Протокол стандартизированной оценки системной микроваскулярной функции в кожной микроциркуляции человека с использованием лазерной спекл-контрастной визуализации

Summary

Этот протокол описывает стандартизированный, неинвазивный метод оценки системной микрососудистой функции в кожной микроциркуляции человека с использованием лазерной спекл-контрастной визуализации в сочетании с фармакологическим ионофорезом и физиологическими стимулами для оценки микрососудистой реактивности в клинических исследовательских условиях.

Abstract

Лазерная спекл-контрастная визуализация (LSCI) — это высокоразрешающая, неинвазивная оптическая техника, которая позволяет в реальном времени визуализировать микрососудистую перфузию крови в полном режиме реального времени. Этот протокол представляет стандартизированную методологию оценки системной микрососудистой функции в кожной микроциркуляции человека с использованием LSCI. Поскольку измерения, полученные с помощью этой техники, обладают высокой чувствительностью к окружающим и физиологическим факторам, протокол акцентирует внимание на строгих процедурах стандартизации для повышения воспроизводимости и надежности экспериментов. Протокол подробно описывает основные меры контроля окружающей среды, включая стабилизацию комнатной температуры при 23°C ± 1°C, позиционирование участников, процедуры акклиматизации и минимизацию внешних помех при получении изображений. Методология интегрирует LSCI с двумя дополняющими провокационными манёврами для оценки реактивности кожной микрососудистой системы. Постокклюзивная реактивная гиперемия используется для оценки интегрированной микрососудистой реактивности, тогда как фармакологические вызовы, основанные на ионофорезезе, применяются для оценки функции эндотелия. В частности, ацетилхолин вводится для оценки вазодилатации, зависящей от эндотелия, а нитропруссид натрия — для оценки вазодилатации, независимой от эндотелия. Этот пошаговый визуализированный протокол предназначен для облегчения внедрения стандартизированных методологий LSCI в клинических и трансляционных исследовательских условиях. Этот подход успешно применялся для выявления микрососудистых нарушений в ряде клинических состояний, включая резистентную гипертензию, диабет и ишемическую болезнь сердца. Обеспечивая воспроизводимую и неинвазивную оценку микрососудистой реактивности, эта методология предоставляет ценный инструмент для изучения состояния системных сосудистых заболеваний, мониторинга прогрессирования заболевания и оценки эффективности вмешательств, направленных против микрососудистой системы.

Introduction

Основная цель этого протокола — предоставить стандартизированную, воспроизводимую методологию оценки системной микроваскулярной функции и реактивности с помощью лазерной спекл-контрастной визуализации (LSCI) в сочетании с физиологическими и фармакологическими провокационными манёврами. Микроциркуляция, состоящая из терминальных кровеносных сосудов — артериол, капилляров и венул — диаметром меньше примерно 100 мкм^1, является основным центром метаболического обмена и критически важным фактором периферического сосудистого^{сопротивления 2}. Дисфункция эндотелиума в этих мелких сосудах часто предшествует макрососудистым изменениям и служит ранним биомаркером сердечно-сосудистых заболеваний, включая гипертонию, диабет и ишемическую болезнь^{сердца.} Важно, что хотя нарушение микрососудистых заболеваний значительно способствует повреждению концевых органов, оно действует вместе с макроваскулярным атеросклерозом и системным хроническим воспалением в ходе многофакторного заболевания. Поэтому неинвазивная оценка микрососудистой реактивности необходима как для ранней диагностики, так и для мониторинга терапевтической эффективности в трансляционных^{исследованиях 4}.

Обоснование использования кожной микроциркуляции в качестве суррогата системного сосудистого здоровья заключается в её доступности и роли репрезентативного окна в глобальную функцию^{эндотелия 5,6}. Традиционно лазерная доплеровская флоуметрия (LDF) считается золотым стандартом для неинвазивной кожной оценки⁷. Однако LDF ограничен плохим пространственным разрешением, поскольку обеспечивает измерения по точкам, которые очень чувствительны к присущей гетерогенности перфузии^{кожи 8}. В отличие от этого, LSCI предлагает значительные преимущества, обеспечивая полнополевые визуализации перфузии тканей в реальном времени с высоким временным и пространственным^{разрешением 9}. Анализируя интерференционную картину, создаваемую лазерным рассеянием света, LSCI позволяет одновременно оценивать несколько сосудистых областей без необходимости физического контакта или экзогенных^{красителей 10,11}.

