Вскрытие и выделение ганглиев дорсального корня мыши

Краткое содержание

Дорсальные корневые ганглии (DRG) содержат первичные тела сенсорных нейронов и передают периферические сенсорные сигналы в спинной мозг. Этот протокол описывает метод диссекции DRG у мышей, который поддерживает стандартизированную изоляцию структурно целостных ганглиев, анатомическую сегментарную идентификацию, интуитивное руководство для начинающих пользователей и снижение процедурного повреждения тканей.

Аннотация

Дорсальные корневые ганглии (DRG), содержащие клеточные тела первичных сенсорных нейронов, служат критически важными релейными структурами для передачи сенсорных сигналов от периферических тканей к спинному мозгу. Они играют важную роль в изучении боли, повреждений нервов и нейродегенеративных заболеваний. Получение целостной ткани DRG имеет решающее значение для изучения функциональных свойств, молекулярной экспрессии и патологических изменений сенсорных нейронов. Однако из-за их небольших размеров и глубокого расположения в позвоночном канале точная идентификация и изоляция DRG представляют собой значительные технические сложности. В этом исследовании мы разработали стандартизированный протокол изоляции мышиного DRG. Этот метод даёт подробное описание анатомической локализации DRG, обнажения позвоночного канала и ключевых этапов изоляции ганглиев. Вся процедура иллюстрируется репрезентативными изображениями и видеозаписями. Этот подход способствует получению структурно целостного DRG с анатомическим указанием для сегментной идентификации и подходит для окрашивания и иммунофлуоресцентного анализа. По сравнению с предыдущими методами вскрытия DRG, этот метод позволяет стандартизировать восстановление сегментально идентифицированных ганглиев, обеспечивает интуитивные анатомические рекомендации для начинающих пользователей и снижает процедурное повреждение тканей.

Введение

Дорсальные корневые ганглии (DRG), содержащие клеточные тела первичных сенсорных нейронов, являются необходимыми структурами для передачи периферических сенсорных сигналов — включая механические, тепловые и ноцицептивные стимулы — в спинной^{мозг 1,2,3} . Хотя в настоящее время доступны качественные ресурсы, описывающие DRG, по-прежнему необходимы подробные процедурные рекомендации для точной идентификации и изоляции DRG от грудного до крестцового сегмента внутри одного образца, при этом минимизируя риск повреждения DRG во время сбора тканей.

Нейроны DRG являются ключевыми компонентами периферического сенсорного пути. Их аксоны разделяются: одна ветвь простирается на периферические ткани, а другая — в дорсальный рог спинного мозга, играя ключевую роль в передаче боли, повреждении нервов, воспалительных реакциях и патогенезе различных неврологических заболеваний⁴. Кроме того, DRG привлекли значительное внимание в таких областях, как восстановление повреждений нервов, механизмы хронической боли, пластичность сенсорных нейронов и нейроиммунная^{регуляция 5,6}. Широкий спектр экспериментальных исследований требует целостной ткани DRG для применения, включая иммуногистохимическое окрашивание, анализ секвенирования РНК, первичную культуру нейронов и^{электрофизиологические исследования 7}. Поэтому получение структурно целостной и точно идентифицируемой по сегментам тканей DRG является фундаментальным для изучения сенсорных нейронных цепей, молекулярных характеристик нейронов и патологических изменений.

DRG расположены рядом с межпозвоночными отверстиями и соединены с спинным мозгом через дорсальные корни. Из-за их небольшого размера, ограды в костных структурах и сложности окружающей анатомии, целостная изоляция представляет собой значительные технические сложности. Кроме того, отсутствие чётких анатомических ориентиров и стандартизированных процедур увеличивает риск структурных повреждений или неправильной сегментной идентификации при сборе тканей.

По сравнению с существующими методами диссекции DRG у мышей, метод, установленный в данном исследовании, обладает рядом преимуществ. Во-первых, ранее описанные методы изоляции DRG у мышей обычно требуют удаления позвоночника у животного, затем сегментации и среднего открытия изолированного позвоночника, после чего DRG рассекают из межпозвоночного отверстия. В ходе этого процесса пересечение позвоночника и многократное разрезание могут легко привести к механическим повреждениям DRG, а также к отсутствию некоторых сегментов или неясной идентификации^{сегментов 8}. В отличие от этого, наш метод выполняется непосредственно in situ у мыши, без предварительной изоляции или пересечения позвоночника, что снижает риск потери DRG во время сбора ткани. На протяжении всей процедуры инструменты применяются преимущественно к костным структурам и соединительным тканям, окружающим DRG, а не непосредственно захватывают или тянут сам ганглий, что сохраняет его целостность.

Во-вторых, существующие методы часто не имеют чётких, стабильных анатомических ориентиров для идентификации различных сегментов DRG. Поскольку нервы, соединённые с DRG, часто перерезаются при удалении позвоночника, становится сложно точно определить сегментарное происхождение отдельных DRG на основе хода и паттернов ветвления нервов. В отличие от этого, наш метод выполняется непосредственно in situ у мыши и поэтому сохраняет естественные анатомические отношения между DRG, соединёнными нервами и окружающими структурами, позволяя идентифицировать различные сегменты DRG по нервным связям и локальным анатомическим ориентирам. Мы предлагаем использовать морфологические характеристики L2 и L3 в качестве ключевых анатомических ориентиров, а также анатомическую связь между L3–L5 и седалищным нервом, а затем последовательную идентификацию соседних сегментов как в ростральном, так и в каудальном направлениях.

Кроме того, этот метод даёт относительно систематическое описание ключевых этапов, включая экспозицию позвоночного столба и позвоночного канала, открытие позвоночного канала с последующим общением спинного мозга, экспозицию DRG, а также локализацию и диссекцию под руководством стереомикроскопа. Рабочий процесс ясен, а анатомические ориентиры чётко очерчены, что может улучшить стандартизацию и воспроизводимость процедур, особенно для новичков. DRG, полученные этим методом, сохраняют хорошую тканевую целостность и поэтому хорошо подходят для дальнейших анализов, включая иммунофлуоресцентное и H&E-окрашивание.

В этом исследовании мы разработали стандартизированный метод вскрытия и изоляции мышиного DRG и предоставили схемы анатомической локализации, а также репрезентативные изображения и видеодокументацию процедуры отбора проб. Этот метод способствует выделению DRG от грудного до крестцового уровня в одном образце при одновременном снижении риска повреждения DRG при сборе тканей.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились строго в соответствии с протоколом, утверждённым Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Шанхайской восточной больницы. Процедуры вскрытия, описанные в данном исследовании, проводились с использованием взрослых мышей C57BL/6 (самцы или самки, 12 недель, 25–30 г). На рисунке 1 показаны инструменты вскрытия, используемые в этом протоколе.

1. Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов, фиксированных перфузией, принимайте соответствующие меры защиты, чтобы избежать воздействия фиксационных средств. Проводите вскрытие в выхлопчике или на хорошо проветриваемом скамейке, а также носите соответствующие средства индивидуальной защиты на протяжении всей процедуры, включая перчатки, защитную одежду и защитные очки.

1. Поддерживайте мышей в цикле света 12 часов и 12 часов темноты при температуре окружающей среды примерно 24 °C и относительной влажности 55 %, с импровзационным доступом к еде и воде.
2. Перед началом вскрытия усыпьте мышь в камере с углекислым газом, пока дыхание полностью не прекратится. Подтвердите смерть, затем поместите животное в положение лежа на доске для вскрытия и закрепите конечности булавками, чтобы сохранить устойчивую позу.
3. Распылите шерсть на грудно-абдоминальную область 70% этанола, чтобы снизить загрязнение волос и поддерживать чистое рабочее поле.
4. Используйте ножницы, чтобы открыть кожу вдоль средней линии груди и живота. Удлините разрез черепно вдоль вентральной средней линии, чтобы полностью обнажить грудную клетку. Поднимите нижний конец грудины и разрезайте грудную стенку по обеим сторонам реберной дуги, чтобы открыть грудную полость и открыть сердце. При необходимости удалите часть грудины и рёбра, чтобы получить чёткий обзор сердца.
5. Сделайте небольшой разрез в правом предсердии с помощью ножниц, чтобы создать выход крови и перфузии. Заполните 20 мл шприц предварительно охлаждённым PBS (4 °C) и медленно введите иглу в левый желудочек возле вершины сердца. Стабилизируйте иглу и избегайте проколов стенку желудочка.
6. Перфузия медленно и равномерно охлаждала PBS, пока печень не побледнела, отток не стал чистым, а большая часть крови не была вымыта. Затем замените PBS на 20 мл предварительно охлаждённого 4% параформальдегида (4 °C) и продолжайте перфузию медленно, ровно до тех пор, пока конечности не станут жёсткими, хвост не загнутся, а ткани не изменятся с красного на бледный, что указывает на практически завершение фиксации.
7. После перфузии вынимите иглу, удалите остатки жидкости из грудной полости и немедленно приступите к забору тканей. Если для дальнейших анализов требуется нефиксированная ткань, перфузируйте только с предварительно охлаждённым PBS и опустите этап фиксации параформальдегидов 4%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте медленную, равномерную и равномерную скорость перфузии на протяжении всей процедуры, чтобы избежать разрыва сердца или отёка тканей, вызванных чрезмерным давлением. Выполняйте все вышеперечисленные процедуры при комнатной температуре.

2. DRG и соседние нервы (рисунок 2)

1. Экспозиция позвоночного столба и позвоночного канала (3–5 мин)
   1. Положите мышь в положение лежа и закрепите её на доске. Сделайте продольный разрез по средней линии спинной кожи ножницами, расширяя разрез от хвоста к шее.
   2. Используйте ножницы, чтобы отделить спинную кожу от подлежащей соединительной ткани и отразить кожу по бокам с обеих сторон, чтобы полностью обнажить спинную мышцу. Протрите волосы, прилипшие к поверхности соединительной ткани, впитывающей бумагой или прополосните хирургическое поле физиологическим раствором, чтобы сохранить операционную зону чистой.
   3. Разрезать спинные мышцы и соединительные ткани продольные вдоль обеих сторон позвоночника, чтобы полностью обнажить позвоночные структуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предотвратите проникновение ножниц слишком глубоко в грудную или брюшную полость при разрезе дорсальных тканей, так как это может повлиять на последующие процедуры вскрытия.
   4. Аккуратно очистите соединительные ткани и остатки мышц, покрывающие позвоночник, костяным ронжером. Если остаточная ткань мешает визуализации, обрезайте их ножницами по мере необходимости, чтобы получить полное обнажение позвоночника. Затем ножницами перережьте шейные позвонки с дорсальной стороны, чтобы отделить краниальный конец позвоночника от головы и выполнить следующие шаги.
2. Откройте позвоночный канал и обнажите спинной мозг (рисунок 3; 8–10 мин).
   1. Вставьте микроизогнутые ножницы в позвоночный канал на уровне шейного отдела и разрезайте по обеим сторонам слошек, чтобы открыть канал.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы избежать травмы спинного мозга во время процедуры.
   2. Удалять спинные пластинки, чтобы постепенно обнажать спинную часть спинного мозга.
   3. Продолжайте перерезать дорсальные пластинки вдоль продольной оси позвоночника с помощью микроизогнутых ножниц, постепенно расширяя часть от грудной к крестцовой области, чтобы полностью обнажить спинную часть спинного мозга.
3. Экспозиция DRG (рисунок 4; 8–10 мин)
   1. После полного открытия дорсальной поверхности спинного мозга используйте костный ронжер для аккуратного открытия позвонковых каналов с обеих сторон и чередуйте манипуляцию между левой и правой сторонами.
   2. После полного отделения позвоночного канала с обеих сторон наблюдайте DRG, расположенный внутри межпозвоночных отверстия, под стереомикроскопом.
4. Идентификация DRG (рисунок 5; 8–10 мин)
   1. После полного отражения позвоночного канала и полного открытия спинного мозга под стереомикроскопом осмотрите нервные пучки спинного корня, возникающие от дорсальной поверхности спинного мозга. Следуйте по дорсальным корням вбок и идентифицируйте DRG возле межпозвоночных отверстия как овальные или овальные структуры.
   2. Во время идентификации подтвердите, что DRG находится на границе между дорсальным корнем спинного нерва и межпозвоночным отверстием, и наблюдайте, что она расположена как двусторонняя пара на каждом сегменте спинного мозга. Определите DRG как ганглий, образованный клеточными телами сенсорных нейронов, при этом одна сторона входит в дорсальный рог спинного мозга, а другая — в периферические ткани.
   3. Используйте стереомикроскоп, чтобы определить DRG как слабо жёлтую или серо-белую, слегка опухшую структуру с более полной формой и сравнительно чёткими границами.
5. Провести сегментную идентификацию и вскрытие DRG (рисунок 6; 8–10 мин)
   1. Используйте микрохирургические щипцы под стереомикроскопом, чтобы аккуратно поднять нервный пучок спинного корня и таким образом получить полную экспозицию прикреплённого DRG.
   2. Используйте следующие признаки для определения сегментальной идентичности DRG: обозначите DRG, соединённые с множественно ветвящимися нервными волокнами (>2 ветвями), как L2 и больше черепных DRG, а DRG, соединённые с раздвоенными нервными волокнами (только две ветви), как L3 и более хвостовые DRG. Далее идентифицируйте оставшиеся сегменты DRG последовательно выше и ниже в зависимости от расположения межпозвоночных отверстий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нервные волокна, возникающие из DRG L3–L5, сливаются в седалищный нерв.
   3. Используйте микрохирургические изогнутые ножницы или щипцы для аккуратного разделения соединительной ткани и нервных волокон вокруг DRG и постепенного освобождения ганглия от прикрепления к тканям вокруг межпозвоночного отверстия.
   4. Пересекать волокна дорсального корня, соединяющие DRG с спинным мозгом, и одновременно перерезать нервный пучок, простирающийся к периферии, чтобы изолировать ганглий.
   5. Аккуратно изолируйте DRG с помощью микрохирургических щипцов. Если требуется длительное сохранение и последующий иммунофлуоресцентный анализ, немедленно поместить изолированный DRG в центрифугную трубку объёмом 0,5 мл с 4% параформальдегида и фиксировать ткань на 3 часа. После фиксации промыйте ткань в течение 3 × 5 минут с 0,1 M PBS (основные компоненты: NaCl, KCl, Na2HPO4 и KH2PO4), затем переместите ткань в раствор сахарозы 30% для обезвоживания до опускания на дно. Наконец, внедрить ткань в ОКТ и хранить при −80 °C для длительного сохранения.

