Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В данном протоколе представлена совместимая с микроскопом платформа для магнитного нанопривода, объединяющая флуоресцентные суперпарамагнитные наночастицы, калиброванный электромагнит и конфокальную визуализацию в реальном времени для дистанционной и контролируемой стимуляции шванновских клеток и динамического мониторинга их механосенсорных реакций.
Механические силы критически регулируют поведение клеток, однако многие существующие методы механической стимуляции основаны на прямом физическом контакте или искусственно созданной внеклеточной среде, что ограничивает их гибкость при проведении динамических исследований живых клеток. В данной работе мы представляем платформу магнитного наноактуатора для дистанционной, бесконтактной и контролируемой механостимуляции клеток Шванна in vitro. Эта интегрированная установка позволяет осуществлять дистанционную магнитную стимуляцию и синхронную визуализацию живых клеток в рамках одного экспериментального сеанса. В данной статье описываются подготовка флуоресцентных суперпарамагнитных наночастиц (SPIONs), опционально функционализированных SPIONs (f-SPIONs), нацеленных на актин, конструирование и калибровка совместимого с микроскопом устройства электромагнитной стимуляции, оценка магнитных сил на уровне отдельных частиц и отдельных клеток, а также интеграция магнитного воздействия с конфокальной визуализацией в режиме реального времени. Клетки Шванна — это высокочувствительные к механическим воздействиям глиальные клетки, которые играют важную роль в развитии, поддержании и восстановлении периферических нервов. Мониторинг их реакций на механическую стимуляцию в режиме реального времени имеет решающее значение для понимания того, как механические силы влияют на организацию цитоскелета и поведение клеток. Данная платформа предоставляет воспроизводимый рабочий процесс для изучения механобиологии клеток Шванна и может быть адаптирована для других типов механически чувствительных клеток и многоклеточных систем.
Механические стимулы регулируют широкий спектр клеточных процессов, включая адгезию, миграцию, пролиферацию, дифференцировку и фенотипическую пластичность1,2,3. Исследования в области механобиологии показали, что как нейроны, так и глиальные клетки проявляют выраженную механочувствительность и отклик на протяжении всего развития4,5,6,7. Для изучения того, как клетки воспринимают силу и реагируют на нее, было разработано множество экспериментальных п....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В экспериментах, описанных в данном протоколе, использовалась установленная линия клеток Шванна крысы (RSC96); участие людей или живых животных не потребовалось. Данное исследование проводилось в рамках более широкого исследовательского проекта с использованием животных, который был одобрен Комитетом по этике и благополучию животных Первой больницы Университета Цзилинь (номер одобрения 2022-0045).
1. Приготовление флуоресцентных магнитных суперчастиц
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения (HRTEM) показала, что итоговая формуляция наночастиц имела кластерное магнитное ядро и внешнюю оболочку после модификации поверхности (Рисунок 1). Итоговые f-SPIONs имели средний общий диаметр 63.36 ± 16.65 nm, при этом магнитное ядро, обогащенное Fe₃O₄, имело размер примерно 56.60 ± 6.19 nm, а внешняя оболочка, состоящая из полидофамина и фаллоидина-Alexa Fluor 350, имела среднюю толщину примерно 5.79 ± 1.36 nm. Эти результаты подтв.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Наночастицы оксида железа широко признаны магнитными наноматериалами с благоприятной биосовместимостью. Суперпарамагнитные наночастицы Fe₃O₄, широко используемые в качестве контрастных веществ для магнитно-резонансной томографии, нашли обширное применение в клинической визуализационной диагностике29,30. В недавнем исследовании нашей группы20 было показано, что f-SPIONs обладают крайне низкой цитотоксичностью и отличной биобезопасностью. На.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта финансовых интересов.
Данная работа была поддержана Национальным природным научным фондом Китая (гранты № 82571677 и 82001304, выданные Y.W.), Специальной программой по подготовке медицинских и санитарных кадров в провинции Цзилинь (грант № JLSRCZX2025-134, выданный Y.W.) и проектом программы имени Безунова Университета Цзилиня (грант № 2024B19, выданный Y.W.). Авторы выражают благодарность химическому факультету Университета Цзилиня (Государственная ключевая лаборатория супрамолекулярных структур и материалов) и Чанчунскому институту прикладной химии Китайской академии наук за помощь в разработке, синтезе и определении характеристик наноматериалов. Авторы также благодарят Институт трансля....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,2-гексадекандиол | Sigma-Aldrich | 213748 | Технического сорта, 90%; используется в синтезе методом термического разложения |
| ibidi 35 мм µ—чашки Петри | ibidi | 80156 | Используется для культивирования и визуализации шванновских клеток |
| Бензиловый эфир | Sigma-Aldrich | 108014 | 98%; растворитель для Fe3О4 синтез наночастиц |
| Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп | Nikon | AXR (Ti2-E) | Используется для прижизненной визуализации клеток и флуоресцентной микроскопии |
| Специальный электромагнит | Специально сконструированный | Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести. | Компактный однополюсный электромагнит для генерации градиента магнитного поля in vitro |
| Цианин 3.5 карбоновая кислота | Duofluor Inc. | D10128 | Флуоресцентный краситель для определения Fe3О4·сборка суперчастиц Cy3.5; ММ 593,20; хранить при -20 °C, в защищенном от света месте |
| Дефероксамин мезилат | Sigma-Aldrich | D9533 | Железохелатирующий агент, используемый для удаления неинтернализованного и ассоциированного с мембраной железа |
| Цифровой гауссметр | МАГНИТНАЯ МЕШАЛКА WEITE | WT103 | Используется для измерения магнитной индукции и калибровки градиента магнитного поля, создаваемого специализированным электромагнитом |
| Допамина гидрохлорид | Sigma-Aldrich | H8502 | ≥98% (ТСХ); используется для покрытия полидофамином |
| Прибор для динамического рассеяния света | Malvern Instruments | Zetasizer Nano-ZS | Используется для измерения гидродинамического диаметра и индекса полидисперсности (PDI) |
| Fluo-4 AM | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | F14201 | Индикатор кальция, используемый для анализа Ca в живых клетках2+ визуализация |
| Флуориметрический спектрофотометр | Shimadzu | RF-6000 | Используется для характеристики фотолюминесценции |
| Просвечивающий электронный микроскоп высокого разрешения | JEOL | JEM-F200 | Используется для ПЭМВР-визуализации морфологии и ядра наночастиц–оболочечная структура |
| Атомно-эмиссионный спектрометр с индуктивно-связанной плазмой | PerkinElmer | Optima 3300 DV | Используется для количественного определения внутриклеточного железа |
| Ацетилацетонат железа(III), Fe(acac)3 | Sigma-Aldrich | F300 | 97%; предшественник для Fe3О4 синтез наночастиц |
| Инкубатор для живых клеток, устанавливаемый на предметный столик | TOKAI HIT | TENP&CO2 | Используется для конфокальной визуализации живых клеток во время магнитной стимуляции |
| Олеиновая кислота | Sigma-Aldrich | O1008 | ≥99% (ГХ); поверхностный лиганд для Fe3О4 синтез наночастиц |
| Олеиламин | Sigma-Aldrich | O7805 | Технический сорт, 70%; лиганд для синтеза наночастиц |
| Фаллоидин–Alexa Fluor 350 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | A22281 | Дополнительный реагент для функционализации с таргетированием на актин |
| Pluronic F-127 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | P3000MP | Используется для облегчения загрузки Fluo-4 AM при исследовании уровней Ca в живых клетках2+ визуализация |
| Программируемый стабилизированный источник питания постоянного тока | Тунмэнь | eTM-L605SPL (60 В, 5 А) | Используется для питания специализированного электромагнита для генерации градиентного магнитного поля in vitro |
| Шванновские клетки RSC96 | Банк клеток Китайской академии наук | Данных нет | Линия шванновских клеток крысы |
| Додецилсульфат натрия (ДСН) | Sigma-Aldrich | 436143 | реактив стандарта ACS, ≥99,0%; сурфактант для создания микроэмульсий типа «масло в воде» |
| SQUID-магнетометр | Quantum Design Inc. | MPMS-XL | Используется для измерения магнитного гистерезиса при 300 К |
| Толуол | Sigma-Aldrich | 244511 | Безводный, 99,8%; растворитель для сборки суперчастиц |
| Просвечивающий электронный микроскоп | FEI | EP 5018/40, Tecnai Spirit Biotwin | Используется для исследования ультраструктуры клеточных и нервных тканей |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно