Гибридизационная цепная реакция FISH в развивающейся оптической доле дрозофилы

Amanda Araujo Gomes Ferreira; Bogdan Sieriebriennikov; Hunter Whitbeck; Jennifer A. Malin

doi:10.3791/71681

Методическая статья

Гибридизационная цепная реакция FISH в развивающейся оптической доле дрозофилы

DOI:

10.3791/71681

⸱

17 июля 2026 г.

Amanda Araujo Gomes Ferreira^*¹ , Bogdan Sieriebriennikov^*¹ , Hunter Whitbeck^*² , Jennifer A. Malin³

¹Department of Biology, New York University, ²Department of Biological Sciences, Columbia University, ³Department of Biology, The City College of New York

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает этапы, необходимые для проведения гибридизации цепной реакции флуоресцентной in situ гибридизации (HCR-FISH) в оптических долях личинок Drosophila melanogaster . Процедуры проектирования зонда, гибридизации, амплификации и монтажа тканей подробно описаны для облегчения визуализации развивающейся оптической долей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание нейронного развития требует точной характеристики того, когда и где экспрессируются гены. Методы, такие как гибридизация in situ , давно позволяют визуализировать экспрессию генов в развивающихся тканях. Хотя гибридизация in situ широко используется в эмбрионах Drosophila melanogaster , её применение для развития зрительных систем ограничено рядом технических сложностей. Например, длинные зонды часто плохо проникают в оптическую долю, а протоколы, основанные на диффузивных каталитических репортерах, такие как пероксидаза хрена, часто дают низкие соотношения сигнал/шум в целостных препаратах. Гибридизационная цепная реакция флуоресцентной in situ гибридизация (HCR-FISH) преодолевает многие из этих ограничений и обеспечивает более надёжное обнаружение сигналов. Как и в обычной FISH, мономеры зонда ДНК гибридизируются с последовательностями РНК внутри тканей. Однако в HCR-FISH флуоресцентно конъюгированные усилители формируют стабильные шпилькообразные структуры, которые запускают полимеризацию дополнительных мономеров, тем самым усиливая интенсивность сигнала. Использование мультиплексированных зондовых наборов также позволяет использовать более короткие олигонуклеотиды (~45 нт, по сравнению с до 1000 нт в традиционных FISH), улучшая проникновение зонда и обеспечивая более равномерное окрашивание в целостных образцах. В этой статье описывается протокол HCR-FISH, оптимизированный для личиночной оптической доли дрозофилы . Протокол адаптирует существующие подходы HCR-FISH, оптимизируя условия фиксации и увеличивая концентрацию зондов и шпильок для повышения интенсивности сигнала и проникновения тканей. Представлены списки реагентов и пошаговые процедуры. Также представлены потенциальные применения в нейробиологии развития, включая визуализацию новорождённых нейронов и характеристику паттернов экспрессии генов в случаях, когда традиционные методы, такие как эндогенно маркированные белки или окрашивание антител, не дают достаточной информации.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание того, как устроен мозг, требует определения как разнообразия типов клеток, так и генного репертуара, экспрессируемого внутри каждой клетки^{типа 1}. Недавние достижения в секвенировании одноклеточных РНК позволили исследователям решать эти вопросы с высоким^{разрешением 2}. Однако многие подходы с одной клеткой не сохраняют пространственную информацию, что требует дополнительных экспериментов для отображения транскрипционных кластеров клеток к их расположению в развивающемся мозге.

Системы экспрессии бинарных генов, такие как GAL4-UAS, могут предоставлять позиционную информацию, но не являются^{количественными 3}. Кроме того, задержки между экспрессией генов и обнаружением репортеров могут затеять физиологически значимые паттерны экспрессии на ранних этапах развития. Иммунокрашивка — ещё один широко используемый подход для определения тканеспецифических экспрессионных^{паттернов 4}. Однако секретируемые белки часто диффузны и их трудно точно локализировать.

