Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обмен опытом по долгосрочной выживаемости в неартериализированной модели трансплантации печени крыс

114 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71650

⸱

22 мая 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Organ Transplantation Center, the Affiliated Hospital of Qingdao University, 2Institute of Organ Donation and Transplantation, Medical College of Qingdao University, 3Organ Transplant Center, Fujian Medical University Union Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Цель этого представленного протокола — поделиться оптимизированным хирургическим опытом для создания неартериализированной модели трансплантации печени крыс, с акцентом на технические усовершенствования, обеспечивающие долгосрочную выживаемость животных сверх 100 дней.

Аннотация

В экспериментальной трансплантации печени модель крыс является золотым стандартом для изучения иммунологии и метаболических процессов трансплантации; Однако реконструкция чрезвычайно тонкой печёночной артерии (~0,5 мм) представляет собой серьёзную техническую задачу. Для обхода этого широко используется упрощённая модель неартериализированной трансплантации печени крыс (NArLT). К сожалению, тяжёлые желчные осложнения — такие как вытекание желчи и ишемический холангит — возникающие вследствие артериальной депривации, часто ограничивают долгосрочную выживаемость реципиентов. Это препятствие значительно ограничивает исследования по ключевым темам, включая долгосрочную иммуносовместимость хозяина и трансплантат и хроническое отторжение. Здесь мы представляем оптимизированный протокол для модели NArLT, который включает критические технические доработки для успешного преодоления этих ишемических желчных повреждений. Ключевые улучшения включают значительно укорочённую анепатическую фазу, технику безприкосновенной дисекции желчных путей, тщательное промывление желчных путей и оптимизированный внутренний метод стентирования желчных путей. После внедрения этой улучшенной процедуры уровень выживаемости реципиента превысил 94% в течение 100-дневного периода наблюдения. В конечном итоге этот оптимизированный протокол предоставляет высоковоспроизводимую и надёжную платформу для изучения механизмов, лежащих в основе долгосрочной толерантности к трансплантации, тем самым поддерживая разработку новых терапевтических стратегий в трансплантационной медицине.

Введение

Модель трансплантации печени крысы является самой широко используемой экспериментальной платформой для фундаментальных исследований трансплантации. Однако его более широкое применение часто затрудняется известной крутой кривой обучения, которая может значительно замедлить прогресс экспериментальных исследований 1,2. Кроме того, традиционные модели трансплантации печени крыс часто страдают от неоптимального успеха хирургического вмешательства и низких долгосрочных показателей выживаемости. Благодаря критическому оптимизированию хирургических процедур, тщательному уточнению оперативных деталей и проведению сосудистых и желчных реконструкций под прямой визуализацией, кривая обучения, связанная с этой сложной микрохирургической моделью, может быть существенносокращена до 3,4. Трансплантация печени остаётся единственным лечебным методом лечения терминальной стадии заболеваний печени, что делает создание моделей трансплантации печени крыс глубоко значимым для научныхисследований 5,6.

Модель неартериализированной трансплантации печени крыс (NArLT) предлагает значительные преимущества в экспериментальной хирургии: она обходит серьёзную проблему микрососудистого артериального анастомоза, сокращает общее время операции и сокращает продолжительность анестезии у крыс. Несмотря на недостаток артериального кровоснабжения, результативный желчный ответ в этой модели предлагает уникальную перспективу для исследования ишемических желчных повреждений. Однако традиционные модели NArLT связаны с высоким уровнем послеоперационных осложнений желчных заболеваний до 30%7, что серьёзно снижает долгосрочную выживаемость. В традиционной классической модели трансплантации печени крыс долгосрочная выживаемость реципиента составляет менее 70%–85%8. Для решения этой проблемы в исследовании введен оптимизированный протокол с использованием мягкого желчного стента, обработанного гепарином. Используя метод «без прикосновения» желчной диссекции для максимизации перибилиарной микроваскулярной сети, а также тщательное промывление желчных путей холодной перфузии, этот подход направлен на фундаментальное снижение осложнений желчных заболеваний с помощью физической поддержки и ишемическойзащиты 9, в конечном итоге обеспечивая надёжную и стабильную платформу для долгосрочного иммунологического мониторинга.

Таким образом, максимизация успеха процедур и продление выживаемости реципиента являются основными целями любых технических инноваций в трансплантации печени крыс. Достижение этих целей является критически важным условием для обеспечения своевременного и непрерывного продвижения экспериментальных исследований на последующихэтапах 10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты и операции на животных в данном исследовании были одобрены Комитетом по этике экспериментальных животных Университета Циндао (No 20260301SD5020260401065). Прилагайте все усилия, чтобы минимизировать страдания животных.

