Стандартизированная иммунофлуоресцентная визуализация туннельных нанотрубок и митохондриального переноса между астроцитами и нейронами

Краткое содержание

Этот протокол стандартизирует фиксацию, окрашивание и методы конфокальной визуализации для визуализации туннельных нанотрубок и переноса митохондрий между астроцитами и нейронами in vitro.

Аннотация

Митохондрии — это важные органеллы, регулирующие выработку энергии, клеточную сигнализацию и метаболический гомеостаз в нервных клетках. Туннельные нанотрубки (ТНТ) — это тонкие мембранные структуры, которые обеспечивают междуклеточную коммуникацию на большие расстояния и облегчают передачу клеточных компонентов, включая митохондрии, между связанными клетками. Надёжная визуализация тротила и переноса митохондрий требует тщательного обращения с образцами, поскольку эти структуры крайне хрупки и чувствительны к условиям фиксации, промывания и визуализации. Этот протокол описывает стандартизированные процедуры фиксации, окрашивания и конфокальной визуализации ТНТ в астроцитах и системах кокультуры астроцит–нейрон. Рабочий процесс включает мембранное и цитоскелетное окрашивание для визуализации TNT, митохондриальное маркирование для отслеживания локализации митохондрий и иммунофлуоресцентное окрашивание для колокализации Miro1. На протяжении всей процедуры подчеркиваются важные этапы сохранения морфологии ТНТ, включая бережное мытьё и обращение с защитой от света. Протокол также описывает методы визуализации для характеристики ТНТ и митохондрий в препаратах фиксированных клеток. Эти методы предоставляют воспроизводимую экспериментальную основу для изучения образования ТНТ и переноса митохондрий между нейронными клетками in vitro.

Введение

Митохондрии служат энергетическими фабриками клетки, обеспечивая энергию, необходимую для клеточной деятельности за счёт образования аденозинтрифосфата, а также играя важную роль в передаче клеточных сигналов и редокс-балансе¹. В нервной системе митохондриальные метаболиты могут повышать сложность и возбудимость нейронных процессов, тем самым поддерживая их рост^{и развитие 2}. Митохондрии не являются статичными органеллами; Они постоянно изменяют свою морфологию, расположение и распределение, чтобы адаптироваться к различным внутриклеточным и внеклеточным стрессам и метаболическим^{потребностям 3}. Межклеточный митохондриальный перенос способствует поддержанию гомеостаза тканей и способствует развитию в физиологических условиях, тогда как при патологических условиях участвует в восстановлении повреждений, иммунной регуляции и прогрессировании^{болезни 4,5}.

Межклеточная коммуникация материалов и энергии необходима для различных биологических процессов, включая клеточный гомеостаз, восстановление тканей и регуляцию нейронных сетей. Текущие исследования выявили несколько способов межклеточной коммуникации, среди которых туннельные нанотрубки (ТНТ) представляют собой один из наиболее широко изученных механизмов, связанных с межклеточным митохондриальным^{переносом 6}. ТНТ — это мембранные структуры на основе F-актина, похожие на мост, с трубчатой морфологией, диаметром от 50 до 200 нм и длиной до нескольких клеток до нескольких диаметров^{клеток.} Исследования показали, что ТНТ могут служить физическими связями между нейронными клетками и тесно связаны с началом и прогрессированием нейродегенеративных заболеваний, рака мозга и других заболеваний. Например, митохондриальный перенос от микроглии к нейронам с помощью тротила сообщается как спасение нейронных^{клеток 8,9}.

Современные исследования ТНТ обычно сталкиваются с рядом проблем, включая структурную хрупкость ТНТ, которая делает их подверженными разрушениям и, следовательно, может влиять на результаты экспериментов; трудности с отличием ТНТ от филоподий или других выступов мембраны; а также сложности, связанные с точной количественной оценкой межклеточных ТНТ. Для повышения воспроизводимости и согласованности исследований, связанных с ТНТ, необходимы стандартизированные методы промывания, фиксации, окрашивания и визуализации ТНТ, позволяющие точную оценку их структуры и распределения при минимизации экспериментальной вариабельности. Такие факторы, как плотность клеток до фиксации, защита от света, интенсивность промывки, продолжительность фиксации и условия окрашивания после фиксации, могут влиять на структуру и устойчивость тротила. В этом исследовании мы описываем процедуры предварительной обработки, окрашивания и конфокальной визуализации ТНТ и структур, связанных с митохондриями, в системах культуры астроцитов и астроцит-нейронов.