Методы маркировки нуклеотидов, такие как гибридизация in situ (ISH), также широко применяются для получения пространственной информации о экспрессии^{генов 5}. В ISH маркированные олигонуклеотиды ДНК связываются с интересующими обратно-комплементарными РНК-последовательностями. Ранние методы ISH использовали радиомаркированные^{ДНК-зонды 6}, тогда как поздние протоколы включали более безопасные метки, такие как дигоксигенин, флуоресцеин и^{родамин} ^7,8,9. Учёные быстро адаптировали ISH для применения в Drosophila melanogaster, где он применялся для характеристики организации политенных хромосом и картирования паттернов экспрессии генов разрыва, таких как горбун, у эмбрионов целого^{маунта 10,11}.

Несмотря на широкое применение, ряд технических ограничений препятствовал внедрению ISH в более толстые препараты цельного крепления, такие как личиночная оптическая доля. Многие протоколы in situ опирались на диффузные каталитические репортеры, такие как пероксидаза хрена, что часто приводило к низким соотношениям сигнал/^{шум 12}. Кроме того, многие подходы использовали длинные зонды, направленные на отдельные последовательности, чтобы повысить специфическую точность. Хотя они эффективны в эмбрионах Drosophila и политенных хромосомах, длинные зонды плохо проникают в личиночный мозг и часто производят неравномерное^{метирование} 10,11,13.

Разработка одномолекулярной флуоресцентной ISH (smFISH) и гибридизационной цепной реакции флуоресцентной флуоресцентной in situ (HCR-FISH) устранило многие из этих^{ограничений 14,15}. Используя наборы коротких зондов, размещённых по одному генетическому региону, smFISH уменьшает среднюю длину зонда примерно с 1 000 нт до примерно 40 нт¹⁶. Это значительно улучшает проникновение зонда при сохранении высокой интенсивности сигнала. HCR-FISH дополнительно улучшает соотношение сигнал/шум, используя флуоресцентно сопряжённые усилители, которые повышают точность позиционирования и усиливают выходной сигнал. Важно, что этот этап амплификации, по-видимому, масштабируется линейно с концентрацией транскрипта, что позволяет количественно измерять уровень экспрессии^{генов 17}.

HCR-FISH начинается с инициаторных зондов, дополняющих целевую последовательность. Эти немаркированные олигонуклеотиды ДНК содержат одноцепочечную инициаторную последовательность, которая связывается с входным доменом флуоресцентно маркированного H1-усилительного зонда. Усилители H1 имеют шпильку, которая сохраняет каталитическую неактивность до связи с инициаторной последовательностью. При привязке усилитель H1 открывается и открывает последовательность, которая связывается с партнёрским зондом H2. Это взаимодействие открывает шпильку H2, позволяя ей связывать ещё один зонд H1 (рисунок 1)¹⁵. Повторяющиеся циклы связывания H1/H2 создают стабильный полимер, который усиливает флуоресцентный сигнал и уменьшает фоновый шум. Поскольку каждая инициаторная последовательность специфична для соответствующей пары H1/H2, несколько зондов с разными инициаторными последовательностями и флуорофорами могут использоваться одновременно для маркировки нескольких генов в одном образце.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Графическое представление рабочего процесса HCR-FISH. ДНК-зонды, содержащие инициаторные последовательности, гибридизуются с транскриптом целевой РНК. Флуоресцентно маркированные усилители ДНК связываются с инициаторной последовательностью и проходят последовательную полимеризацию, формируя стабильные двухцепочечные цепи амплификации. Прямая конъюгация флуорофоров улучшает усиление сигнала и соотношение сигнал/шум. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Недавние улучшения HCR-FISH ещё больше повысили его полезность. Конструкция зонда с разделённым инициатором повышает специфичность усилителя, а вторичные антитела, конъюгированные с инициаторами HCR, позволяют одновременно проводить иммуногистохимию и^{HCR-FISH 18}. Кроме того, расширенные варианты флуорофоров теперь позволяют одновременно мультиплексировать до 10 генов^{— 19,20}.

Хотя первоначальные эксперименты с доказательством концепции HCR-FISH проводились на данио-рерио (Danio rerio), метод получил широкое распространение во многих системах, особенно в немодельных организмах, где антитела дорогие или^{недоступны.} Синтез зондов также предлагает более быструю альтернативу генерации антител, что может потребовать нескольких месяцев разработки. В результате HCR-FISH обеспечивает быстрый подход к валидации кандидатских генов, идентифицированных с помощью наборов данных секвенирования одноклеточной^{РНК 21}. Даже в устоявшихся генетических модельных организмах HCR-FISH предоставляет ценный метод пространственного картирования новорождённых нейронов, когда репортеры GAL4 или иммуногистохимия не способны адекватно маркировать определённые популяции клеток.

