Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Holmium: Индукция контрактуры шеи мочевого пузыря с помощью лазера YAG в модели крыс

495 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71646

⸱

28 июля 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Urology, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 2Center of Nephrology and Rheumatology, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 3Beijing Institute of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол демонстрирует трансвезическую лазерную абляцию Ho:YAG для создания воспроизводимой модели фиброза шеи мочевого пузыря у крыс для изучения фиброзного ремоделирования, вызванного термическими травмами, и терапевтических вмешательств.

Аннотация

Контрактура шеи мочевого пузыря (БНК) — это фиброзное сужение выхода мочевого пузыря и сложное осложнение после трансуретральной резекции простаты (ТУРП). Существующие животные модели часто используют экстравезикальное перевязывание или химическую каутеризацию, которые недостаточно воспроизводят фиброз, вызванный термической травмой, возникающим после эндоскопической операции, и могут демонстрировать ограниченную воспроизводимость. Здесь мы описываем модель фиброза шеи мочевого пузыря у крысы, вызванную трансвезическим лазером Holmium:YAG (Ho:YAG лазер) абляции шеи мочевого пузыря. После небольшой лапаротомии и цистотомии по нижней средней линии в просвет мочевого пузыря под прямой визуализацией вводится лазерное волокно Ho:YAG размером 200 мкм. Энергия лазера подаётся в контактном режиме с частотами 1,0 Дж и 10 Гц в течение 5 с на каждую точку в положениях 3 и 9 часов шеи мочевого пузыря, что соответствует 50 Дж на точку и 100 Дж на животное. Через четыре недели у опрошедшённых животных наблюдается грубое увеличение мочевого пузыря, сужение шеи мочевого пузыря, утолщение стенки мочевого пузыря и гистологические признаки фиброзной ремоделирования, включая усиленное отложение коллагена и повышенную экспрессию коллагена типа I и III. Этот протокол предоставляет практическую модель, имитирующую локализованные рубцы, вызванные термической травмой, у выхода мочевого пузыря. Поскольку используются самки крыс и функциональное уродинамическое тестирование не проводилось в текущем исследовании, модель лучше всего подходит для изучения фиброза шеи мочевого пузыря и структурного ремоделирования, а не для полного воспроизведения мужского БНК после простатической операции. Модель может быть полезна для изучения фиброзных механизмов BNC и для доклинической оценки антифиброзных или реконструктивных вмешательств.

Введение

Контрактура шейки мочевого пузыря (БНК) — это фиброзное сужение шеи мочевого пузыря, которое часто происходит после трансуретральных процедур, особенноТУРП 1,2,3. Патологическая основа — чрезмерное образование рубцов и отложение коллагена после повреждения тканей и аномального заживленияран 4,5,6. Поскольку BNC может приводить к устойчивой дисфункции мочеисточения, повторяющимся вмешательствам и значительной заболеваемости, для изучения его патогенеза и лечения необходима воспроизводимая экспериментальнаямодель 7.

Для изучения обструкции выхода мочевого пузыря или периуретрального фиброза использовались несколько животных, включая экстравезикальную перевязкупроксимальной уретры 8 и другие открытые хирургическиеметоды 9. Хотя эти модели могут вызывать обструкцию мочи и гипертрофию детрузора, они не воспроизводят конкретно локализованное термическое повреждение, которое, как считается, инициирует послеоперационную БНК после эндоскопической операции. Кроме того, анатомическая мишень и степень повреждения часто трудно стандартизировать, что может увеличивать изменчивость между животными.

Идеальная модель, связанная с BNC, должна соответствовать трём критериям: она должна нацеливаться на анатомическую шею мочевого пузыря, воспроизводить контролируемые термические повреждения, аналогичные эндоскопическим энергетическим устройствам, и надёжно вызывать фиброзное сужение с приемлемой хирургической сложностью. Для решения этих потребностей мы разработали трансвезический лазерный протокол Ho:YAG у самок крыс. Были отобраны самки для облегчения хирургического воздействия и выделения специфических термических повреждений шеи мочевого пузыря и фиброзного ремоделирования без вмешательства предстательной ткани. Используя прямую внутривезическую визуализацию, этот метод обеспечивает точную передачу лазерной энергии на слизистое и подслизистую и подслизистую область мочевого пузыря, а также приводит к воспроизводимому фиброзному сужению выхода мочевого пузыря.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утверждёнными Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Комитета по этике благополучия экспериментальных животных Пекинского института традиционной китайской медицины (Одобрение No BJTCM-R-2025-03-02). Животных содержали в стандартных условиях с доступом к еде и воде ad libitum. В текущем протоколе было использовано всего 16 крыс, включая 8 крыс из контрольной группы без операций и 8 крыс в группе, обработанной лазером Ho:YAG. Два животных из группы Ho:YAG, обработанной лазером, умерли после операции. Дополнительные животные не были исключены из-за перфорации, сильного кровотечения или неудачной модельной индукции.

1. Предоперационная подготовка

  1. Подготовьте мелоксикам фармацевтического класса для периоперационной анальгезии (рисунок 1A), ингаляционную анестезию мелких животных (рисунок 1B), лазерную систему Ho:YAG с лазерным волокном диаметром 200 мкм (рисунок 1C), стерильные микрохирургические инструменты (рисунок 1D), 8-0 впитываемые плетёные швы (покрытая полигликолевой кислотой, PGA) для закрытия цистотомии, 4-0 впитываемые плетёные полиглактины 910 для закрытия кожи, стерильный физиологический раствор, стерильные шторы, стерильные ватные палочки и стерильная смазка (рисунок 1E).
  2. Индуцировать анестезию с 3%–4% изофлурана в кислороде в индукционной камере и поддерживать анестезию с 1,5%–2,5% изофлурана через носовой конус во время операции.
  3. Корректируйте концентрацию в соответствии с частотой дыхания и утверждённым институциональным протоколом на животных. Подтвердите достаточную глубину анестезии по отсутствию рефлекса сжатия пальца перед разрезом и пересмотрите глубину анестезии на протяжении всей процедуры.
  4. Подстригите шерсть широко от нижней части живота, чтобы драпировка закрывала оставшуюся шерсть и предотвращала контакт между инструментами и нестриженными волосами.
  5. Дезинфицировать хирургическое поле чередующимися повидон-йодными и 70% изопропиловыми спиртными скрабами; Выполните три применения каждого раствора перед драпировкой.
  6. Поместите животное в положение лежа на грелке с температурой 37 °C и поддерживайте стерильное состояние на протяжении всей процедуры.
  7. Если требуется заполнение мочевого пузыря или интраоперационная идентификация шеи мочевого пузыря, смазывайте небольшой стерильный катетер или канюлю стерильной смазкой, аккуратно вводите его через уретральный метус в мочевой пузырь и медленно вводите стерильный физиологический раствор. Избегайте резкого вставления или переполнения. Удалите или закрепите катетер в соответствии с запланированным хирургическим воздействием.

2. Воздействие мочевого пузыря

  1. Сделайте разрез кожи ниже средней линии 3–4 см в стерильных условиях (рисунок 2A).
  2. С помощью тонких щипцов и микроножниц разделяют подкожную ткань и открывают linea alba для входа в брюшинную полость.
  3. Аккуратно выделяйте мочевой пузырь наружу с помощью атравматических щипцов (рисунок 2B).
  4. Определите шею мочевого пузыря как место соединения между основанием мочевого пузыря и проксимальной уретрой.
  5. Поместите тупой зонд под шею мочевого пузыря, чтобы обеспечить мягкую поддержку и стабилизировать целевую область (рисунок 2C).

3. Трансвезическая лазерная абляция Ho:YAG

  1. Расширите мочевой пузырь стерильным физиологическим раствором, пока стенка мочевого пузыря не станет умеренно напряжённой. Избегайте чрезмерного расширения, которое может скрыть анатомические ориентиры или увеличить напряжение в месте цистотомии.
  2. Создайте продольную цистотомию 0,5 см в переднем куполе мочевого пузыря с помощью тонких микроножниц (рисунок 2D).
  3. Введите подготовленное 200-мкм лазерное волокно Ho:YAG через цистотомию в просвет мочевого пузыря.
  4. Продвигайте волокно под прямой визуализацией к шее мочевого пузыря.
  5. Аккуратно поместите кончик волокна в прямой контакт с слизистой шейки мочевого пузыря. Сохранять контактный режим без видимых вмятиний ткани; Убедитесь, что расстояние от кончика до тканей составляет примерно 0 мм на протяжении всей подачи энергии.
  6. Подавайте лазерную энергию на частотах 1,0 Дж и 10 Гц в течение 5 секунд на позиции 9 часов (рисунок 3A) и повторяйте на позиции 3 часа (рисунок 3B). Эта настройка обеспечивает 50 Дж на пункт и 100 Дж на животное, при этом мощность фиксирована на уровне 10 Вт у всех животных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная абляция обозначена равномерным отбеливанием слизистой и образованием мелкого кратера от слизистой до субслизистой без карбонизации.
  7. Держите волокно стабильным во время нанесения 5 секунд и избегайте вдавливания волокна в стену. Избегайте глубокого образования кратеров или перфорации всей толщины. Не направляйте волокно к отверстиям мочеточника или дистальной уретре.
  8. Удалите клетчатку и промите просвет мочевого пузыря стерильным физиологическим раствором, чтобы удалить мусор и подтвердить гемостаз.
  9. Закройте цистотомию с прерыванием 2–3 раза 8-0 васывающиеся плетёные швы (покрытые PGA) в водонепроницаемом виде.
  10. Заполните мочевой пузырь стерильным физиологическим раствором 0,5–1,0 мл для подтверждения отсутствия протечки из линии закрытия (рисунок 3C).
  11. Закройте брюшную стенку и кожу слоями (рисунок 3D).

4. Послеоперационный уход

  1. Держите крысу на грелке, пока она полностью не восстановится после наркоза.
  2. Вводите мелоксикам под кожу в дозе 1 мг/кг для послеоперационной анальгезии и продолжайте один раз в день в течение 1–3 дней или согласно утверждённому протоколу на животных.
  3. Ежедневно наблюдайте за животным не менее 7 дней на предмет признаков боли, недомогания, гематурии, задержки мочи, отслоения раны или инфекции.
  4. Обеспечивайте поддержку гидратации и размягчённую пищу по мере необходимости в ранний период восстановления.

5. Оценка контрактуры шеи мочевого пузыря

  1. Дайте животным восстановиться в течение 4 недель после операции, чтобы позволить фиброзную ремоделизацию шеи мочевого пузыря.
  2. В конце эксперимента усыпить животных с помощью передозировки пентобарбиталом натрия (150 мг/кг, внутрибрюшинно) или другого метода, одобренного институциональным протоколом для животных, и подтвердить смерть до извлечения тканей. Убрать мочевой пузырь, шею мочевого пузыря и проксимальную уретру в блоке.
  3. Откройте образец продольно и сфотографируйте шею мочевого пузыря, чтобы задокументировать грубое сужение.
  4. Зафиксировать ткань в 4% параформальдегиде при 4 °C в течение 24 часов, обезвожить с помощью градированного этанола, прочистить в ксилоле, внедрить в парафин и получить серийные 4-мкм сечения через область шеи мочевого пузыря.
  5. Срезы окрашиваются гематоксилином и эозином, трихромом Массона и пикросириусом красным в соответствии со стандартными гистологическими протоколами или инструкциями производителя для оценки сужения просвета, утолщения стенки шеи мочевого пузыря и отложения коллагена.
  6. Для иммуногистохимии депарафинизируют срезы, проводят забор антигена, блокируют эндогенную пероксидазу и неспецифическое связывание, инкубируют срезы антителами против коллагена I и III типа коллагена, применяют соответствующие вторичные антитела, разрабатывают с хромогеном и контрокрашиваются гематоксилином.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела разбавляются согласно рекомендациям производителя.
  7. Количественно определите площадь просвета и коллаген-положительную область с помощью программного обеспечения ImageJ/Fiji или аналогичного программного обеспечения для анализа изображений.
    1. Калибруйте шкалу пиксель в микрометр с помощью планки микроскопа, вручную определите просвет мочевого пузыря, шеи и область тканей, а также измерьте площадь просвета.
    2. Для трихромной окрашивания Массона применяйте единый цветовой порог для выявления синих пикселей с положительным коллагеном в интересующей области.
    3. Вычислите долю коллаген-положительной площади как коллаген-положительную площадь, делённую на общую площадь ткани.
    4. Проведите измерения сопоставимых участков и полей каждого животного и анализируйте изображения вслепую.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная индукция модели подтверждается сужением выхода из мочевой пузыря и гистологическими доказательствами концентрического фиброза и увеличенного отложения коллагена в месте поражения. Эффективность эксплуатации составила 6/8 в группе Ho:YAG, обработанной лазером, на основе развития ожидаемого валового и гистологического фенотипа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Через четыре недели после операции у крыс, обработанных лазером Ho:YAG, показали воспроизводимые грубые и гистологические изменения, соответствующие фиброзному сужению шеи мочевого пузыря. В этом исследовании контрольная группа без операций включала 8 крыс, а группа Ho:YAG, обработанная лазером, — 8 крыс. 6/8 обработанных животных развили ожидаемый фенотип; отток включал 2 послеоперационных смерти в группе Ho:YAG, обработанной лазером, без дополнительных исключений. Грубо, контрольный пу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании мы установили модель сужения фиброзного сужения шеи мочевого пузыря у крыс с помощью трансвезической лазерной абляции Ho:YAG. Основная сила этого метода заключается в том, что он вызывает контролируемое термическое повреждение анатомического шеи мочевого пузыря, за которым следует прогрессивная фиброзная ремоделирование. Это отличается от традиционных экстравезикальных моделей перевязки, которые в основном создают обструкцию за счёт внешнего сжатия, а не внутреннего о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (No 82474255 для H.R.) и исследовательской программой администрации TCM провинции Хэбэй (B2025018 для H.R.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Absorbable braided suture (coated PGA), 8-0Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd., Shanghai, ChinaR831
Anti-collagen I antibody, mouse monoclonalProteintech Group, Inc., Wuhan, China66761-1-Ig
Anti-collagen III antibody, mouse monoclonalProteintech Group, Inc., Wuhan, China68320-1-Ig
Coated Vicryl Plus suture (polyglactin 910), 4-0Ethicon, Inc. (Johnson & Johnson)VCP773DSH 26 mm ½-circle taper needle; violet braided; absorbable; Lot: RLMCJX
Hematoxylin and eosin (HE) staining kitServicebio, Wuhan, China2310005
Holmium-YAG Laser System (LITHO)Quanta System S.p.A, Italyhttps://www.quantasystem.com/laser/litho/1 J, 10 Hz, 10 W, 200 μm fiber
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibodyBoster, Wuhan, ChinaBA1050
IsofluraneRWD2025010601
Masson’s trichrome staining kitZhuhai Baso Biotechnology Co., Ltd., Zhuhai, Guangdong, ChinaBA4079B
Meloxicam InjectionQilu Animal Health, Shandong, ChinaE135H003
Paraformaldehyde (4%)Servicebio, Wuhan, China2510H0070148
Picrosirius red staining kitNanjing Senbeijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, Jiangsu, China20250228
Safety intravenous catheter, 24 GGuangdong Lily Medical Technology Co., Ltd., Foshan, Guangdong, ChinaAD4-240827
Small-animal inhalation anesthesia systemRWD Life Science, Shenzhen, Chinahttps://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/Induce with 3%–4% isoflurane in oxygen

Ссылки

  1. Wu Y, et al. Analysis of risk factors for bladder neck contracture after transurethral endoscopic surgery for benign prostatic hyperplasia. Aging Male. 2024;27(1):2429456.
  2. Rassweiler J, et al. Complications of transurethral resection of the prostate (TURP)--incidence, management, and prevention. Eur Urol. 2006;50(5):969-79; discussion 980.
  3. Simhan J, et al. Bladder neck contracture. Transl Androl Urol. 2014;3(2):214-20.
  4. Browne BM, Vanni AJ. Management of urethral stricture and bladder neck contracture following primary and salvage treatment of prostate cancer. Curr Urol Rep. 2017;18(10):76.
  5. Pakshir P, Hinz B. The big five in fibrosis: macrophages, myofibroblasts, matrix, mechanics, and miscommunication. Matrix Biol. 2018;68-69:81-93.
  6. Li L, Zhao Q, Kong W. Extracellular matrix remodeling and cardiac fibrosis. Matrix Biol. 2018;68-69:490-506.
  7. Ren Y, et al. Bladder neck contracture: incidence, mechanisms, and therapeutic advances. Ann Med Surg (Lond). 2025;87(11):7378-7389.
  8. Mattiasson A, Uvelius B. Changes in contractile properties in hypertrophic rat urinary bladder. J Urol. 1982;128(6):1340-2.
  9. Igawa Y, et al. A rat model for investigation of spinal mechanisms in detrusor instability associated with infravesical outflow obstruction. Urol Res. 1993;21(4):239-44.
  10. Varkarakis IM, et al. Comparison of erbium:yttrium-aluminum-garnet and holmium:yttrium-aluminum-garnet lasers for incision of urethra and bladder neck in an in vivo porcine model. Urology. 2005;65(1):191-5.
  11. Hu X, et al. Clinical comparison of TURP, PVP and HoLEP for small volume BPH. Sci Rep. 2025;15(1):34751.
  12. Kang D, et al. Morphological characterization of tissue destruction according to the distance between holmium:YAG laser tip and tissue surface. Int Neurourol J. 2024;28(3):196-206.
  13. Zhang SL, Wong AW. A novel technique for atraumatic transurethral catheterisation of male rats. Biol Open. 2024;13(9).
  14. Kendall RT, Feghali-Bostwick CA. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Front Pharmacol. 2014;5:123.
  15. Kitta T, et al. Benefits and limitations of animal models in partial bladder outlet obstruction for translational research. Int J Urol. 2018;25(1):36-44.
  16. Wang Y, et al. Urethral orifice hyaluronic acid injections: a novel animal model of bladder outlet obstruction. BMC Urol. 2015;15:8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Медицинавыпуск 233выпуск 233пустое значениевыпускгольмиевые YAG-лазерыживотные моделикрысыфиброзколлаген I типаколлаген III типаобструкция шейки мочевого пузыря
Holmium: Индукция контрактуры шеи мочевого пузыря с помощью лазера YAG в модели крыс
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.