток, а другой — подготовкой животных.

  1. При получении конфлюэнтной клеточной культуры в флаконе (конфлюэнтность 80%–90%) добавьте 3 mL трипсина на 5 min при 37 °C и 5% CO2.
  2. Осторожно постучите по флакону, чтобы отделить все клетки, избегая образования комков, и ресуспендируйте их в среде для культивирования клеток.
  3. Подсчитайте количество клеток с помощью камеры Малассеза (или другим доступным методом).
  4. Центрифугируйте клетки при 300 × g в течение 5 min, затем ресуспендируйте в равном объеме PBS, чтобы ввести 200 000 клеток в 100 µL.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток было выбрано на основании обзора литературы (см. Дополнительную таблицу 2).
  5. Осторожно наберите в шприц 26 G 500 µL клеточной суспензии. Чтобы избежать слишком длительного пребывания клеточной суспензии в шприце, рекомендуется набирать объем меньше того, который необходим для 5 животных.
  6. Одновременно (по возможности) поместите мышей в камеру с изофлураном и быстро введите в состояние наркоза с помощью 3% изофлурана при потоке 1 L/min в атмосферном воздухе. Как только животное уснет, поместите его в положение на спине, зафиксировав нос в конусе с 1% изофлураном.
  7. С помощью ватной палочки нанесите крем для мягкого удаления волос на грудную клетку и левую нижнюю часть брюшной стенки животного на 1 min. Удалите волосы и крем водой, затем просушите кожу салфеткой.
  8. Убедитесь в достаточности анестезии, проверив реакцию на укол пальца лапы.
  9. Найдите верхний левый молочный сосок в области брюшной полости. Осторожно захватите его пинцетом и приподнимите вверх (см. Рисунок 1B).
  10. Введите иглу шприца подкожно и продвигайте ее до тех пор, пока игла не окажется под молочной железой.
  11. Введите 100 µL клеточной суспензии. Под соском должен образоваться подкожный пузырек (см. Рисунок 1C). Животным контрольной группы следует вводить PBS. Рандомизацию можно провести с помощью программного обеспечения для рандомизации (например, RandoMice — бесплатного онлайн-инструмента) или путем распределения мышей по группам лечения в заранее определенном соотношении 1:1 или 2:2 (или выше).
  12. Осторожно извлеките иглу и отпустите захваченный пинцетом сосок.
  13. Взвесьте животное, чтобы определить исходную массу тела для протокола.
  14. Дайте животному очнуться на атмосферном воздухе, прежде чем возвращать его в клетку.

2. Неделя 1: Контроль роста опухоли с помощью биолюминесценции

ПРИМЕЧАНИЕ: Эту процедуру можно проводить в любой день после инъекции для контроля роста. Более того, ее можно выполнять в несколько временных точек, если представляет интерес скорость роста опухоли. Однако через 10–14 дней сигнал может ослабнуть из-за естественного отбора опухолевых клеток в процессе развития рака. Кроме того, повторный рост шерсти не должен препятствовать надлежащему захвату фотонов, если протокол был правильно выполнен в начале. См. Рисунок 2A,B для ознакомления с репрезентативными результатами количественного определения биолюминесценции на 2-й, 5-й, 8-й и 11-й дни после инъекции опухолевых клеток.

  1. Поместите животных в камеру с изофлураном и быстро проведите индукцию анестезии 3% изофлураном.
  2. После засыпания животных введите люциферин внутрибрюшинно (IP) из расчета 10 µL/г массы тела с помощью шприца 26-G. Избегайте введения люциферина с левой стороны из-за наличия опухоли, которая иногда может прощупываться уже через несколько дней.
  3. Поместите мышей в фотонный имиджер в положении на спине для оптимизации захвата фотонов, так как опухоль находится на брюшной стороне. Поместите нос в конус для носа и снизьте концентрацию изофлурана до 1%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное размещение 5 животных в устройстве захвата фотонов требует определенного времени; начинайте их размещение как минимум за 2 мин до начала сбора данных.
  4. Начните регистрацию люминесцентной активности через 10 мин после инъекции люциферина и продолжайте её в течение 5 мин (см. Рисунок 2A). Режим сбора данных для используемого здесь устройства был BLI с экспозицией 89 ms на кадр, размером изображения 220 mm x 165 mm и размером пикселя BVR 153 µm.
  5. По завершении регистрации дайте животному проснуться на обычном воздухе, прежде чем возвращать его в клетку.
  6. Используйте программное обеспечение для количественного анализа, адаптированное для данного фотонного имиджера, следуя рекомендациям производителя.

3. Неделя 2: Обработка доксорубицином

ПРИМЕЧАНИЕ: Эхокардиографическую оценку следует провести до начала инъекций Dox. Таким образом, используйте анестезию, введенную после эхокардиографии, для выполнения инъекции, пока животное находится в состоянии сна, чтобы минимизировать стресс от первой инъекции Dox. Кроме того, кумулятивную дозу следует адаптировать для каждой линии мышей. В данной работе, основываясь на предыдущих собственных данных и литературе29, использовались дозы 16 mg/kg для мышей Balb/c и 24 mg/kg для C57Bl/6J (см. Рисунок 3A–C).

  1. Ресуспендируйте и разведите порошок доксорубицина физиологическим раствором. Разведение следует подготовить таким образом, чтобы доза 4 mg/kg доксорубицина соответствовала объему 240–360 µL. В качестве рекомендации предлагается приготовить раствор с концентрацией 2 mg/mL, затем выполнить 6-кратное разведение физиологическим раствором (конечная концентрация 0,33 mg/mL).
  2. Через две недели после инъекции опухолевых клеток убедитесь, что опухоль пальпируется в нижней левой части брюшной полости, но ее размер составляет менее 1 cm.
  3. Взвесьте животное для контроля потери массы тела после введения доксорубицина.
  4. С помощью шприца с иглой 26 G введите соответствующий объем препарата для достижения дозы 4 mg/kg внутрибрюшинно в нижнюю правую часть живота. Животным группы контроля следует вводить физиологический раствор. Рандомизацию можно провести так же, как в шаге 1.11.
  5. Повторяйте эту процедуру ежедневно в течение 4 дней для достижения кумулятивной дозы 16 mg/kg (для мышей C57Bl/6J добавьте еще 2 дня для достижения дозы 24 mg/kg).