3. Подтвердите наличие компонентов ганглия.

1. Результаты окрашивания H&E (Рисунок 7)
   1. Зафиксировать изолированный DRG немедленно в традиционном гистологическом фиксативе, например, 4% параформальдегиде. После фиксации промывайте ткань в буфере с фосфатом 0,1 м, проводите обезвоживание, очистку и встраивание парафина согласно стандартным гистологическим процедурам, а также подготовьте срезы ткани диаметром 4–6 мкм для дальнейшего анализа окрашивания.
   2. Проведите окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) на срезах для оценки общей структуры и клеточной морфологии DRG. Используйте окрашенные срезы для определения клеточных компонентов и структуры тканей ганглия, а также для определения качества полученного DRG.
   3. Изучите секции, окрашенные H&E, под микроскопом и убедитесь, что DRG состоит преимущественно из множества тел сенсорных нейронных клеток. Определите нейроны с крупными, круглыми или яйцевидными соматами, а также наблюдайте их хорошо видимые ядра, а также заметные ядерца, присутствующие в некоторых нейронах. Также подтверждается наличие близко расположенных спутниковых глиальных клеток, окружающих нейроны в характерном кольцеобразном расположении.
   4. Осмотрите внутреннюю часть ганглия и определите нервные волокнистые пучки и перегородку соединительной ткани, чтобы убедиться, что общая структура ткани цела и чётко организована. Проверьте, что клеточные границы хорошо очерчены и не отсутствует явное нарушение или структурный дисбаланс тканей.
   5. Подтверждение успешной изоляции DRG на окрашивании H&E по наличию сохранившейся общей структуры, чётко очерченной клеточной морфологии и отсутствию явных механических повреждений. Обнаружить повреждения образца, наблюдая нарушенную клеточную архитектуру, неясные края тканей или локальное разрушение тканей, возникающее во время вскрытия или обработки. Используйте эти результаты H&E как практическую основу для оценки качества сбора DRG и целостности ткани.
2. Результаты иммунофлуоресцентного окрашивания TUBB3 (Рисунок 8)
   1. Немедленно закрепить изолированный DRG в 4% параформальдегиде на 3 часа. После завершения фиксации прополосните ткань три раза за 0,1 M PBS, оставляя 5 минут на каждую промывку. Затем поместите ткань в 30% сахарозный раствор, пока она не оседет на дне, затем внедрите её в ОКТ и разрезайте замороженные срезы с толщиной 8–12 мкм для окрашивания иммунофлуоресценцией вниз.
   2. Прогрейте участки до комнатной температуры, прополощите их 3 × 5 минут в PBS и проведите забор антигена с помощью раствора для забора антигена Tris-EDTA. Дайте кускам естественным путём остыть до комнатной температуры, затем снова помойте их 3 × 5 минут с PBS и заблокируйте 5% BSA на 30–60 минут при комнатной температуре. После этапа блокировки нанесите первичное антитело TUBB3, маркированное фторофором, и инкубируете эти участки ночью при 4 °C. На следующий день промыйте срезы трижды с помощью PBS, окрашьте ядра DAPI, закрепите срезы и сделайте снимки с помощью флуоресцентного микроскопа.
   3. Осмотрите срезы DRG и убедитесь, что хорошо сохранившиеся образцы имеют выраженный контур ганглия, целостную структуру тканей и упорядоченное клеточное расположение. Наблюдайте иммунофлуоресценцию TUBB3 преимущественно в телах сенсорных нейронных клеток и нервных волокнах для определения общего нейронного распределения внутри ганглия. Используйте контрокрашивание DAPI, чтобы идентифицировать крупные TUBB3-положительные клетки как сенсорные нейроны, и обратите внимание, что маленькие DAPI-положительные ядра, расположенные вокруг этих клеток, имеют морфологический ритернат, соответствующий ядрам сателлитных глиальных клеток. Выявить повреждения, связанные с рассечением или обработкой, вследствие нарушения непрерывности тканей, нерегулярной локализации сигнала TUBB3, плохо определённой морфологии нейронов или фокальных увеличений фонового сигнала.
   4. Применяйте иммунофлуоресцентное окрашивание TUBB3 как дополнительный индикатор целостности тканей DRG. Успешную изоляцию DRG можно распознать по наличию сохранившегося контура ганглия, выраженным флуоресцентным сигналам в телах сенсорных нейронных клеток и нервных волокнах, четкой клеточной морфологии и минимальному фоновому окрашиванию.

Результаты

Успешная изоляция DRG требует сохранения целостности ганглия без явного сжатия, сдавления или разрыва. Аккуратно поднимите боковые нервные волокна, постепенно освобождайте ганглий из окружающих тканей и перерезайте соединённые нервные волокна только после полной мобилизации ганглия, чтобы его можно было удалить целым. Во время процедуры избегайте прямого сцепления ганглиозного тела с помощью инструментов. После выделения сохраняйте родную морфологию DRG внутри межпозвоночного отверстия м...

Обсуждение

DRG, являясь ключевыми компонентами периферической сенсорной нервной системы, играет критическую роль в передаче механической, тепловой и ноцицептивной сенсорной информации в центральную^{нервную систему 9,10,11}. Нейроны DRG демонстрируют характерную псевдоуниполярную морфологию: один процесс распространяется на периферические ткани, а другой — на спинной рог спинного мозга, играя ключевую роль в ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,5 мл центрифужная пробирка	Не указано	Не указано	Используется для хранения фиксированных ганглии заднего корешка
20 мл шприц	Не указано	Не указано	Используется для перфузии сердца
30% раствор сахарозы	Не указано	Не указано	Используется для дегидратации тканей перед встраиванием в OCT
4% параформальдегид	Servicebio	G1101
5% BSA	Solarbio	SW3015
70% этанол	Не указано	Не указано	Используется для уменьшения загрязнения шерстью перед диссекцией
Абсорбентная бумага	Не указано	Не указано	Используется для удаления шерсти из соединительной ткани
Взрослые мыши C57BL/6	Vital River	Не указано	мужского или женского пола; возраст 12 недель; 25–30 г
Alexa Fluor 488-конъюгированный козлиный анти-кроличиный IgG	Servicebio	GB25303
Анти-TUBB3 антитело	Proteintech	CL488-66375	Используется для иммунофлюоресценции TUBB3
Камера с углекислым газом	Не указано	Не указано	Используется для эвтаназии
DAPI	Servicebio	G1012
Диссекционная доска	Не указано	Не указано	Используется для закрепления мыши во время диссекции
Флуоресцентный микроскоп	Не указано	Не указано	Используется для визуализации иммунофлюоресцентных сечений
Костные кусачки Friedman-Pearson	RWD	S21022-14	Извлечено из рукописи: костные кусачки (RWD, S21022-14)
Набор для окрашивания H&E	Servicebio	G1005
Микрохирургические изогнутые ножницы	ASSI	SDCT16R8	Извлечено из рукописи: микроизогнутые ножницы (ASSI, SDCT16R8)
Микрохирургические пинцет	Fine Science Tools	11254-20	Извлечено из рукописи: микрохирургические пинцет (FST, 11254-20)
OCT компаунд	Sakura Finetek	No. 4583
PBS	Servicebio	G2156
Шпильки	Не указано	Не указано	Используется для закрепления конечностей на доске для диссекции
Физиологический раствор	Не указано	Не указано	Используется для промывания операционного поля
Ножницы	Fine Science Tools	14060-09	Извлечено из рукописи: ножницы (FST, 14060-09)
Стереомикроскоп	Leica Microsystems, Вецлар, Германия	10447197	Извлечено из рукописи: стереомикроскоп (Leica, 10447197)
Трис-ЭДТА раствор для ретриева антигена	Solarbio	C1038