Этот протокол исследования обычно применяется в большинстве лабораторных условий. Валидация первичных астроцитов и мышиной гиппокампальной нейронной линии подтвердила, что протокол подходит как для первичных нейронных клеток, так и для бессмертных клеток. Однако у этого протокола всё ещё есть несколько ограничений. Конфокальная микроскопия обеспечивает более низкое пространственное разрешение, чем сверхразрешённые методы визуализации TNT, а оценка переноса митохондрий на основе MitoTracker может зависеть от утечки красителя и не-митохондриальных помех^{сигнала 10}.

Протокол

В этом исследовании не участвовали ни люди, ни живые позвоночные; Использовались только коммерчески полученные или устоявшиеся клеточные линии, и этическое одобрение не требовалось.

1. Окрашивание тротила в астроцитах

1. Посев ячейок
   1. Семена изолировали первичные крысиные астроциты на проходе 3 (P3) в 35-мм стеклянные культурные чашки с плотностью 5 × 10⁴ клеток на тарелку. Добавьте 2 мл модифицированной смеси Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 от Dulbecco (DMEM/F-12) полной среды, дополненную 10% сывороткой из плода бычьего скота (FBS) и 1% тройной смесью антибиотиков (пенициллин G, стрептомицин и амфотерицин B). Культивировать клетки при 37°C в увлажнённом инкубаторе, содержащем 5% CO₂.
   2. Инкубировать клетки примерно в течение 24 часов, пока не произойдёт прикрепление.
2. Предварительное лечение и фиксация
   1. После прикрепления клетки перенесите посевные блюда на чистый стол при защищённом свете условиях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизировать ненужное движение и вибрацию при обращении для сохранения целостности тротила.
   2. Аккуратно удалите посевную среду при слабом освещении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте полного высыхания поверхности клетки при снятии среды, так как тротилы могут схлопнуться и прикрепиться к субстрату культуры.
   3. Аккуратно промыйте клетки одним разом 500 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) без ионов кальция и магния (pH 7,3–7,5). Медленно добавляйте и убирайте PBS вдоль стенки посевной чаши, чтобы не нарушать межклеточный тротил во время мытья.
   4. Аккуратно удалите PBS.
   5. Фиксируйте клетки коммерческим раствором фиксации тканей 4% с параформальдегидом (pH 7,2–7,4) на 30 минут при комнатной температуре (RT; 20°C–25°C) при слабом освещении.
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с фиксационными растворами с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты и выполняйте все процедуры в соответствии с институциональными рекомендациями по химической безопасности.
   6. Удалите фиксирующее средство.
   7. Промой клетки один раз PBS.
3. Проницаемость клеток и флуоресцентное окрашивание
   1. Пропустите клетки 500 мкл готового раствора проницаемости Triton X-100 на 20 минут при RT.
      ВНИМАНИЕ: Triton X-100 может нарушить работу хрупких структур тротила. Минимизировать чрезмерное возбуждение во время пермеабилизации.
   2. Удалите раствор для проницаемости.
   3. Промой клетки один раз PBS.
   4. Приготовьте раствор для окрашивания непосредственно перед использованием. Разведите краситель для окрашивания F-актина в PBS до конечной концентрации 1 мкм и используйте 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) как готовую к использованию ядерную окрашивку. Тщательно перемешайте оба раствора для окрашивания перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты для окрашивания на основе фаллоидина могут использоваться в качестве альтернативы для визуализации F-актина.
   5. Смешивайте растворы для окрашивания F-актина и ядерного окрашивания в соотношении 1:1 (равные объёмы) при условиях защиты от света.
   6. Добавьте подготовленный раствор для окрашивания в посуду для посевов.
   7. Инкубировать клетки в течение 30 минут при 37°C в темноте.
   8. Удалите раствор для окрашивания.
   9. Мойте клетки три раза с помощью PBS, используя 500 мкл за стирку по 1 минуту за стирку.
   10. Добавьте 1 мл PBS, чтобы предотвратить высыхание клеток во время подготовки к визуализации.
4. Конфокальная визуализация
   1. Получайте изображения с помощью инвертированного конфокального микроскопа Nikon с объективом ×20. Используйте возбуждение 405 нм для DAPI и 488 нм для окрашивания на F-актин. Снимайте изображения с разрешением 1024 × 1024 пикселя в условиях защиты от света на RT.
   2. Проведите качественную оценку и ручную количественную оценку, используя как минимум пять случайно выбранных полей зрения на выборку. Количественно определите количество ТНТ и количество ТНТ-положительных ячеек, содержащих один или несколько ТНТ в каждом поле зрения (рисунки 1A и 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте изображения сразу после окрашивания, чтобы минимизировать потерю флуоресценции и структурные нарушения ТНТ.

Рисунок 1: Флуоресцентное окрашивание туннельных нанотрубок (TNT) у астроцитов. (A) Репрезентативные изображения конфокальной микроскопии, показывающие окрашивание ядра и F-актина в астроцитах, культивируемых в чашках с стеклянным дном. (B) Увеличенный вид коробчатой области в панели A. Белые стрелки указывают на структуры, похожие на тротил, между соседними ячейками. (C) Репрезентативные изображения, показывающие структуры, похожие на тротил, нарушенные из-за неправильного обращения с образцом. (D) Увеличенный вид коробочной области в панели C. Жёлтые стрелки указывают на разрушенные структуры, похожие на тротил. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

2. Окрашивание для переноса митохондрий от астроцитов к нейронам с помощью TNT

1. Посева астроцитов и митохондриальная маркировка
   1. Семена изолировали первичные крысиные астроциты в проходе 3 (P3) в 35-мм стеклянные чаши с плотностью 3 ×^{10 4} ячейки на тарелку. Добавьте 2 мл полной среды DMEM/F-12 с добавлением 10% FBS и 1% тройной смеси антибиотиков (пенициллин G, стрептомицин и амфотерицин B). Культивировать клетки при 37°C в увлажнённом инкубаторе, содержащем 5% CO₂.
   2. Инкубировать клетки примерно в течение 24 часов, пока не произойдёт прикрепление.
   3. После прикрепления клетки перенесите посевные блюда на чистый стол при слабом освещении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизировать ненужное движение и вибрацию при обращении для сохранения целостности тротила.
   4. Аккуратно убирайте посевную среду в условиях защиты от света. Избегайте нарушения тротила во время среднего удаления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте полного высыхания поверхности клетки при снятии среды, так как тротилы могут схлопнуться и прикрепиться к субстрату культуры.
   5. Восстановить 50 мкг лиофилизированного красителя MitoTracker в диметилсульфоксиде (DMSO) для приготовления раствора объёмом 1 мм и хранить его при температуре −20°C. Перед использованием разведите стандартный раствор в 400 мкл полной среды DMEM/F-12 с добавлением смеси 10% FBS и 1% тройной антибиотиковой смеси, чтобы получить итоговую концентрацию MitoTracker 50 мкм.
      ВНИМАНИЕ: Защищайте флуоресцентные красители от прямого освещения во время процедур подготовки и инкубации.
   6. Добавьте рабочее раствор для окрашивания митохондриальных средств в посевные чашки.
   7. Инкубировать клетки при 37°C в увлажнённом инкубаторе, содержащем 5% CO₂, в течение 30 минут в условиях освещения.
   8. Удалите раствор для окрашивания митохондрий в условиях, защищённых светом.
   9. Аккуратно промыйте клетки один раз 500 мкл PBS без ионов кальция и магния (pH 7,3–7,5). Медленно добавляйте и убирайте PBS вдоль стенки посевной чаши, чтобы не нарушать межклеточный тротил во время мытья.
   10. Аккуратно удалите PBS.
2. Кокультура астроцит-нейрон
   1. Семя увековечили нейронные клетки гиппокампа мыши на проходе 3 (P3) в сосуды с астроцитами при плотности 3 ×^{10 4} клеток на тарелку. Добавьте клетки в общий объём 2 мл, состоящую из смеси 1:1 полной среды DMEM и DMEM/F-12, дополненной смесью 10% FBS и 1% тройной антибиотиковой смеси. Установите кокультуру с помощью метода прямого контакта без вставки Трансвелла. Культивировать клетки при 37°C в увлажнённом инкубаторе, содержащем 5% CO₂.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно добавляйте нейронные клетки, чтобы минимизировать нарушение существующих структур ТНТ.
   2. Поддерживайте кокультуру в течение 24 часов в стандартных условиях инкубатора, одновременно защищая образцы от ненужного освещения во время процедур обработки.
3. Фиксация и проницаемость
   1. Удалите посевную среду в условиях защиты от света.
   2. Промой клетки один раз PBS.
   3. Фиксировать клетки раствором фиксации 4% тканевых клеток, содержащим параформальдегид, на 30 минут при RT при слабом освещении.
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с фиксационными растворами с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты и выполняйте все процедуры в соответствии с институциональными рекомендациями по химической безопасности.
   4. Удалите фиксирующее средство.
   5. Промой клетки один раз PBS.
   6. Пропустите клетки 500 мкл готового раствора проницаемости Triton X-100 на 20 минут при RT при слабом освещении.
      ВНИМАНИЕ: Triton X-100 может нарушить работу хрупких структур тротила. Минимизировать чрезмерное возбуждение во время пермеабилизации.
   7. Удалите раствор для проницаемости.
   8. Промой клетки один раз PBS.
4. Флуоресцентное окрашивание и визуализация
   1. Приготовьте раствор для окрашивания непосредственно перед использованием. Разведите краситель для окрашивания F-актина в PBS до конечной концентрации 1 мкм и используйте DAPI как готовую к использованию ядерную окрашивку. Тщательно перемешайте растворы для окрашивания перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты для окрашивания на основе фаллоидина могут использоваться в качестве альтернативы для визуализации F-актина.
   2. Смешайте растворы для окрашивания F-актина и ядерного окрашивания в соотношении 1:1 (равные объёмы) в условиях защиты от света непосредственно перед использованием.
   3. Добавьте подготовленный раствор для окрашивания в посуду для посевов.
   4. Инкубировать клетки в течение 30 минут при 37°C в темноте.
   5. Удалите раствор для окрашивания.
   6. Мойте клетки три раза с помощью PBS, используя 500 мкл за стирку по 1 минуту за стирку.
   7. Добавьте 1 мл PBS, чтобы предотвратить высыхание клеток во время подготовки к визуализации.
   8. Получайте изображения с помощью инвертированного конфокального микроскопа Nikon с объективом ×20. Используйте возбуждение 405 нм для DAPI, 488 нм для окрашивания F-актином и 665 нм для окрашивания MitoTracker. Снимайте изображения с разрешением 1024 × 1024 пикселя в условиях защиты от света на RT.
   9. Проведите качественную оценку, используя как минимум пять случайно выбранных полей зрения на выборку. Оценить наличие структур, похожих на ТНТ, и сигналов, связанных с митохондриями, флуоресценции внутри межклеточных мембранных соединений (рисунки 2A и 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте изображения сразу после окрашивания, чтобы минимизировать потерю флуоресценции и структурные нарушения ТНТ.

Рисунок 2: Флуоресцентное окрашивание митохондрий и TNT в кокультурной системе астроцит-нейрон. (A) Репрезентативные изображения конфокальной микроскопии, показывающие окрашивание ядра, митохондрий и F-актина в астроцитах и нейронах, культивируемых в чашах с стеклянным дном. Астроциты демонстрировали неправильную звёздоподобную или многоугольную морфологию с расширенными клеточными отростками, тогда как нейронные клетки выглядели круглыми или овальными с тонкими нейритовыми расширениями. (B) Увеличенный вид коробчатой области в панели A. Белые стрелки указывают на структуры, похожие на тротил, связанные с митохондриями, между клетками. Обе популяции клеток различались главным образом по характерной клеточной морфологии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

3. Иммунофлуоресцентное колокализация для митохондрий и Miro1 в TNT

1. Посева астроцитов и митохондриальная маркировка
   1. Семена изолировали первичные крысиные астроциты в проходе 3 (P3) в 35-мм стеклянные чаши с плотностью 3 ×^{10 4} ячейки на тарелку. Добавьте 2 мл полной среды DMEM/F-12 с добавлением 10% FBS и 1% тройной смеси антибиотиков (пенициллин G, стрептомицин и амфотерицин B). Культивировать клетки при 37°C в увлажнённом инкубаторе, содержащем 5% CO₂.
   2. Инкубировать клетки примерно в течение 24 часов, пока не произойдёт прикрепление.
   3. После прикрепления клетки перенесите посевные блюда на чистый стол при слабом освещении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизировать ненужное движение и вибрацию при обращении для сохранения целостности тротила.
   4. Аккуратно убирайте посевную среду в условиях защиты от света. Избегайте нарушения тротила во время среднего удаления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте полного высыхания поверхности клетки при снятии среды, так как тротилы могут схлопнуться и прикрепиться к субстрату культуры.
   5. Восстановить 50 мкг лиофилизированного красителя MitoTracker в DMSO для приготовления раствора на 1 мМ и хранить его при температуре −20°C. Перед использованием разведите стандартный раствор в 400 мкл полной среды DMEM/F-12 с добавлением смеси 10% FBS и 1% тройной антибиотиковой смеси, чтобы получить итоговую концентрацию MitoTracker 50 мкм.
      ВНИМАНИЕ: Защищайте флуоресцентные красители от прямого освещения во время процедур подготовки и инкубации.
   6. Добавьте рабочее раствор для окрашивания митохондриальных средств в посевные чашки.
   7. Инкубировать клетки при 37°C в увлажнённом инкубаторе, содержащем 5% CO₂, в течение 30 минут в условиях освещения.
   8. Удалите раствор для окрашивания митохондрий в условиях, защищённых светом.
   9. Аккуратно промыйте клетки один раз 500 мкл PBS без ионов кальция и магния (pH 7,3–7,5). Медленно добавляйте и убирайте PBS вдоль стенки посевной чаши, чтобы не нарушать межклеточный тротил во время мытья.
   10. Аккуратно удалите PBS.
2. Кокультура астроцит-нейрон
   1. Семя увековечили нейронные клетки гиппокампа мыши на проходе 3 (P3) в сосуды с астроцитами при плотности 3 ×^{10 4} клеток на тарелку. Добавьте клетки в общий объём 2 мл, состоящую из смеси 1:1 полной среды DMEM и DMEM/F-12, дополненной смесью 10% FBS и 1% тройной антибиотиковой смеси. Установите кокультуру с помощью метода прямого контакта без вставки Трансвелла. Культивировать клетки при 37°C в увлажнённом инкубаторе, содержащем 5% CO₂.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно добавляйте нейронные клетки, чтобы минимизировать нарушение существующих структур ТНТ.
   2. Поддерживайте кокультуру в течение 24 часов в стандартных условиях инкубатора, одновременно защищая образцы от ненужного освещения во время процедур обработки.
3. Фиксация и проницаемость
   1. Удалите посевную среду в условиях защиты от света.
   2. Промой клетки один раз PBS.