В этой статье описывается протокол HCR-FISH, оптимизированный для личинки третьего возраста Drosophila. Протокол адаптирует методы, ранее опубликованные у других организмов, для использования в зрительной системе Drosophila ²². Условия фиксации, обычно используемые для иммуногистохимии дрозофилы, были оптимизированы для применения в FISH. Концентрации зонда и шпильки были увеличены для повышения интенсивности сигнала и проникновения тканей. Вместо точечных пластин использовались ПЦР-пробирки для снижения потребления реагентов и упрощения обращения с мелкими образцами тканей. Кроме того, время промывания и гибридизации было сокращено, чтобы учесть меньший размер мозга дрозофилы по сравнению с другими системами насекомых, широко используемыми для HCR-FISH.

Репрезентативные приложения демонстрируют, как этот подход может предоставлять позиционную информацию для конкретных нейронных популяций в процессе развития. Эти эксперименты показывают, что определённые транскрипты, такие как резкие, могут быть обнаружены раньше с помощью HCR-FISH, чем при окрашивании антител или репортерных линиях. Обсуждаются также возможные трудности, стратегии устранения неисправностей и применение HCR-FISH для изучения развития зрительных систем у дрозофилы .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты с Drosophila melanogaster проводились в соответствии с рекомендациями Городского колледжа Нью-Йорка, Колумбийского университета и Нью-Йоркского университета по уходу и использованию исследовательских организмов. Исследовательские инструменты, используемые в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовьте буферы

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все реагенты в трубках без нуклеазы с использованием фильтрующих кончиков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Носите перчатки на протяжении всей процедуры. Очистите рабочие поверхности раствором для дезактивации РНазой перед началом работы.

Подготовьте решения без нуклеазы
1. Подготовьте 1x PBS-T, разбавляя 20x PBS, Triton X-100 и глицин в безнуклеазной воде до конечных концентраций 1x PBS, 1% (v/v) тритона X-100 и 1 мМ глицина.
2. Подготовьте 5x SSCT, разбавляя 20x SSC и Tween-20 в воде без нуклеаз, чтобы получить 5x SSC с 0,1% (v/v) Tween-20.
3. Разведите 20x PBS в воде без нуклеаз, чтобы подготовить 1x PBS.

2. Проектные зонды

Для коммерческого проектирования зондов выбирайте изоформу, интересующую для интересующего вида, и упорядоченные зонды, соответствующие желаемому усилителю, используя веб-интерфейс производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческие химические и инициаторные последовательности зондов HCR являются собственными и находятся под патентом компанией Molecular Instruments.
1. Модифицировать целевую область в веб-интерфейсе, если требуется обнаружение транскрипта или до мРНК.
2. Закажите примерно 20 зондов для высоковыраженных транскриптов. Используйте до 40 зондов для транскриптов с низким количеством в препаратах с целыми дрозофилами .
  ПРИМЕЧАНИЕ: Закажите специализированные олигограммы для более коротких транскриптов, которые содержат меньше сайтов связывания зонда.
Для ручного проектирования зондов скачайте последовательность FASTA для целевого транскрипта. Определите, стоит ли нацеливаться на одну изоформу или на все изоформы гена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отдавайте приоритет конститутивным экзонам или высокоэкспрессируемым изоформам, выявленным из наборов данных секвенирования РНК, чтобы улучшить сигнал.
1. При проектировании зондов для обнаружения до мРНК проектируйте зонды, охватывающие межмежи интрона и экзонов. Проектирование зондов, охватывающих соединения соединения, для обнаружения зрелых транскриптов. Используйте интронные зонды для обнаружения зарождающихся транскриптов внутри ядер.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Интронные зонды могут не колокализироваться с зрелыми цитоплазматическими транскриптами и могут требовать дополнительных маркеров для идентификации клеток.
2. Определите размер набора зонда. Используйте минимум около 5 зондов для коротких транскриптов, если большие наборы зондов невозможно спроектировать. Используйте 20 зондов для стандартных применений и примерно 40 зондов для оптимальной чувствительности в целостных образцах^18,23.
3. Если вы проектируете собственные зонды, используйте последовательности длиной 25nt, разделённые проставкой 2 ударных ударов, и добавьте разделённые инициаторные последовательности на 5-футовый конец каждого олиго.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя последовательности инициаторов первого поколения с разделением доступны публично, коммерческие инициаторы следующего поколения являются проприетарными¹⁸.
4. Если вы проектируете собственные зонды, проверьте последовательности зондов. Убедитесь, что зонды внутри каждого комплекта имеют одинаковую температуру плавления. Подтвердите 100% идентичность между зондами.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте сильных G-богатых областей и поддерживайте сходство GC среди^{зондов 24}. Минимизировать повторяющиеся последовательности и оценить внецелевую связь с помощью^{BLAST 25}.
5. Используйте общедоступное программное обеспечение для проектирования зондов, когда^{это уместно 26,27}.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты с открытым исходным кодом могут не воспроизводить оптимизированную производительность коммерческих конвейеров проектирования зондов.

3. Вскрыть, исправить и предварительно гибридизовать мозг

Буфер гибридизации зонда до 37 °C.
ВНИМАНИЕ: Буфер гибридизации зонда содержит формамид. Держите его под капюшоном с химическим паром, надевая соответствующие средства индивидуальной защиты.
Разведите каждый зонд, установленный до конечной концентрации 1 мкм, используя дистиллированную воду без нуклеаз.
Аликотирайте примерно 250 мкл PBS без нуклеазы на дисекционную тарелку.
Перенесите блуждающую личинку третьего возраста в PBS с помощью щипцов. Держите брюшко одной парой щипцов, а вторую — за крючки для рта. Оттяните крючки от тела, чтобы изолировать мозг и вентральный нервный пупов (VNC).
Удалите жировые тела и слюнные железы, сохраняя VNC. Переместить вскрытый мозг в трубку с 600 мкл ледяного безнуклеазного PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите оптические доли под водой на протяжении всего вскрытия, чтобы предотвратить высыхание тканей.
Повторяйте вскрытие, пока не будет собрано примерно шесть зрительных лопастей. Завершите вскрытие в течение 20 минут для минимизации разрушения тканей.
Добавьте 200 мкл 16% параформальдегида (PFA) для получения конечной концентрации 4% PFA. Аккуратно переверните трубку, чтобы перемешать и инкубировать 15 минут при комнатной температуре.
ВНИМАНИЕ: PFA токсичен и мутагенен. Держите под капюшоном с химическим паром, надевая перчатки.
Удалить фиксатор из образцов и оставить как выделенные химические отходы. Промывайте пробы три раза с 600 мкл холодного PBS без нуклеаз, используя дисекционную чашу для захвата раствора для мытья.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте растворы для промывания на предмет потери тканей и восстанавливайте любые смещённые мозги под микроскопом.
Перенесите мозг в ПЦР-трубку, содержащую 100 мкл предварительно нагретого буфера гибридизации зонда.
Аккуратно перемешайте, щёлкая по трубке, и инкубуйте 10 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мозг остаётся под водой и не прилипает к стенкам труб.

4. Гибридизация зондов

Подготовьте решение для зонда мощностью 4 нм, добавив 0,4 пмоль каждого набора зонда в буфер гибридизации зонда для конечного объёма 100 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличить концентрацию датчика до 16 нМ, если интенсивность сигнала в начальных окрасках низкая.
Удалите буфер предварительного гибридизации, не нарушая ткань. Добавляйте разбавленный раствор зонда в каждый образец.
Инкубировать образцы при 37 °C на нутаторе в течение 16–24 часа.

5. Усиление сигнала зонда

Доведите буфер усилителя до комнатной температуры. Подготовьте примерно 200 мкл буфера амплификации на образец.
Уравновесный буфер мойки. Тёплый буфер для промывания зонда до 37 °C с помощью водяной бани.
ВНИМАНИЕ: Probe Wash Buffer содержит формамид. Держать под вытяжкой химического парня.
Снимите раствор для зонда и храните при -20 °C для повторного использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторно используйте растворы для зонда, пока интенсивность окрашивания не снизится.
Промывайте образцы четыре раза по 10 минут в предварительно нагретом буфере для промывания при 37 °C. Промывайте образцы дважды по 5 минут в комнатной температуре 5x SSCT.
Добавьте 100 мкл буфера усиления без шпильок. Инкубировать 30 минут при комнатной температуре.
Нагрейте термоциклер до 95 °C. Добавьте по 2 мкл каждого приклада шпильки объемом 3 мкм для отдельных ПЦР-трубок. Подготовьте по одной трубке для каждого вида шпильки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличивайте концентрацию усилителя, если окрашивание приводит к разрежённой точке или низкому соотношению сигнал/шум.
Инкубировать шпильки при 95 °C в течение 90 секунд. Защитите трубки от света и инкубуйте при комнатной температуре не менее 30 минут.
Приготовьте раствор для усиления. Комбинируйте шпильки в буфере усиления до конечного объёма 100 мкл на образец.
Удалить буфер амплификации из образцов. Добавьте буфер усиления с шпильками.
Инкубировать на ночь при комнатной температуре на нутаторе, защищённом от света (завернутым в фольгу).
Удалите раствор усиления. Промывайте образцы дважды в течение 5 минут в 150 мкл 5x SSCT. Промывайте три раза в течение 10 минут в 150 мкл 5x SSCT на нутаторе. Проведите две короткие промывки в безнуклеазном PBS, чтобы удалить моющее средство.

6. Установка мозгов для визуализации

Прикрепите наклейку проставки для изображения к стеклянному слайду. Аккуратно нажмите нижним концом щипца, чтобы удалить застрявшие пузырьки воздуха.
Разрежьте мозг пополам через вентральную нервную связку с помощью щипцов.
Поместите мозг в центр спейсерной ямы. Ориентируйте ткань вбок, чтобы зрительная доля была обращена вверх.
Добавьте достаточное количество крепящего материала против фейда (около 25 мкл), чтобы заполнить скважину без появления воздушных пузырьков. Равномерно распределяйте монтажную среду с помощью щипцов.
Наденьте накладку на образец и запечатайте лаком для ногтей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для учёных, изучающих развивающую нейробиологию, HCR-FISH предоставляет надёжный метод визуализации паттернов экспрессии генов и определения пространственного положения развивающихся нейронов в зрительной доле дрозофилы .

