$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Это исследование было проведено с использованием установленных человеческих линий острого миелоидного лейкоза и их производных, устойчивых к доксорубицину. Не участвовали люди, животные или первичные образцы, полученные из пациентов. Поэтому одобрение институционального надзорного совета для исследований на людях и этики животных не требовалось. Клеточные линии были получены в Институте гематологии Китайской академии медицинских наук в Тяньцзине, Китай, и хранятся в Фуцзянском институте гематологии при Фуцзянском медицинском университете Союзной больницы. Идентичность клеток была подтверждена кариотипом и морфологической оценкой перед экспериментами, а все клеточные культуры тестировались на загрязнение микоплазмой. Химикаты, оборудование и программное обеспечение, используемые в протоколе, перечислены в Таблице материалов.
1. Культура клеток и подтверждение устойчивого фенотипа
Человеческие клетки острого миелоидного лейкоза HL60 и K562, а также их производные, устойчивые к доксорубицину, HL60/A и K562/A, были получены в Институте гематологии Китайской академии медицинских наук, Тяньцзинь, Китай. Клетки культивировались в среде Roswell Park Memorial Institute 1640 с добавлением 10% плодовой сыворотки крупного рогатого скота и 1% пенициллин-стрептомицином при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с содержанием 5% углекислого газа.
Клетки HL60/A содержались в полной среде с 1 мкг/мл доксорубицина, а клетки K562/A — в полной среде с 5 мкг/мл доксорубицина для сохранения устойчивого фенотипа. Доксорубицин был удален из посевной среды за месяц до экспериментального тестирования, чтобы избежать острых эффектов отбора лекарств во время анализов.
До проведения экспериментов устойчивый фенотип был повторно подтверждён путём сравнения концентраций доксорубицина в половине максимальных тормозных концентраций между родительскими и резистентными клетками. Стабильность устойчивости после 1 месяца культуры без лекарств оценивалась путём повторного анализа чувствительности к доксорубицину и изучения базального P-гликопротеина и экспрессии белка-1, ассоциируемого с мультилекарственной резистентностью. Культуры использовались для экспериментов только тогда, когда резистентные производные сохраняли более высокие значения полумаксимальной концентрации доксорубицина и более высокую экспрессию транспортеров по сравнению с их родительскими аналогами.
2. Разработка и разработка лекарственных средств
FTY720, доксорубицин и SC79 были подготовлены как стандартные растворы согласно инструкциям производителя. FTY720 и SC79 растворялись в диметилсульфоксиде, а доксорубицин был приготовлен в рекомендованном растворителе и защищён от света при обращении. Рабочие растворы свежеразбавлялись в полной культурной среде перед обработкой. Итоговая концентрация диметилсульфоксида оставалась одинаковой для всех групп обработки и не превышала 0,1%.
Контрольные группы с транспортными средствами получили такую же конечную концентрацию диметилсульфооксида, как и соответствующие группы обработки. Для экспериментов с комбинированной обработкой в качестве сенсибилизирующей концентрации использовалось 5 мкм FTY720. Доксорубицин применялся при 4 мкм для клеток HL60/A и 8 мкм для клеток K562/A в апоптозе и внутриклеточных анализах накопления доксорубицина, если не указано иное.
3. Анализ жизнеспособности клеток и расчёт концентрации в полу-максимальной тормозной концентрации
Ячейки посеивались в пластины с 96 лунками по 1 × 104 ячейки на колодцы в полной среде по 100 мкл. Для тестирования FTY720 на один препарат клетки HL60, K562, HL60/A и K562/A обрабатывались FTY720 с концентрацией 0, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 и 100 мкм FTY720 в течение 48 часов. Для тестирования чувствительности к доксорубицину клетки HL60/A и K562/A обрабатывались серийными концентрациями доксорубицина при наличии или отсутствии 5 мкм FTY720 в течение 48 часов.
Жизнеспособность клетки измерялась с помощью анализа Cell Counting Kit-8 согласно инструкциям производителя. После обработки в каждую скважину добавляли реагент Cell Counting Kit-8, и пластину инкубировали при 37 °C в течение 2 часов. Поглощение измерялось при 450 нм с помощью считывателя микропластин.
Относительная жизнеспособность ячеек рассчитывалась следующим образом: относительная жизнеспособность ячеек = [(поглощение обработанных скважин — поглощение пустых скважин) / (поглощение управляющих скважин с транспортным средством — поглощение пустых скважин)] × 100%
Полумаксимальные значения ингибиторной концентрации рассчитывались с использованием нелинейной регрессии с четырёхпараметрической логистической моделью доза-ответ в GraphPad Prism, версия 9.5. Каждый эксперимент включал три независимых биологических реплики, по три технических скважины в каждом условии обработки.