1. Предоперационная подготовка

  1. Экспериментальные животные
    1. В качестве доноров используйте взрослых самцов крыс типа Sprague–Dawley (SD) возрастом 8–10 недель и весом 220–250 г. Убедитесь, что вес реципиента немного больше веса донора, с разницей в пределах 50 г.
    2. Домашние крысы в определённых условиях, свободных от патогенов, при контролируемой температуре 22°C ± 2°C и относительной влажности 50% ± 10%.
    3. Поддерживайте 12-часовой цикл свет/тьма с плотностью клетки 2–3 крысы в клетке.
    4. Обеспечьте стандартный лабораторный рацион грызунов. Позвольте крысам привыкнуть к лабораторной среде не менее 1 недели до хирургического вмешательства.
    5. Быстрые животные в течение 12 часов перед операцией. Разрешить доступ к воде ad libitum.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Голодание перед операцией помогает минимизировать риск аспирации во время анестезии и предотвращает расширение желудка, которое может ухудшить функцию дыхания и препятствовать хирургическому вмешательству.
  2. Хирургические инструменты и материалы
    1. Используйте инструменты, необходимые для трансплантационной операции, как показано на рисунке 1. Перечислите данные о расходниках, используемых в хирургии, в Таблице материалов.
    2. Выберите оболочки эпидуральных катетеров 5F и 6F, сопоставив внешний диаметр катетеров с физиологическими внутренними диаметрами целевых сосудов у самцов крыс с SD весом 220–250 г.
    3. Используйте оболочку 5F (примерно 1,67 мм) для портальной вены (PV). Используйте оболочку диаметром 6F (примерно 2,00 мм) для инфрапеченической нижней полой вены (IHIVC).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте размер катетера на основе сочетания анатомических стандартов и внутриоперационной визуальной оценки под хирургическим микроскопом. Проведите сравнение внешнего диаметра катетера в реальном времени с внутренним просветом целевого сосуда. Подходящее совпадение достигается, когда катетер занимает примерно 70–80% просвета сосуда, обеспечивая плавное введение без чрезмерного растяжения стенки сосуда и чрезмерной свободы. Для крыс с SD в указанном весовом диапазоне для начального выбора размера могут использоваться заранее заданные анатомические диаметры сосудов, которые следует корректировать внутриоперационно в зависимости от индивидуальных вариаций. Операторы должны устанавливать соотношение сосуда с катетером через предварительное микрохирургическое обучение.
    4. Для крыс с синдромом SD в возрасте 8–10 недель выберите оболочки эпидурального катетера 5F и 6F в качестве манжет для PV и IHIVC соответственно (рисунок 2A).
    5. Подготовьте манжеты с общей функциональной длиной (трубчатое тело) 2,0–2,5 мм. Сохраняйте длину удлинения 3,0–4,0 мм для обращения с щипцем.
    6. Зажмите стенку манжеты челюстями комарных щипцов, чтобы создать окружной канавку, расположенную примерно в 0,5–1,0 мм от проксимального края манжеты (см. рисунок 2A для подробностей). Поддерживайте глубину канавки примерно 0,1–0,2 мм для надёжного завязывания узлов и последующего фиксирования.
    7. Убедитесь, что паз не позволяет 7-0 скользить с жёсткой поверхности катетера.
    8. Обрежьте внутривенный катетер объемом 22G, чтобы создать желчный стент с наклонёнными или скошенными концами. Убедитесь, что длина составляет 5–7 мм.
    9. Предпочитаю длину стента 7 мм. Корректируйте длину в зависимости от анатомических вариаций, используя горизонтальный уровень правой желудочной вены в качестве ориентира. Оцените расстояние от этого ориентира до печёночного холма, чтобы определить длину стента.
    10. Укоротите стент (примерно до 5–6 мм), если предполагаемое расстояние ограничено или при установке возникает сопротивление. Убедитесь, что примерно 2–3 мм стента можно вставить в желчный проток без изгиба, изгиба или выступа.
    11. Замочить стент в гепаринизированном физрастворе (100 МЕ/мл) при комнатной температуре (23°C ± 2°C). Сохраняйте стент в погружении минимум 30 минут перед использованием, чтобы предотвратить внутрисветовое свертывание желчи при введении в желчный просвет донора (рисунок 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте манжету перед операцией и используйте щипцы для комаров, чтобы создать борозды в стенке манжеты для облегчения завязывания узлов и фиксации после успешной канюляции. Убедитесь, что концы обрезанного желчного стента не слишком острые, чтобы предотвратить перфорацию желчных протоков. Под хирургическим микроскопом (увеличение 10×–16×) подтверждается, что срезаная кромка чиста и свободна от зазубренных пластиковых заусенцев; Если кончик кажется игольчатым, немного притупите его с помощью микроножниц. Во время манипуляций используйте только мелкие, беззубчатые микрощипцы для работы со стентом. Избегайте чрезмерного внешнего усилия, что подтверждается выравниванием, овализацией или изгибом просвета стента; Сбросить и заменить любой деформированный стент, так как сужение люминального движения увеличивает риск послеоперационных осложнений желчной системы.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Хирургические инструменты, используемые при пересадке. (А) Нержавеющая стальная почечная чаша. (B) Держатели для микро-иглы. (C) Микроножницы. (D) Микрощипцы (прямые и изогнутые). (E) Микрососудистые зажимы и маленькие зажимы в стиле бульдога в стиле комаров. (F) Стандартный держатель для иглы. (G) Прямые гемостатические щипцы (комарные щипцы). (H) Сосудистый зажим. (I) Стандартные хирургические ножницы. (J) Резинка (сделанная из манжеты стерильной хирургической перчатки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Изготовленные на заказ хирургические манжеты, желчный стент и планируемые разрезы на животе. (A) Подготовка сосудистых манжет и желчного стента вместе с миллиметровой линейкой. Слева направо: оболочка эпидурального катетера 6F, используемая для манжеты инфрагепатиальной нижней полой вены (IHIVC), оболочка 5F для манжеты воротной вены (PV), и желчный стент диаметром 5–7 мм, снятый из внутривенного катетера 22G. (B) Крестообразный разрез на брюшной животной донорской крысе для максимального хирургического воздействия. (C) Стандартный разрез для лапаротомии по средней линии на брюшке крысы реципиента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