В более широкой литературе интеграция LSCI с фармакологическими провокациями, вызванными ионофорезом, такими как ацетилхолин (ACh) и нитропруссид натрия (SNP), была подтверждена как надёжный подход к оценке эндотелийно-зависимых и независимых от эндотелиума вазодилататорных^{путей 12,13}. Кроме того, постокклюзивная реактивная гиперемия (PORH) обеспечивает интегрированную оценку микрососудистой реактивности с участием эндотелиальных медиаторов, нейрогенных сенсорных нервов и функции гладкой мышцы^{сосудов 12}. Несмотря на преимущества, высокая чувствительность LSCI к изменчивости окружающей среды и физиологии требует строгих процедур стандартизации. Этот протокол решает эти задачи, подробно описывая критически важные меры контроля окружающей среды, включая стабилизацию температуры комнаты при 23°C ± 1°C и стандартизированное позиционирование участников, чтобы повысить воспроизводимость внутри и между^{субъектами 10}. Эта методология подходит для клинических и трансляционных исследователей, стремящихся к методологически обоснованному, неинвазивному подходу к изучению микрососудистой патофизиологии у различных популяций пациентов.

Protocol

Все процедуры с участием человека проводились в соответствии с этическими стандартами Национального института кардиологии (Министерство здравоохранения Бразилии), в соответствии с национальными нормативными актами (Национальный комитет этики по исследованиям – INAEP – согласно Закону No 14 874 от мая 2024 года) и Хельсинкской декларацией (пересмотренная в 2024 году).

1. Подготовка участников и контроль окружающей среды

1. Стабилизировать обычную среду
   1. Стабилизировать температуру в кабинете для осмотра (RT; 23°C ± 1°C) с помощью специального термостата для поддержания стабильной тепловой среды.
   2. Контролируйте RT каждые 10 минут с помощью откалиброванного цифрового термометра (точность ±0,1°C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кожная микрососудистая функция очень чувствительна к колебаниям температуры.
2. Подготовьте участника перед оценкой
   1. Инструктуйте участников воздерживаться от курения, употребления кофеина или алкоголя, а также от интенсивных физических упражнений в течение 24 часов до оценки.
   2. Инструктируйте участников голодать не менее 2 часов перед оценкой, при этом разрешая принимать воду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Воздержание от кофеина и интенсивные физические упражнения минимизируют внешнее воздействие на сосудистый тонус кожи. Кофеин, как антагонист аденозиновых рецепторов, и физическая активность, воздействуя на симпатический драйв и терморегуляцию, могут вызывать продолжительные изменения микрососудистой реактивности, которые продолжаются несколько часов после воздействия ^4,14.
3. Позиционировать участника для получения изображений
   1. Расположить недоминантную руку участника на уровне сердца с помощью подушек для удержания предплечья в горизонтальном и стабильном положении.
   2. Используйте вентральную поверхность предплечья в качестве места для обследования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Недоминантное предплечье минимизирует влияние латерализованного сосудистого ремоделирования, связанного с повседневной деятельностью. Вентральное предплечье обеспечивает благоприятные анатомические характеристики для оптической визуализации, включая снижение плотности волос и уменьшенную толщину кожи, что минимизирует артефакты сигнала и улучшает воспроизводимость ионтофоретического препарата.
4. Обеспечить стабилизацию сердечно-сосудистых сосудов
   1. Держите участника в состоянии покоя не менее 20 минут перед началом микрососудистых записей.
   2. Ограничите участнику возможность говорить, двигать осмотренной конечностью или использовать электронные устройства в период отдыха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Период стабилизации минимизирует вегетативные и сердечно-сосудистые флуктуации до исходного приобретения.
5. Минимизировать артефакты движения
   1. Поместите недоминантное предплечье участника на вакуумную подушку.
   2. Отрегулируйте подушку, чтобы удерживать поверхность вентрального предплечья в стабильном горизонтальном положении на протяжении всего изображения.
6. Подготовьте поверхность кожи
   1. Выбирайте участки кожи без видимых волос для всех измерений.
   2. При необходимости удаляйте волосы хирургической машинкой для стрижки за 24 часа до обследования.
      ВНИМАНИЕ: Не используйте бритву для удаления волос, так как раздражение кожи может помешать микроваскулярным измерениям.
7. Измерьте артериальное давление
   1. Выберите размер манжеты в соответствии с окружностью руки участника.
   2. Проведите три последовательных измерения артериального давления с помощью калиброванного автоматического осциллометрического устройства с интервалом в 1 минуту между измерениями.
   3. Отбросьте первое измерение и вычислите среднее значение последних двух измерений, чтобы определить среднее артериальное давление (MAP) согласно сердечно-сосудистым рекомендациям ESC/ESH и AHA.

