Методическая статья

3D микро-КТ визуализация корневых клубеньков Medicago sativa

101 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71686

⸱

28 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Бобовые вступают в симбиоз с почвенными бактериями, образуя корневые клубеньки, в которых бактерии фиксируют атмосферный азот для использования растением. Микро-КТ позволяет проводить неразрушающую 3D-визуализацию организации тканей, зон бактероидов и сосудистых пучков этой непрозрачной плотной ткани корневых клубеньков, что дает преимущества перед традиционными методами визуализации, требующими изготовления срезов клубеньков.

Аннотация

Симбиотические отношения между бобовым растением Medicago sativa и почвенными бактериями Sinorhizobium meliloti приводят к образованию азотфиксирующих корневых клубеньков. Традиционные деструктивные методы, включая изготовление парафиновых срезов, срезов на вибратоме и криосрезов, применялись для визуализации распределения бактерий в клубеньке, что крайне затрудняет получение надежной трехмерной информации. Эти подходы часто сочетают с флуоресцентным мечением или окрашиванием, что может вызвать дополнительный стресс, влияющий на рост растений и формирование клубеньков. Микро-КТ зарекомендовала себя как относительно быстрый, простой и надежный инструмент в биологии растений, позволяющий неразрушающим способом визуализировать гистологические особенности растений в трех измерениях (3D), что позволяет избежать деструктивных артефактов при подготовке образцов и обеспечить высокоточное 3D-реконструирование. Несмотря на то, что микро-КТ применялась для изучения корневых клубеньков бобовых, до сих пор отсутствовал детальный утвержденный протокол, описывающий весь процесс от сбора растений и подготовки образцов до сканирования и программной визуализации.

В данном исследовании мы представляем пошаговый рабочий процесс микро-КТ с использованием Medicago sativa в качестве модели. Протокол включает иссечение клубеньков из корней, фиксацию, усиление контраста, монтаж, сканирование и трехмерную реконструкцию. Особое внимание уделяется критическим параметрам, влияющим на такие элементы, как качество изображения, сохранность тканей и контрастность. С помощью данного подхода можно визуализировать общую организацию тканей, инфицированные бактериоидами клетки и сосудистые пучки в трех измерениях без физического сечения клубеньков. Описанный здесь алгоритм представляет собой воспроизводимый метод неразрушающей визуализации нативных корневых клубеньков с высоким разрешением и, вероятно, может быть адаптирован для других видов бобовых, предоставляя исследователям практический инструмент для изучения структуры клубеньков и организации бактерий внутри них в 3D.

Введение

Растения семейства Leguminosae (или Fabaceae), такие как Medicago sativa (люцерна), вступают в симбиотические отношения с азотфиксирующими почвенными бактериями семейства Rhizobiaceae, например Sinorhizobium meliloti, что приводит к развитию корневых клубеньков. В условиях дефицита азота растение выделяет флавоноиды для привлечения бактерий. Это активирует экспрессию Nod-факторов у симбиотических бактерий, что вызывает искривление корневого волоска и последующее формирование инфекционной камеры, окружающей бактерии1,2,3,4. Из ослабленного участка стенки камеры формируется инфекционная нить, представляющая собой удлиняющуюся трубку, которая переносит бактерии через клетку корневого волоска5. Когда инфекционная нить достигает внутренней коры, серия клеточных делений инициирует формирование специализированного корневого органа, называемого корневым клубеньком1,2,5. Затем бактерии инфицируют клетку клубенька и живут внутриклеточно, будучи окруженными симбиосомальной мембраной внутри клетки. Здесь растение предоставляет бактериям углерод и другие питательные вещества. Взамен бактерии фиксируют азот для растения, превращая непригодный для использования атмосферный азот в аммиак, форму, доступную для растения2,3,4. Таким образом, корневой клубенек функционирует как жизненно важная биологическая фабрика по фиксации азота, поддерживая рост растений даже в отсутствие синтетических азотных удобрений. Этот процесс биологической фиксации азота имеет экономическое и экологическое значение, поскольку позволяет бобовым расти без применения синтетических удобрений6. Более того, некоторые бобовые формируют индетерминантные клубеньки, в которых создаются отчетливые зоны, где бактерии дифференцируются и фиксируют азот более эффективно4. Следовательно, для детального изучения биологической фиксации азота важно визуализировать как внешнюю, так и внутреннюю структуру клубенька (где бактерии физически занимают растительные клетки внутри него). Однако клубенек представляет собой непрозрачный орган, заполненный красным растительным белком легемоглобином, что затрудняет применение традиционных методов визуализации.