   3. Фиксируйте клетки коммерческим раствором фиксации клеток 4% с параформальдегидом (pH 7,2–7,4) на 30 минут в RT при слабом освещении.
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с фиксационными растворами с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты и выполняйте все процедуры в соответствии с институциональными рекомендациями по химической безопасности.
   4. Удалите фиксирующее средство.
   5. Промой клетки один раз PBS.
   6. Пропустите клетки 500 мкл готового раствора проницаемости Triton X-100 на 20 минут при RT при слабом освещении.
      ВНИМАНИЕ: Triton X-100 может нарушить работу хрупких структур тротила. Минимизировать чрезмерное возбуждение во время пермеабилизации.
   7. Удалите раствор для проницаемости.
   8. Промой клетки один раз PBS.
4. Блокировка и иммунофлуоресцентное окрашивание
   1. Блокируйте клетки 5% козьей сывороткой на 1 час при РТ при слабом освещении. Приготовьте раствор для блокировки, разбавляя козью сыворотку в соотношении 1:20 в PBS.
   2. Уберите раствор для блокировки.
   3. Разбавьте моноклональное антитело кролика против Miro1 в PBS при соотношении разбавления 1:100. Добавьте разбавленный раствор первичных антител в посевные чашки и инкубируют за ночь (12–16 часов) при 4°C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите образцы с флуоресцентной маркировкой от прямого освещения на протяжении всего процесса окрашивания.
   4. Удалите первичный раствор антител.
   5. Мойте клетки три раза с помощью PBS, используя 500 мкл за стирку по 1 минуту за стирку.
   6. Разведите вторичное антитело IgG флуоресцентного козла против кроликов в PBS с коэффициентом разбавления 1:100. Добавьте 500 мкл разбавлённого вторичного раствора антител в каждую посевную чашу и инкубируемые в течение 1 часа в условиях защиты от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании не был включён контроль без первичных антител. В будущих экспериментах следует включать соответствующие методы контроля иммунофлуоресценции для дальнейшей проверки специфичности окрашивания.
   7. Удалите вторичный раствор флуоресцентного антитела.
5. Флуоресцентное контрокрашивание и визуализация
   1. Приготовьте раствор для окрашивания непосредственно перед использованием. Разведите краситель для окрашивания F-актина в PBS до конечной концентрации 1 мкм и используйте DAPI как готовую к использованию ядерную окрашивку. Тщательно перемешайте растворы для окрашивания перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты для окрашивания на основе фаллоидина могут использоваться в качестве альтернативы для визуализации F-актина.
   2. Добавьте раствор для окрашивания в посевные чашки.
   3. Инкубировать клетки в течение 30 минут при 37°C в темноте.
   4. Удалите раствор для окрашивания.
   5. Мойте клетки три раза с помощью PBS, используя 500 мкл за стирку по 1 минуту за стирку.
   6. Добавьте 1 мл PBS, чтобы предотвратить высыхание клеток во время подготовки к визуализации.
   7. Получайте изображения с помощью инвертированного конфокального микроскопа Nikon с объективом ×20. Собирайте изображения в Z-стеке с шагом размером 5 мкм в общем диапазоне изображения 40 мкм (8 оптических срезов). Используйте возбуждение 405 нм для DAPI, 488 нм для окрашивания с F-актином, 594 нм для иммунокрашивания Miro1 и 665 нм для окрашивания MitoTracker. Снимайте изображения с разрешением 1024 × 1024 пикселя в условиях защиты от света на RT.
   8. Проведите качественную оценку, используя как минимум пять случайно выбранных полей зрения на выборку. Оценить структуры, похожие на ТНТ, сигналы флуоресценции, связанные с митохондриями, и видимую колокализацию между Miro1 и окрашиванием, ассоциированным с митохондриями, в межклеточных мембранных соединениях (рисунок 3A–3C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте изображения сразу после окрашивания, чтобы минимизировать потерю флуоресценции и структурные нарушения ТНТ.

Рисунок 3: Колокализационное окрашивание митохондрий и Miro1 в ТНТ в системе кокультуры астроцит-нейрон. (A) Репрезентативные изображения конфокальной микроскопии, показывающие окрашивание ядров, митохондриального, Miro1 и F-актина в астроцитах и нейронах, культивируемых в чашах с стеклянным дном. Белые стрелки указывают на области видимой колокализации между сигналами, ассоциированными с митохондриями, и Miro1 внутри структур, подобных ТНТ. (B) Трёхмерное реконструированное Z-стековое изображение, показывающее структуры, похожие на тротил, сформированные между соседними ячейками. (C) Боковая реконструкция того же изображения Z-стека, показывающего структуры, похожие на тротил, простирающиеся между соседними ячейками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Результаты

В монокультурных препаратах астроцитов были обнаружены тонкие выступы мембран, соединяющие соседние клетки после окрашивания F-актина и ядерного окрашивания (рисунок 1A и 1B). Были обнаружены многочисленные структуры, похожие на тротил, простирающиеся между соседними астроцитами, и отдельные астроциты часто образовывали связи с несколькими окружающими клетками. Успешное сохранение структур, похожих на тротил, было связано с аккуратным обращением во время процедур промывания и фиксации. Чрезмерные механические нарушения при удалении или промывке среды приводили к снижению обнаружения и структурным нарушениям этих мембранных соединений, что подтверждается нарушением структур, похожих на тротил, после неправильного обращения с образцами (рисунки 1C и 1D).

В препаратах кокультуры астроцит-нейронов флуоресцентные сигналы, связанные с митохондриями, были обнаружены в структурах, похожих на ТНТ, соединяющих соседние клетки после окрашивания MitoTracker и конфокальной визуализации (рисунок 2A и 2B). Эти структуры визуализировались вместе с F-актином и ядерным окрашиванием для поддержки морфологической оценки связей, похожих на тротил. Правильная светозащита и минимизированная интенсивность промывки улучшали сохранение флуоресцентного сигнала и морфологии ТНТ во время подготовки к визуализации.

В экспериментах с колокализацией иммунофлуоресценции перекрывающиеся флуоресцентные сигналы, соответствующие окрашиванию с митохондриями, и иммунокрашению Miro1 наблюдались в структурах, похожих на ТНТ, в препаратах кокультуры астроцит-нейрон (см. рисунок 3A). Эти наблюдения указывают на возможную связь между Miro1 и митохондриями, локализованными внутри структур, подобных ТНТ. Трёхмерная реконструированная Z-стековая визуализация дополнительно подтвердила наличие структур, похожих на тротил, простирающихся между соседними ячейками (рисунки 3B и 3C). Сохранение ТНТ, интенсивность флуоресцентного сигнала и качество изображения зависели от условий фиксации, проницаемости и визуализации.

Обсуждение

Первым критическим шагом в описанном выше экспериментальном протоколе является предварительное защищённое светом перед фиксацией. Структуры, похожие на ТНТ, очень хрупкие, и поддержание светозащитных условий после извлечения из инкубатора важно для сохранения интенсивности флуоресцентного сигнала и структурной целостности при подготовке образца. Второй критически важный шаг — выполнение промывания PBS с мягкой обработкой для минимизации нарушений структур, похожих на ТНТ, вызванных течением жидкости. Соблюдение этих ключевых процедур обработки помогает сохранить морфологию и стабильность структур, похожих на ТНТ, а также улучшает согласованность последующих результатов визуализации. Чрезмерная аспирация, длительное промывка или сильное перемешивание жидкости могут привести к коллапсу или фрагментации структур, похожих на тротил, во время обработки образцов. Из-за своей динамической природы тротилы чувствительны к свету. Фототоксичность, вызванная воздействием света, может вызывать нарушение ТНТ, что затрудняет визуализацию этих структур¹¹. Поэтому во время экспериментов, связанных с ТНТ, следует поддерживать светозащищённые условия.

Внутриклеточное движение митохондрий способствует распределению энергии клетки, особенно в нейронах. Исследования показали, что митохондрии могут перемещаться по актиновым филаментам и^{микротрубочкам 12}. Недавние исследования также показали, что TNT могут функционировать как межклеточные коммуникационные структуры на расстоянии, связанные с переносом митохондрий между нейронными^{клетками 13}. Методологический подход, описанный в этом исследовании, позволяет визуализировать структуры, похожие на ТНТ, и сигналы флуоресценции, связанные с митохондриями, в системах нейронной клеточной культуры. Предыдущие исследования показали, что межклеточный митохондриальный перенос между нейронными клетками может способствовать восстановлению тканей и нейропротекторным процессам при неврологических заболеваниях, таких как болезнь Паркинсона и ишемическое повреждение^{мозга 14,15}. Используя методы, описанные в этом исследовании, наблюдались структуры, похожие на тротил, между астроцитами и нейронами, а также сигналы флуоресценции, связанные с митохондриями, локализованные внутри этих структур.

Как отмечалось в^{предыдущих исследованиях 10}, окрашивание MitoTracker подвержено утечке красителя и передаче сигналов не митохондриальным, что может снижать надёжность данных. Для устранения этого ограничения будущие исследования должны применять более надёжные методы, такие как генетически закодированное митохондриальное метирование, чтобы получить более убедительные результаты. В современных экспериментальных условиях два типа клеток различались главным образом по клеточной морфологии, что может снизить специфичность идентификации клеток. В будущих исследованиях следует включать флуоресцентную маркировку, специфичную для типа клеток, чтобы повысить точность анализа кокультуры. Miro1 — это адаптерный белок, локализованный на внешней митохондриальной мембране, и участвует в процессах митохондриального транспорта в^{нейронах 16,17}. Используя протокол иммунофлуоресцентной колокализации, описанный в данном исследовании, были обнаружены перекрывающиеся флуоресцентные сигналы, соответствующие окрашиванию с митохондриями, и иммуноокрашиванию Miro1 внутри TNT-подобных структур. Эти наблюдения указывают на возможную связь между Miro1 и митохондриями, локализованными внутри структур, подобных ТНТ. Однако пространственное разрешение традиционной конфокальной микроскопии может ограничивать окончательную оценку молекулярной колокализации в тонких выступах мембран.

Мы провели Z-стековую визуализацию, чтобы подтвердить наличие структур, похожих на TNT, между клетками, тем самым поддержав структурную валидацию этих мембранных соединений. Хотя текущий протокол подходит для большинства экспериментальных сред, конфокальная визуализация фиксированных клеток может привести к потере хрупких структур, похожих на ТНТ, при обработке образца по сравнению с живыми клетками, что ограничивает точную количественную оценку^{ТНТ 18}. Кроме того, визуализация фиксированных клеток не позволяет однозначно определить направление переноса митохондрий, что требует дальнейших исследований в будущих исследованиях. Этот протокол обеспечивает стандартизированный экспериментальный рабочий процесс для окрашивания структур, похожих на ТНТ, сигналов, связанных с митохондриями, и связанных белков в системах нейронной клеточной культуры. По сравнению с неконтролируемой промывкой и фиксацией, протокол делает акцент на аккуратном обращении с образцами и сохранении флуоресценции во время подготовки к визуализации. Эти методы могут помочь улучшить экспериментальную согласованность и воспроизводимость в исследованиях, связанных с ТНТ.

В итоге данное исследование предоставляет практический и широко применимый лабораторный протокол для качественной оценки ТНТ и исследования митохондриального транспорта через структуры, подобные ТНТ. Однако этапы обработки образцов, такие как фиксация и промывка, могут вводить количественную вариабельность по сравнению с методами изображения живых клеток. Кроме того, конфокальная микроскопия обеспечивает более низкое пространственное разрешение, чем микроскопия с суперразрешением, что ограничивает детальную структурную характеристику ТНТ. Кроме того, митохондриальное окрашивание на основе MitoTracker зависит от утечки красителя и неспецифического сигнала, что следует учитывать в будущих исследованиях для повышения точности экспериментов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1% смесь тройного антибиотика	Biosharp	BL142A	Предотвращает бактериальные и грибковые заражения при культивировании клеток
4% тканевый клеточный фиксатор	Solarbio	P1110	Реагент для фиксации клеток
Анти-Miro1 антитело	Abcam	AB319154	Первичное антитело против Miro1
Астроциты	Первичные клетки, выделенные в лаборатории	NA	Астроциты были выделены из головного мозга новорожденных крыс SD в возрасте 1–3 дня. Чистота выделенных клеток подтверждена GFAP-окрашиванием, и клетки 3-го пассажного ряда (P3) использовались для всех экспериментов
Среда для культивирования астроцитов (DMEM/F-12)	Gibco	6125011	DMEM и F-12 смешаны в соотношении 1:1 (объем/объем), дополнены 10% сывороткой бычьего плода (FBS) и 1% тройной антибиотиковой смесью
Конфокальный микроскоп	Nikon AX	ECLIPSE TI2-E	Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа Nikon AX (Nikon Corporation, Япония), управляемого NIS-Elements (версия 5.4)
DAPI	Servicebio	G1012-100ML	Краситель для окрашивания ядер
DMSO	BioFroxx	1084ML100	Растворитель, используемый для приготовления запасных растворов флуоресцентных красителей
Краситель для окрашивания F-актина	Thermo Fisher Scientific	A57243	Реагент для окрашивания F-актина для визуализации цитоскелетных структур и туннельных нанотрубок
Сыворотка бычьего плода	ExCell Bio	FSD500	Обеспечивает необходимые питательные вещества для культивирования клеток
Флуоресцентное вторичное антитело (козье антитело против кроликовых IgG)	ABclonal	AS039	Вторичное антитело для иммунофлюоресцентного окрашивания
Стеклянная чаша для культивирования клеток	NEST	801001	Чаша для конфокальной микроскопии
Сыворотка козьего сыра	Solarbio	210C051	Реагент для блокировки иммунофлюоресцентного окрашивания
MitoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	M22426	Краситель для окрашивания митохондрий
Нейроны	Банк клеток CAS	HT22-GNM47	Увековеченные мышьи нейроны гиппокампа содержались в полной среде DMEM. Клетки 3-го пассажного ряда (P3) были собраны и использованы для последующих экспериментов.
Среда для культивирования нейронных клеток (DMEM)	Servicebio	G4511-500ML	DMEM, дополненный GlutaPlus и пировиноградной солью натрия, без HEPES, дополненный 10% сывороткой бычьего плода (FBS) и 1% тройной антибиотиковой смесью
Фосфатно-буферный раствор соли (PBS)	Servicebio	G4203-500ML	Буфер для промывания, используемый при фиксации и окрашивании
Тритон X-100	Solarbio	P1080	Реагент для пермеабилизирования клеток