2. Настройка системы LSCI и конфигурация программного обеспечения

1. Подготовьте систему LSCI
   1. Включите систему LSCI не менее чем за 10 минут до получения изображения, чтобы обеспечить стабилизацию лазерного источника.
   2. Проверьте стабилизацию лазера с помощью программного индикатора состояния перед началом записи.
2. Позиционирование лазерной головки
   1. Разместите лазерную головку прямо над предплечьем участника.
   2. Отрегулируйте лазерную головку на расстоянии ровно 15 см от поверхности кожи с помощью инструмента для измерения расстояния, предоставленного производителем (рисунок 1A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание фиксированной дистанции захвата обеспечивает оптимальную фокусировку изображения и единообразный угол зрения между участниками.
3. Настройте программное обеспечение для приобретения
   1. Запустите программное обеспечение для получения изображений и создайте новый файл исследования.
   2. Введите демографическую информацию участника и ранее рассчитанный MAP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При применимости включайте подробные инструкции по работе с программным обеспечением и репрезентативные скриншоты в качестве дополнительного материала.
4. Настройте параметры приобретения
   1. Установите частоту дискретизации на 1 изображение/с (1 Гц).
   2. Отрегулируйте пространственное разрешение примерно до 0,1 мм/пиксель для зоны обнаружения цели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Частота дискретизации 1 Гц обеспечивает подходящий баланс между временным разрешением и соотношением сигнал/шум, при этом адекватно фиксируя гиперемическую и фармакологическую кинетику отклика.
5. Минимизировать помехи окружающего света
   1. Перед получением изображения выполните проверку шума на фоне или вычитание темных кадров в соответствии с требованиями системы.
   2. Приглушайте свет в комнате и блокируйте внешний солнечный свет с помощью занавесок во время всех записей, когда вычитание тёмных кадров недоступно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартизированное окружающее освещение минимизирует оптические помехи и улучшает воспроизводимость сигнала.
6. Определите области интереса (ROI)
   1. Создайте как минимум три круглых ROI примерно 80^{мм 2} на экране предварительного просмотра в программном обеспечении для приобретения.
   2. Разместите два ROI над электродными участками ионофореза и один ROI над участком оценки PORH.
   3. Разместите все ROI на вентральном предплечье примерно в 5 см дистальной ямки, избегая видимых поверхностных вен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартизация ROI минимизирует влияние пространственной гетерогенности в кожной перфузии и уменьшает наличие артефактов на краях, связанных с камерами доставки лекарств.
7. Получите базовую запись перфузии
   1. Записывайте кожную кровоточку в состоянии покоя непрерывно в течение 5 минут до сосудистой стимуляции.
   2. Отслеживайте сигнал перфузии в реальном времени и подтверждайте отсутствие скачков, вызванных движением, во время базового сбора сигнала.
   3. Определите базовую стабильность как изменение перфузионного сигнала <10% в течение непрерывного интервала в 2 минуты.
8. Включить анализ кожной сосудистой проводимости (CVC)
   1. Введите MAP участника в программное обеспечение для приобретения.
   2. Включите автоматический расчет CVC в настройках программного обеспечения.
9. Записывайте данные о перфузии и проводимости
   1. Настройте программное обеспечение так, чтобы оно автоматически вычисляло CVC, деля значения перфузии в реальном времени (APU) на MAP.
   2. Записывайте как исходные перфузионные единицы (PU), так и рассчитанные значения CVC одновременно на протяжении всего протокола.
      
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экспрессия микроваскулярной перфузии в виде CVC минимизирует запутанное влияние системных колебаний артериального давления и позволяет более надёжно сравнивать участников с разными гемодинамическими профилями.