4. Недели 2–5: Мониторинг кардиотоксичности

ПРИМЕЧАНИЕ: Эту процедуру можно проводить еженедельно. Более частая оценка требует осторожности, так как животные зачастую наиболее уязвимы на 3-й и 4-й неделях протокола, а некоторые линии мышей чувствительны к общей анестезии, что может привести к повышению смертности. Эхокардиография проводится под кетаминовой анестезией для оптимизации шансов на регистрацию сердечной дисфункции, поскольку изофлуран вызывает депрессию миокарда; при этом для мышей Balb/c используется доза 40 mg/kg, а для мышей C57Bl/6J — 80 mg/kg39. Рекомендуется провести одно ультразвуковое исследование до инъекции опухолевых клеток, чтобы количественно оценить потенциальное влияние роста опухоли на функцию сердца до начала химиотерапии.

  1. Взвесьте животное. При обнаружении значительной потери массы тела следуйте Дополнительная таблица 1.
  2. Проведите анестезию животных путем внутрибрюшинного (IP) введения кетамина с использованием шприца с иглой 26 G в дозе 40 мг/кг (для мышей Balb/c) или 80 мг/кг (для мышей C57Bl/6J) для достижения легкого уровня анестезии.
  3. Поместите животное на грелку, чтобы предотвратить гипотермию.
  4. После того как животное уснет, выбрейте шерсть, как описано в разделе 1.7, чтобы получить зону грудной клетки без волосяного покрова.
  5. Через десять минут после инъекции кетамина проведите эхокардиографию продолжительностью не более 5 мин. Используйте предварительно нагретый ультразвуковой гель. В зависимости от используемого устройства сосредоточьтесь на M-режиме и/или проведите количественную оценку деформации (strain-quantification).
  6. При использовании M-режима регистрируйте срезы в середине желудочков в парастернальной проекции по длинной оси; запись должна охватывать как минимум 4 секунды сокращений и повторяться не менее 3 раз для получения репрезентативного среднего значения показателей функции сердца мыши (см. Рисунок 4А,B). Здесь частота кадров была установлена на уровне 100 кадров/с, частота передачи — 38,4 МГц при 100% мощности, частота приема — 96 МГц, скорость звука — 1538 м/с, а скорость развертки — 1200 Гц.
  7. Примерно через 5 минут животное придет в сознание настолько, что проведение эхокардиографии станет невозможным. Поместите его обратно в клетку, предварительно удалив гель, использовавшийся для ультразвукового исследования.
  8. Слепое количественное определение функции сердца39,40Соответствующая дисфункция в данной модели определяется как значение на 10% ниже базового уровня и абсолютное значение <50% фракционного укорочения (ФУ) левого желудочка при сохранении частоты сердечных сокращений >300 уд/мин. Если значение FS до начала обработки слишком низкое, рассмотрите возможность исключения животного из анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого количественного анализа 4-секундных фрагментов необходимо наличие как минимум 3 сердечных циклов, однако по возможности следует использовать большее количество циклов. Если это возможно, все эхокардиографические исследования должен проводить один и тот же специалист, а количественный анализ — другой человек, чтобы обеспечить «слепой» метод анализа. Рекомендации по контролю качества эхокардиографии опубликованы в другом источнике.40.
  9. Проведите статистический анализ (см. шаг 6). Рекомендуемым тестом для анализа двух групп на протяжении всего протокола является двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA), так как сравниваются два фактора: время и воздействие.
  10. Выполняйте данную процедуру еженедельно. Дисфункция проявляется всего через одну неделю терапии доксорубицином.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если в какой-либо временной точке после введения доксорубицина (Dox) требуется забор крови, например, для измерения сердечных биомаркеров, следует произвести забор крови сразу после проведения эхокардиографии, чтобы избежать повторного введения анестетика, минимизировать стресс у животного и оптимизировать время.

5. Неделя 5: Процедура забива

ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале данный протокол сбора органов следует выполнять вдвоем.

  1. После проведения последней эхокардиографии на 5-й неделе повторно введите животным кетамин внутрибрюшинно в дозе 100 mg/kg. Примените местную анестезию, нанеся каплю 1% тетракаина на глаз, который будет использоваться для забора крови.
  2. С помощью гепаринизированного капилляра проведите ретроорбитальный забор крови, собрав максимально возможный объем в пробирку с гепарином (или с помощью EDTA-капилляра в пробирку с EDTA).
  3. Когда забор крови станет невозможен, проведите цервикальную дислокацию в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами. Немедленно поместите собранную кровь на лед до дальнейшей обработки, продолжая выполнение протокола эвтаназии, как описано в шаге 5.5.
  4. Центрифугируйте кровь при 2000 x g в течение 10 min при 4 °C для разделения клеток крови и плазмы. Быстро заморозьте пробирку с плазмой в жидком азоте и храните при -80 °C до проведения дальнейшего анализа.
  5. Поместите животное на крышку из пенополистирола, покрытую абсорбирующей бумагой, и зафиксируйте 4 конечности булавками.
  6. Опухоль должна иметь значительный размер (не менее 2 cm). Вырежьте опухоль с широким краем здоровой ткани вокруг нее, чтобы отделить ее. Дальнейшее препарирование можно провести после сбора остальных органов, описанного в шаге 5.15.
  7. В отдельной области аккуратно препарируйте опухоль маленькими острыми ножницами, удерживая ее пинцетом. Чтобы увеличить натяжение, не повреждая опухоль, приколите излишки кожи к крышке. Это облегчит препарирование.
  8. После того как опухоль будет полностью отделена, аккуратно промойте ее раствором PBS, чтобы удалить кровь, шерсть и другие прилипшие частицы. Взвесьте опухоль.
  9. Поместите нейлоновую сетку с размером ячеек 22 µm в центрифужную пробирку объемом 5 mL, аккуратно положите на нее опухоль и держите на льду до центрифугирования.
  10. Центрифугируйте пробирку при 100 x g в течение 10 min при 4 °C для сбора интерстициальной жидкости (см. Рисунок 5A). Получаемый объем составляет от 1 до 20 µL, жидкость часто имеет красный цвет (Рисунок 5B). Перенесите ее в микроцентрифужную пробирку объемом 200 µL и храните при -80 °C до дальнейшего анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшуюся часть опухоли можно разрезать на более мелкие фрагменты, поместить в пробирки для хранения, быстро заморозить в жидком азоте и хранить при –80 °C до дальнейшего анализа.
  11. Для забора костного мозга отсеките ножницами правую конечность, препарируйте скальпелем и пинцетом бедренную и большеберцовую кости так, чтобы удалить все мышцы, соединительную ткань и жир. Скальпелем срежьте эпифизы с обеих сторон обеих костей. Поместите очищенные кости в PBS в 12-луночные культуральные планшеты, завершая сбор органов мышей, как описано в шаге 5.15.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробные сведения об изоляции костного мозга опубликованы в другом источнике41.
  12. Проколите дно микроцентрифужных пробирок объемом 500 µL иглой 18 G, поместите в них две кости, а затем поместите эту пробирку в центрифужную пробирку объемом 1.5 mL, заполненную 400 µL PBS.
  13. Центрифугируйте пробирки при 10,000 x g в течение 1 min при 4 °C. На дне пробирки 1.5 mL будет виден осадок клеток; все они являются клетками костного мозга, в то время как строма костного мозга остается в PBS. Аспирируйте весь супернатант (строму костного мозга) в отдельную пробирку для хранения, быстро заморозьте материал в жидком азоте и храните при -80 °C.
  14. С помощью ножниц сделайте поперечный разрез ниже грудной клетки на уровне диафрагмы и разрежьте грудину вдоль ее продольной оси, чтобы обнажить легкие и сердце.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости для дальнейшего анализа здесь можно провести удаление всей крови с помощью физиологического раствора.
  15. Соберите все органы, необходимые для биомолекулярного и гистологического анализа. Взвесьте их и разрежьте на более мелкие фрагменты, чтобы облегчить последующий биомолекулярный анализ. Быстро заморозьте все пробирки в жидком азоте сразу после того, как орган будет разрезан на части, затем храните их при -80 °C.
  16. Для сердца отделите верхушку от верхней части сердца и поместите ее в пластиковые формы, заполненные OCT. После помещения в OCT поместите образец в холодный изопентан перед быстрым замораживанием в жидком азоте и хранением при -80 °C.

6. Статистический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Весь статистический анализ и построение графиков были выполнены с использованием программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных в соответствии с рекомендациями статистического руководства42.

  1. Представленные данные приведены как среднее ± SEM.
  2. Используйте одинаковый масштаб для всех графиков фракционного укорочения.
  3. Отображайте каждую отдельную экспериментальную единицу (мышь) на каждом графике.
  4. Выполните тест Шапиро-Уилка для оценки нормальности распределения каждой экспериментальной группы при уровне значимости альфа p = 0,05.
  5. Для сравнения двух групп используйте критерий Уэлча или критерий Манна-Уитни в зависимости от нормальности распределения (критерий Уэлча при нормальном распределении в обеих группах, критерий Манна-Уитни, если в одной или обеих группах распределение не является нормальным). Выберите двусторонние варианты с уровнем доверия 95%.
  6. Для сравнения более чем двух групп в один конкретный момент времени снова определите, являются ли распределения групп нормальными, как описано в шаге 6.4. Если распределение нормально, проведите однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующей коррекцией Холма-Сидака для множественных сравнений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если распределение не является нормальным, вместо этого следует провести тест Краскела-Уоллиса с коррекцией Данна для множественных сравнений. Для определения значимости порог альфа для всей совокупности тестов установлен на уровне 0,05.
  7. Для лонгитюдных данных использовался двухфакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями (repeated-measure two-way ANOVA) с последующей коррекцией Сидака для множественных сравнений с целью изучения различий между группами в конкретный момент времени. Для определения значимости порог альфа для всей совокупности тестов установлен на уровне 0,05.

Результаты

Данный протокол, как показано в Рисунок 1Апредставляет собой 5-недельный протокол, в результате которого формируются следующие экспериментальные группы: мыши без опухоли, не получавшие докс, мыши без опухоли, получавшие докс, мыши с опухолью, не получавшие докс и мыши с опухолью, получавшие докс. Количество этих групп может быть удвоено в зависимости от того, используются ли оба пола. Первых 2 недель роста опухоли перед началом введения докса достаточно для того, чтобы опухоль развилась после инъекции 200 000 клеток в 4th левая молочная железа животных (Рисунок 1BПодтверждением правильности выполнения подкожной инъекции при осторожном введении суспензии опухолевых клеток является появление пузырька под соском (Рисунок 1C). Таблица 1 в документе кратко изложены ключевые параметры протокола для каждой линии мышей, а также основные результаты, которые будут рассмотрены ниже.

Рисунок 2A представляет собой репрезентативное изображение биолюминесцентного сигнала, полученного при введении люциферина одной мыши без опухоли (слева) и одной мыши с опухолью (справа) со сбором фотонов в течение 5 min. Данный анализ требует, чтобы опухоли экспрессировали ген люциферазы для генерации фотонов после инъекции люциферина. В общей сложности в течение 11 дней с помощью биолюминесценции наблюдалось за 33 мышами Balb/c с инъекциями клеток 4T1Luc, при этом использовалось 9 контрольных животных. Рисунок 2B подтверждает, что опухоль быстро растет, однако интенсивность сигнала начинает выходить на плато после 8-го дня; кроме того, как показано на Рисунке 2C, наблюдается более быстрый начальный рост опухоли у самок по сравнению с самцами мышей Balb/c. Только у 1 из 45 мышей Balb/c опухоль отсутствовала через 5 недель, в то время как у всех мышей C57Bl/6J через 5 недель была опухоль (Рисунок 2D).

Рисунок 3A  и Рисунок 3B демонстрируют, что кумулятивное снижение дозы Dox приводит к повышению выживаемости через 3 недели после начала введения Dox: в то время как при дозе 24 mg/kg мыши Balb/c с опухолями не выжили, при дозе 16 mg/kg выживаемость составила 50%. Однако мыши C57Bl/6J с опухолями более резистентны даже к дозе 24 mg/kg Dox, так как >80% из них выживают через 3 недели после начала химиотерапии (Рисунок 3D). Пол оказал существенное влияние на результат: у самок мышей Balb/c наблюдалась значительно более высокая выживаемость, чем у самцов (выжили 16 из 29 самок по сравнению с 3 из 16 самцов). На Рисунке 3C показаны половые различия у мышей Balb/c, получавших 16 mg/kg Dox (статистический тест не проводился из-за малого количества самцов). У мышей C57Bl/6J статистически значимых различий в выживаемости между двумя полами не наблюдалось (см. Рисунок 3E).

Репрезентативное изображение нормальной функции сердца мыши, оцененной с помощью эхокардиографии до лечения Dox, показано на рисунке 4A, а изображение сердца мыши с сердечной дисфункцией после введения Dox — на рисунке 4B. Количественная оценка FS в М-режиме у 17 мышей линии C57Bl/6J с опухолями, получавших 24 mg/kg Dox, демонстрирует значительное снижение через две недели (59.3% до Dox vs 44.3% после Dox, p < 0.0001, рисунок 4C). Только 1 из 12 выживших мышей (8%) не соответствовала заранее определенным критериям кардиотоксичности. Частота сердечных сокращений незначительно, но достоверно снижается с 623 BPM до Dox до 569 BPM после Dox (p < 0.05, рисунок 4D). Все параметры, количественно определенные в М-режиме, приведены в Дополнительной таблице 3.

Подтверждение кардиотоксического эффекта доксорубицина получают с помощью макро- и микроскопического анализа. Рисунок 6A,B демонстрирует, что абсолютная масса сердца значительно снижается после лечения доксорубицином у немногих выживших опухоленосимых самок мышей линии Balb/c, однако при приведении массы сердца к общей массе тела наблюдается лишь определенная тенденция. В эксперименте на здоровых мышах линии C57Bl/6 введение 24 mg/kg доксорубицина через одну неделю после начала терапии вызвало ожидаемые изменения уровней мРНК следующих генов в сердце: повысились уровни Atrogin и Murf1, что свидетельствует об атрофии; повысился уровень NQO1, что указывает на окислительный стресс, и повысился уровень Bax, что свидетельствует о проапоптотическом состоянии (Рисунок 6C–F).

Рисунок 5A представляет собой схематическое изображение протокола забора интерстициальной жидкости опухоли. Репрезентативное изображение собранной жидкости показано на Рисунке 5B: полученный объем невелик.

figure-results-1
Рисунок 1: Репрезентативные иллюстрации экспериментального протокола. (A) Схематический обзор экспериментального протокола. Создано с помощью BioRender (лицензия № JE29USE7LU). (B) Схематическое изображение подкожного введения опухолевых клеток. Создано с помощью BioRender (лицензия № SO29JHW7R6). (C) Схематическое изображение успешной подкожной имплантации опухоли. Создано с помощью BioRender (лицензия № SO29JHW7R6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Биолюминесцентная визуализация и частота имплантации опухоли. (A) Репрезентативные биолюминесцентные изображения контрольной мыши (слева) и мыши с опухолью (справа). (B) Динамика биолюминесцентного сигнала во времени (mean ± SEM; двухфакторный дисперсионный анализ [ANOVA] с повторными измерениями; *P < 0.05). (C) Сравнение биолюминесцентных сигналов у самцов и самок мышей Balb/c (mean ± SEM). (D) Частота успешной имплантации опухоли у обеих линий мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Анализ выживаемости мышей с опухолями. (A) Кривая выживаемости Каплана–Мейера для мышей Balb/c, получавших доксорубицин (Dox) в дозе 24 mg/kg. (B) Кривая выживаемости Каплана–Мейера для мышей Balb/c, получавших Dox в дозе 16 mg/kg. (C) Кривая выживаемости Каплана–Мейера при сравнении самцов и самок мышей Balb/c, получавших Dox в дозе 16 mg/kg. Статистический анализ не проводился из-за ограниченного количества самцов мышей. (D) Кривая выживаемости Каплана–Мейера для мышей C57BL/6J, получавших Dox в дозе 24 mg/kg. (E) Кривая выживаемости Каплана–Мейера при сравнении самцов и самок мышей C57BL/6J, получавших Dox в дозе 24 mg/kg (лог-ранговый критерий, P = 0.86). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4Эхокардиографическая оценка кардиотоксичности, вызванной доксорубицином. (A) Репрезентативная эхокардиограмма в M-режиме здоровой мыши. (B) Репрезентативная эхокардиограмма в М-режиме мыши с доксорубицин-индуцированной кардиотоксичностью. (C) Фракционное сокращение (FS) у мышей линии C57BL/6J до и через 14 дней после введения доксорубицина. (D) Частота сердечных сокращений (ЧСС) у мышей линии C57BL/6J до и через 14 дней после введения доксорубицина. Данные представлены для n = 17 мышей. Статистические сравнения проводились с использованием t-критерия Уэлча t-критерий. *P < 0.05; ****P ≤ 0,0001. Сокращения: FS — фракционное сокращение; HR — частота сердечных сокращений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Протокол забора образцов органов. (A) Схематическое представление протокола сбора интерстициальной жидкости опухоли. Создано с помощью BioRender (лицензия № HV29USD91R). (B) Репрезентативное изображение, демонстрирующее сбор интерстициальной жидкости опухоли в процессе забора образцов органов. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6
Рисунок 6: Доксорубицин-индуцированная кардиотоксичность. (A) Масса сердца, измеренная через 3 недели после начала лечения доксорубицином в дозе 16 mg/kg у мышей Balb/c с опухолями. (B) Масса сердца, нормализованная по общей массе тела, измеренная через 3 недели после начала лечения доксорубицином в дозе 16 mg/kg у мышей Balb/c с опухолями. (C) Экспрессия мРНК Atrogin в миокарде мышей C57BL/6J через 1 неделю после начала лечения доксорубицином в дозе 24 mg/kg. (D) Экспрессия мРНК Murf1 в миокарде мышей C57BL/6J через 1 неделю после начала лечения доксорубицином в дозе 24 mg/kg. (E) Экспрессия мРНК NQO1 в миокарде мышей C57BL/6J через 1 неделю после начала лечения доксорубицином в дозе 24 mg/kg. (F) Экспрессия мРНК BAX в миокарде мышей C57BL/6J через 1 неделю после начала лечения доксорубицином в дозе 24 mg/kg. Статистический анализ проводили с помощью t-критерия Уэлча или U-критерия Манна-Уитни, в зависимости от распределения данных. ns, P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Линия мышейBalb/cC57Bl/6J
Используемая клеточная линия4T1LucPY8119
Количество введенных клеток200 000200 000
Использованный полСамцы и самкиСамцы и самки
Количество дней инъекций46
Суточная доза4 мг/кг4 мг/кг
Кумулятивная доза доксорубицина16 мг/кг24 мг/кг
Доза кетамина40 мг/кг80 мг/кг
Частота возникновения кардиотоксичности>90%>90%
Выживаемость19/4516/19

Таблица 1: Ключевые параметры протокола для каждой линии мышей. Сравнение основных экспериментальных переменных и концентраций реагентов, используемых в протоколах для мышей линий Balb/c и C57BL/6J.

Дополнительная таблица 1: Гуманитарные конечные точки для обеспечения благополучия животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 2: Литературный обзор экспериментальных протоколов для 4T1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 3: Эхокардиографические параметры, измеренные в M-режиме у 17 мышей линии C57BL/6J с опухолями, получавших доксорубицин в дозе 24 mg/kg. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

В данной работе была разработана модель кардиотоксичности, индуцированной доксорубицином, у мышей с опухолями молочной железы, которая считается имеющей высокую клиническую значимость для будущих исследований в области кардиоонкологии. Целью было имитировать клинический путь пациента с момента поступления в больницу с диагностированным раком до начала лечения потенциально кардиотоксической химиотерапией. Протокол основан на прагматическом подходе и использует иммунокомпетентных мышей, доступных во всем мире, что позволяет другим исследовательским группам воспроизвести его в своих лабораториях. Высокий процент успешной имплантации опухолей делает эту модель перспективным кандидатом для будущих кардиоонкологических токсикологических исследований.

К распространенным ошибкам при выполнении данного протокола относятся проведение эхокардиографии у мышей с низкой частотой сердечных сокращений, что может привести к искусственному занижению показателя фракционного сокращения (FS). Чтобы обеспечить точность измерения FS, следует дать мышам восстановиться после первоначального отрицательного хронотропного действия анестетиков перед проведением эхокардиографической оценки. Для мышей линии Balb/c может потребоваться дальнейшее снижение дозы анестетика, если уровень смертности остается высоким. Все эхокардиографические обследования в ходе исследования должен проводить один и тот же экспериментатор, поскольку межисследовательская вариабельность может быть значительной43. При имплантации опухоли извлечение шприца во время инъекции может привести к формированию линейной опухоли, которая может вырасти больше, чем опухоли, полученные при правильном введении. Также критически важно выбрать правильный сосок молочной железы, так как введение в сосок верхней части живота может помешать проведению эхокардиографической оценки на более поздних стадиях развития опухоли. Для обеспечения того, чтобы каждая мышь получила сопоставимое количество клеток и тем самым минимизировать разброс размеров опухолей в конце протокола, рекомендуется проводить ручной подсчет клеток в суспензии и тщательное перемешивание перед инъекцией. При необходимости еженедельного забора крови следует строго контролировать объем собираемого материала, так как после введения доксорубицина мыши становятся более уязвимыми. Рекомендуемый максимальный общий объем крови при каждой процедуре забора составляет 50 µL, поскольку бóльшие объемы могут увеличить смертность в ходе протокола. Частота и объем забора крови также должны соответствовать местным этическим требованиям по содержанию животных и правилам институционального вивария. Для компенсации потери жидкости после забора крови можно ввести подкожно эквивалентный объем физиологического раствора.

Для сравнения с данной процедурой введения доксорубицина был рассмотрен недавно опубликованный обзор моделей AIC на животных, который показал, что в большинстве доклинических моделей (88%) использовались повторные инъекции Dox, а измерение результатов (зачастую с помощью эхокардиографии) проводилось спустя несколько недель29. В большинстве статей сообщалось об использовании линии C57Bl/6J (73,8%), вероятно, из-за её жизнеспособности и низкой стоимости29. К сожалению, в значительном количестве исследований игнорировалось влияние опухоли на биологию животного перед введением AC17,29. Только в 46 из 736 исследований сообщалось об использовании моделей с опухолью, в 12 из них использовалась клеточная линия 4T1 (трижды негативный рак молочной железы) у мышей Balb/c, и только одна представляла собой модель рака молочной железы у мышей C57Bl/6J (а именно, EGFR2-положительный рак молочной железы)29. В другом исследовании использовались мыши C57Bl/6J с EGFR-2-положительным раком молочной железы, однако рост опухоли не был допущен до начала химиотерапии, что ограничивает трансляционный аспект данной модели32.

Ксенотрансплантационные модели с использованием иммунодефицитных мышей позволяют применять линии опухолевых клеток человека, однако в них отсутствует функциональная иммунная система, что ограничивает изучение механизмов иммуноопосредованной кардиотоксичности и является серьезным недостатком, учитывая растущую значимость кардиотоксичности, связанной с ингибиторами контрольных точек иммунного ответа. В области кардиоонкологии появляются модели на крупных животных, но они всегда будут иметь такие недостатки, как высокая стоимость и ограниченные возможности генетической инженерии44. Системы in vitro и 2D/3D-системы на основе человеческих клеток (например, кардиомиоциты, полученные из иПСК человека, сердечные органоиды) позволяют проводить высокопроизводительный механистический и токсикологический скрининг, но не могут воспроизвести интегративную физиологию всего организма (гемодинамику, нейрогуморальную регуляцию, иммунное взаимодействие), которую фиксируют модели in vivo. По сравнению с этими подходами данная сингенная, иммунокомпетентная модель с опухолью обеспечивает более клинически релевантный контекст для изучения взаимодействия между опухолевой нагрузкой и кардиотоксичностью, вызванной химиотерапией, ценой большей биологической вариабельности, более высокой смертности у некоторых линий и более низкой пропускной способности по сравнению с более простыми моделями in vitro или моделями in vivo без опухолей.

Модели кардиотоксичности при AC без опухолевого носителя, которые преимущественно использовались до настоящего времени, обеспечивают высокую воспроизводимость, низкую стоимость и облегчают проведение эхокардиографической оценки и анализ выживаемости, однако они не учитывают системное воздействие опухолевой нагрузки, рак-ассоциированного воспаления и кахексии на сердце, которые все чаще признаются значимыми сопутствующими факторами кардиотоксичности у пациентов17,45. Более того, метаболическое перепрограммирование сердца и, следовательно, его сократительная функция могут изменяться под воздействием секретируемых онкометаболитов, таких как D-2-гидроксиглутарат или сукцинат14. Таким образом, если кардиоонкологическая модель создается для биохимического анализа сердца с использованием различных омиксных методов (например, протеомики и метаболомики), наличие опухоли перед химиотерапией является обязательным. Также имеются данные о том, что сама опухоль может вызывать выраженную сердечную дисфункцию, хотя эти сведения в литературе противоречивы. В то время как в некоторых моделях было продемонстрировано пагубное влияние инокуляции опухоли на FS или параметры электрической проводимости, в других было обнаружено, что наличие опухоли защищало мышей от ремоделирования, вызванного поперечным пережатием аорты11,13,46. В зависимости от предварительной гипотезы также необходимы животные без опухолевого носителя. Они представляют собой единственную среду, в которой прямой кардиотоксический эффект химиотерапевтического препарата может быть отделен от искажающего влияния самой опухоли, что является необходимым условием для установления причинно-следственной связи и выяснения специфических механизмов действия препарата. Эти животные будут служить контролем для оценки эффекта противораковой терапии и её взаимодействия с опухолью при возникновении кардиотоксичности. Без такого компаратора было бы невозможно определить, какая часть наблюдаемого сердечного фенотипа обусловлена действием препарата, влиянием опухоли или их взаимодействием. Это различие критически важно не только для механистического понимания, но и для рациональной разработки кардиопротекторных стратегий. Следовательно, важно признать, что каждая из этих моделей отвечает на разные и дополняющие друг друга научные вопросы и что ни одна из моделей по отдельности не является достаточной для полного воспроизведения сложности клинической кардиоонкологии; для получения надежных механистических и трансляционных выводов часто требуется комбинированное или последовательное использование обеих моделей.

В данном протоколе кардиотоксичность определялась в соответствии с рекомендациями ESC по кардиоонкологии 2022 года, согласно которым умеренная бессимптомная сердечная дисфункция, связанная с противоопухолевой терапией, определяется как снижение фракции выброса левого желудочка (LVEF) >10% при значении LVEF от 40% до 49%16. Однако для точной количественной оценки LVEF требуется наличие 3D-модуля в ультразвуковом аппарате39. Чтобы избежать некорректной оценки систолической функции сердца и сохранить простоту протокола для применения в лабораториях с менее современным оборудованием, в качестве маркера сердечной дисфункции было предпочтительно использовать FS, который легко и точно определяется при анализе в M-режиме у мышей с применением тех же критериев, что и в рекомендациях ESC. При использовании данного протокола 90% выживших мышей соответствуют критериям кардиотоксичности, что делает этот метод перспективным для будущих трансляционных исследований. Кардиотоксический эффект Dox был подтвержден путем макроскопической оценки (снижение массы сердца) у мышей линии Balb/c. Группа мышей C57Bl/6 с опухолями без введения препарата в данной работе не была представлена, поэтому сравнение для этой линии на данный момент отсутствует. Кроме того, у мышей C57Bl/6 без опухолей доза Dox вызвала изменения, согласующиеся с имеющимися данными о механизмах кардиотоксичности антрациклинов: усиление атрофии, окислительный стресс и апоптоз19,20.

Тем не менее, более современные показатели, используемые у пациентов, такие как глобальная продольная деформация (GLS) по методу спекл-трекинга, не были количественно определены в данной работе по техническим причинам. Если это осуществимо в конкретных условиях, определение GLS было бы дополнительным преимуществом, поскольку этот показатель обычно считается более чувствительным для выявления ранних повреждений сердца23. Для повышения достоверности обнаружения кардиотоксичности также можно оценивать циркулирующие сердечные биомаркеры, такие как тропонин; однако объем плазмы, традиционно необходимый для такого анализа у мышей, может стать ограничивающим фактором из-за низкого общего объема крови у этих животных. Более того, общая ослабленность животных после введения Dox может привести к росту показателей смертности во время или после забора крови. Последним ограничивающим фактором является чувствительность анализов на такие биомаркеры, что зачастую может затруднить интерпретацию результатов.

Несмотря на то, что все ультразвуковые исследования проводились одним опытным экспериментатором, наблюдалась значительная еженедельная вариабельность показателей у одних и тех же мышей Balb/c, даже в отсутствие лечения. Это может быть объяснено чувствительностью данной линии к анестезии кетамином47. В частности, изначально был отмечен высокий уровень смертности во время процедур под анестезией, в результате чего до конца протокола доживало малое количество животных; это привело к снижению дозы кетамина для мышей Balb/c с 80 mg/kg до 40 mg/kg. Анализ графиков выживаемости мышей Balb/c, получавших Dox, показывает, что часть смертей происходит в моменты проведения анестезии (еженедельная эхокардиография), однако большинство животных погибает в виварии вне проведения каких-либо активных процедур, что подчеркивает: основным фактором смертности у этих мышей является Dox. Тем не менее, при интерпретации графиков выживаемости для данной модели при сравнении двух или более линий важно учитывать летальные исходы, связанные с анестезией. Для снижения риска смерти от анестезии можно проводить эхокардиографию у мышей в сознании, однако это требует предварительного обучения и акклиматизации животных перед включением их в протокол. Что касается Dox, то даже при сниженных дозах почти половина мышей Balb/c не дожила до конца протокола. Можно попытаться индуцировать кардиотоксичность с использованием еще более низких доз Dox, но при этом существует риск уменьшения количества животных, соответствующих критериям кардиотоксичности. Другой стратегией может быть увеличение времени восстановления животного после каждой инъекции Dox; данный подход в настоящей работе не применялся, но в литературе имеются данные о повышении выживаемости при таком подходе29.

