В этом исследовании были выявлены основные цели и пути применения шиконина против RCC посредством многометодного анализа и валидации in vitro , что стало основой для дальнейших механистических исследований.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
В этом исследовании были выявлены основные цели и пути применения шиконина против RCC посредством многометодного анализа и валидации in vitro , что стало основой для дальнейших механистических исследований.
Почечноклеточная карцинома (РКК) — одна из самых распространённых опухолей в мочевыводящей системе и имеет самый высокий уровень смертности. Предыдущие исследования показали, что шиконин может лечить почечноклеточную карциному, но механизм остаётся неясным. Поэтому наше исследование было направлено на разъяснение механизма применения шиконина в лечении почечноклеточной карциномы с помощью сетевой фармакологии, молекулярного докинга и in vitro функциональных тестов, включая пролиферацию клеток, миграцию и апоптоз, с валидацией western blot (WB). Шиконин-мишени были скринингованы с помощью PharmMapper, SwissTargetPrediction и других баз данных, а также выявлены связанные с RCC мишени из онлайн-баз данных Mendelian Inheritance in Man (OMIM), GeneCards и других баз данных; Потенциальные терапевтические цели были получены с помощью анализа пересечений. Была построена сеть взаимодействия белков и белков (PPI), а Cytoscape использовался для скрининга основных мишеней, а молекулярное стыкованное соединение применялось для анализа связывания между шиконином и ключевыми мишенями. Всего было собрано 374 мишени шиконина и 1 087 связанных с RCC, а также выявлено 98 перекрывающихся генов мишени. Были идентифицированы шесть основных целей (SRC, PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD, PTPN11 и PIK3R1). Анализы генной онтологии (GO) и Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) показали, что шиконин оказывает анти-RCC эффект главным образом за счёт регулирования активности белккиназ, HIF-1 и IL-17. Молекулярная стыковка подтвердила, что шиконина обладает сильной связной связью с этими основными мишенями. Исследования in vitro с использованием человеческих RCC Caki-1 и 786-O показали, что шиконин значительно ингибирует пролиферацию и миграцию клеток в зависимости от дозы, способствует апоптозу клеток и повышает активность каспазы-3 и каспазы-8. Эксперименты Western Blot дополнительно подтвердили, что шиконин модулирует экспрессию основных белков-мишень и подавляет сигнальный путь HIF-1. В этом исследовании систематически проясняется фармакологический механизм применения шиконина при почечноклеточной карциноме, предоставляя теоретическую основу для разработки и применения шиконина как нового анти-РКК-препарата.
Почечноклеточная карцинома (РКК) — самая распространённая злокачественная опухоль мочевыводящей системы, составляющая примерно 90% всех злокачественных опухолей почек и 2%–3% взрослых злокачественных опухолей в мире. Согласно данным GLOBOCAN 2022, в мире в 2022 году было зарегистрировано около 434 800 новых случаев и 155 953 смерти от почечноклеточной карциномы, при этом частота и смертность РКК демонстрируют устойчивую тенденцию роста. Американское онкологическое общество оценило 80 980 новых случаев и 14 510 смертей от почечноклеточной карциномы только в США в 2025 году. Почечноклеточная карцинома имеет самый высокий уровень смертности среди злокачественных опухолей мочевыводящей системы, а пациенты с метастатическим или лекарственно-устойчивым РКРК всё ещё демонстрируют плохой прогноз. С широким применением таргетной терапии и иммунотерапии достигнут значительный прогресс в клиническом лечении РКК. Стандартное лечение первой линии для запущенной или метастатической почечноклеточной карциномы в основном включает комбинированные схемы ингибиторов иммунных контрольных точек или схемы, сочетающие ингибиторы иммунных контрольных точек с антиангиогенными ингибиторами тирозинкиназ. Несмотря на постоянное развитие терапевтических подходов, большое число пациентов всё ещё испытывают прогрессирование заболевания, лекарственную резистентность или непереносимость лечения. Поэтому разработка новых анти-РКЦ препаратов с чёткими механизмами, безопасностью и эффективностью остаётся неотложной клинической потребностью 1,2,3.
Шиконин является основным биоактивным компонентом, извлекаемым из Radix Arnebiae, а его производное ацетилшиконин проявляет заметное анти-РКК-фармакологическое воздействие. Существующие данные показали, что шиконин проявляет анти-РКК активность через многоцелевую и многопутную регуляторные механизмы. Механически шиконин может повышать экспрессию гена супрессора опухолей TEK и ингибировать фосфорилирование сигнального каскада AKT/mTOR, тем самым подавляя пролиферацию, миграцию и инвазию клетокRCC 4; Кроме того, шиконин индуцирует внутриклеточное накопление реактивных видов кислорода (ROS), что вызывает дисфункцию митохондрий, что дополнительно инициирует множество запрограммированных паттернов гибели клеток, включая апоптоз, некроптоз и аутофагию в клеткахRCC 5. Он также модулирует экспрессию микроРНК, таких как miR-15b и miR-99b, и регулирует гены, связанные с апоптозом, включая FOXO1 и PDCD4, через пути MAPK/ERK, при этом эти регуляторные эффекты демонстрируют явную специфичностьклеточной линии 6. В частности, шиконин сохраняет сильную противоопухолевую активность против сунитиниб-резистентных РКК-клеточных линий, при этом вызывая терапевтический эффект за счёт активации комплексов некросом, ингибирования пути AKT/mTOR и индуцирования остановки цикла G2/M 7. Хотя анти-РКК-эффекты шиконина частично подтверждены существующими экспериментальными исследованиями, основные терапевтические цели, ключевые сигнальные сети и молекулярные регуляторные механизмы шиконина против РКЦ остаются неясными; Кроме того, систематическое предсказание, молекулярная проверка и экспериментальное подтверждение его центральных целей всё ещё отсутствуют, что создаёт важный исследовательский пробел в текущих исследованиях.
Сетевая фармакология и молекулярное стыкинг служат дополняющими техническими подходами в современных исследованиях естественных лекарств и изучении фармакологических механизмов. С систематической точки зрения сетевая фармакология может систематически декодировать многоцелевые, многопутные холистические характеристики взаимодействия между биоактивными соединениями и мишенями, связанными с заболеваниями. В отличие от этого, молекулярное стыкование позволяет на молекулярном уровне подтвердить аффинность связывания и стабильный паттерн взаимодействия между маломолекулярными соединениями и основными белками-мишенями. Сочетание этих двух методологий создаёт систематический исследовательский замкнутый цикл целостного прогнозирования цели, за которым следует молекулярная верификация. Сочетание экспериментальной валидации с сетевой фармакологией и молекулярным докированием является основным подходом в исследованиях натуральных лекарств, который способствует прояснению патогенеза заболеваний и выявлению механизмов фармакологических соединений, а также предоставляет теоретическую основу для фундаментальных исследований и трансляционного применениялекарств 8,9.
В этом исследовании применялась сетевая фармакология для прогнозирования кандидатов на шиконин в лечении почечноклеточной карциномы. Молекулярное стыковивание использовалось для теоретической проверки потенциальных целей, и ключевые мишени действия были окончательно определены через эксперименты in vitro и дополнительно подтверждены экспериментами Western Blot (WB). Весь процесс исследования показан на рисунке 1.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все человеческие клеточные линии, использованные в этом исследовании, были приобретены из подтверждённых коммерческих клеточных банков, и свежие человеческие ткани или образцы пациентов не собирались. Поэтому этическое одобрение не требовалось для этого исследования на основе клеток in vitro .
Получение и предсказание шиконинов
Ключевое слово «шиконин» было найдено в базе данных PubChem. Была скачана SDF-структура шиконина, и получена упрощённая система молекулярного входа (SMILES). В соответствии с требованиями соответствующих баз данных по целям, потенциальные мишени шиконинов были предсказаны и собраны из баз данных PharmMapper, SwissTargetPrediction, HERB и SEA Search Server 3 марта 2026года 10, 11 и 12.
Получение мишеней для почечноклеточной карциномы
Используя почечноклеточную карциному в качестве ключевого слова, из базы данных терапевтических целей (TTD), OMIM и GeneCards были получены мишеневые заболевания, полученные от человека, при этом виды ограничивались Homo sapiens и Релевантным показателем > 50. В итоге было получено 1148 мишеней, а после суммирования и дедупликации было получено 1087 уникальных мишеней, связанных с карциномой почек— 13,14,15.
Выявление пересечений шиконина для лечения почечноклеточной карциномы
Прогнозируемые генные мишени шиконина и почечноклеточной карциномы были введены в Venny 2.1, онлайн-инструмент для анализа. Перекрывающиеся цели были выявлены с помощью анализа пересечений и визуализированы в диаграмме Венна.
Создание сети компонент-мишень заболеваний
Используя шиконин как основную отправную точку исследований, мы интегрировали физиологическую ассоциационную информацию между этими основными мишенями и RCC и построили молекулярную сеть взаимодействия троичной системы «компонент-мишень-болезнь» с помощью программного обеспечения визуализации Cytoscape.
Построение сети взаимодействия белков и приобретения основных мишеней шиконина в лечении почечноклеточной карциномы
База данных белковых взаимодействий STRING является основным инструментом для построения сетей взаимодействия белок-белок (PPI), позволяющего анализировать и визуализировать взаимоотношения между белками. В этом исследовании перекрывающиеся мишени между шиконином и почечноклеточной карциномой были отправлены в базу данных STRING, при этом вид был установлен в Homo sapiens для дальнейшего извлечения. Нажмите кнопку «Продолжить» для дальнейшего анализа. В модуле «Настройки» внизу страницы с результатами анализа минимально требуемый балл взаимодействия был установлен на высоком уровне уверенности 0,900. В то же время несвязанные белки и разрозненные узлы в сети были скрыты для получения оптимизированного взаимного отображения сети PPI. Данные хранились в формате TSV и импортировались в программное обеспечение Cytoscape. Соответствующие параметры были отрегулированы так, чтобы размер узла и цветовой оттенок соответствовали соответствующим значениям, а толщина краёв — балл скорости связывания. Карта сети PPI была установленана 16,17.
На основе вышеуказанной сети PPI были точно отобраны основные цели. Плагин cytohubba открывался в модуле приложений Cytoscape, и нажималась кнопка Расчёт , чтобы запустить программу вычислений. Алгоритм MCC выбирался из топ-6 узлов, ранжированных по параметрам, и нажималась кнопка «Отправить » для завершения расчёта. Шесть основных целей были отобраны для благоустройства и загрузки данных.
Анализ обогащения GO и анализ путей KEGG шиконина в лечении почечноклеточной карциномы
База данных Metascape использовалась для анализа обогащения GO. В этом исследовании в базу данных были внесены шиконин-таргетированные пересечения с почечноклеточной карцинома. Сначала выбранный вид был Homo sapiens (человек), затем был выбран режим пользовательского анализа. Анализ обогащения проводился для трёх измерений функционального обогащения ГО: молекулярных функций, клеточных компонентов и биологических процессов. Порог p-значения был установлен на 0,01, и была нажата кнопка анализа обогащения для проведения анализа с использованием платформы микрокредита с целью построения визуализации GO анализа обогащения шиконина в лечении почечноклеточнойкарциномы 18,19.
База данных KOBAS 3.0 была использована для проведения анализа обогащения сигнальных путей KEGG на перекрывающихся целях между шиконином и почечноклеточной карциномой, и эта база данных позволяет проводить статистический анализ генов по аннотации путей и обогащению. Экранированные цели пересечения импортировались в базу данных KOBAS 3.0; источником выбранного вида был H. sapiens (человек), тип скрининга ограничивался сигнальным путём KEGG, а порог p-значения для анализа обогащения был установлен на уровне <0,01. После анализа были получены результаты обогащения пути KEGG. На основе результатов анализа обогащения p-значение использовалось в качестве основы для сортировки, а 10 верхних сигнальных каналов KEGG были отсеяны. Обработка визуализации была завершена с помощью платформы микросигнализации, и, наконец, был нарисован пузырьковый диаграмма Санки по обогащению KEGG, который сохранил20,21.
Проверка молекулярного стыковки
Трёхмерная (3D) структура шиконина была извлечена из базы данных PubChem, и программное обеспечение Open Babel было применено для преобразования 3D-структуры в стандартный формат PDB. Трёхмерные белковые структуры основных мишеней, выявленные методом сетевого фармакологического анализа, были загружены в формате PDB из базы данных белков RCSB и базы данных AlphaFold. Кристаллические структуры целевых белков включали PIK3CA (PDB ID: 9B4T), PIK3CD (PDB ID: 8BCY), PIK3R1 (PDB ID: 7CIO), PTPN11 (PDB ID: 9R16), SRC (PDB ID: 9NS1), PIK3CB (структура, предсказанная AlphaFold, AF-Q8BTI9-F1-model_v6). Были удалены молекулы воды и гетероатомы, добавлены полярные водороды, а заряды Гастейгера назначены с помощью AutoDock Tools. Программное обеспечение AutoDock Tools использовалось для выбора стыковочной коробки подходящего размера, чтобы покрыть весь целевой белок для молекулярного стыковки. Наконец, была получена визуализация пар компонентов мишень-актив с оптимальной энергией связывания. Программное обеспечение PyMol использовалось для анализа сайтов связывания, типа и расстояния взаимодействия связывания, а также для создания трёхмерного конформационного визуализационногоизображения 22,23.
Тест на цитотоксичность
Клетки Caki-1 были инъекциированы в 96-колодцевые культивные пластины с плотностью 5 000 клеток на колодцу и обработаны шиконином в концентрациях 12,5, 25, 50 и 100 мкмоль/л в течение 12 и 24 часов соответственно. Для клеток 786-O было проведено только 24-часовое лечение с одинаковым градиентом концентрации. Цитотоксическое действие шиконина на обе линии клеток оценивалось с помощью МТТ-анализа. Все эксперименты проводились в биологических тройных копиях с тремя техническими репликами для каждого состояния. Результаты выражаются в виде значений IC50 . Хотя общий ингибирующий тренд был постоянен между двумя клетками клетки, шиконин проявил более высокую цитотоксичность по отношению к клеткам Caki-1. Поэтому для последующих функциональных экспериментов были отобраны клетки Caki-1.
Влияние шиконина на миграцию клеток Caki-1, определённое с помощью теста на царапину
Клетки Caki-1 и клетки 786-O в логарифмической фазе были засеяны в пластины с 6 ячецами. Параллельные линии царапины создавались на дне каждой скважины с помощью стерильного наконечника пипетки объёмом 200 мкл. После ночного прикрепления PBS использовался для промывания культивированных клеток. Клетки обрабатывали разными концентрациями шиконина (12,5, 25, 50 и 100 мкмоль/л) в течение 12 часов. Через 12 часов изменение царапины на том же месте наблюдалось под микроскопом.
Формула для расчёта влияния шиконина на активность роста клеток Caki-1 была следующей: подвижность = [(0 h scratch area − 12 h scratch area)/0 h scratch area] × 100%.
Определение деятельности Caspase-3 и Caspase-8
Клетки Caki-1 на логарифмической фазе роста были собраны, а концентрация клеток была скорректирована до 5 × 106 клеток/мл, после чего следовала инкубация в течение 12 часов. После обработки клеток Caki-1 различными концентрациями шиконина (12,5, 25, 50 и 100 мкмоль/л) и инкубации в течение 24 часов обнаружение клеток было проведено в соответствии с описанием тестового набора Caspase.