Рисунок 1. Экспериментальная установка для оценки кожной микрососудистой перфузии с использованием лазерной спекл-контрастной визуализации (LSCI) в сочетании с ионофорезом. (A) Репрезентативная экспериментальная установка, используемая для оценки кожной микроваскулярной диагностики с использованием лазерной спекл-контрастной визуализации и ионофореза вазодилататорных агентов. (B) Репрезентативный микрососудистый перфузионный ответ во время трансдермальной ионтофоретической подачи кумулятивных доз ацетилхолина (ACh). (C) Репрезентативное изображение ионофореза ACh. (D) Репрезентативное изображение управляющего электрода с транспортным средством. Метки обозначают следующие компоненты: (1) головка имиджера; (2) электроды для доставки лекарств ионофореза; и (3) дисперсионный электрод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

3. Ионофорез и фармакологическая провокация

1. Подготовьте кожу к ионофорезу
   1. Очистите выбранные участки кожи вентрального предплечья с помощью безалкогольного физиологического раствора или мягкого очищающего средства для кожи.
   2. Аккуратно высушите кожу перед установкой электрода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерной механической стимуляции во время подготовки кожи, так как механически индуцированная вазодилатация может мешать исходным измерениям.
2. Позиционирование электродов для доставки лекарств
   1. Прикрепите два электрода для подачи лекарств к подготовленным участкам кожи с помощью двусторонних клеевых дисков (рисунок 1A).
   2. Поддерживайте расстояние между электродами примерно 5 см для предотвращения помех электрического тока.
3. Подготовьте решение ACh
   1. Заполните первую электродную камеру 200 мкл раствора ACh 2%, приготовленного в 0,9%^{физиологическом растворе 14,15}.
   2. Используйте электрод ACh для оценки эндотелиум-зависимой вазодилатации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранная концентрация препарата была оптимизирована для индуцирования устойчивого дозозависимого микрососудистого ответа при минимизации неспецифического раздражения и гальванических артефактов.
4. Подготовьте решение SNP
   1. Заполните вторую электродную камеру 200 мкл раствора 2% SNP, приготовленного в солевом растворе 0,9%.
   2. Используйте электрод SNP для оценки эндотелиум-независимой вазодилатации.
      ВНИМАНИЕ: SNP чувствительна к свету. Защитите раствор от воздействия света с помощью алюминиевой фольги и используйте его в течение 4 часов после приготовления для поддержания фармакологической стабильности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранная концентрация SNP способствует стабильной вазодилатации плато, минимизируя неспецифические электрические эффекты.
5. Удалите застрявшие пузырьки воздуха
   1. Осмотрите камеры электродов на наличие захваченных пузырьков воздуха перед прикреплением кожи.
   2. Удалите видимые воздушные пузырьки, аккуратно постукивая по камере электрода или используя стерильный пластиковый кончик шприца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки воздуха могут препятствовать току и приводить к неоднородной доставке препарата.
6. Положение опорного электрода
   1. Прикрепите опорный (нейтральный) электрод примерно на 15 см проксимально к электродам для доставки лекарства с помощью проводящего геля или клея (рисунок 1A).
   2. Подтвердите стабильный контакт с электродом перед началом ионофореза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пространственное разделение между фармакологическими и PORH оценочными областями минимизирует смешивающие взаимодействия и предотвращает перекрытие аксонного рефлексного вспышки, вызванного ACh, с областью измерения PORH.
7. Подключите систему ионофореза
   1. Подключите все электроды к блоку подачи ионофореза перед применением тока.
   2. Подтвердите полярность электрода перед началом протокола (анодальная для ACh; катодальная для SNP).
      ВНИМАНИЕ: Неправильная полярность электродов может снизить эффективность доставки препарата и изменить сосудистую реакцию.
8. Применить протокол тока ионофореза
   1. Введите шесть дополнительных токовых доз по 30, 60, 90, 120, 150 и 180 мкА для обоих фармакологических препаратов.
   2. Наносите каждую текущую дозу в течение 10 секунд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол инкрементального текущего тока позволяет построить кривую доза-ответ и облегчает оценку чувствительности микрососудистой и ответов^{плато 11}. Сочетание амплитуд низкого тока и коротких интервалов стимуляции минимизирует неспецифическую гальваническую вазодилатацию.
9. Сохраняйте интервал между стимуляциями
   1. Поддерживайте интервал в 60 секунд между последовательными токами.
   2. Отслеживайте сигнал перфузии в период стабилизации между дозами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранный интервал позволяет стабилизировать микрососудистый ответ при сохранении локальной доставки препарата без системных воздействий.
10. Запишите микроваскулярный ответ
    1. Фиксируйте сигнал микрососудистой перфузии непрерывно во всех стимуляциях ионофореза.
    2. Продолжайте запись не менее 10 минут после окончательного применения, чтобы зафиксировать максимальную плато-реакцию. Репрезентативный дозозависимый ответ показан на рисунке 2A.