В зрительной доле дрозофилы (рисунок 2A) нейроны в медулле нейропил возникают из нейрональных стволовых клеток (нейробластов), полученных из пространственно оформленного нейроэпителия, называемо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном исследовании описывается адаптация HCR-FISH для использования в личиночной оптической доле дрозофилы melanogaster . Традиционные методы гибридизации in situ часто плохо работают в целостной личиночной ткани мозга из-за ограниченного проникновения зонда и низкой интенсивности сигнала. Представленный здесь протокол оптимизирует несколько критически важных шагов для улучшения качества окрашивания в развивающейся оптической доле. Условия фиксации, обычно используем...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Клода Десплана за предоставление доступа к молекулярным приборам HCR-FISH зондам и dpp-GAL4; Леска UAS-Stinger. Авторы также благодарят Аниша Ачарью и Гарри Чоя из Molecular Instruments за техническую обратную связь и обсуждения по реализации HCR-FISH. Этот протокол был адаптирован из ранее опубликованных и неопубликованных методологий HCR-FISH, разработанных Мег^{Янгер, 22} года, Хантером Уитбеком, Богданом Сериебриенниковым, Амандой Араухо Гомес Феррейра, Йен-Чун Чен и Янцици Зеном. Богдан Сериебриенников получил поддержку от программы Human Frontier Science (LT000010/2020-L). Дженнифер Малин получила поддержку гранта Национального института здравоохранения R00 EY032269.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10% Tween-20	Bio-Rad Laboratories	1662404	НД
20x PBS, pH7.4	Growcells.com	MRGF-6396	2,74M NaCl, 53,7 мМ KCl, 20,3 мМ Na2HPO4, 29,4 мМ KH2PO4
20x SSC	Quality Biological	351-003-131	3M NaCl, 0,3M цитрата натрия
37 °C incubator	Fisher Scientific (Isotemp)	15-015-2633	НД
37 °C water bath	Fisher Scientific	FSGPD15D	НД
Aluminum foil	Reynolds Wrap/Fisher Brand	15-078-291	НД
Antibody: Mouse-anti-Abrupt	DSHB	Abrupt; RRID: AB_528344	Разбавление: 1:20
Antibody: Chicken anti-GFP	Millipore Sigma	Catalog# 06-896; RRID: AB-619712	Разбавление: 1:500
Antibody: Rabbit anti-GFP	Life Technologies	#11122; RRID: AB_221569	Разбавление: 1:500
Antibody: Rabbit anti-Dll	Genscript/Desplan lab	-	Разбавление: 1:200
Antibody: Rat anti-NCadherin	DSHB	DN-Ex #8, RRID: AB_528121	Разбавление: 1:50
Antibody: Rabbit anti-SoxN	Genscript/Desplan lab	-	Разбавление: 1:200
Antibody: Guinea Pig anti-Traffic jam	Gift from D. Godt	-	Разбавление: 1:2,000
Antibody: Donkey anti-Rat 405	Jackson ImmunoResearch	Code # 712-475-150; RRID: AB_2340680	Разбавление: 1:100
Antibody: Donkey anti-Chicken 488	Jackson ImmunoResearch	Code #703-545-155; RRID: AB_2340375	Разбавление: 1:200
Antibody: Donkey anti-Mouse 488	Jackson ImmunoResearch	Code #715-545-151; RRID: AB_2341099	Разбавление: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit 488	Jackson ImmunoResearch	Code #711-545-152; RRID: AB_2313584	Разбавление: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit A555	Thermo Scientific	Catalog #A-31572; RRID: AB_162543	Разбавление: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat Cy3	Jackson ImmunoResearch	Code #712-165-153; RRID: AB_2340667	Разбавление: 1:200
Antibody: Donkey anti-Guinea Pig 647	Jackson ImmunoResearch	Code #706-605-148; RRID: AB_2340476	Разбавление: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat 647	Jackson ImmunoResearch	Code #712-605-153; RRID: AB_2340694	Разбавление: 1:200
Antifade mountant	Thermo Fisher Scientific	S36940 (SlowFade Gold Antifade Mountant)	Другие типы slowfades также подойдут, включая те, что содержат DAPI (S36936)
Confocal Microscope	Zeiss	LSM-880	НД
Cover slips (22 x 30)	VWR	16004-332	НД
Fly: D. melanogaster: ab-GFP-FLAG	BDSC	38626; RRID: BDSC_38626	НД
Fly: D. melanogaster: Canton S	BDSC	64349; RRID: BDSC_64349	НД
Fly: D. melanogaster: dpp-Gal4	BDSC	1553; RRID: BDSC_1553	НД
Fly: D. melanogaster: ham-GFP.FPTB	BDSC	83660; RRID: BDSC_83660	НД
Fly: D. melanogaster: yw; 10xUAS-myr-GFP;	BDSC	32198; RRID: BDSC_32198	НД
Fly: D. melanogaster: UAS-Stinger	BDSC	84277; RRID: BDSC_84277	НД
Fly: D. melanogaster: wit-KO-Gal4	BDSC	600136; RRID: BDSC_600136	НД
Forceps	Dumont	#5 или #55s	НД
Glass slides	VWR	16005-106	НД
Glycine	Millipore Sigma	G7126-10MG	НД
HCR Amplification buffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	НД
HCR-Gold Amplifiers	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	НД
HCR HiFi Probes	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	НД
HCR Probe Hybridization Buffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	Содержит формамид
HCR Probe Wash Buffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	Содержит формамид
Nail polish (clear)	Electron Microscopy Sciences	72180	НД
Nuclease-free water (not DEPC-treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9937	НД
Nutating mixer	Corning/Fisher Scientific	10-320-100	НД
Paraformaldehyde, 16% (w/v)	Electron Microscopy Sciences	15710	Токсично
PCR Machine/Thermal Cycler	Bio-Rad	1851148 (C1000 Touch Thermal Cycler)	НД
PCR pull-apart tube strips with dome cap strips (0.2 mL)	USA Scientific	#1402-2400	НД
Petri dishes (150 x 15 mm; for making dissecting dishes)	Fisher Scientific	FB0875714	НД
RNase ZAP	ThermoFisher Scientific	AM9780	НД
Slide spacer stickers	SUNJin	IS016 (i

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Гибридизационная цепная реакция FISH в развивающейся оптической доле дрозофилы

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи