Платформа магнитного нанопривода для дистанционной и контролируемой механостимуляции шванновских клеток с конфокальной визуализацией в режиме реального времени

Yang Wang; Ting Liu; Mingxi Yang; Chong Qi; Bin Liu

doi:10.3791/71685

Методическая статья

Платформа магнитного нанопривода для дистанционной и контролируемой механостимуляции шванновских клеток с конфокальной визуализацией в режиме реального времени

21 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71685

⸱

8 сентября 2026 г.

Yang Wang¹^,² , Ting Liu³ , Mingxi Yang¹^,² , Chong Qi⁴ , Bin Liu¹^,²

¹Department of Hand Surgery, Orthopedic Center, The First Hospital of Jilin University, ²Key Laboratory of Tissue Repair, Reconstruction and Regeneration of Jilin Province, ³International Medical Department, Geriatric Medical Center, The First Hospital of Jilin Universit, ⁴Institute of Translational Medicine, The First Hospital of Jilin University

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе представлена совместимая с микроскопом платформа для магнитного нанопривода, объединяющая флуоресцентные суперпарамагнитные наночастицы, калиброванный электромагнит и конфокальную визуализацию в реальном времени для дистанционной и контролируемой стимуляции шванновских клеток и динамического мониторинга их механосенсорных реакций.

Аннотация

Механические силы критически регулируют поведение клеток, однако многие существующие методы механической стимуляции основаны на прямом физическом контакте или искусственно созданной внеклеточной среде, что ограничивает их гибкость при проведении динамических исследований живых клеток. В данной работе мы представляем платформу магнитного наноактуатора для дистанционной, бесконтактной и контролируемой механостимуляции клеток Шванна in vitro. Эта интегрированная установка позволяет осуществлять дистанционную магнитную стимуляцию и синхронную визуализацию живых клеток в рамках одного экспериментального сеанса. В данной статье описываются подготовка флуоресцентных суперпарамагнитных наночастиц (SPIONs), опционально функционализированных SPIONs (f-SPIONs), нацеленных на актин, конструирование и калибровка совместимого с микроскопом устройства электромагнитной стимуляции, оценка магнитных сил на уровне отдельных частиц и отдельных клеток, а также интеграция магнитного воздействия с конфокальной визуализацией в режиме реального времени. Клетки Шванна — это высокочувствительные к механическим воздействиям глиальные клетки, которые играют важную роль в развитии, поддержании и восстановлении периферических нервов. Мониторинг их реакций на механическую стимуляцию в режиме реального времени имеет решающее значение для понимания того, как механические силы влияют на организацию цитоскелета и поведение клеток. Данная платформа предоставляет воспроизводимый рабочий процесс для изучения механобиологии клеток Шванна и может быть адаптирована для других типов механически чувствительных клеток и многоклеточных систем.

Введение

Механические стимулы регулируют широкий спектр клеточных процессов, включая адгезию, миграцию, пролиферацию, дифференцировку и фенотипическую пластичность¹^,²^,³. Исследования в области механобиологии показали, что как нейроны, так и глиальные клетки проявляют выраженную механочувствительность и отклик на протяжении всего развития⁴^,⁵^,⁶^,⁷. Для изучения того, как клетки воспринимают силу и реагируют на нее, было разработано множество экспериментальных подходов, включая атомно-силовую микроскопию (AFM), аспирацию микропипеткой, оптические пинцеты, системы культивирования с растяжением и микрофлюидные платформы⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Эти методы значительно продвинули изучение механотрансдукции. Однако многие из них требуют прямого физического контакта с клетками или зависят от заранее определенных искусственных механических условий, что делает их менее подходящими для дистанционной, динамически управляемой стимуляции, совместимой с методами визуализации.

Доставка силы с помощью магнитных наночастиц представляет собой альтернативную стратегию для дистанной механостимуляции¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Поскольку большинство биологических тканей обладают низкой магнитной восприимчивостью, внешние магнитные поля могут проникать в биологические образцы без прямого контакта и селективно воздействовать на магниточувствительные частицы, введенные в клетки или ткани. В присутствии градиента магнитного поля эти частицы испытывают направленные силы, которые могут быть использованы для создания механических воздействий на субклеточном, клеточном или тканевом уровне⁸^,⁹. Данный подход привлекателен тем, что он является бесконтактным, настраиваемым, совместимым с визуализацией живых объектов и потенциально применимым к более сложным биологическим системам.

Клетки Шванна представляют собой высокочувствительные к механическим воздействиям глиальные клетки¹⁹^,²⁰, которые играют важнейшую роль в развитии, поддержании и восстановлении периферических нервов²¹^,²².Динамическое наблюдение за реакциями клеток Шванна на физическую стимуляцию имеет важное значение для понимания того, как сила регулирует организацию цитоскелета и поведение клеток. Однако многие традиционные системы приложения силы не вполне совместимы с микроскопией высокого разрешения в режиме реального времени. Чтобы преодолеть это ограничение, мы разработали платформу магнитного наноактуатора, которая объединяет флуоресцентные магнитные суперчастицы (f-SPIONs), нацеленные на актиновый цитоскелет, специальное электромагнитное устройство, совместимое со столиком конфокального микроскопа, и количественную систему оценки силы. Эта интегрированная установка позволяет осуществлять дистанную магнитную стимуляцию и синхронную визуализацию живых клеток в рамках одного экспериментального сеанса.

Описанный здесь рабочий процесс включает подготовку флуоресцентных магнитных суперчастиц (SPIONs), дополнительную функционализацию на основе фаллоидина для таргетирования актина с целью создания f-SPIONs, характеристику наночастиц, конструирование электромагнитного устройства и калибровку поля, оценку магнитной силы, а также комбинированную магнитную стимуляцию с конфокальной визуализацией в режиме реального времени. Несмотря на то, что данная платформа была оптимизирована для клеток Шванна, она может служить практической основой для аналогичных исследований других механически чувствительных живых систем.

Протокол

В экспериментах, описанных в данном протоколе, использовалась установленная линия клеток Шванна крысы (RSC96); участие людей или живых животных не предусматривалось. Данное исследование проводилось в рамках более широкого исследовательского проекта, включающего эксперименты на животных, который был одобрен Комитетом по этике и благополучию животных Первой больницы Цзилиньского университета (номер одобрения 202-045).

1. Приготовление флуоресцентных магнитных суперчастиц

Синтез наночастиц Fe₃O₄, покрытых олеиновой кислотой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наночастицы Fe₃O₄, покрытые олеиновой кислотой, были синтезированы методом термического разложения, как описано ранее²⁰^,²³.
1. Добавьте 2 mmol Fe(ac)₃, 6 mmol олеиновой кислоты, 6 mmol олеиламина и 5 mmol 1,2-гексадекандиола в 20 mL бензилового эфира в реакционной колбе.
2. Перемешивайте смесь в атмосфере азота в течение 15 min до получения гомогенного раствора предшественника.
3. Нагрейте смесь до 20 °C со скоростью 20 °C/min.
4. Выдерживайте реакционную смесь при температуре 200 °C в течение 30 min.
5. Повысьте температуру до 265 °C и кипятите смесь с обратным холодильником в течение 30 min.
6. Оставьте реакционную смесь охлаждаться до комнатной температуры естественным путем.
7. Соберите наночастицы Fe₃O₄ с помощью магнитного разделения.
8. Промойте наночастицы этанолом 3 раза.
9. Редиспергируйте очищенные наночастицы в толуоле.
Сборка суперчастиц Fe₃O₄·Cy3.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Суперчастицы Fe₃O₄·Cy3.5 были подготовлены, как описано ранее²⁰^,²⁴^,²⁵.
1. Диспергируйте 28 mg наночастиц Fe₃O₄, покрытых олеиновой кислотой, в 4 mL толуола в трехгорлой круглодонной колбе объемом 50 mL.
2. Приготовьте водную фазу, содержащую 12,5 mg додецилсульфата натрия и 3 mg Cyanine 3.5 (Cy 3.5) в 12,5 mL воды.
3. Смешайте суспензию наночастиц Fe₃O₄ в толуоле (28 mg в 4 mL; 7 mg/mL) с водным раствором ПАВ/красителя для образования микроэмульсии «масло в воде».
4. Тщательно перемешивайте до получения стабильной эмульсии.
5. Нагрейте трехгорлую круглодонную колбу до 60 °C и непрерывно перемешивайте при 30 rpm в течение 6 h.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура выпаривания при пониженном давлении или роторного испарения не требуется.
6. Испарите толуол в условиях, описанных выше, чтобы вызвать агрегацию наночастиц Fe₃O₄. С помощью одноразовой трансферной пипетки перенесите небольшую аликвоту раствора в пробирку и оставьте ее в покое. Отсутствие расслоения фаз указывает на полное удаление толуола.
7. Перенесите суспензию суперчастиц Fe₃O₄·Cy3.5 в центрифужные пробирки объемом 15 mL. Центрифугируйте при 2,370 × g в течение 5 min при комнатной температуре для сбора суперчастиц и осторожно удалите супернатант, не задев осадок.
8. Редиспергируйте осадок в ультрачистой деионизированной воде и снова центрифугируйте при 2,370 × g в течение 5 min при комнатной температуре. Удалите супернатант и повторите процедуру промывки трижды, чтобы удалить остатки свободного красителя Cy3.5 и додецилсульфата натрия.
Покрытие суперчастиц полидофамином (PDA).
ПРИМЕЧАНИЕ: Суперчастицы, покрытые полидофамином, были подготовлены, как описано ранее²⁰^,²⁶.
1. Центрифугируйте суспензию суперчастиц Fe₃O₄·Cy3.5 при 2,370 × g в течение 5 min при комнатной температуре и удалите супернатант.
2. Редиспергируйте осадок в 10 mM Tris-буфере (pH 8,5).
3. Добавьте в суспензию 26 mg мономера дофамина.
4. Перемешивайте смесь при комнатной температуре в течение 3 h в щелочных условиях.
5. Центрифугируйте суспензию при 2,370 × g в течение 5 min при комнатной температуре.
6. Удалите супернатант и редиспергируйте осадок в ультрачистой воде для получения частиц Fe₃O₄·Cy3.5@PDA (SPIONs).
Опциональная функционализация частиц фаллоидином-Alexa Fluor 350.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхностная функционализация суперчастиц проводилась с использованием коммерчески доступного фаллоидина-Alexa Fluor 350²⁰.
1. Приготовьте 5 mL водного раствора, содержащего 10 единиц фаллоидина-Alexa Fluor 350.
2. Добавьте в раствор 20 µL суспензии Fe₃O₄·Cy3.5@PDA, содержащей 2 mg частиц.
3. Осторожно перемешивайте смесь при комнатной температуре в течение 24 h.
4. Центрифугируйте смесь при 2,370 × g в течение 5 min при комнатной температуре.
5. Удалите супернатант и редиспергируйте осадок в деионизированной воде.
6. Храните конечную формуляцию Fe₃O₄·Cy3.5@PDA@phalloidin (f-SPIONs) в защищенном от света месте до использования.

2. Характеристика наночастиц

Определение морфологии и размера.
1. Подготовьте образцы наночастиц для просвечивающей электронной микроскопии (TEM) или просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения (HRTEM) в соответствии с требованиями прибора.
2. Получите изображения для определения общей морфологии частиц, структуры ядро-оболочка и среднего диаметра (Рисунок 1).
3. Подготовьте водные суспензии наночастиц для метода динамического рассеяния света (DLS).
4. Измерьте гидродинамический диаметр и индекс полидисперсности (PDI).
5. Сравните результаты электронной микроскопии и DLS для оценки однородности состава и коллоидного поведения.
Определение магнитных свойств.
1. Подготовьте высушенные или концентрированные образцы наночастиц, подходящие для анализа с помощью сверхпроводящего квантового интерферометра (SQUID).
2. Запишите кривые магнитного гистерезиса при 30 K.
3. Определите намагниченность насыщения, остаточную намагниченность и коэрцитивную силу.
4. Подтвердите, что частицы проявляют суперпарамагнитное поведение с незначительной остаточной намагниченностью и коэрцитивной силой.
Определение флуоресцентных свойств.
1. Приготовьте суспензию f-SPION в ультрачистой деионизированной воде и перенесите ее в кварцевую кювету.
2. Запишите спектры фотолюминесценции с помощью флуоресцентного спектрофотометра.
3. Подтвердите, что флуоресцентный сигнал остается обнаруживаемым после промывки и ресуспендирования.
Валидация локализации, связанной с актином, при использовании таргетного состава.
1. Получите клетки RSC96.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки RSC96, использованные в данном исследовании (линия спонтанно трансформированных шванновских клеток крысы, созданная путем длительного культивирования первичных шванновских клеток крысы), были получены из банка клеток Китайской академии наук, Шанхай, Китай (CSTR: 19375.09.3101RATGNR6); тесты на микоплазменное и грибковое загрязнение дали отрицательный результат. Использовались клетки в пассажах 3–10.
2. Культивируйте клетки в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% раствором пенициллина-стрептомицина (10 U/mL пенициллина и 10 µg/mL стрептомицина).
3. Высейте клетки RSC96 с плотностью 1 × 10⁵ клеток на одну 35-мм чашку для микроскопии и культивируйте их в течение 24 ч при 37 °C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO₂, для обеспечения адгезии клеток.
4. Отожмите имеющуюся культуральную среду, дважды промойте клетки фосфатно-солевым буфером (PBS) и добавьте полную культуральную среду, содержащую 15 µg/mL f-SPIONs. Инкубируйте клетки с f-SPIONs в течение 12 ч.
5. Отожмите культуральную среду и дважды промойте клетки ледяным PBS, содержащим 1 mM дефероксамина, чтобы полностью удалить неинтернализированные частицы.
6. Получите конфокальные изображения для оценки внутриклеточного распределения частиц. Установите параметры визуализации: диафрагма (pinhole) — 1 единица Эйри (AU) и z-шаг — 0.43 µm для получения оптических срезов внутриклеточных структур с высоким разрешением.
7. Определите, наблюдается ли накопление частиц в клеточных областях, связанных с актином.

3. Сборка и калибровка устройства для электромагнитной стимуляции (Рисунок 2)

Сборка электромагнитного устройства.
1. Сконструируйте компактную систему электромагнитных катушек, размер которой соответствует предметному столику конфокального микроскопа и камере для живых клеток (Рисунок 2A,B).
2. Подключите катушку к регулируемому источнику питания или внешнему источнику тока.
3. Выполните численное моделирование среды с градиентным магнитным полем с помощью COMSOL Multiphysics 4.3b (Рисунок 2C,D).
4. Подтвердите, что электромагнит создает соответствующее градиентное магнитное поле (ГМП) при различных значениях входного тока (Рисунок 2G).
Измерение магнитной индукции и калибровка градиентного магнитного поля.
1. Разместите электромагнит рядом с культуральной чашкой так, чтобы кончик полюса был направлен к центру чашки и находился на расстоянии 1 mm от ее внешней стенки (Рисунок 2E,F).
2. Сохраняйте данную относительную геометрическую конфигурацию электромагнита и культуральной чашки во всех последующих экспериментах по стимуляции магнитной силой и визуализации живых клеток.
3. Используйте цифровой гауссметр для измерения магнитной индукции в заданных точках области стимуляции, используя позиционную сетку на дне культуральной чашки в качестве пространственного ориентира.
4. Рассчитайте локальный градиент поля на основе пространственного изменения магнитной индукции.
5. Откалибруйте и подтвердите численно смоделированный градиент магнитного поля, используя экспериментально измеренные и рассчитанные значения градиента магнитного поля.

4. Оценка магнитных сил, создаваемых платформой.

Определите модель оценки силы.
1. Используйте уравнение силы, действующей на магнитные наночастицы в неоднородном магнитном поле²⁷^,²⁸:
2. При допущении о суперпарамагнитном выравнивании по приложенному полю упростите уравнение до
  $Уравнение магнитной силы $F_{\text{f-SPION}}=m\frac{dB}{dr}$; формула для изучения магнитного поля.$
  где:
  F является ли наномагнитная сила
  м является магнитным дипольным моментом
  является градиентом магнитного поля
  dB/dr представляет собой градиент магнитного поля (Тл/м), создаваемый соответствующим устройством генерации магнитного поля.
3. Во всех расчетах используйте измеренный градиент поля, полученный с помощью откалиброванного устройства.
Оцените силу, воздействующую на одну наночастицу.
1. Определите средний размер частиц по изображениям ПЭМВР.
2. Рассчитайте объем магнитного сердечника, исходя из допущения о его сферической геометрии.
3. Оцените магнитный объем, специфичный для Fe₃O₄, на основе магнитной фракции ядра.
4. Рассчитайте магнитный дипольный момент в соответствии с $Формула расчета химической массы $m=\rho \cdot V \cdot M_m$, уравнение стехиометрии.$
  где:
  М_м представляет собой массовую намагниченность f-SPIONs (16 А·м²/кг) при заданной напряженности поля;
  ρ плотность Fe₃O₄ (5,24 г/см³³).
  V составляет ли объем магнитного ядра Fe₃O₄ в каждой f-SPION (5,89 × 10⁻¹⁷ см³).
5. Умножьте дипольный момент на измеренный градиент поля, чтобы оценить силу, действующую на одну наночастицу ().
Оценка поглощения наночастиц одной клеткой Шванна.
1. Высейте клетки Шванна линии RSC96 в плотности 5 × 10⁵ количество клеток на лунку в 35-мм чашках для культурального микроскопического анализа.
2. Инкубируйте клетки в течение 24 ч в стандартных условиях культивирования.
3. Замените среду на свежую среду, содержащую 15 µg/mL ф-СПИОН (функционализированные суперпарамагнитные оксиды железа).
4. Инкубируйте клетки еще в течение 12 ч.
5. Дважды промойте клетки ледяным фосфатно-солевым буфером, содержащим 1 мМ дефероксамина.
6. Соберите и подсчитайте клетки.
7. Измерение содержания внутриклеточного железа методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-АЭС).
8. Вычислите количество интернализованных частиц на одну клетку, разделив среднюю массу железа в одной клетке на массу железа в одной частице. .
Оцените силу, воздействующую на одну клетку Шванна.
1. Рассчитайте силу на уровне отдельной клетки в соответствии с
  
  где:
  является магнитной силой, воздействующей на один f-SPION.
  $Уравнение концентрации SPION, $ n^\text{f-SPIONs}_\text{cell} $, научная нотация, диаграмма.$ — это количество интернализованных f-SPION на одну клетку.
  F_клетка — магнитная сила, действующая на одну клетку.
2. Представьте полученное значение как расчетную магнитную силу, воздействующую на одну клетку Шванна (F_клетка).
3. Четко укажите, что данное значение является расчетной оценкой на основе модели, а не результатом прямого измерения внутриклеточной силы.

5. Сочетание магнитной стимуляции с конфокальной лазерной сканирующей микроскопией (CLSM) в режиме реального времени

Введите магнитные наночастицы в клетки Шванна.
1. Высейте шванновские клетки в совместимые с визуализацией чашки для культивирования ibidi или в микрофлюидные камеры для культивирования.
2. Дайте клеткам прикрепиться и восстановиться.
3. Замените имеющуюся среду на свежую культуральную среду, содержащую 15 µg/mL функционализированные суперпарамагнитные частицы оксида железа (f-SPIONs).
4. Инкубируйте клетки в течение 12 ч для обеспечения загрузки f-SPION.
5. Перед тем как продолжить, оцените морфологию клеток.
Удалите неинтернализованные частицы.
1. Удалите среду, содержащую наночастицы.
2. Дважды промойте клетки фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим 1 мМ дефероксамина.
3. Замените промывочный раствор на совместимую с визуализацией среду для живых клеток.
4. Перед началом визуализации убедитесь в низком уровне фонового содержания внеклеточных частиц.
Интегрируйте устройство с электромагнитом с системой конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM).
1. Соберите электромагнит с камерой для культивирования живых клеток, установив электромагнит в предварительно откалиброванное положение.
2. Установите собранную камеру для культивирования живых клеток на предметный столик конфокального микроскопа (Рисунок 3). Убедитесь, что чашка с культурой находится в пределах области эффективной стимуляции (Рисунок 3A).
3. Подайте питание на электромагнит в соответствии с заданными параметрами и подтвердите эффективное воздействие градиентного магнитного поля в области чашки для культивирования (Рисунок 3B).
4. Убедитесь, что объектив может достичь фокальной плоскости без помех.
5. Убедитесь, что устройство не препятствует позиционированию объектива или перемещению предметного столика.
6. Учитывая тепло, выделяемое при работе электромагнита, отрегулируйте температурные настройки компонентов камеры для живых клеток в соответствии с заранее определенными оптимальными условиями культивирования, чтобы обеспечить внутреннюю среду с 37 °C и 5% CO₂ (Рисунок 3C).
7. Убедитесь, что вся система работает нормально и стабильно.
Функциональный Ca2+²визуализация в живых клетках.
1. Инкубируйте клетки в растворе Кребса–Рингера (pH 7,4), содержащем 3 µM Fluo-4 AM и 0,1% Pluronic F-127 при 37 °C в течение 30 мин.
2. После инкубации дважды промойте культуры фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и перенесите их на платформу для визуализации живых клеток системы конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM) для получения изображений (Рисунок 4A).
3. Используя сетку позиционирования на дне культуральной чашки ibidi, сделайте снимки в пяти заранее определенных точках.
4. Разделите каждое поле обзора на 25 равных областей и выберите от 0 до 3 клеток в каждой области для количественного анализа флуоресценции, в зависимости от фактической плотности клеток в данной области.
5. Определите полный контур отдельной клетки в качестве области интереса (ROI) и отслеживайте магнитно-индуцированный кальциевый ответ, анализируя изменения интенсивности флуоресценции (ΔF) внутри этой области.
6. Рассчитайте изменение интенсивности флуоресценции по формуле ΔF = (F_{стимуляция}- F₀). Рассчитайте изменение интенсивности флуоресценции до и после стимуляции (ΔF/F₀) превышающее 10%, считается событием кальциевого ответа.
  ПРИМЕЧАНИЕ: F_{нестимулированный} представляет интенсивность флуоресценции до стимуляции магнитной силой, F₀ представляет собой базовую интенсивность флуоресценции, а F_{стимуляция} отражает индуцированную интенсивность флуоресценции после стимуляции магнитной силой.
7. Для коррекции фона вычтите среднюю интенсивность фоновой флуоресценции, измеренную в области без клеток, из значения интенсивности флуоресценции каждого ROI.
8. Проведите три независимых эксперимента, используя по одной культуральной чашке в каждом эксперименте.
Выполните таймлапс-визуализацию и примените магнитную стимуляцию во время визуализации.
1. Установите следующие параметры таймлапс-визуализации: интервал сбора данных 2,1 с на кадр, общая продолжительность сбора данных 650 с и стандартная оптическая секционная визуализация с высоким разрешением при использовании 1 AU.
2. При визуализации клеток проводите непрерывный захват изображений в течение 50 с без подачи тока для записи интенсивности внутриклеточной флуоресценции кальция в отсутствие стимуляции магнитной силой (F_{нестимулированные}) (Рисунок 2H и Рисунок 4B).
3. Нормализуйте интенсивность флуоресценции, зарегистрированную в течение первых 50 с, и определите её как базовую интенсивность флуоресценции (F₀)₀).
4. Затем подайте на электромагнит постоянный ток силой 3,0 А, чтобы подвергнуть клетки Шванна, нагруженные магнитными наночастицами, воздействию градиента магнитного поля 3,25 Тл/м и, таким образом, стимулировать их магнитной силой. Продолжайте таймлапс-визуализацию в течение 10 минут для регистрации интенсивности внутриклеточной флуоресценции кальция во время магнитной стимуляции (F_{стимуляция}) (Рисунок 2H и Рисунок 4C).
5. Количественно рассчитайте изменение интенсивности флуоресценции как ΔF/F₀ (Рисунок 4D,Е).
Выполните статистический анализ и проанализируйте содержание Ca²данные флуоресценции⁺.
1. Для каждой клетки рассчитайте медианное значение ΔF/F₀ по анализируемому временному ряду и используйте это значение в качестве показателя Ca на уровне клетки.²метрика отклика ⁺
2. Проведите три независимых эксперимента для каждого экспериментального условия, используя по одной культуральной чашке на условие в каждом эксперименте. Объедините данные по клеткам, проанализированным в трех независимых экспериментах, для описательного представления, и укажите n как общее количество проанализированных клеток в каждой группе.
3. Оцените нормальность распределения данных ΔF/F₀ на уровне отдельных клеток с помощью критерия Колмогорова-Смирнова.
4. Поскольку Ca²Если данные о флуоресцентном ответе имеют ненормальное распределение, представляйте их в виде медианы и межквартильного размаха (IQR).
5. Анализ различий между группами проводили с помощью непараметрического критерия Фридмана с последующим применением критериев знаковых рангов Уилкоксона для попарных сравнений, как сообщалось ранее.
6. Рассмотрите P < 0,05 для обозначения статистической значимости.

Результаты

Просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения (HRTEM) показала, что конечная формуляция наночастиц имела кластеризованное магнитное ядро и внешнюю оболочку после модификации поверхности (Рисунок 1). Конечные f-SPIONs имели средний общий диаметр 63.36 ± 16.65 nm, при этом магнитное ядро, обогащенное Fe₃O₄, имело размер примерно 56.60 ± 6.19 nm, а внешняя оболочка, состоящая из полидофамина и фаллоидина-Alexa Fluor 350, имела среднюю толщину примерно 5.79 ± 1.36 nm. Эти результаты подтвердили успешное создание архитектуры суперчастиц, подходящей для магнитного воздействия и флуоресцентной визуализации.

Анализ магнитного гистерезиса показал, что частицы проявляют выраженное суперпарамагнитное поведение с незначительной остаточной намагниченностью и коэрцитивной силой. При воздействии внешнего магнитного поля 10 0 Oe (1.0 T) их намагниченность насыщения достигала приблизительно 35 A·m²/kg (Рисунок 5). В отсутствие градиента магнитного поля f-SPIONs демонстрировали хорошую диспергируемость в водной среде (Рисунок 6A). При воздействии градиентного магнитного поля f-SPIONs проявили высокую магнитную отзывчивость (Рисунок 6B). Флуоресцентный анализ дополнительно подтвердил, что частицы сохранили возможность оптического детектирования после синтеза и модификации поверхности (Рисунок 7).

Устройство электромагнитной стимуляции было успешно интегрировано в систему визуализации живых клеток (Рисунок 3). Калибровка магнитного поля показала, что устройство создавало стабильный градиент магнитного поля в области культуры клеток (Рисунок 2E,F), при этом градиент магнитного поля in vitro составлял примерно 3.25 T/m при данной экспериментальной конфигурации (Рисунок 2G).

Конфокальная микроскопия продемонстрировала эффективное поглощение флуоресцентных магнитных наночастиц клетками Шванна (Рисунок 7). После промывки сигнал флуоресценции оставался преимущественно связанным с клетками, а не со свободными частицами в среде. Для формуляции, направленной на актин, конфокальная визуализация дополнительно показала накопление частиц в клеточных областях, связанных с актином.

Конфокальная таймлапс-визуализация показала, что магнитная стимуляция и визуализация живых клеток могут быть реализованы в рамках одного экспериментального рабочего процесса при сохранении стабильного оптического доступа к клеткам на протяжении всего периода стимуляции (Рисунок 2H и Рисунок 4A).

Количественное резюме дополнительно связало дизайн наночастиц, калибровку устройства и клеточную нагрузку. При воздействии градиентного магнитного поля in vitro с интенсивностью 3,25 T/m магнитная сила, действующая на одну f-SPION, оценивалась примерно в 1,59 × 10^-5 pN. На основании количественного определения внутриклеточного железа было установлено, что каждая клетка Шванна RSC96 интернализировала примерно 9,30 ± 2,8 × 10³ частиц, что соответствует расчетной общей магнитной силе примерно 0,15 ± 0,05 pN на клетку.

По сравнению с базовой флуоресценцией, под воздействием магнической стимуляции, опосредованной f-SPIONs, клетки RSC96 демонстрировали активную динамику Ca²⁺ и значительно усиленные сигналы флуоресценции Ca²⁺ (Рисунок 4D). Количественный анализ сигналов флуоресценции Ca²⁺ показал, что изменение интенсивности флуоресценции Ca²⁺ (ΔF/F₀) в клетках RSC96 в группе магнической стимуляции (62,96 [35,07–91,67]) было значительно выше, чем в группе нормального контроля (-5,74 [-15,6–1,20]), группе контроля f-SPIONs (-16,70 [-2,02–-12,0]) и группе контроля с градиентным магнитным полем (-12,90 [-21,24–-6,97]) (Рисунок 4E).

Структура наночастиц на ПЭМ-изображениях; анализ методом электронной микроскопии, демонстрирующий детали кластеризации наночастиц.
Рисунок 1Морфология и структура ядро-оболочка ф-SPION определены с помощью ПЭВПР. (A) f-SPIONs имеют сферическую форму и обладают типичной структурой ядро-оболочка, где внутреннее магнитное ядро состоит из наночастиц Fe₃O₄ и Cy3.5.B) Внешняя оболочка состоит из ПДА и фаллоидина-Alexa Fluor 350. На изображениях на панели B представлены репрезентативные увеличенные виды областей, обведенных красным прямоугольником на панели A; белые линии и стрелки указывают на измеренную толщину оболочки. Масштабная линейка на панели B соответствует 10 нм. Было проведено три независимых измерения, в общей сложности проанализировано 680 наночастиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Схема электромагнитного устройства с медным проводом и железным сердечником; моделирование магнитного поля; график поля.
Рисунок 2Конструирование, калибровка и эксплуатация специализированного электромагнита для магнитной стимуляции живых клеток. (A,B) Катушка электромагнита была намотана на железный сердечник с использованием эмалированного медного провода диаметром 1,1 мм; общее количество витков составило 410. Катушка имела внешний диаметр 60 мм, внутренний диаметр 20 мм, длину 10 мм и сопротивление постоянному току приблизительно 1,2 Ом. Наконечник полюса размером 13,0 мм × 12,0 мм × 3,0 мм (длина × ширина × высота) был изготовлен из пермаллоя марки 1J50.C,DМаксимальный входной ток электромагнита не превышал 3 А. При входном токе 3 А вблизи вершины полюса создавался градиент магнитного поля приблизительно 6,7 Тл/м.Е,F) Распределение градиента магнитного поля внутри чашки с культурой вблизи кончика полюса при входном токе 3 А. В области визуализации клеток был создан средний статический градиент магнитного поля приблизительно 3,25 Тл/м. (G) Градиенты магнитного поля, создаваемые электромагнитом при различных значениях входного тока: 1 А, 2 А и 3 А. (H) Протокол тайм-лапс визуализации живых клеток, подачи тока и воздействия градиентного магнитного поля в данном исследовании. Тайм-лапс изображения регистрировались непрерывно в течение 50 с без подачи тока. Затем подавался постоянный ток силой 3,0 А, и тайм-лапс визуализация продолжалась в течение 10 мин. DC: постоянный ток. GMF: градиентное магнитное поле. Панели E, F и G адаптированы с разрешения Liu et al.²⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Камера для культивирования живых клеток с системой CLSM-визуализации, электромагнитом, нагревателями и установкой постоянного тока.
Рисунок 3Интеграция электромагнита в камеру для культивирования живых клеток. (A) Специальный компактный электромагнит, расположенный в откалиброванном месте внутри камеры для культивирования живых клеток, для воздействия градиентного магнитного поля на область чашки с клеточной культурой.B) Интегрированная установка, включающая систему конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ), платформу для магнитного нанопривода и внешний источник питания постоянного тока. (CОптимизация температурных настроек для отдельных компонентов камеры для культивирования клеток обеспечивает стабильную температуру внутри чашки с культурой во время работы электромагнита.D) Параметры установки температуры для отдельных компонентов камеры для культивирования клеток. CLSM: конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. PV: измеренное значение. SV: заданное значение. Top Heater: температура нагревателя верхней крышки. Stage heater: температура нагрева предметного столика микроскопа и нижней части камеры для культивирования. Bath heater: температура водяной бани. Lens heater: температура нагревателя объектива. Temp sensor: фактическая температура, измеренная температурным датчиком. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Схема магнитного наноактиватора; f-SPION, ионы кальция, DIC-микроскопия, результаты флуоресценции.
Рисунок 4Репрезентативные изображения кальциевого ответа в шванновских клетках при стимуляции магнитной силой. (A) Интегрированный рабочий процесс для магнитной стимуляции и анализа уровня Ca в живых клетках²⁺ визуализация на платформе магнитного наноактуатора. (B) Базовый уровень Ca²⁺ флуоресцентное изображение, полученное до магнитной стимуляции (F_{нестимулированные}). (C) Ca²⁺ флуоресцентное изображение, полученное после магнитной стимуляции (F_{стимуляция}), демонстрирующее изменение интенсивности флуоресценции (ΔF). (D) Разрешение по времени Ca²⁺ сигнальные кривые, зарегистрированные до и после магнитной стимуляции.Е) Количественный анализ и сравнение изменений Ca²⁺ флуоресценция (ΔF/F₀) между различными экспериментальными группами. DIC: дифференциально-интерференционный контраст. F_{нестимулированный}: интенсивность флуоресценции до стимуляции магнитной силой. F₀: базовая интенсивность флуоресценции. F_{стимуляция}: индуцированная интенсивность флуоресценции после стимуляции магнитной силой. ΔF: изменение интенсивности флуоресценции. «Normal» — группа нормального контроля, «f-SPIONs+GMF» — группа магнитного нанопривода, «f-SPIONs» — контрольная группа f-SPIONs, а «GMF» — контрольная группа с градиентным магнитным полем. Было проведено три независимых эксперимента, по одной культуральной чашке на каждое экспериментальное условие в каждом эксперименте. Для каждой клетки в качестве показателя отклика на клеточном уровне использовалось медианное значение ΔF/F₀ по всему анализируемому временному ряду. Данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха (IQR), а n указывает общее количество клеток, проанализированных в трех независимых экспериментах. Статистический анализ проводился с использованием критерия Фридмана с последующим использованием критерия знаковых рангов Вилкоксона, как было ранее описано в работе Liu et al. Количественные данные на панели E были адаптированы с разрешения Liu et al.²⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Графики зависимости намагниченности от поля, петля гистерезиса при 30 К, анализ магнитных свойств, диаграмма.
Рисунок 5Суперпарамагнитные свойства f-SPIONs. (A) Петля магнитного гистерезиса f-SPION, демонстрирующая типичное суперпарамагнитное поведение. (B) Увеличенное изображение петли гистерезиса вблизи нулевого магнитного поля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Эксперимент с магнитным полем: катушка с флаконом. Эффект включения/выключения GMF на дисперсность (PDI: 0,16).
Рисунок 6Водная диспергируемость и отклик функционализированных SPION на градиент магнитного поля. (AВ отсутствие градиентного магнитного поля f-SPIONs остаются хорошо диспергированными в водной среде.B) При приложении градиентного магнитного поля f-SPION быстро мигрируют и накапливаются вдоль направления градиента поля. GMF: градиентное магнитное поле. PDI: индекс полидисперсности. Стрелка указывает направление градиентного магнитного поля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Визуализация клеток с помощью наночастиц Fe3O4; флуоресцентная микроскопия, совмещенное изображение DIC, Cy3.5 и фаллоидина.
Рисунок 7Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ) флуоресцентной визуализации интернализации f-SPION в шванновских клетках. (A) Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ) шванновских клеток после совместной инкубации с f-SPIONs (15 µg/mL) в течение 12 ч с последующей промывкой (диафрагма = 1 AU; шаг по z = 0.43 µm), что свидетельствует о сохранности морфологии клеток и минимальном количестве внеклеточных частиц на фоне. (B) Красная флуоресценция, зафиксированная в канале Cy3.5 (Ex/Em: 561–568/607 нм), указывает на наличие f-SPIONs, меченных Cy3.5, внутри шванновских клеток.C) Голубая флуоресценция, зафиксированная в канале Alexa Fluor 350 (Ex/Em: 350–360 нм/440–460 нм), подтверждает успешное включение модуля функционализации фаллоидин-Alexa Fluor 350.D) Комбинированное изображение, демонстрирующее значительное пространственное перекрытие сигналов красной и синей флуоресценции, что свидетельствует об успешном создании магнитно-флуоресцентных суперчастиц. DIC: дифференциально-интерференционный контраст. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Наночастицы оксида железа широко признаны магнитными наноматериалами с благоприятной биосовместимостью. Суперпарамагнитные наночастицы Fe₃O₄, широко используемые в качестве контрастных веществ для магнитно-резонансной томографии, нашли обширное применение в клинической визуализационной диагностике²⁹^,³⁰. В недавнем исследовании нашей группы²⁰ было показано, что f-SPIONs обладают крайне низкой цитотоксичностью и отличной биобезопасностью. Наномагнитная платформа активации, построенная с использованием f-SPIONs в качестве механических актуаторов в сочетании с управляемым электромагнитом, эффективно активировала динамику цитоскелета в клетках Шванна, индуцировала открытие механочувствительного ионного канала Piezo1, вызывала трансмембранный приток Ca²⁺ и впоследствии способствовала «перепрограммированию» экспрессии генов и фенотипическим изменениям в клетках²⁰.

Несколько этапов имеют особое значение для успешной реализации данной платформы. Первым критическим шагом является подготовка наночастиц. Частицы должны оставаться хорошо диспергированными, магниточувствительными и оптически детектируемыми после синтеза и модификации поверхности. Агрегация на любом этапе может снизить однородность клеточного захвата, изменить эффективные магнитные свойства и ухудшить качество визуализации живых клеток.

Вторым критически важным этапом является процедура загрузки наночастиц в клетки и последующая промывка. Концентрация наночастиц и время инкубации должны быть достаточными для обеспечения детектируемой внутриклеточной загрузки, не вызывая при этом избыточного внеклеточного накопления и не нарушая морфологию клеток. Тщательное удаление частиц, которые не были интернализированы или ассоциированы с мембраной, имеет решающее значение, особенно при использовании флуоресцентной визуализации для оценки внутриклеточной локализации. Недостаточная промывка может привести к неправильной интерпретации паттернов локализации, а также может исказить оценки силы на клеточном уровне.

Третьим критическим этапом является геометрическое выравнивание устройства магнитной стимуляции относительно образца. Поскольку магнитная сила напрямую зависит от градиента локального поля, взаимное расположение электромагнитной катушки и плоскости образца должно соответствовать конфигурации, использованной при калибровке. Даже незначительные изменения в расстоянии между катушкой и образцом или в их выравнивании могут изменить эффективные условия стимуляции.

Платформа может быть модифицирована в зависимости от решаемой биологической задачи. В случаях, когда достаточно общего магнитного нагружания и приложения силы, можно использовать флуоресцентные суперчастицы (SPIONs) с ПДА-покрытием без функционализации для таргетинга на актин. Если требуется субклеточная локализация вблизи богатых актином областей, вместо них можно использовать формуляцию с функционализацией фаллоидином (f-SPIONs). Такая модульность является практическим преимуществом данной платформы.

Данный метод имеет несколько ограничений. Во-первых, рассчитанное количество магнитных частиц, поглощаемых одной клеткой, представляет собой среднее значение по популяции, тогда как загрузка частиц на уровне отдельных клеток неизбежно характеризуется гетерогенностью. Во-вторых, значения магнитной силы, приведенные в этом исследовании, являются расчетными оценками на основе модели, а не прямыми измерениями внутриклеточных механических нагрузок. В-третьих, данный протокол был в первую очередь разработан и оптимизирован для клеток Шванна, культивируемых в условиях визуализации in vitro. В плотных трехмерных системах клеточного культивирования и тканях может потребоваться существенная оптимизация, поскольку поглощение наночастиц, их внутриклеточное распределение, оптическая доступность и механическое сопряжение могут отличаться от показателей в двухмерных культурах. Наконец, дополнительная стратегия таргетинга на актин повышает вероятность локализации частиц в актин-ассоциированных областях, но не гарантирует равномерного или специфического таргетинга всех богатых актином структур внутри живых клеток.

Несмотря на эти ограничения, представленная платформа магнитного наноактивирования обладает несколькими отчетливыми методологическими преимуществами по сравнению с существующими методами приложения силы. Например, атомно-силовая микроскопия (АСМ) позволяет точно воздействовать локализованной силой, но требует прямого механического контакта с мишенью и не всегда легко интегрируется с длительным имиджингом живых клеток⁸. Системы на основе растяжения и модифицированные подложки могут обеспечивать механические стимулы на уровне популяции клеток, но они зависят от предопределенных интерфейсов материалов и малопригодны для дистанного приложения силы внутри клеток¹⁰. Оптические пинцеты обеспечивают высокое пространственное разрешение при воздействии силы, однако сопряжены с риском лазерного повреждения тканей⁸. Методы с использованием микропипеток относительно просты в эксплуатации, но обладают сравнительно низкой пропускной способностью и разрешением по силе¹². Микрофлюидные системы эффективны для создания специфических механических микросред, таких как напряжение сдвига и давление жидкости, но сталкиваются с техническими трудностями при воспроизведении сложных клеточных сред и интеграции нескольких режимов механической стимуляции¹¹. Напротив, данная платформа объединяет дистанную бесконтактную стимуляцию, управляемую магнитную активацию, флуоресцентный трекинг частиц и прямую совместимость с конфокальным имиджингом в реальном времени в рамках единого рабочего процесса.

Та же общая стратегия может быть адаптирована для других типов клеток, реагирующих на механические воздействия, и более сложных биологических моделей. Она также может быть распространена на более плотные многоклеточные системы, такие как нейрональные органоиды, эпителиальные кисты или эпителий, подобный клеткам почки собаки породы Мадин-Дарби (MDCK). В таких условиях потребуется дополнительная оптимизация проникновения частиц, их распределения и оценки силы в механически связанных трехмерных образцах. Несмотря на эти трудности, текущий рабочий процесс обеспечивает практическую основу для более широкого развития стратегий магнитомеханической стимуляции в живых системах.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта финансовых интересов.

Благодарности

Данная работа была поддержана Национальным природным научным фондом Китая (гранты № 82571677 и 82001304, выданные Y.W.), Специальной программой по подготовке медицинских и санитарных кадров в провинции Цзилинь (грант № JLSRCZX2025-134, выданный Y.W.) и проектом программы имени Безунова Университета Цзилиня (грант № 2024B19, выданный Y.W.). Авторы выражают благодарность химическому факультету Университета Цзилиня (Государственная ключевая лаборатория супрамолекулярных структур и материалов) и Чанчунскому институту прикладной химии Китайской академии наук за помощь в разработке, синтезе и определении характеристик наноматериалов. Авторы также благодарят Институт трансляционной медицины при Первой больнице Университета Цзилиня за помощь в проведении конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,2-гексадекандиол	Sigma-Aldrich	213748	Технического сорта, 90%; используется в синтезе методом термического разложения
ibidi 35 мм µ—чашки Петри	ibidi	80156	Используется для культивирования и визуализации шванновских клеток
Бензиловый эфир	Sigma-Aldrich	108014	98%; растворитель для Fe₃О₄ синтез наночастиц
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп	Nikon	AXR (Ti2-E)	Используется для прижизненной визуализации клеток и флуоресцентной микроскопии
Специальный электромагнит	Специально сконструированный	Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести.	Компактный однополюсный электромагнит для генерации градиента магнитного поля in vitro
Цианин 3.5 карбоновая кислота	Duofluor Inc.	D10128	Флуоресцентный краситель для определения Fe₃О₄·сборка суперчастиц Cy3.5; ММ 593,20; хранить при -20 °C, в защищенном от света месте
Дефероксамин мезилат	Sigma-Aldrich	D9533	Железохелатирующий агент, используемый для удаления неинтернализованного и ассоциированного с мембраной железа
Цифровой гауссметр	МАГНИТНАЯ МЕШАЛКА WEITE	WT103	Используется для измерения магнитной индукции и калибровки градиента магнитного поля, создаваемого специализированным электромагнитом
Допамина гидрохлорид	Sigma-Aldrich	H8502	≥98% (ТСХ); используется для покрытия полидофамином
Прибор для динамического рассеяния света	Malvern Instruments	Zetasizer Nano-ZS	Используется для измерения гидродинамического диаметра и индекса полидисперсности (PDI)
Fluo-4 AM	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	F14201	Индикатор кальция, используемый для анализа Ca в живых клетках²⁺ визуализация
Флуориметрический спектрофотометр	Shimadzu	RF-6000	Используется для характеристики фотолюминесценции
Просвечивающий электронный микроскоп высокого разрешения	JEOL	JEM-F200	Используется для ПЭМВР-визуализации морфологии и ядра наночастиц–оболочечная структура
Атомно-эмиссионный спектрометр с индуктивно-связанной плазмой	PerkinElmer	Optima 3300 DV	Используется для количественного определения внутриклеточного железа
Ацетилацетонат железа(III), Fe(acac)₃	Sigma-Aldrich	F300	97%; предшественник для Fe₃О₄ синтез наночастиц
Инкубатор для живых клеток, устанавливаемый на предметный столик	TOKAI HIT	TENP&CO₂	Используется для конфокальной визуализации живых клеток во время магнитной стимуляции
Олеиновая кислота	Sigma-Aldrich	O1008	≥99% (ГХ); поверхностный лиганд для Fe₃О₄ синтез наночастиц
Олеиламин	Sigma-Aldrich	O7805	Технический сорт, 70%; лиганд для синтеза наночастиц
Фаллоидин–Alexa Fluor 350	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	A22281	Дополнительный реагент для функционализации с таргетированием на актин
Pluronic F-127	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	P3000MP	Используется для облегчения загрузки Fluo-4 AM при исследовании уровней Ca в живых клетках²⁺ визуализация
Программируемый стабилизированный источник питания постоянного тока	Тунмэнь	eTM-L605SPL (60 В, 5 А)	Используется для питания специализированного электромагнита для генерации градиентного магнитного поля in vitro
Шванновские клетки RSC96	Банк клеток Китайской академии наук	Данных нет	Линия шванновских клеток крысы
Додецилсульфат натрия (ДСН)	Sigma-Aldrich	436143	реактив стандарта ACS, ≥99,0%; сурфактант для создания микроэмульсий типа «масло в воде»
SQUID-магнетометр	Quantum Design Inc.	MPMS-XL	Используется для измерения магнитного гистерезиса при 300 К
Толуол	Sigma-Aldrich	244511	Безводный, 99,8%; растворитель для сборки суперчастиц
Просвечивающий электронный микроскоп	FEI	EP 5018/40, Tecnai Spirit Biotwin	Используется для исследования ультраструктуры клеточных и нервных тканей

Ссылки

Cheng B, et al. Mechanobiology across timescales. Nat Rev Phys. 2025;7:621-44.
Di X, et al. Cellular mechanotransduction in health and diseases: from molecular mechanism to therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:282.
Pillai EK, Franze K. Mechanics in the nervous system: from development to disease. Neuron. 2024;112(3):342-61.
Franze K. The mechanical control of nervous system development. Development. 2013;140(15):3069-77.
Franze K, Guck J. The biophysics of neuronal growth. Rep Prog Phys. 2010;73:094601.
Moore SW, Sheetz MP. Biophysics of substrate interaction: influence on neural motility, differentiation, and repair. Dev Neurobiol. 2011;71(11):1090-101.
Franze K, Janmey PA, Guck J. Mechanics in neuronal development and repair. Annu Rev Biomed Eng. 2013;15:227-51.
Sun W, et al. Biophysical approaches for applying and measuring biological forces. Adv Sci (Weinh). 2022;9(5):e2105254.
Mohammed D, et al. Innovative tools for mechanobiology: unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:162.
Constantinou I, Bastounis EE. Cell-stretching devices: advances and challenges in biomedical research and live-cell imaging. Trends Biotechnol. 2023;41:939-50.
Polacheck WJ, Li R, Uzel SGM, Kamm RD. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 2013;13(12):2252-67.
Li Z, et al. Non-invasive acquisition of mechanical properties of cells via passive microfluidic mechanisms: a review. Biomicrofluidics. 2021;15(3):031501.
Xiao Y, Du J. Superparamagnetic nanoparticles for biomedical applications. J Mater Chem B. 2020;8(3):354-67.
Yang X, et al. Nanotechnology enables novel modalities for neuromodulation. Adv Mater. 2021;33(52):e2103208.
Semeano AT, et al. Effects of magnetite nanoparticles and static magnetic field on neural differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev Rep. 2022;18(4):1337-54.
Lee B, et al. Design of oxide nanoparticles for biomedical applications. Nat Rev Mater. 2025;10:252-67.
Kim YJ, et al. Magnetoelectric nanodiscs enable wireless transgene-free neuromodulation. Nat Nanotechnol. 2025;20:121-31.
Signorelli L, Hescham SA, Pralle A, Gregurec D. Magnetic nanomaterials for wireless thermal and mechanical neuromodulation. iScience. 2022;25(11):105401.
Liu T, Wang Y, Lu L, Liu Y. SPIONs-mediated magnetic actuation promotes nerve regeneration by inducing and maintaining repair-supportive phenotypes in Schwann cells. J Nanobiotechnology. 2022;20:159.
Liu T, et al. f-SPION-mediated magnetic stimulation induces reparative Schwann cell reprogramming via cytoskeletal dynamics-gated activation of Piezo1. J Nanobiotechnology. 2026;24:298.
Jessen KR, Mirsky R, Lloyd AC. Schwann cells: development and role in nerve repair. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;7(7):a020487.
Jessen KR, Mirsky R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. J Physiol. 2016;594(13):3521-31.
Sun S, Zeng H. Size-controlled synthesis of magnetite nanoparticles. J Am Chem Soc. 2002;124(28):8204-5.
Zhuang J, Wu H, Yang Y, Cao YC. Controlling colloidal superparticle growth through solvophobic interactions. Angew Chem Int Ed Engl. 2008;47(12):2208-12.
Bai F, et al. A versatile bottom-up assembly approach to colloidal spheres from nanocrystals. Angew Chem Int Ed Engl. 2007;46(35):6650-3.
Tang L, et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(43):15344-9.
Tay A, Kunze A, Murray C, Di Carlo D. Induction of calcium influx in cortical neural networks by nanomagnetic forces. ACS Nano. 2016;10(2):2331-41.
Tay A, Di Carlo D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Lett. 2017;17(2):886-92.
Cheng FY, et al. Characterization of aqueous dispersions of Fe(3)O(4) nanoparticles and their biomedical applications. Biomaterials. 2005;26(7):729-38.
Lee N, et al. Iron oxide-based nanoparticles for multimodal imaging and magnetoresponsive therapy. Chem Rev. 2015;115(19):10637-89.