Рисунок 2. Репрезентативные записи кожной микрососудистой перфузии во время ионофореза и постокклюзивной реактивной гиперемии (ПОРГ). (A) Репрезентативная запись кожного микрососудистого потока крови, полученного с помощью LSCI во время ионофореза 2% ACh, проводимого с использованием увеличивающихся анодальных токов 30, 60, 90, 120, 150 и 180 мкА в течение 10 секунд с интервалом в 1 минуту. (B) Репрезентативная запись, полученная во время оценки PORH. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

4. Постокклюзивно-реактивная гиперемия (PORH)

1. Позиционировать окклюзионную манжету
   1. Разместите стандартную пневматическую манжету (ширина примерно 12 см) на верхней части руки той же конечности, что используется для записи LSCI.
   2. Разместите манжету проксимально к выбранному месту микрососудистой оценки.
2. Определите регион оценки PORH
   1. Создайте третий ROI на вентральной предплечье рядом с электродными участками ионофореза.
   2. Разместить ROI в области кожи, свободной от лечения, чтобы избежать фармакологических помех.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте пространственное расстояние между участками фармакологической стимуляции и областью оценки PORH для сохранения независимых сосудистых реакций.
3. Получите базовую запись PORH
   1. Фиксируйте кожную перфузию в состоянии покоя непрерывно в течение 5 минут до окклюзии артерии.
   2. Отслеживайте базовый сигнал перфузии, чтобы подтвердить стабильность сигнала до надувания манжеты.
4. Индуцировать артериальную окклюзию
   1. Быстро надувайте пневматическую манжету в течение < 5 секунд с помощью автоматического надувного устройства или ручной надувания.
   2. Увеличьте давление в манжете до 50 мм рт. ст. выше ранее измеренного систолического давления (SBP) участника.
      ВНИМАНИЕ: Перед началом периода окклюзии подтвердите полную артериальную окклюзию, так как неполная окклюзия может нарушить гиперемический ответ.
5. Сохраняйте период окклюзии
   1. Поддерживайте артериальную окклюзию непрерывно ровно 3 минуты.
   2. Проверьте полную окклюзию, подтвердив, что сигнал LSCI уменьшается до биологического нулевого плато (< 10 APU).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Биологический нулевый сигнал отражает остаточное движение кровяных клеток независимо от направленного кровотока, включая броуновское движение.
6. Освободите окклюзионную манжету
   1. Мгновенно спустите давление манжеты с помощью быстрого выпускного клапана.
   2. Обеспечить немедленное восстановление кровотока для запуска реактивного гиперемического ответа.
7. Запишите гиперемический отклик
   1. Продолжайте запись LSCI не менее 5 минут после снятия манжеты.
   2. Зафиксировать пиковую перфузионную реакцию и последующий возврат к базовым уровням перфузии. Репрезентативный ответ PORH показан на рисунке 2B.
8. Количественно определить реакцию PORH
   1. Рассчитайте пиковый CVC в программном обеспечении для получения изображений.
   2. Вычислите площадь под кривой (AUC) гиперемического сигнала отклика с помощью программного обеспечения для анализа.

5. Извлечение данных и статистический анализ

1. Откройте и проверьте записанные данные
   1. Откройте файлы записанного получения с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
   2. Проверьте, что все заранее определённые ROI остаются правильно расположенными над соответствующими точками измерения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ROI переноса происходит только тогда, когда артефакты движения или дрейф захвата нарушают исходное размещение.
2. Определите интервалы анализа
   1. Определите конкретные интервалы анализа на графиках тренда перфузии и CVC.
   2. Выберите непрерывный базовый интервал в 60 секунд непосредственно перед первым сосудистым стимулом.
   3. Выберите последние 30 секунд каждого 60-секундного интервала после стимуляции ионофореза, чтобы зафиксировать микрососудистый ответ плато.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите базовую стабильность как коэффициент вариации (CV) < 5% перфузионного сигнала, чтобы минимизировать влияние вазомоторных колебаний и артефактов движения перед анализом данных.
3. Определите переменные отклика PORH
   1. Определите биологический нулевый сигнал во время фазы артериальной окклюзии протокола PORH.
   2. Определите пиковое значение CVC сразу после снятия манжеты.
4. Вычислите средние значения интервала
   1. Вычислите среднее значение CVC для каждого предварительно заданного интервала анализа с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
   2. Проверьте отсутствие артефактов движения перед подтверждением окончательных рассчитанных значений.
5. Организовывать извлеченные данные
   1. Экспортировать или вручную транскрибировать средние значения сырого PU и средние значения CVC в структурированную таблицу.
   2. Организуйте набор данных по группам исследований и сосудистым стимулам, включая ацетилхолин, нитропруссид натрия и ответы PORH.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте единообразные коды файлов и идентификации участников на протяжении всей обработки данных, чтобы минимизировать ошибки транскрипции.
6. Рассчитайте вторичные сосудистые исходы
   1. Рассчитайте процентное увеличение от исходных значений перфузии или CVC, чтобы определить сосудистую реактивность.
   2. Рассчитывайте AUC при необходимости для анализа вторичных конечных точек.
7. Проведение статистического анализа
   1. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения для статистического анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При применимости включайте репрезентативные скриншоты или инструкции по работе с программным анализом в качестве дополнительного материала.
   2. Оценка распределения данных
      1. Оценивайте нормальность данных с помощью теста Шапиро-Уилка.
      2. Выражайте нормально распределённые данные как среднее ± стандартное отклонение (SD).
      3. Экспрессируйте ненормально распределенные данные в виде медианы и межквартильного диапазона (IQR).
   3. Сравните микрососудистые реакции
      1. Сравните двухгрупповые наборы данных с помощью независимого t-теста, когда предположения нормальности выполняются.
      2. Сравните несколько групп с помощью одностороннего ANOVA, а затем тест Tukey's post-hoc.
   4. Определить критерии статистической значимости
      1. Определите статистическую значимость как p < 0,05.
      2. Обрабатывайте отсутствующие данные, вызванные артефактами движения, используя парное удаление или исключение из затронутого анализа.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Применяйте одну и ту же стратегию отсутствия данных последовательно во всех исследовательских группах для сохранения аналитической целостности.

Results

Успешное применение этого протокола даёт стабильную исходную линию, за которой следуют чёткие и различимые микрососудистые реакции на каждый сосудистый стимул. В технически успешном эксперименте базовая запись демонстрирует стабильный перфузионный сигнал с минимальными колебаниями, определяемый как SD < 10% от среднего сигнала. Во время ионофореза ACh и SNP ожидается поэтапное увеличение APU, отражающее дозозависимую вазодилатацию. Успешный ответ на PORH характеризуется быстрым снижением перфузии до стабильного биологического нуля во время окклюзии артерии, за которым следует резкий гиперемический пик сразу после отпускания манжеты, обычно достигающий значений в несколько раз выше базового уровня у здоровых пациентов. Рисунок 1A иллюстрирует экспериментальную схему, используемую для кожной микрососудистой оценки с использованием LSCI и ионофореза. На рисунках 1B–1D показаны представительные реакции ионофореза и расположение электродов. Рисунок 2A демонстрирует репрезентативный дозозависимый микрососудистый ответ во время ионофореза ACh, тогда как рисунок 2B демонстрирует репрезентативный ответ PORH.

Неоптимальные или технически неудачные записи обычно характеризуются нестабильностью сигнала или артефактами, связанными с движением. Высокочастотные всплески или резкие колебания базовой линии обычно указывают на движение участников или недостаточную стабилизацию системы поддержки вакуумной подушки. Сниженный или отсутствующий вазодилататорный ответ во время ионофореза у в целом здоровом участнике обычно указывает на плохой контакт электрода с кожей или задержание пузырьков воздуха в камере электрода, что приводит к нарушению подачи электрического тока. Рисунок 3 демонстрирует показательный пример недопустимой записи, характеризующейся нестабильностью сигнала, связанной с движением.

Рисунок 3. Типичный пример недопустимой микрососудистой перфузии во время ионофореза. Репрезентативная запись кожного микрососудистого потока крови, полученная с помощью LSCI во время ионофореза ACh, демонстрирующая нестабильность сигнала и артефакты, связанные с движением, неподходящие для количественного анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Неспособность достичь стабильного биологического нуля во время фазы окклюзии PORH указывает на неполную артериальную окклюзию, часто вызванную неправильным положением манжеты или недостаточной надутой манжеты. В таких условиях последующий гиперемический отклик становится ослабленным и непригодным для достоверной интерпретации.

Успешно выполненные протоколы генерируют воспроизводимые перфузионные и CVC-кривые. Максимальное плато CVC, наблюдаемое при ионофорезе SNP, отражает полную сосудистую ёмкость и структурную целостность сосудов, тогда как ответ, опосредованный ACh, в первую очередь отражает эндотелиально-зависимую микрососудистую функцию. Стандартизированное сравнение этих сосудистых ответов позволяет различать паттерны, соответствующие сохраненной и нарушенной функции микрососудистой системы. В таблице 1 представлены репрезентативные количественные микрососудистые параметры, полученные у здоровых молодых испытуемых и пациентов с резистентной артериальной гипертензией.

Микроваскулярный параметр	Подразделение	Здоровые молодые контроли (n = 25)	Пациенты с резистентной артериальной гипертензией (n = 50)	p-значение
Базовый CVC	APU/mmHg	0,37 ± 0,13	0,29 ± 0,12	0.01
Пиковый CVC, вызванный ACh,	APU/mmHg	0,67 ± 0,23	0,51 ± 0,19	0.004
Пиковый CVC, вызванный SNP	APU/mmHg	0,60 ± 0,21	0,41 ± 0,17	0.0003
PORH Peak CVC	APU/mmHg	0,87 ± 0,18	0,60 ± 0,16	< 0,0001

Таблица 1: Репрезентативные параметры микрососудистой реактивности у здоровых молодых пациентов и пациентов с резистентной артериальной гипертензией. Значения выражаются в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). p-значения рассчитывались с помощью независимого t-теста для сравнения между группами. Сокращения: ACh, ацетилхолин; SNP, нитропруссид натрия; PORH — постокклюзивно-реактивная гиперемия; CVC, кожная сосудистая проводимость; APU, произвольные единицы перфузии. Данные представляют собой неопубликованные результаты лаборатории авторов.

Discussion

LSCI предоставляет стандартизированный и неинвазивный подход к оценке системной микроваскулярной функции с высоким пространственным и временным разрешением. По сравнению с LDF, который ограничен одноточковыми измерениями и высокочувствительн к пространственной гетерогенности перфузии кожи, LSCI позволяет полностью полную визуализацию и одновременно оценивать несколько ROI. Эта характеристика значительно повышает воспроизводимость измерений и снижает коэффициент вариации в клинических микроваскулярных исследованиях. Кроме того, бесконтактный характер LSCI минимизирует локальные артефакты давления, часто связанные с методами на основе зондов, повышая его пригодность для повторных оценок в трансляционных и клинических исследованиях.

Ключевым элементом этого протокола является нормализация перфузионных данных в MAP для вычисления CVC. Поскольку кожная перфузия крови сильно зависит от системного перфузионного давления, интерпретация только исходного АФУ может привести к значительным запутанию, особенно в популяциях с изменённым гемодинамическим профилем, таких как гипертония или дислипидемия. По этой причине протокол рекомендует сообщать как о чистом ПУ, так и о нормализованных значениях CVC для улучшения интерпретации функции микрососудистых сосудов при различных физиологических и патологических условиях. Ещё одним важным аспектом протокола является строгая стабилизация окружающей среды и участников, включая контроль температуры в помещении, минимизацию артефактов движения и стандартизированное позиционирование участников, что необходимо для достижения воспроизводимых записей.

Также необходимо учитывать несколько ограничений LSCI. Метод в основном оценивает поверхностную кожную микроциркуляцию на глубине примерно 0,5–1 мм, поэтому может не полностью отражать более глубокие сосудистые слои. Кроме того, пигментация кожи и помехи окружающего света могут влиять на соотношение сигнал/шум, что подчёркивает важность описанных в этом протоколе мер контроля окружающей среды. Ещё одним ограничением является использование единого базового измерения MAP для расчета CVC на протяжении всей процедуры. Хотя системное артериальное давление может колебаться примерно в течение примерно 40-минутного периода записи, повторное надувание манжет было намеренно предотвращено, поскольку повторные измерения артериального давления могут вызвать симпатическую активацию и артефакты движения, мешающие сигналу лазерного спекла. Будущие исследования, интегрирующие непрерывный неинвазивный гемодинамический мониторинг, могут дополнительно улучшить физиологическую интерпретацию измерений микрососудистой проводимости.

Ключевые этапы протокола включают стабилизацию окружающей среды, управление движением, позиционирование электродов и полную окклюзию артерий во время PORH. Нестабильные исходные записи обычно вызваны движением участников или недостаточными периодами отдыха и могут быть минимизированы восстановлением стабилизации вакуумной амортизационной системы и продлением периода акклиматизации. Притуплённые ионтофоретические реакции часто свидетельствуют о плохом контакте электрода с кожей или о задержании воздушных пузырьков в камере подачи; Аккуратное заполнение камеры и перестановка электродов обычно решают эти проблемы. Неспособность достичь биологического нуля во время фазы окклюзии PORH обычно отражает неполную артериальную окклюзию, вызванную недостаточной надуванием манжет или неправильным расположением манжет. В таких условиях возникающая гиперемическая реакция становится ослабленной и непригодной для достоверной интерпретации.

Интеграция физиологических и фармакологических провокаций является одной из главных сторон этого протокола, поскольку эти подходы оценивают взаимодополняющие аспекты микрососудистой регуляции. PORH обеспечивает интегрированную физиологическую оценку микрососудистой реактивности, включающей эндотелиальные, нейрогенные и сосудистые гладкомышечные механизмы, вызванные временной ишемией и сдвиговым^{стрессом 16}. В отличие от этого, ионофорез позволяет селективно оценивать эндотелиально-зависимые и эндотелиально-независимые вазодилататорные^{пути 15}. ACh оценивает эндотелиально-зависимую вазодилатацию, опосредованную оксидом азота, тогда как SNP, прямой донор оксида азота, оценивает чувствительность гладкой мышцы сосудов независимо от эндотелиальной^{сигнализации 15}. Сравнительная интерпретация этих ответов позволяет различать функциональное нарушение эндотелиума и структурное микрососудистое ремоделирование. Это различие особенно актуально при старении, резистентной гипертензии, диабете и хронических метаболических заболеваниях, где нарушенное эндотелиальное сигналирование и микрососудистая рефракция могут^{сосуществовать 14,17}.

В заключение, этот стандартизированный протокол LSCI предоставляет воспроизводимый и трансляционно значимый метод для неинвазивной оценки здоровья микрососудистых организмов человека. Сочетание фармакологического ионофореза с физиологическим ишеми-реперфузионным тестированием позволяет детально охарактеризовать эндотелиальную и структурную сосудистую функцию, минимизируя экспериментальную вариабельность за счёт строгой стандартизации окружающей среды и гемодинамики. Учитывая чувствительность к раннему выявлению микроваскулярной дисфункции при различных сердечно-сосудистых и метаболических заболеваниях, этот подход является ценным инструментом для клинических исследований, лонгитюдного мониторинга и терапевтической оценки в трансляционной сосудистой медицине.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<Сильно>Снаряжение
Автоматический осциллометрический монитор давления	Omron Healthcare	HEM-7120	Используется для оценки базового среднего артериального давления (MAP) (3 измерения)
Цифровой калиброванный термометр	Delta OHM	HD2301.0	Точность и дополнение; 0,1&°; C для мониторинга комнатной температуры
Дисперсионный (Справочный) электрод	Перимед АВ	PF 384	Электрод с нейтральной поверхностью большой поверхности
Электроды для доставки лекарств	Перимед АВ	PF 383 / LI 611	Неинвазивные ионофорезные камеры (примерно 80 мм²)
Контроллер питания ионофореза	Перимед АВ	Периионтная микроваскулярная диагностика	Двухканальный контроллер тока (до 200 и микро; A)
Система лазерной спекл-контрастной визуализации (LSCI)	Перимед АВ	PeriCam PSI NR	Высокоразрешающая перфузионная камера
Медицинская вакуумная подушка	AB Germa	Н/Д	Используется для стабильного положения предплечья на уровне сердца
Одноручный вакуумный насос	AB Germa	Н/Д	Используется для эвакуации вакуумных подушек
Быстрый надуватель с манжетами	D.E. Hokanson, Inc.	E20 Rapid Cuff Inflator	Используется для стандартизированной артериальной окклюзии на 3 минуты
<сильные>реагенты и расходники
Хлорид ацетилхолина (ACh)	Сигма-Олдрич	A6625	Эндотелийно-зависимый вазодилататор, приготовленный при 2%
Алкогольные подготовочные подушки	Бектон Дикинсон	326895	Прокладки с 70% изопропиловым спиртом для подготовки кожи
Деионизированная вода	Сигма-Олдрич	38796	Используется для окончательного промывания электродов
Хлорид натрия (0,9% физиологического раствора)	Местный поставщик	Н/Д	Растворитель для приготовления лекарств и очистки кожи
Натрий Нитропруссид (SNP)	Сигма-Олдрич	S0501	Эндотелийно-независимый вазодилататор, приготовленный при 2%
Стерильная марля	Местный поставщик	Н/Д	Используется для сушки поверхности кожи после чистки
<Сильный>Софт
Программное обеспечение для анализа перфузии	Перимед АВ	PIMSoft	Программное обеспечение для сбора данных LSCI и анализа ROI
Программное обеспечение для статистического анализа	Программное обеспечение GraphPad	Призма 10	Используется для подгонки кривой доза-ответа и расчёта площади под кривой (AUC)