Влияние шиконина на скорость апоптоза клеток Caki-1
Логарифмически растущие клетки Caki-1 были посеяны в культивированные пластины с 6 колодцами. Клетки обрабатывались шиконином в концентрациях 12,5, 25, 50 и 100 мкмоль/л в течение 24 часов при отсутствии контрольной группы. Клетки аккуратно подвешивали в PBS, собирали и подсчитывали. Всего 1 ×10 5 ресуспендированных ячеек были центрифугированы при 300 × г в течение 5 минут. Супернатант был отброшен, а клетка аккуратно суспендирована в 195 мкл буфера связывания Annexin V-FITC. Затем добавляли 5 мкл Annexin V-FITC, затем 10 мкл раствора для окрашивания йодида пропидия, оба с аккуратным смешиванием. Клетки инкубировали при комнатной температуре (20–25 °C) в темноте в течение 15 минут перед анализом.
Анализ путей клеточной сигнализации
Клетки Caki-1 были обработаны шиконином 12,5, 25, 50 и 100 мкмоль/л. Через 24 часа клетки были взяты в холодный PBS, лизированы с буфером лизиса клеток, содержащим ингибитор протеазы, и измерили концентрацию белка. Белок был выделен на геле с 10% натрия додецилсульфата (SDS)-полиакриламида. После переноса на мембраны PVDF мембраны блокировались 5% BSA на 3 часа, затем инкубировали ночью при 4 °C с другим первичным антителом. Впоследствии мембраны инкубировали с вторичным антителом с разбавлением 1:3000. Белковые диапазоны были обнаружены с помощью системы обнаружения ECL и количественно проанализированы с помощью программного обеспечения ImageJ.
Статистический анализ
Экспериментальные результаты были представлены как среднее ± стандартного отклонения (x ± s, n = 3). До проведения параметрического статистического анализа нормальность проверялась с помощью теста Шапиро-Вилка, а однородность дисперсии оценивалась тестом Левина. Односторонний анализ дисперсии (ANOVA) в сочетании с пост-хок тестом Тьюки проводился с помощью программного обеспечения SPSS. Статистические графики были созданы с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. Для парных сравнений групп использовался t-тест независимых выборок, а p < 0,05 показал статистически значимые различия.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Получение и предсказание шиконинов
Используя четыре вышеупомянутые базы данных, были предсказаны потенциальные цели шиконина, и после интеграции и суммирования было выявлено 426 целей. Обобщённые цели были дедупликационированы, в результате чего было 374 цели, как показано на рисунке 2A.
Получение мишеней для почечноклеточной карциномы
Всего было получено 1 147 целей после суммирования данных, связанных с тремя базами данных...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
PIK3CA официально известен как изоформа альфа-субъединицы 4,5-бисфосфатного 3-киназного каталитического субъединицы 4,5-бисфосфатного киназы. PIK3CA, центральный компонент пути PI3K/AKT/mTOR, играет важную роль в возникновении, развитии и лечении почечноклеточной карциномы (RCC). Исследования показали, что PIK3CA — это высокочастотный мутантный ген этого подтипа (6/57, 11%), и его мутация напрямую связана с аномальной активацией пути PI3K/AKT. Кроме того, такие пациенты хорошо реагируют ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторам нечего раскрывать.
Это исследование было профинансировано Комиссией по науке и технологиям провинции Гуйчжоу (gzwkj2024-516); Национальная и провинциальная программа подготовки талантов в области инноваций в науке и технологиях Университета традиционной китайской медицины Гуйчжоу, Университета традиционной китайской медицины TD Hopes [2023] 005; Гуйчжоуский провинциальный фонд естественных наук [номера грантов: ZK [2024] 404]; Белок-полисахаридный комплекс Чуаньсюн на основе характеристик долгоциркулирующего молока Пикеринга для стимулирования лечения головной боли с помощью Чуаньсюна (82360779).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 786-O | American Type Culture Collection (ATCC) | RRID: CVCL_1051 (ATCC CRL-1932) | Человеческая клеточная линия ясноклеточного рака почечной клетки |
| AlphaFold база данных | Европейская молекулярная биологическая лаборатория (EMBL) - EBI | AlphaFold база данных структур белков | База данных предсказания структуры белков (AlphaFold база данных структур белков) |
| Программное обеспечение AutoDock Tools | Институт исследований Скриппса | 1.5.7 | Программное обеспечение для молекулярного докирования для предсказания связывания лиганд-белок |
| Caki-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | RRID: CVCL_0234 (ATCC HTB-46) | Человеческая клеточная линия ясноклеточного рака почечной клетки |
| Клетки Caki-1 | Муданьцзянский нормальный университет | HTB-46 (RRID: CVCL_0234) | Человеческая клеточная линия ясноклеточного рака почечной клетки |
| Наборы для обнаружения каспазы 3 и каспазы 8 | Credit Suisse Biotechnology Co Ltd (Цюаньчжоу, Китай) | Набор для анализа активности каспазы-3, номер каталога RX302848M, Набор для анализа активности каспазы-8, номер каталога RX302849M | Используется для обнаружения активности каспаз для оценки апоптоза клеток |
| Программное обеспечение Cytoscape | Консорциум Cytoscape | 3.9.1 | Используется для построения и визуализации биологических сетей |
| Среда DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Среда культуры клеток для культуры клеток Caki-1 и 786-O |
| Фетальный бычий сыворотка | Gbico | 10099-141 | Добавка к среде культуры клеток для роста клеток Caki-1 и 786-O |
| GeneCards | Институт Вайцмана | https://www.genecards.org/ | Комплексная база данных человеческих генов для аннотации целевого гена |
| GraphPad Prism | GraphPad, Сан-Диего, Калифорния, США | версия 8.3.0 | Для построения статистических графиков |
| База данных HERB | Китайская академия наук | http://herb.ac.cn | База данных компонентов-целей традиционной китайской медицины |
| Программное обеспечение ImageJ | Национальный институт здравоохранения (NIH) | Fiji | Программное обеспечение для анализа изображений для морфологии клеток и определения количества полос на запад-блот |
| Инвертированный микроскоп | Olympus, IX73, Япония | Увеличение 100× | Используется для наблюдения за изменениями морфологии клеток после обработки шиконина |
| База данных KOBAS 3.0 | Пекинский университет | http://bioinfo.org/kobas/ | Инструмент анализа обогащения онтологии генов и путей |
| База данных Metascape | Мемориальный онкологический центр Слоан-Кеттеринг | https://metascape.org/gp/index.html) | Инструмент анализа обогащения генной функции и сетевого анализа |
| Платформа Microcredit | Национальный центр биоинформатики (Китай) | http://www.bioinformatics.com.cn/ | Онлайн-платформа биоинформатического анализа для обработки данных |
| Набор для анализа МТТ | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (Пекин, Китай) | номер каталога M8180 | Используется для обнаружения жизнеспособности клеток (анализ антипролиферации) |
| OMIM | Школа медицины университета Джонса Хопкинса | https://www.omim.org/ | Онлайн-база данных менделевского наследования человека (база данных генетических заболеваний человека) |
| База данных PharmMapper | Восточный китайский университет науки и технологий | https://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/ | База данных для предсказания мишеней для малых молекулярных лекарств |
| PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD и PTPN11 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Даллас, Техас, США) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Даллас, Техас, США) | Первичные антитела для анализа запад-блота целевых белков |
| Программное обеспечение PyMol | Schrödinger, Inc. | 2.2.0 | Программное обеспечение для визуализации молекул для анализа структуры белков |
| База данных белков RCSB | Банк данных структур белков RCSB (Университет Ратгерса) | https://www.rcsb.org/ | База данных структур белков (PDB) для молекулярного моделирования |
| База данных поисковой системы SEA | Университет Калифорнии, Сан-Франциско | https://sea.bkslab.org | Подход Similarity Ensemble для прогнозирования мишеней |
| Шикониин (чистота 98% | организмы, произрастающие в Китае | Y0001439 | Маломолекулярное соединение, используемое для лечения рака почечной клетки (RCC) в этом исследовании |
| SPSS | IBM, Армонк, Нью-Йорк, США | версия 20.0 | Для статистического анализа |
| STRING | Европейская молекулярная биологическая лаборатория (EMBL) | https://stringdb.org/ | База данных сети взаимодействий белок-белок |