Методы визуализации, применявшиеся в прошлом, были деструктивными. Для получения срезов тканей использовались парафиновое сечения, сечение вибратомом и криосечения, однако эти методы нарушают естественное состояние ткани и вносят артефакты, которые затрудняют трехмерную (3D) реконструкцию6,7,8,9,10. Реконструкция на основе срезов тканей клубеньков, залитых парафином, была успешно проведена, но этот метод предполагает использование дегидратированных образцов и требует более 200 отдельных срезов8. На отдельных срезах можно увидеть части сосудистой системы, но не то, как пучки разделяются и охватывают клубенёк. Перед конфокальной микроскопией срезы тканей подвергались различным методам флуоресцентного маркирования и окрашивания, но эти подходы зачастую сопровождались следующими проблемами8,9,10: (i) ткани клубеньков растений обладают высокой автофлуоресценцией, (ii) многие методы требуют просветления тканей перед визуализацией, (iii) флуоресцентное окрашивание может повредить ткани клубенька, iv) инокуляция растений бактериями с меткой зеленого флуоресцентного белка (GFP) вызывает стресс, который влияет как на рост растения, так и на формирование клубеньков, и v) нативные клубеньки слишком велики для легкого сечения всего образца5,11.

Компьютерная томография (КТ), широко применяемая в медицине, используется как в диагностических, так и в терапевтических целях12,13. Её вариация с более высоким разрешением — рентгеновская микротомография (MicroCT) — представляет собой метод визуализации, позволяющий осуществлять неразрушающую трехмерную (3D) визуализацию малоразмерных объектов. Если при КТ оборудование перемещается вокруг крупного объекта, то при микро-КТ вращается сам объект, расположенный близко к источнику рентгеновского излучения, что обеспечивает гораздо более высокое разрешение. Метод MicroCT применяется в биологии развития животных, а также зарекомендовал себя как перспективный инструмент в биологии растений6,10,14,15,16,17,18,19. Важно отметить, что микро-КТ и рентгеновская томография на базе синхротрона широко используются в физиологии растений для исследования эмболии ксилемы и перекрестной проверки данных визуализации с традиционными измерениями гидравлического потока20,21,22. Поскольку этот метод позволяет визуализировать целые органы без физического секционирования, микро-КТ сохраняет пространственные взаимосвязи во всем клубеньке. При использовании соответствующих контрастных веществ метод позволяет различать структуры на уровне тканей, такие как сосудистые пучки и зоны инфекции, а также проникать глубже, чем позволяют традиционные оптические методы, ограниченные рассеиванием света, что особенно ценно для непрозрачных и автофлуоресцирующих клубеньков. Образцы также могут быть подвергнуты повторному сканированию, включены в последующие корреляционные рабочие процессы после обработки образцов для световой или электронной микроскопии или помещены в архив для дальнейшего анализа. Хотя в нескольких исследованиях использовались микро-КТ и синхротронная рентгеновская КТ для изучения корневых клубеньков сои, детальных протоколов, охватывающих весь процесс от сбора и окрашивания клубеньков до визуализации и реконструкции, особенно для более мелких клубеньков, таких как у люцерны, не существует6,14. Рентгеновский контраст зависит от плотности ткани, а большинство растительных тканей имеют низкую плотность и слабо ослабляют рентгеновское излучение. Без контрастного вещества клубеньки невозможно отличить от фона при использовании стандартного настольного микро-КТ. Мы использовали фосфовольфрамовую кислоту (PTA) — неспецифический краситель, который связывается с белками и другими биомолекулами и, как было показано, обеспечивает высокий контраст в растительных тканях14.

В данном исследовании представлен подробный пошаговый протокол микро-КТ визуализации корневых клубеньков бобовых на примере люцерны с использованием стандартной лабораторной системы, которая является более доступной альтернативой рентгеновской микроскопии (XRM) и синхротронных платформ6,14. Данный рабочий процесс включает конкретные инструкции по сбору клубеньков с корня, фиксации, окрашиванию, усилению контраста, монтажу, сканированию, 3D-реконструкции и анализу (Рисунок 1). Между этими этапами мы приводим детальные параметры для обеспечения стабильной фиксации образца, удержания влаги и высокого контраста. В конечном итоге этот конвейер микро-КТ представляет собой воспроизводимый метод, позволяющий осуществлять неразрушающую визуализацию трехмерных гистологических особенностей с высоким разрешением, включая общую организацию тканей, заполнение растительных клеток бактериями, отчетливые зоны азотфиксации и сосудистые пучки целых корневых клубеньков люцерны в их нативном состоянии. Мы полагаем, что данный протокол будет применим и к другим видам бобовых, предлагая исследователям практичный метод визуализации 3D-структуры и организации этого крайне важного органа корня в неизменном виде.

Протокол

1. Сбор и фиксация узелков

  1. С помощью скальпеля (см. Таблицу материалов) сделайте прямой разрез корня с обеих сторон интересующего вас узелка, чтобы узелок остался прикрепленным к корню (Рисунок 2).
  2. Перенесите от восьми до двенадцати узелков в стеклянный флакон объемом 20 mL, содержащий 10 mL 70% (v/v) этанола (см. Таблицу материалов).

2. Окрашивание узелков

  1. Приготовьте 1% (w/v) раствор PTA в 70% этаноле, добавив 2 g порошка PTA в 200 mL 70% этанола в квадратном бутыле с широким горлом объемом 200 mL (см. Таблицу материалов). Встряхивайте до полного растворения, затем храните при 4 °C. Приготовьте краситель за 1 день до использования.
  2. Удалите 70% этанол, использовавшийся при фиксации, и замените его 10 mL 1% раствора PTA (см. Таблицу материалов).
  3. Поместите стеклянный флакон на орбитальный шейкер при комнатной температуре и скорости 80 rpm на 4 недели. Еженедельно заменяйте раствор для окрашивания на 10 mL свежего 1% раствора PTA (см. Таблицу материалов, Рисунок 2).

3. Монтирование узелков

  1. Растопите парафин на нагревательной плитке при 100 °C в открытом стеклянном стакане объемом 100 mL (см. Таблицу материалов).
  2. Выберите наконечники для дозатора объемом 200 µL для заливки образцов. Загерметизируйте узкий конец наконечников, слегка погрузив их (на 1–2 mm) в расплавленный парафин (см. Таблицу материалов).
  3. Промойте образец в 2 mL 70% этанола в микропланшете с лунками диаметром 35 mm в течение 5 min (см. Таблицу материалов).
  4. Добавьте 0,2 g низкоплавящегося агарозы в коническую колбу Эрленмейера объемом 25 mL и смешайте с 20 mL деминерализованной воды, чтобы получить 1% (w/v) раствор низкоплавящегося агарозы. Нагрейте смесь на плитке при 50 °C и несколько раз встряхните до полного растворения. Затем поместите колбу в водяную баню, настроенную на 40 °C (см. Таблицу материалов).
  5. Добавьте примерно 25 µL 1% низкоплавящегося агарозы в перевернутые загерметизированные наконечники и подождите 1 min для охлаждения (см. Таблицу материалов).
  6. Захватите один клубенек и перенесите его в наконечник с помощью тонкого пинцета, чтобы иммобилизовать его в 1% низкоплавящемся агарозе. Используйте наконечник для нанесения геля, чтобы переместить клубенек максимально близко к запечатанной парафином стороне наконечника, не повреждая корневой клубенек (см. Таблицу материалов).
  7. Поместите наконечники с корневыми клубеньками в штатив, чтобы низкоплавящийся агароза затвердел. После затвердевания закройте открытый конец наконечников Parafilm для удержания влаги (см. Таблицу материалов). Храните образцы в холодильнике при 4 °C и проведите сканирование залитых образцов в течение недели.

4. МикроКТ-визуализация

  1. Установите наконечники пипеток вверх дном на подходящий по размеру держатель образцов, чтобы максимально приблизить их к источнику рентгеновского излучения и обеспечить точное центрирование образца (см. Таблицу материалов).
  2. Откройте программное обеспечение для КТ. Плотно прикрутите образец в держателе к вращательному столику микроКТ (см. Таблицу материалов, Рисунок 3, Дополнительный рисунок 1).
  3. Включите отображение с камеры и источник рентгеновского излучения, затем откройте экран непрерывного рентгеновского просмотра (Дополнительный рисунок 1).
  4. Отрегулируйте высоту образца по вертикали так, чтобы интересующая область оказалась в центре экрана непрерывного рентгеновского просмотра. Запишите это значение высоты для использования далее в шаге 4.10 (Дополнительный рисунок 1).
  5. При биннинге 512 × 512 отрегулируйте размер пикселя (см. Дополнительную таблицу 1) так, чтобы образец заполнял большую часть поля зрения при непрерывном рентгеновском просмотре, оставив некоторое свободное пространство по краям (Дополнительный рисунок 1).
  6. Центрируйте образец на экране непрерывного рентгеновского просмотра, поворачивая его каждые 45° и корректируя положение по центру (Дополнительный рисунок 1).
  7. Измените биннинг на 2048 × 2048 (см. Дополнительную таблицу 1, Дополнительный рисунок 1).
  8. В меню Режимы сканирования (Scanning Modes) выберите вариант без фильтра, установите напряжение 50 kV и ток 40 µA (см. Дополнительную таблицу 1, Дополнительный рисунок 1).
  9. Выполните коррекцию плоского поля, переместив образец вниз на 68 mm, чтобы он вышел из поля зрения на экране непрерывного рентгеновского просмотра. Выключите функцию Коррекция плоского поля (Flat Field Correction) и установите Время экспозиции (Exposure Time) таким образом, чтобы среднее рентгеновское пропускание составляло 55%. Включите Коррекцию плоского поля (см. Дополнительную таблицу 1, Дополнительный рисунок 1).
  10. Верните образец на высоту, определенную в шаге 4.4 (Дополнительный рисунок 1).
  11. В разделе Параметры сканирования (Scanning Options) укажите имя файла и расположение папки (Дополнительный рисунок 1).
  12. Установите шаг вращения 0.200°. Установите Усреднение кадров (Frame Average) на 3 и Случайное перемещение (Random Movement) на 30. Выберите сканирование на 360° (см. Дополнительную таблицу 1, Дополнительный рисунок 1).
  13. При необходимости отрегулируйте Частичную ширину (Partial width), чтобы исключить избыточное пустое пространство и уменьшить объем данных (Дополнительный рисунок 1).
  14. Нажмите Сканировать (Scan), чтобы начать процесс сканирования (Дополнительный рисунок 1).

5. Реконструкция изображения

  1. Откройте программное обеспечение для реконструкции изображений и загрузите все 2D-проекции, полученные в результате сканирования (см. Таблицу материалов, Рис. 4).
  2. Нажмите Preview, чтобы визуализировать результаты реконструкции в области зеленой линии (Дополнительный рисунок 2).
  3. Отрегулируйте гистограмму во вкладке Output. Отсеките плоскую область справа и установите значение 0 или чуть меньше 0 слева (Дополнительный рисунок 2).
  4. На вкладке Start нажмите Fine Tuning для последующего выравнивания. Установите Parameter step на единицу, а Number of trials на пять. Нажмите Start и OK. Когда результаты появятся во вкладке Output, нажмите на окно prv и пролистайте результаты с помощью стрелок, чтобы выбрать наилучшее выравнивание. Оставьте выбранным изображение с наилучшим качеством (Дополнительный рисунок 2).
  5. Активируйте ROI во вкладке Output, поставив галочку в поле Use ROI. В качестве формы ROI выберите circle. Отрегулируйте размер ROI в соответствии с размером образца в объеме данных, вернувшись на вкладку Start и перемещая зеленую линию для предварительного просмотра различных областей. Оставьте некоторое свободное пространство вокруг образца (Дополнительный рисунок 2).
  6. Вернитесь на вкладку Start. Переместите красные линии сверху и снизу, чтобы отсечь области, не требующиеся для данных реконструкции. Проверьте, не были ли исключены важные данные, переместив зеленую линию к красным линиям и просмотрев реконструкции во вкладке Output (Дополнительный рисунок 2).
  7. Во вкладке Output сохраните реконструкцию в виде изображений TIFF (16 бит) в нужном расположении (Дополнительный рисунок 2).
  8. Вернитесь на вкладку Start и нажмите Start (Дополнительный рисунок 2).

6. 3D-визуализация

  1. Откройте программное обеспечение Dragonfly (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительную информацию о Dragonfly и его возможностях можно найти по адресу https://dragonfly.comet.tech/
  2. Импортируйте реконструированные TIFF-изображения.
  3. Выберите все изображения и убедитесь, что расстояние между изображениями совпадает со значением Scaled Image Pixel Size в текстовом файле сканирования (Дополнительный рисунок 3).
  4. Отрегулируйте уровень окна для получения 3D-вида с хорошим контрастом (Дополнительный рисунок 3).
  5. Прокрутите различные плоскости 2D-срезов (XY, поперечная; XZ, корональная; YZ, сагиттальная) (Дополнительный рисунок 3).
  6. Щелкните правой кнопкой мыши по изображению и экспортируйте скриншот вида, чтобы сохранить изображения срезов по мере необходимости (Рисунок 4).

Результаты

Мы собрали по два корневых клубенька с трех растений M. sativa. Два клубенька были использованы для сравнения продолжительности окрашивания, а четыре были визуализированы после полного 28-дневного окрашивания 1% PTA в 70% этаноле для повышения контраста. Использование 1% низкоплавящегося агарозы в качестве среды для монтажа в наконечниках пипеток позволило создать вокруг образца среду с низкой рентгеновской плотностью. Раствор для окрашивания успешно повысил контраст растительной ткани (Рисунок 5A,B, Дополнительный рисунок 4). Сигнал от образца легко отделялся от фона и наконечника пипетки по гистограмме данных, что позволило беспрепятственно визуализировать в 3D внешнюю и внутреннюю структуру всего корневого клубенька (Рисунок 5A,B).

Наружный эпидермис виден, однако он обладает меньшим контрастом по сравнению с другими тканями (Рисунок 5C–E). С другой стороны, сосудистые пучки четко выражены и непрерывно проходят от основания до вершины образца (Рисунок 5A,B). На поперечных срезах отчетливо видно количество и разветвление этих пучков (Рисунок 5C>). Кроме того, внутренняя ткань демонстрирует хороший контраст, что позволяет идентифицировать кору и растительные вакуоли (Рисунок 5C–E). Высокий контраст также облегчает распознавание инфицированных и неинфицированных клеток (Рисунок 5C–E). Коронарные и сагиттальные срезы раскрывают распределение меристематической, инфекционной и дифференцировочной зон (Рисунок 5D). В Дополнительном видео 1 представлен обзор 3D-реконструированного клубенька с поворотом на 360°.

figure-results-1
Рисунок 1: Схема протокола. Обзор рабочего процесса использования микроКТ для визуализации корневых клубеньков бобовых и время, необходимое для каждого этапа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Корневые клубеньки M. sativa для данного протокола. (A) Растение M. sativa через 28 дней после инокуляции бактериями S. meliloti (28 dpi). Черные пунктирные линии обозначают рекомендуемые линии разреза для извлечения показанных клубеньков. Для трех растений было извлечено по два клубенька с каждого, всего было отсканировано четыре образца. (B) Клубенек M. sativa 28 dpi после 4 недель окрашивания PTA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Обзор подготовки образца для микроКТ. Корневой узелок, окрашенный контрастным веществом, стабилизирован в низкоплавком агарозе внутри наконечника микропипетки. Один конец наконечника микропипетки запечатан парафином, и наконечник закреплен на поворотном столике внутри микроКТ-сканера. Источник рентгеновского излучения (без фильтра) расположен с одной стороны установки, и лучи проходят через образец, достигая рентгеновского детектора с другой стороны. В результате сканирования получается 2D-проекция, основанная на плотности тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Пример реконструкции изображений и 3D-визуализации. (Слева) 2D-проекция. (В центре) Срез реконструкции. A1, B1 и C1 показывают реконструированные поперечные срезы в точках A, B и C на 2D-проекции микроКТ. (Справа) 3D-визуализация корневого клубенька, полученная на основе реконструированных изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Аннотированные репрезентативные изображения. (A) Аннотированная 3D-визуализация корневого клубенька M. sativa. (B) Красные, синие и зеленые контуры на 3D-изображении, показывающие соответственно поперечную (C), корональную (D) и сагиттальную (E) плоскости. Аннотированные поперечные (C), корональные (D) и сагиттальные (E) срезы корневого клубенька M. sativa. Сокращения: c – кора; e – эпидермис; ic – инфицированная клетка; r – корень; uc – неинфицированная клетка; v – вакуоль; vb – сосудистый пучок; ZI – Зона I (меристематическая); ZII – Зона II (инфекции); ZIII – Зона III (дифференцировки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1. Скриншоты программного обеспечения для микроКТ-визуализации. (A1) Открытие и закрытие дверцы предметного столика. (A2) Включение режима просмотра с камеры. (A3) Включение источника рентгеновского излучения. (A4) Включение режима непрерывного рентгеновского просмотра. (A5) Регулировка высоты образца. (A6) Настройка размера пикселя. (A7) Вращение образца. (A8) Изменение биннинга. (A9) Смена фильтра. (A10) Опции доступа к режимам сканирования. (A11) Установка напряжения и тока источника рентгеновского излучения. (A12) Двойной щелчок для отключения коррекции плоского поля. (A13) Параметры сканирования. (B1) Коррекция плоского поля отключена. (B2) Опции доступа к режимам сканирования. (B3) Среднее рентгеновское пропускание. (B4) Регулировка времени экспозиции. (B5) Обновление плоских полей. (C1) Присвоение имени файлу и выбор места сохранения данных. (C2) Установка шага вращения, усреднения кадров, случайного перемещения и сканирования на 360 deg. (C3) Регулировка частичной ширины. (C4) Запуск сканирования.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2. Скриншоты программного обеспечения для реконструкции изображений. (A1) Выбор области для предварительного просмотра образца. (A2) Предварительный просмотр образца. (A3) Тонкая настройка параметров. (A4) Установка количества попыток и шага параметра для посториентирования. (A5-6) Верхняя и нижняя границы области реконструкции. (A7) Запуск реконструкции. (B1) Регулировка контрастности. (B2) Просмотр и пошаговый разбор результатов посториентирования. (B3) Создание круговой области интереса (ROI). (B4) Выбор формата файла и места сохранения данных.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 3. Скриншоты программного обеспечения для 3D-визуализации. (A) Информация о расстоянии между изображениями. (B) Инструменты выбора, вращения и масштабирования (сверху). Настройка уровней окна для контрастности (снизу). (C) Отображение масштабного отрезка (сверху). Изменение цвета фона (снизу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 4. Реконструкция MicroCT после окрашивания PTA в течение 14, 17 и 28 дней. (A) Реконструированный срез M. sativa после 14 д окрашивания PTA демонстрирует шум во внешнем слое (n = 1). (B) Реконструированный срез M. sativa после 17 д окрашивания PTA демонстрирует более высокий контраст во внешнем слое, но меньшую четкость внутренней структуры по сравнению с (A) (n = 1). (C) Реконструированный срез M. sativa после 28 д окрашивания PTA демонстрирует более высокий контраст как во внешнем, так и во внутреннем слоях по сравнению с (A) и (B) (n = 4).Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 1: Параметры микро-КТ визуализации.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительное видео 1: 3D-видео узла.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Ниже приведены рекомендации по подготовке и окрашиванию образцов. При подготовке образцов для микрокомпьютерной томографии (microCT) крайне важно аккуратно иссекать клубеньки для сохранения структурной целостности. Мы рекомендуем оставлять небольшой сегмент корня с обеих сторон от места прикрепления клубенька для сохранения пространственного контекста и минимизации повреждения тканей. Использование контрастного вещества имеет решающее значение для усиления ослабления рентгеновского излучения и визуализации внутренних анатомических особенностей14. Предыдущее исследование с использованием окрашивания PTA показало, что для достижения достаточного контраста у различных видов растений и типов тканей требуется минимальный период окрашивания в 14 дней, при этом признаков гиперпрокрашивания не наблюдалось14. В том исследовании корневые клубеньки сои, индуцированные Bradyrhizobium (фиксированные на 14-й день после инокуляции), окрашивались в течение 35 дней14. Используя этот диапазон (14–35 дней) в качестве ориентира, мы провели предварительные испытания по окрашиванию собственных образцов клубеньков в нескольких временных точках (14, 17 и 28 дней) и сравнили полученный контраст изображений. Для данного протокола был выбран 28-дневный период окрашивания, так как он обеспечил лучший контраст, более четкие границы клеток и более равномерное окрашивание по сравнению с более короткими временными интервалами (Дополнительная фигура 4). Отметим, что реконструкции для 14 и 17 дней получены от одного клубенька, а не в результате систематического исследования повторностей, в то время как условие с 28-дневным окрашиванием включает все четыре отсканированных клубенька; длительность окрашивания следует корректировать в зависимости от разрешения, необходимого для конкретного исследования. 28-дневный период окрашивания также является довольно длительным. Как предлагалось в предыдущих работах, окрашивание с помощью микроволнового излучения может помочь ускорить проникновение PTA и тем самым сократить необходимое время окрашивания14. Для усиления контраста в растительных тканях также используются препараты на основе йода, такие как раствор Люголя23,24. Мы выбрали PTA на основании его продемонстрированной эффективности в тканях клубеньков и не сравнивали различные контрастные вещества, так как основной целью данной работы была разработка единого воспроизводимого протокола14. В будущих исследованиях следует протестировать другие красители на различных видах растений и типах тканей.