4. Анализ комбинаций лекарств
Влияние FTY720 на чувствительность к доксорубицину оценивалось путём сравнения доза-ответ между дозой и ответом при наличии или отсутствии FTY720. Клетки HL60/A и K562/A были обработаны серийными концентрациями только доксорубицина или в сочетании с FTY720 в течение 48 часов.
Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью теста Cell Counting Kit-8, а половинные максимальные значения ингибирующих концентраций рассчитаны с использованием нелинейной регрессии с четырёхпараметрической логистической моделью доза-ответ. Изменения чувствительности к доксорубицину интерпретировались на основе изменений кривых дозы-ответа и различий в половине максимальных тормозных концентраций между группами лечения.
Поскольку эксперименты не были разработаны как полное исследование с фиксированным соотношением дозы и матрицы, формальный анализ индекса комбинаций не проводился. Поэтому результаты интерпретировались как доказательство изменённой чувствительности к доксорубицину, а не как окончательная фармакологическая синергия.
5. Анализ апоптоза с помощью Annexin V и проточной цитометрии йодида пропидия
Клетки HL60/A и K562/A были засеяны в пластины с 6 лунками при 4 × 105 клеток/мл и обработаны в течение 48 часов транспортным средством, только FTY720, только доксорубицином или доксорубицином в сочетании с FTY720. Для комбинированного лечения 5 мкм FTY720 комбинировали с 4 мкм доксорубицином в клетках HL60/A или 8 мкм доксорубицином в клетках K562/A.
После обработки клетки собирались, включая клетки, взвешенные в культурной среде, и дважды промывались холодным фосфатно-буферным физиологическим раствором. Клетки были повторно суспендированы в буфере связывания Annexin V в концентрации, рекомендованной производителем комплекта для обнаружения апоптоза. Каждый образец окрашивался 5 мкл Annexin V-флуоресцеин изотиоцианатом или Annexin V-аллофикоцианином и 5 мкл пропидиевым йодидом, после чего инкубировали 15 минут при комнатной температуре в темноте.
Образцы были немедленно проанализированы с помощью проточной цитометрии. Для настройки элементов компенсации и квадрантных элементов использовались неокрашенные элементы, одноокрашенные элементы и флуоресцентные элементы минус один. Обломки были исключены с помощью прямого и бокового рассеяния гейтингов. Ранние апоптотические клетки определялись как Annexin V-положительные и пропидиево-отрицательные клетки, а поздние апоптотические или мёртвые клетки — как Annexin V-положительные и проидий-йодид-положительные клетки. Общий апоптоз рассчитывался как сумма ранних и поздних апоптотических клеточных фракций. Для каждого образца было получено не менее 10 000 жизнеспособных одиночных событий.
6. Внутриклеточный анализ накопления доксорубицина
Клетки HL60/A и K562/A были засеяны в пластины с 6 лунками при температуре 4 ×10 5 клеток/мл и культивировались ночью. Клетки затем обработали транспортным контролем, только доксорубицином или доксорубицином в сочетании с 5 мкм FTY720. Клетки HL60/A были обработаны доксорубицином 4 мкм, а клетки K562/A — 8 мкм доксорубицином. Клетки инкубировали 4 часа при 37 °C и защищались от света.
После обработки клетки дважды извлекали и промывали холодно-фосфатно-буферным физиологическим раствором для удаления внеклеточного доксорубицина. Клетки были ресуспендированы в фосфатно-буферный физиологический раствор и проанализированы с помощью проточной цитометрии с использованием внутренней флуоресценции доксорубицина. Необработанные клетки использовались для определения фоновой автофлуоресценции, а клетки, обработанные доксорубицином, использовались в качестве эталонного показателя флуоресценции. Внутриклеточное накопление доксорубицина количественно определялось как медианная интенсивность флуоресценции после исключения обломков и агрегатов. Медианные значения интенсивности флуоресценции нормализовались до группы с одиночным содержанием доксорубицина в каждом независимом эксперименте.
7. Проточный цитометрический анализ экспрессии P-гликопротеинов и мультилекарственной резистентности белка 1
Ячейки HL60/A и K562/A были засеяны в пластины с 6 лунками при 2 × 106 элементах/мл и обработаны 5 мкм FTY720 или аппаратным контролем в течение 24 часов. После обработки клетки дважды промывались ледяным фосфат-буферным физиологическим раствором и возвращались в буфер для окрашивания клеток 100 мкл.
Клетки были окрашены антителами анти-P-гликопротеинов, конъюгированными с фикоэритрином, и антителами белка-1, ассоциированного с мультирезистентностью Alexa Fluor 647, по рекомендованному производителем разбавлению. Для настройки и компенсации вентиляции были включены сопоставленные изотипные контроли, неокрашенные, одноокрашенные и флуоресцентные элементы минус один. Образцы инкубировали 30 минут при температуре 4 °C в темноте, дважды промывались с буфером для окрашивания клеток и повторно суспендовали в буфере для окрашивания клеток объемом 500 мкл перед получением.
Проточная цитометрия проводилась с помощью проточного цитометра BD FACScan. Для каждого образца было получено не менее 10 000 жизнеспособных одиночных событий. Уровни экспрессии P-гликопротеинов и мультирезистентных белков 1 количественно оценивались как медианная интенсивность флуоресценции после вычитания соответствующего контрольного изотипа сигнала. Нормированные значения были выражены относительно группы управления транспортным средством в каждом независимом эксперименте.
8. Западное блоттинг и денситометрическая количественная оценка
После назначенных обработок клетки были собраны и дважды промыты холодным фосфат-буферным физиологическим раствором. Общий белок был извлечен с помощью буфера радиоиммунопреципитационного анализа с дополнением ингибиторами протеазы и фосфатазы. Концентрация белка измерялась с помощью набора для анализа белков на бицинхониновой кислоте.
Всего 30 мкг белка на полосу отделялись электрофорезом гель натрия додецилсульфат-полиакриламида и передавались на мембраны поливинилидендифторида. Мембраны блокировались 5% обезжиренным молоком или 5% бычьей сывороткой альбумином в Tris-буферном физиологическом растворе, содержащем Tween 20, в течение 1 часа при комнатной температуре.
Мембраны инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами против тотальной протеинкиназы B, фосфорилированной протеинкиназы B, общей механистической мишени рапамицина, фосфорилированной механической мишени рапамицина, расщеплённой каспазы-3, расщеплённой поли(аденозиндифосфат-рибоза) полимеразы, P-гликопротеина, белка 1, ассоциированного с мультилекарственной резистентностью, и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. После промывки мембраны инкубировали соответствующими вторичными антителами, конъюгированными пероксидазой хрена, в течение 1 часа при комнатной температуре. Белковые полосы визуализировались с помощью усиленного обнаружения хемилюминесценции.
Интенсивность диапазона была количественно измерена с помощью программного обеспечения ImageJ, версии 1.53t. Фосфорилированная протеинкиназа B была нормализована до полной белккиназы B, а фосфорилированная механистическая мишень рапамицина — до общей механистической мишени рапамицина. P-гликопротеин, белок 1, ассоциированный с мультипрепараторезистентностью, расщепленная каспаза-3 и расщепленная поли(аденозиндифосфат-рибоза) полимераза были нормализованы до глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Нормализованные значения выражались в виде изменений сгибания относительно группы с контролем транспортного средства или только с доксорубицином, в зависимости от сравнения. Western blot анализы проводились с использованием трёх независимых биологических репликат. Необрезанные изображения Western blot хранились в публичном хранилище данных или загружались как дополнительные файлы.
9. Спасательный эксперимент SC79
Для изучения связи сигнализации протеинкиназы B с наблюдаемыми эффектами FTY720, клетки HL60/A и K562/A были обработаны FTY720 при наличии или отсутствии SC79, активатора протеинкиназы B. Клетки предварительно обрабатывались с помощью 5 мкм FTY720 в течение 12 часов, а затем дополнительно обработаны 30 мкм SC79 или аппаратным контролем в течение 12 часов.
После лечения были оценены уровни фосфорилированной протеинкиназы B, фосфорилированной механистической мишени рапамицина, P-гликопротеина и белка-1, ассоциированных с мультипрепаратоустойчивостью. Параллельно апоптоз оценивался с помощью окрашивания Annexin V и пропидиевым йодидом после обработки доксорубицином, FTY720 и SC79. Спасательные эффекты интерпретировались как доказательства, связанные с путём. Поскольку не проводилось эксперимента по генетической гиперэкспрессии или «knockdown», причинные выводы приводились с осторожностью.
10. Статистический анализ и отчетность по данным
Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism (версия 9.5) и IBM SPSS Statistics (версия 23.0). Биологические репликаты определялись как независимые эксперименты, проводимые в разные дни с использованием независимо культивируемых клеток. Технические репликаты определялись как повторные скважины или повторные измерения в рамках одного биологического эксперимента.
Данные были представлены как средние ± стандартной ошибке среднего, если не указано иное. Сравнения в двух группах анализировались с помощью непарного двухстороннего t-теста Студента, когда данные были примерно нормально распределены. Сравнения между тремя и более группами анализировались с помощью одностороннего анализа дисперсии, за которым последовал пост-хок тест Тьюки. Эксперименты с двумя независимыми факторами, такими как концентрация препарата и условие лечения, анализировались с использованием двустороннего анализа дисперсии с соответствующим коррекцией с множественным сравнением.
Когда предположения о нормальности не поддерживались, использовались непараметрические тесты. Точные p-значения указывались, когда это было возможно. Статистическая значимость была определена как p < 0,05 после коррекции для множественных сравнений. Все легенды рисунков указывали количество биологических репликаций, используемый статистический тест, значение полос ошибок и порог значимости. Значения отдельных биологических репликаций отображались на диаграммах рассеяния или накладывались на столбчатые диаграммы, когда это было возможно.