Наблюдения, сделанные при создании данной модели, а именно то, что мыши Balb/c более чувствительны к Dox, чем мыши C57Bl/6J, и что самки более устойчивы к Dox, чем самцы, согласуются с имеющимися литературными данными29. Более того, схожие и воспроизводимые результаты, полученные на обеих линиях мышей, дополнительно подтверждают надежность предлагаемой модели. За счет достижения высоких кумулятивных доз путем введения умеренно высоких ежедневных доз в течение короткого периода времени были получены высокие показатели кардиотоксичности при высоком уровне выживаемости. Создание модели рака молочной железы (PY8119 представляет собой рак молочной железы, подобный трижды негативному) на линии C57Bl/6J будет очень полезно для дальнейших исследований, поскольку эти мыши представляют собой один из основных генетических фонов для трансгенных моделей34. Высокий процент успешности инокуляции опухолей, подтверждающий эффективность выбранного метода инъекций, также является многообещающим аспектом данной модели. Кроме того, высокая толерантность этих мышей к Dox открывает возможность для более длительных исследований с повторным введением Dox для имитации часто встречающейся в клинике ситуации вторичного рака или метастазирования. Наконец, протокол забора органов позволяет собрать все солидные органы, опухоли и их интерстициальную жидкость, а также костный мозг и его строму, что обеспечивает возможность очень тщательного анализа модели.

Данная модель имеет ряд ограничений. Из-за прагматичного дизайна и стремления избежать инвазивного хирургического вмешательства, при подкожной инъекции невозможно точно контролировать локализацию опухоли (например, в конкретной молочной железе, а не в подкожном жире), что может иметь большое значение в зависимости от изучаемого научного вопроса48. Если требуется точное введение в область развития рака, для выполнения ортотопической инъекции может потребоваться более обширная операция, хотя это представляется действительно важным главным образом при планировании биохимического анализа опухоли, поскольку объем, латентный период и частота возникновения опухолей схожи независимо от метода инъекции48. Также можно утверждать, что использование только антрациклинов (ACs) не полностью соответствует клинической ситуации, когда пациенты часто получают комбинированные схемы лечения, например, с циклофосфамидом или цисплатином. Это действительно могло бы стать следующим этапом разработки данного протокола; однако адаптация дозы для каждого используемого химиопрепарата должна быть проведена тщательно. Кроме того, смертность более 50% у мышей Balb/c через 3 недели после начала терапии Dox остается очень высокой; снижение дозы могло бы повысить выживаемость, возможно, за счет менее выраженной кардиотоксичности. Также следует отметить, что дозы, используемые в данной модели, выше тех, которые обычно применяются у людей сегодня, что может ограничить трансляционный потенциал этой модели.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении данной рукописи.

Благодарности

Благодарим команду вивария за помощь в ежедневном мониторинге благополучия животных. Благодарим Леан Боргес, Элиаса Айт Асса и Клеманс Шабо за помощь в разработке протокола работы с животными. Выражаем благодарность доктору Жюли Хельт из подразделения INSERM 932 за предоставление линии клеток PY8119. Особая благодарность доктору Сильвену Прову и его студенту Мел Гавенс за помощь в проведении биолюминесцентного анализа.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клетки 4T1LucATCCCRL-2539
Доксорубицин в порошкеCliniscience23214-92-8
ЭхокардиографVisual SonicsVEVO LT-200
ЛюциферинPerkin Elmer E1605
Нейлоновая сеткаMerckNY2002500
PhotonImager OptimaBioSpace Lab
Клетки PY8119Подарено Dr Julie Helft

Ссылки

  1. Meijers WC, et al. Heart failure stimulates tumor growth by circulating factors. Circulation. 2018;138(7):678-691.
  2. de Wit S, et al. Pressure overload-induced cardiac hypertrophy stimulates tumor growth in tumor-prone Apc(Min) mice. Circ Heart Fail. 2023;16(9):e010740.
  3. Avraham S, et al. Early cardiac remodeling promotes tumor growth and metastasis. Circulation. 2020;142(7):670-683.
  4. Langier Goncalves I, et al. Heart failure promotes cancer progression in an integrin β1-dependent manner. Int J Mol Sci. 2023;24(24):17367.
  5. Koelwyn GJ, et al. Myocardial infarction accelerates breast cancer via innate immune reprogramming. Nat Med. 2020;26(9):1452-1458.
  6. Wong J, Soh CH, Wang B, Marwick T. Long-term risk of heart failure in adult cancer survivors: a systematic review and meta-analysis. Heart. 2024;110(19):1188-1195.
  7. Kuiper JG, et al. Risk of heart failure among colon and rectal cancer survivors: a population-based case-control study. ESC Heart Fail. 2022;9(4):2139-2146.
  8. Mamidanna R, Nachiappan S, Bottle A, Aylin P, Faiz O. Defining the timing and causes of death amongst patients undergoing colorectal resection in England. Colorectal Dis. 2016;18(6):586-593.
  9. Armstrong GT, et al. Aging and risk of severe, disabling, life-threatening, and fatal events in the Childhood Cancer Survivor Study. J Clin Oncol. 2014;32(12):1218-1227.
  10. Herrmann J. Adverse cardiac effects of cancer therapies: cardiotoxicity and arrhythmia. Nat Rev Cardiol. 2020;17(8):474-502.
  11. Kelm NQ, Straughn AR, Kakar SS. Withaferin A attenuates ovarian cancer-induced cardiac cachexia. PLoS One. 2020;15(7):e0236680.
  12. Graca FA, et al. Progressive development of melanoma-induced cachexia differentially impacts organ systems in mice. Cell Rep. 2023;42(1):111934.
  13. Xiong S, et al. Development of an efficient mice model of cancer-associated cardiac cachexia. Anim Models Exp Med. 2025; 8(11):1960-1970.
  14. Karlstaedt A, Moslehi J, de Boer RA. Cardio-onco-metabolism: metabolic remodelling in cardiovascular disease and cancer. Nat Rev Cardiol. 2022;19(6):414-425.
  15. Murphy KT. The pathogenesis and treatment of cardiac atrophy in cancer cachexia. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2016;310(4):H466-H477.
  16. Lyon AR, et al. 2022 ESC Guidelines on cardio-oncology developed in collaboration with the European Hematology Association (EHA), the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology (ESTRO) and the International Cardio-Oncology Society (IC-OS). Eur Heart J. 2022;43(41):4229-4361.
  17. Ghigo A, et al. Update on preclinical models of cancer therapy-related cardiac dysfunction: challenges and perspectives. A scientific statement of the Heart Failure Association (HFA) of the ESC, the ESC Council of Cardio-Oncology, and the European Association of Preventive Cardiology. Eur J Heart Fail. 2025;27(6):1028-1046.
  18. Cagnazzo R, et al. Mismatch between preclinical cardio-oncology and clinical oncology research. JACC CardioOncol. 2025;7(6):770-773.
  19. Mattioli R, et al. Doxorubicin and other anthracyclines in cancers: activity, chemoresistance and its overcoming. Mol Aspects Med. 2023;93:101205.
  20. Martins-Teixeira MB, Carvalho I. Antitumour anthracyclines: progress and perspectives. ChemMedChem. 2020;15(11):933-948.
  21. Fabiani I, Chianca M, Cipolla CM, Cardinale DM. Anthracycline-induced cardiomyopathy: risk prediction, prevention and treatment. Nat Rev Cardiol. 2025;22(8):551-563.
  22. Rivero-Santana B, et al. Anthracycline-induced cardiovascular toxicity: validation of the Heart Failure Association and International Cardio-Oncology Society risk score. Eur Heart J. 2025;46(3):273-284.
  23. Camilli M, Cipolla CM, Dent S, Minotti G, Cardinale DM. Anthracycline cardiotoxicity in adult cancer patients: JACC: CardioOncology state-of-the-art review. JACC CardioOncol. 2024;6(5):655-677.
  24. Díaz-Guerra A, et al. Anthracycline cardiotoxicity induces progressive changes in myocardial metabolism and mitochondrial quality control. JACC CardioOncol. 2024;6(2):217-232.
  25. Omland T, et al. Sacubitril-valsartan and prevention of cardiac dysfunction during adjuvant breast cancer therapy: the PRADA II randomized clinical trial. Circulation. 2025: 152(16):1136-1145.
  26. Henriksen PA, et al. Multicenter, prospective, randomized controlled trial of high-sensitivity cardiac troponin I-guided combination angiotensin receptor blockade and beta-blocker therapy to prevent anthracycline cardiotoxicity: the Cardiac CARE trial. Circulation. 2023;148(21):1680-1690.
  27. Sobiborowicz-Sadowska AM, Kamińska K, Cudnoch-Jędrzejewska A. Neprilysin inhibition in the prevention of anthracycline-induced cardiotoxicity. Cancers (Basel). 2023;15(1):312.
  28. Stansfeld A, et al. Pharmacological strategies to reduce anthracycline-associated cardiotoxicity in cancer patients. Expert Opin Pharmacother. 2022;23(14):1641-1650.
  29. Li M, et al. Optimizing dose selection for doxorubicin-induced cardiotoxicity in mice: a comprehensive analysis of single and multiple-dose regimens. Eur J Pharmacol. 2025;1003:177883.
  30. Gambardella J, et al. Infiltrating macrophages amplify doxorubicin-induced cardiac damage: role of catecholamines. Cell Mol Life Sci. 2023;80(11):323.
  31. Chen Y, et al. Cysteine imaging reveals early redox dysregulation and identifies gnetol as a ferroptosis-modulating agent in doxorubicin cardiotoxicity. Redox Biol. 2026;92:104131.
  32. Luo W, et al. Critical role of the cGAS-STING pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Circ Res. 2023;132(11):321587.
  33. Mouse Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 2002;420(6915):520-562.
  34. Mekada K, Yoshiki A. Substrains matter in phenotyping of C57BL/6 mice. Exp Anim. 2021;70(2):145-160.
  35. Yin L, Duan JJ, Bian XW, Yu SC. Triple-negative breast cancer molecular subtyping and treatment progress. Breast Cancer Res. 2020;22(1): doi.org/10.1186/s13058-020-01296-5.
  36. Akbay EA, et al. D-2-hydroxyglutarate produced by mutant IDH2 causes cardiomyopathy and neurodegeneration in mice. Genes Dev. 2014;28(5):479-490.
  37. Springer J, et al. Prevention of liver cancer cachexia-induced cardiac wasting and heart failure. Eur Heart J. 2014;35(14):932-941.
  38. Herndon ME, et al. The highly metastatic 4T1 breast carcinoma model possesses features of a hybrid epithelial/mesenchymal phenotype. Dis Model Mech. 2024;17(9):dmm050771.
  39. Lindsey ML, Kassiri Z, Virag JAI, De Castro Brás LE, Scherrer-Crosbie M. Guidelines for measuring cardiac physiology in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2018;314(4):H733-H752.
  40. Zacchigna S, et al. Towards standardization of echocardiography for the evaluation of left ventricular function in adult rodents: a position paper of the ESC Working Group on Myocardial Function. Cardiovasc Res. 2021;117(1):43-59.
  41. Assad N, et al. Crosstalk between circulating DPP3 and immune cells in the context of cardio-systemic stress. iScience. 2026;29(3):115114.
  42. Motulsky HJ. GraphPad Statistics Guide. 2016. http://www.graphpad.com/guides/prism/10/statistics/index.htm.
  43. Garcia-Elcano L, et al. Accurate estimation of interobserver variability in echocardiography segmentation measured from 35 experts and impact on derived clinical metrics. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 2025;26(Suppl 1): jeae333.044.
  44. Medina-Hernandez D, et al. SGLT2i therapy prevents anthracycline-induced cardiotoxicity in a large animal model by preserving myocardial energetics. JACC CardioOncol. 2025;7(2):171-184.
  45. Asnani A, et al. Preclinical models of cancer therapy-associated cardiovascular toxicity: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 2021;129(1):e21–e34.
  46. Awwad L, Shofti R, Haas T, Aronheim A. Tumor growth ameliorates cardiac dysfunction. Cells. 2023;12(14):1853.
  47. Levin-Arama M, et al. Subcutaneous compared with intraperitoneal ketamine-xylazine for anesthesia of mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2016;55(6):794-800.
  48. Fleming JM, Miller TC, Meyer MJ, Ginsburg E, Vonderhaar BK. Local regulation of human breast xenograft models. J Cell Physiol. 2010;224(3):795-806.

Перепечатки и разрешения

Теги

Модель кардиоонкологииантрациклиновая кардиотоксичностьмыши с опухолью молочной железытерапия доксорубициномультразвуковое исследование сердцабиолюминесценция опухолифункция левого желудочкамыши с опухольюдоклиническая кардиотоксичность

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.