2. Донорская операция

  1. Начальные шаги
    1. Анестезия донорской крысы с использованием 5% изофлурана при потоке воздуха 1 л/мин в индукционной камере. Оцените глубину анестезии, подтвердив отсутствие спонтанных движений конечностей и отменного рефлекса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина анестезии оценивается по наблюдению за отсутствием спонтанного движения конечностей, отсутствием отменного рефлекса и частотой дыхания. Для обеспечения плавного и безопасного хода операции эти параметры строго пересматриваются каждые 20 минут на протяжении всей процедуры.
    2. Вводите 1% пентобарбитала (40–45 мг/кг) через интрабрюшинную инъекцию в правую нижню часть живота, примерно на 1–2 см латерально от средней линии (linea alba) и 1–2 см черепа в правую паховую связку. Убедитесь, что анестезия достаточно, защемнив заднюю лапу и убедившись, что нет отменного рефлекса.
    3. Разместите донорскую крысу в положении на спине на грелке 37°C для поддержания температуры тела во время операции.
    4. Побрить область абдоминальной хирургии. Продезинфицируйте участок повидон-йодом три раза.
  2. Процедуры перед перфузией печени
    1. Сделайте крестообразный разрез, простирающийся вверх от ксифовидного отростка, вниз до лобкового симфиза и латерально до подмышечной средней линии, чтобы максимизировать обнажение хирургического поля (рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите лапаротомию в два слоя. Сначала разрезайте кожу и подкожную ткань. Затем закрыйте линеа альба щипцами и сделайте небольшой начальный разрез, чтобы воздух прошёл, из-за чего внутренности отпадают. Удлините разрез ножницами, оставляя нижнюю лезвие параллельно брюшной стенке, чтобы предотвратить повреждение органов.
    2. Обмотайте кишечник марлей, пропитанной солевым раствором. Разместите их на стерильном операционном поле с левой стороны живота, чтобы открыть операционную зону.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно поддерживать постоянную влажность выпотрошенного кишечника на протяжении всей процедуры, чтобы предотвратить ишемическое высушивание и гипотермию. Периодически увлажняйте покрывающую марлю, нанося капли тёплого (37°C) обычного физиологического раствора примерно каждые 10–15 минут или сразу после того, как марля начинает высыхать под хирургическим освещением.
    3. Разделите фальциформную связку. Зажать и втянуть отросток в черепах, чтобы обнажить надпеченочную вену (SHIVC) и левую нижнюю френическую вену.
    4. Разделите левую треугольную связку. Перевязывайте левую френическую вену близко к SHIVC с помощью 7-0 или 8-0 шов (рисунок 3A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При перевязке левой нижней френической вены расположите связку ближе к SHIVC. Имейте в виду, что игла для шва может легко проколоть диафрагму и вызвать пневмоторакс; Наложите шов близко к кровеносному сосуду.
    5. Электрокоагуляция рекомендуется для деления сосудов, чтобы добиться быстрого гемостаза и сократить время операции, тем самым улучшая процедурную согласованность и воспроизводимость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Электрокоагуляция стандартизирует гемостаз, сокращает время работы и улучшает воспроизводимость между операторами.
    6. Мобилизуйте хвостатую и папиллярную доли (рисунок 3B).
    7. Используйте микроскопические щипцы для удаления жира и соединительной ткани с поверхности IHIVC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите соединительную ткань, пока стенка сосуда не станет гладкой и прозрачной. Достаточное облучение достигается, когда сосудистые зажимы можно применять без помех и при отсутствии остаточных тканей, которые могли бы навредить манжетам или швам.
    8. Перевязать правую надпочечниковую вену вплотную с IHIVC. Изолируйте правую почечную вену и перевяжите её, чтобы она была запорошена с IHIVC.
    9. Продолжайте вскрытие IHIVC каудально до уровня чуть выше левой почечной вены (рисунок 3C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что IHIVC тщательно скелетизирован (максимально полностью отделить кровеносные сосуды от жировой соединительной ткани) во время вскрытия. Это облегчает последующие процедуры эксплантации печени и крепления манжет.
    10. Аккуратно поднимите печень ватной палочкой. Вскрытие связок между правой нижней печёночной долей и ретробрюшитонеум.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите SHIVC как короткий, широкий, тонкостенный синеватый сосуд на верхнем полюсе печени. Останавливают диссекция, когда передняя поверхность очищена и соседние диафрагмальные волокна станут видимы.
    11. Прекращайте вскрытие при прибытии в SHIVC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь с печенью с максимальной осторожностью, чтобы предотвратить паренхимальные повреждения. Будьте осторожны для защиты IVC во время ретроперитонеального рассечения черепа.
    12. Вскрытие соединительной ткани между ПВ и правильным HA. Изолируйте фотоэлектрический эффект.
    13. Перевязывайте правую желудочную вену (пилорическую вену) вплотную с ПВ. Продолжайте вскрытие до корня селезёночной вены.
    14. Обнажите порта гепатис. Идентифицируйте жировую соединительную ткань, похожую на пуповину, расположенную слева от PV, охватывающую общий желчный проток (CBD) и HA.
    15. Сделайте разрез в форме буквы «V» на передней стенке CBD, на расстоянии 3–5 мм от бифуркации печеночных протоков.
    16. Используйте микрощипцы для удержания желчного стента. Введите стент примерно на 3 мм в желчный путь, сохраняя параллельное выравнивание с протоком.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Двигайте стент плавно, без сопротивления. Убедитесь, что нет боковых выпячиваний, углов или набора стенок воздуховодов. Если возникает сопротивление или деформация, убратитесь и выровняйте перед повторной установкой.
    17. Закрепите стент шёлковым завязкой 7-0 с кольцом. Перевязать ГК на уровне разреза и пересекать её проксималально (рисунок 3D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Строго избегайте чрезмерной «скелетизации» при вскрытии донорского КБД. Сохраняйте перибилиарную соединительную ткань, нервные сплетения и микрососудистые сети для стимулирования раннего коллатерального кровообращения и послеоперационного заживления желчных органов. Поскольку дистальный конец донорского протока является наиболее ишемичной областью, анестомотический участок держите близко к печеночному холму, чтобы минимизировать ишемическую нагрузку.
  3. Перфузия печени
    1. Обнажите брюшную аорту. Введите иглу для вены на коже головы диаметром 23 (23 G) (примерно 1 см), соединённую с шприцем объемом 20 мл, наполненным холодным раствором Университета Висконсина (UW).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Введите иглу в брюшную аорту под малым углом (15°–20°). Подтвердите вход, наблюдая флэшбэк артериальной крови, затем немного продвигайтесь и выровняйте иглу параллельно сосуду, чтобы предотвратить перфорацию задней стенки.
    2. Перед инфузией удалите воздух из шприца. Зажмите и исправьте брюшную аорту и иглу с помощью сосудистого зажима.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите весь воздух из шприца, постукивая для удаления пузырьков и выделяя жидкость, пока на кончике иглы не появится непрерывная капля. Проверьте отсутствие воздуха в игольной втулке до каннуляции.
    3. Медленно инициируйте перфузию, вручную нажимая на шприц с постоянной скоростью 3–3,5 мл/мин (рисунок 3E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите правильное внутрисосудистое размещение, наблюдая за возвратом крови в трубке.
    4. Разрезайте диафрагму. Полностью экспонируйте грудной и грудной аорту.
    5. Зажмите грудную IVC в месте его соединения с правым предсердием вместе с грудной аортой, используя сосудистые зажимы.
    6. Перерезайте грудную IVC непосредственно под зажимом, чтобы обеспечить выток перфусата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наместите зажим как можно глубже и прорезайте под ним, чтобы сохранить длину сосуда. Немедленно начните перфузию, чтобы предотвратить свертывание и сохранить качество трансплантата.
    7. Продолжайте перфузию с постоянной скоростью (3–3,5 мл/мин) до общего объёма примерно 40 мл.
    8. Остановить перфузию, когда паренхима печени становится полностью бледной (желтовато-коричневой) (рисунок 3F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Адекватная перфузия подтверждается, когда печень становится равномерно бледной (желтовато-коричневой), а сточные каналы из пересектированного IHIVC прозрачны, без остаточной крови.
    9. Перерезайте IHIVC с левой почечной веной. Прорезать ПВ на уровне селезёночной вены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте быстрого или насильственного введения перфусата для предотвращения эндотелиального и паренхимального повреждения.
    10. Увеличьте диафрагмальный разрез. Собирайте печеночный трансплантат по блоку с прикреплённой диафрагмой.
    11. Поместите прививку в стерильную чашку Петри с холодным раствором для сохранения UW.
    12. Сохраняйте трансплантат в холодном растворе UW при 4°C. Завершение трансплантации в течение 2 часов после закупки.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Ключевые хирургические этапы при мобилизации печени донора и перфузии in situ. (A) Экспозиция и перевязка левой нижней френической вены. (B) Изоляция и разделение гепато-пищеводных коммуникационных ветвей. (C) Диссекция IHIVC, демонстрирующая перевязку правой надпочечниковой и правой почечной вен. (D) Установка специального желчного стента в общий желчный проток (КБД) с использованием техники «без прикосновения» для сохранения перибилиарной соединительной ткани. (E) Канюляция брюшной аорты для инициации холодной in situ перфузии. (F) Полностью перфузировавшая донорская печень с равномерно бледным видом, что свидетельствует о успешном вымывании крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

3. Подготовка к трансплантату ex vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Всю экс-виво подготовку трансплантата проводите на льду (рисунок 4A). Поддерживайте прививку в растворе UW при температуре 4°C ± 2°C и периодически контролируйте температуру для обеспечения достаточного сохранения холода.

figure-protocol-4
Рисунок 4. Ex vivo подготовка донорского трансплантата печени. (A) Собранный трансплантат печени помещён в стерильную чашку Петри с холодным раствором сохранения UW, помещаемый на дроблённый лёд для поддержания гипотермии. (B) Заковывание донорского PV путём эверсии над индивидуальной манжетой и фиксация с помощью окружной связки. (C) Завершена подготовка манжет к ПВ и IHIVC, с установкой желчного стента. (D) Подготовка надпеченного IVC (SHIVC) с наложением швов на обоих боковых углах для облегчения последующего анастомоза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Подготовка фотоэлектрических манжет
    1. Захватите хвост манжеты с помощью щипцев для комаров и закрепите его так, чтобы хвостовой конец был направлен вниз, перпендикулярно нижней части чашки Петри.
    2. Пропустите микрощипцы через просвет манжеты. Протяните фотоэлектрический прибор через манжету.
    3. Отрегулируйте переднюю стенку PV. Развернуть примерно 3 мм от стенки сосуда над расширенным концом хвоста манжеты.
    4. Закрепите вывернутый сосуд на внешней стенке манжеты с помощью окружной шёлковой завязки 7-0 (рисунок 4B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что сосуд и манжета выровнены без кручения или угла. После фиксации промите PV-манжету примерно 1 мл раствора UW и подтвердите проступность, наблюдая выброс из SHIVC.
  2. Подготовка манжет IHIVC
    1. Подготовка и закрепление IHIVC выполняются с использованием точно тех же этапов, что и для PV в шаге 3.1. Кратко, это включает мобилизацию сосудов, тримирование и фиксацию манжет по тому же стандартизированному протоколу для обеспечения экспериментальной согласованности и воспроизводимости. (Рисунок 4C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите педактность манжеты IHIVC, наблюдая за непрепятственным вытоком из SHIVC после промыва.
  3. Промывка желчных путей
    1. Аккуратно промывайте желчный проток через желчный стент с помощью шприца объемом 1 мл, содержащего 0,5 мл раствора UW.
    2. Убедитесь, что во время промывки не происходит протечки жидкости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие утечки жидкости подтверждает целостность желчного протока.
  4. Подготовка SHIVC
    1. Уменьшите SHIVC печеночного трансплантата, удаляя остаточную диафрагму.
    2. Убедитесь, что SHIVC полностью скелетизирован, как определено в шаге 2.2.7.
  5. Установка шва в стойке
    1. Используйте 7-0 или 8-0 Швы основаны на предпочтениях оператора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С точки зрения хирургических исходов (включая анастомотическую проходимость и выживаемость реципиента) оба размера шва функционально равны в этой модели. Выбор между ними может основываться исключительно на личных предпочтениях оператора или доступности лаборатории, не влияя на воспроизводимость процедуры.
    2. Аккуратно выровняйте пень. Наместите швы на левый и правый боковые уголки, проведя иглу изнутри наружу, примерно в 1 мм от края (рисунок 4D).

4. Операция получателя

  1. Начальные шаги
    1. Анестезировать крысу-реципиента по тому же протоколу, что и для донора (шаг 2.1.1).
    2. Поместите крысу-реципиента на термостатически контролируемую грелку, поддерживаемую при 37°C.
    3. ПРИМЕЧАНИЕ: Взвесьте крысу-реципиента перед анестезией. Убедитесь, что масса донора превышает вес донора примерно на 50 г.
  2. Мобилизация печени реципиента
    1. Проведите лапаротомию по средней линии.
    2. Втяните брюшную стенку вбок с помощью четырёх эластичных ретракторов. Расположите два верхних ретрактора латерально от двусторонних реберных краёв, а два нижних — латерально от двусторонних паховых областей для оптимального воздействия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Примените достаточное втягивание для открытия операционного поля, избегая чрезмерного напряжения, которое может вызвать бланширование тканей или ухудшить дыхание.
    3. Перевязать левую нижнюю френическую вену (LIPV) таким же образом, как описано для донорской процедуры (см. шаг 2.2.1).
    4. Вскрытие связок между левой долей печени и ретробрютинеумом. Мобилизуйте хвостатую и папиллярную доли.
    5. Разделите связки и соединяющие ветви между пищеводом и левой долей печени с помощью электрокоагуляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Электрокоагуляция рекомендуется для обеспечения быстрого гемостаза, сокращения времени операции и повышения процедурной воспроизводимости.
    6. Грубо вскрыть IHIVC до уровня правой почечной вены.
    7. Тщательно изолируйте и перевязывайте левую надпочечниковую вену примерно в 2 мм от её слияния с IHIVC.
    8. Управляйте правой нижней долей печени таким же образом, как описано для донорской процедуры (см. шаг 2.2.4).
    9. Проведите резинку (сделанную из манжеты стерильной хирургической перчатки длиной примерно 10 см) поперечно за SHIVC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Примените мягкую тягу, чтобы открыть SHIVC, не ограничивая дыхательные движения.
    10. Оставьте резинку на месте для использования при последующем разрезе SHIVC.
    11. Рассекать и изолировать PV от печеночного жила до уровня ветви пилорической вены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте диссекцию ФВ только анастомотической. Сохраняйте прилегающие притоки для снижения хирургической травмы.
    12. Изолируйте ХА в печеночном холме.
    13. Перевяжите HA вплотную к hilum и перерезайте её проксималально.
    14. Определите слияние левого и правого печеночных протоков, образующих КБД ниже печеночного холма. Перевязывайте CBD на этом участке с помощью шва 7-0 пролена и перерезайте его (рисунок 5A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизировать хирургическую травму в этой области. Сохраняйте максимально возможную длину HA вместе с перибилиарной соединительной тканью, нервными сплетениями и микрососудистой сетью для раннего установления коллатерального кровообращения.
  3. Реципиент гепатэктомия
    1. Примените микрососудистые зажимы, чтобы немедленно перекрыть IHIVC в правую почечную вену.
    2. Примените микрососудистый зажим, чтобы закрыть ПВ прямо над её соединением с пилорической веной.
    3. Подтвердите успешную сосудистую окклюзию, наблюдая заметное потемнение печеночных паренхим.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердить сосудистую окклюзию путём равномерного потемнения (цианоза) печени, потери паренхимального тургора и коллапса ПВ.
    4. Введите иглу для вены на коже головы объемом 23G, прикреплённую к шприцу объемом 5 мл, в PV.
    5. Ввести 2 мл раствора глюкозы 5% примерно в течение 30 секунд для промывания внутрипеченочной крови в системный кровообращение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Медленно вводите через ПВ возле печёночного холма, чтобы промыть внутрипеченочную кровь в системное кровообращение.
    6. Примените сцепление вниз к резинке, чтобы открыть SHIVC.
    7. Кросс-кламп SHIVC с помощью сосудистого зажима (рисунок 5B).
    8. Прорезать IHIVC, PV и SHIVC с печёночной паренхимой.
    9. Полностью удалите родную печень из брюшной полости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте анепатическую фазу в течение 26 минут (не более 30 минут). Сосуды для пересечения сосудов прижимаются к печени, чтобы сохранить достаточную длину и обеспечить гладкие сосудистые пни.
  4. Имплантация печёночного трансплантата
    1. Реконструкция SHIVC
      1. Разместить печеночный трансплантат в его ортотопической анатомической ориентации.
      2. Используйте заранее наложенный шов размером 7-0 в левом углу, чтобы начать непрерывное накладывание задней стенки к правому углу.
      3. Закрепите шов на шве в правом углу.
      4. Продолжите бегущий шов вдоль передней стенки, чтобы завершить анастомоз (рисунок 6A–6C).
      5. Поддерживайте расстояние входа иглы от края сосуда 0,5–1,0 мм.
      6. Поддерживайте шаг шва 1,0–1,5 мм.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте равномерное расстояние между иглами и шаг накладки швов, чтобы обеспечить надёжный и безнатяжённый анастомоз.
      7. Затягивайте шов после каждого петля, чтобы устранить мёртвое пространство и сохранить соответствующее натяжение.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Перед завершением шва передней стенки промите SHIVC раствором UW с помощью встроенной игли, чтобы вывести остатки воздуха и предотвратить воздушную эмболию.
    2. Реконструкция PV
      1. Поставьте швы 7-0 в левый и правый углы PV-стойки получателя.
      2. Примените трёхточечное сцепление, чтобы создать треугольное отверстие.
      3. Введите ПВ с наручниками донора в просвет.
      4. Закрепите с помощью лигатуры 7-0, привязанной к окружной канавке (рисунок 6D–6F).
    3. Реконструкция IHIVC
      1. Реконструировать IHIVC с помощью той же техники, что и реконструкции PV (см. шаг 4.4.2) (рисунок 6G–6I).
    4. Реперфузия
      1. Последовательно высвобождаются сосудистые зажимы на SHIVC, PV и IHIVC.
      2. Подтвердите успешную реперфузию, наблюдая однородное восстановление цвета трансплантата без заложенности, кровоизлияния или протекания (рисунок 7A).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Активное выделение желчи из желчного протока указывает на восстановление печеночной перфузии и раннюю функцию трансплантата.
    5. Реконструкция желчных арий
      1. Сделайте небольшой поперечный разрез (половину диаметра протока) на передней стенке культа CBD получателя.
      2. Вставьте донорский желчный стент примерно на 3 мм в просвет CBD.
      3. Закрепите стент окружным швом 7-0 (рисунок 7B).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Перед завершением реконструкции наблюдайте активное выделение желчи с дистального кончика донорского стента. Это подтверждает проходимость и раннюю функцию трансплантата.
  5. Потепление получателя
    1. Промыть брюшную полость 150 мл физиологического раствора при 37°C перед закрывкой брюшной полости 150 мл физиологического раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап удаляет остаточную кровь, восстанавливает температуру тела и позволяет проверять гемостаз в анастомозах SHIVC, IHIVC и PV.
  6. Закрытие брюшной полости и послеоперационный уход
    1. Закройте мышечно-фасциальный слой непрерывным швом с впитывающейся нитью 4-0, делая укусы по 5 мм с интервалом в 1 см.
    2. Закройте кожу непрерывным швом шелковой нитью 4-0.
    3. Вводите бупренорфин (0,1 мг/кг) подкожно каждые 12 часов, всего 2 дозы.
    4. Переместите крысу-реципиента в чистую клетку с контролируемой температурой.
    5. Проводите непрерывный мониторинг до полного восстановления после анестезии и возобновления нормального спонтанного движения.

figure-protocol-5
Рисунок 5. Ключевые хирургические этапы при мобилизации печени и гепатэктомии реципиента. (A) Идентификация и перевязка КБД получателя возле гиларной бифуркации. (B) Экспозиция и перекрёстное зажим SHIVC. Резинка накладывается за SHIVC для обеспечения сцепления и улучшения визуализации при зажиме. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-protocol-6
Рисунок 6. Ключевые хирургические этапы сосудистой реконструкции при имплантации печеночных трансплантатов . Реконструкция SHIVC: (A) выравнивание с использованием угловых швов, (B) непрерывное накладывание задней стенки и (C) завершение передней стенки швов. Реконструкция PV с использованием техники манжеты: (D) трёхточечная тяга, (E) введение зафиксированного донорского PV, и (F) перевязка с закреплением манжеты. Реконструкция IHIVC с использованием той же техники манжеты: (G) экспозиция, (H) введение и (I) перевязка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-protocol-7
Рисунок 7. Подтверждение функции трансплантата, реконструкции желчных аручастков и послеоперационного восстановления. (A) Оценка ранней функции трансплантата после реперфузии с видимым выделением желчи из донорского желчного стента. Видны реконструкции PV и IHIVC. (B) Завершена реконструкция желчной системы с установкой и фиксацией донорского желчного стента в реципиента CBD. (C) Репрезентативная крыса-реципиент, демонстрирующая полное послеоперационное восстановление с нормальной осанкой и спонтанной активностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для обеспечения стабильного хирургического качества и воспроизводимости во всех моделях NArLT все процедуры выполнялись одним и тем же опытным микрохирургом. Всего за период исследования было проведено 50 трансплантаций печени крыс. Средняя продолжительность хирургических процедур была следующей: средняя продолжительность донорской операции составляла 25,3 ± 2,6 мин, подготовка трансплантата ex vivo — 13,1 ± 2,1 мин, операция реципиента — 43,0 ± 1,6 мин, а анепатическая фаза — 15,7 ± 1,2...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Модель NArLT является краеугольным камнем экспериментальных исследований трансплантации благодаря избеганию сложного микрососудистого артериальногоанастомоза 11. Однако традиционные методы NArLT исторически страдают от высокого уровня осложнений желчных заболеваний — до 30% — которые серьёзно ограничивают долгосрочную выживаемость и мешают проведению хроническихиммунологических исследований 2. Значимость предлагаемого метода заключается в е...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликтах интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 82370666), Ключевой научно-исследовательской программой провинции Шаньдун, Китай (No 2025KJHZ016) и проектом по технологии здравоохранения провинции Фуцзянь (No 2023CXA014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Всыпаемый шов 4-0EthiconW9109HИспользуется для закрытия мышечно-фасциального слоя (linea alba)
4-0 Шёлковый шовEthiconVCP304HИспользуется для закрытия кожи
7-0 или 8-0 Швы / Шёлковый галстукEthiconZ1711EИспользуется для перевязки сосудов (например, левой френической вены)
Внутривенный катетер 22GБ. Браун4252098BОбрезано до 5– 7 мм с наклонными концами для подготовки желчного стента
23G игла для вены кожи головыShandong Qinkai Medical Industry Co., Ltd.MDLSSVSИспользуется для установки в брюшную аорту для перфузии печени
БупренорфинТяньцзиньский институт фармацевтических исследований Pharmaceutical Co., Ltd.H12020275Введение в виде подкожной анальгезии после операции
Ватная палочкаAoocn216-236Используется для мягкого поднятия печени во время вскрытия
Дроблённый лёдН/ДН/ДИспользуется для поддержания температуры трансплантата во время подготовки ex vivo
Эластичные ретракторыН/ДН/ДИспользуется для втягивания брюшной стенки во время лапаротомии
Оболочки для эпидурального катетераJiangsu Maichuang Medical Device Co., Ltd.20173084015Размеры 5F и 6F; использовался как манжеты для PV и IHIVC
МарляЦентральная медицинская технологическая компания, Ltd.CH-1001Пропитанный солевым раствором; Используется для защиты кишечника
Раствор глюкозы (5%)Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.H20044307Использовался для промыва внутрипеченочной крови во время гепатэктомии реципиента
Гепарин физиологический растворShenzhen Life Biotechnology Co., Ltd.H2012003100 МЕ/мл; используется для замачивания желчного стента
Indwelling NeedleБ. Браун4254074BИспользовался для промывания SHIVC для удаления воздуха перед завершением анастомоза
ИзофлуранJinan Guangshengyuan Biotechnology Co., Ltd.153107015концентрация 5%; используется для индукции анестезии 
Микроваскулярные зажимыShanghai Medical Devices Co., Ltd.JCZ200Используется для окклюзии сосудов во время операции
Комарные щипцыShanghai Medical Devices Co., Ltd.J31010Используется для тонкой обработки и подготовки манжет
Нормальный физиологический раствор (0,9%)Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.H20044304Используется для орошения и замачивания марлей (37°; C)
Пентобарбитал (1%)Shanghai Yuansi Technology Co., Ltd.P050000040– 45 мг/кг; Используется для хирургической анестезии
Периферически введённый венозный катетер (PIVC)Ковидьен8888145015Используется для промывки зафиксированных PV и подтверждения педентности 
Повидон-йодShanxi Trinda Biotechnology Co., Ltd.41836054Используется для дезинфекции хирургических участков
Резинка (из Surgical Glove)АнселлН/ДИспользуется для тяги SHIVC во время операции реципиента
Спраг и Ндаш; Доули РэтсHuafukang (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.22001AВзрослые самцы крыс, 8– 10 недель, 220– 250 г
Стерильная чашка Петри (10 см)Shandong Enyou Biotechnology Co., Ltd.H905001Использовался для удержания трансплантата в растворе UW во время подготовки ex vivo
Шприц (20 мл)Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd.20163141593Используется для контролируемой перфузии печени (3– 3,5 мл/мин) 
Решение по сохранению UWМост к жизниBTL-UW-1LПоддерживается при 4&°; C; Используется для донорской перфузии печени и сохранения трансплантата

Ссылки

  1. Hirata, M., et al. Stepwise approach for acquisition of microsurgical skills through rat orthotopic liver transplantation experiments. Eur Surg Res. , (2023).
  2. Zhao, H., et al. Revisiting orthotopic rat liver transplant. Exp Clin Transplant. , (2021).
  3. Wu, W., et al. Research progress on anatomy reconstruction of rat orthotopic liver transplantation. Transplant Rev (Orlando). , (2024).
  4. Shi, J. H., Line, P. D., Zhang, S. J., Guo, W. Z. Experimental liver surgery for liver research: update, choice and translation. J Inflamm Res. , (2025).
  5. Engel, B., et al. Molecular signatures discriminating different types of rejection in human liver transplants. J Hepatol. , (2025).
  6. Khatua, C. R., Anirvan, P., Panigrahi, M. K., Singh, S. P. Admission Albumin-Bilirubin Score Is Inferior to MELD, MELD-Na+ and Child-Turcotte-Pugh Score in Predicting Survival in Indian Patients with Alcohol-associated Liver Disease. J Transl Gastroenterol. , (2025).
  7. Yu, H., et al. Low hepatic artery blood flow mediates NET extravasation through the regulation of PIEZO1/SRC signaling to induce biliary complications after liver transplantation. Theranostics. , (2024).
  8. Yang, Z., et al. Prognosis analysis of rat liver transplantation under direct vision of single operator. Transplant Proc. , (2024).
  9. Wang, Z., et al. Liver cold storage and transplantation in the cold-adaptive Daurian ground squirrels. J Vis Exp. , (2025).
  10. Wang, X., MacParland, S. A., Perciani, C. T. Immunological determinants of liver transplant outcomes uncovered by the rat model. Transplantation. , (2021).
  11. Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat: technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. , (1979).
  12. Yuan, Z., et al. The effect of microcirculation disturbance of peribiliary vascular plexus on hepatic bile duct epithelial cells in rats undergoing liver transplantation and postoperative rejection reduction by nanocarrier mediation. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). , (2022).
  13. Zhao, D., et al. Regression of bile duct damage and bile duct proliferation in the non-rearterialized transplanted rat liver is associated with spontaneous graft rearterialization. Hepatology. , (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.