Правильное включение в блок имеет такое же важное значение. Образец должен быть полностью покрыт низкоплавким агарозом для предотвращения дегидратации и сохранения его естественной морфологии. После включения образцы следует хранить в течение ночи при температуре 4 °C для обеспечения затвердевания агарозы, что необходимо для поддержания стабильности при сканировании. Закрепленный образец должен быть надежно зафиксирован на предметном столике сканера, чтобы предотвратить дрейф или появление артефактов вибрации во время сбора данных.

Микро-КТ позволяет проводить неразрушающую трехмерную визуализацию тканей всего клубенька с разрешением, которое ниже, чем при световой и электронной микроскопии. Как XRM, так и синхротронная рентгеновская КТ обычно обеспечивают изображения более высокого качества и разрешения, чем традиционная микро-КТ. Синхротронная рентгеновская КТ также позволяет сканировать свежие неокрашенные образцы напрямую, так как высокий поток фотонов и когерентность пучка обеспечивают быстрое получение данных и достаточный контраст без использования контрастных веществ6. Прямое сравнение с данными Duncan et al. (2022)14 и Nakhforoosh et al. (2024)6 ограничено различиями в дизайне исследований: видами растений (соя против Medicago sativa), типом клубеньков (детерминированные против индетерминированных) и методом визуализации (XRM и синхротронная рентгеновская КТ против традиционной микро-КТ). Тем не менее, номинальный размер пикселя наших реконструкций клубеньков составляет примерно 1.75 µm, что выше, чем при сканировании клубеньков у Duncan et al. (2022)14 (2.2 µm, Рисунок 4A), однако их реконструкции все равно демонстрируют большую четкость, чем наши. Вероятно, это отражает тот факт, что эффективное разрешение зависит не только от номинального размера пикселя; вклад вносят оптическое увеличение объективов XRM, чувствительность детектора, стабильность источника, качество камеры и методы реконструкции. В то время как крупные низкоплотные структуры, такие как вакуоли, легко различимы, как показано здесь, заполнение отдельных клеток бактериоидами, а также более мелкие или менее плотные органеллы не визуализируются, и динамические биологические процессы невозможно зафиксировать в режиме реального времени. PTA и контрастные вещества на основе йода неспецифичны и не позволяют определить молекулярную идентичность. Для решения вопросов субклеточного уровня по-прежнему потребуется флуоресцентная или электронная микроскопия. Эти методы визуализации дополняют друг друга: микро-КТ хорошо подходит для изучения морфологии всего органа и 3D-архитектуры тканей, обеспечивая контекст для световой и электронной микроскопии, которые позволяют детально рассмотреть более мелкие структурные и молекулярные особенности.

Нам удалось успешно воспроизвести данный рабочий процесс с использованием клубеньков, находящихся на аналогичных временных точках и стадиях развития, полученных из M. sativa инокулировали другими S. meliloti штаммы, и M. truncatula и Trigonella foenum-graecum инокулировали несколькими различными S. meliloti штаммов (неопубликованные данные). Мы не тестировали клубеньки на разных стадиях развития, так как нашей целью была характеристика и разработка воспроизводимого протокола для зрелых азотфиксирующих клубеньков. Тем не менее, данный рабочий процесс должен быть применим к клубенькам на различных стадиях развития, поскольку более существенным ограничением является размер клубенька. Сканируемые нами клубеньки имели длину примерно 2,5 мм (Дополнительная таблица 1). Для микроКТ, использованной в данном исследовании, рекомендуемый минимальный размер составляет 1 мм в длину. Размер объекта, доступного для визуализации, будет зависеть от используемого аппарата, так как кратность увеличения может быть различной.

Последние данные свидетельствуют о том, что степень заселенности клубенька является важным параметром, который напрямую коррелирует с эффективностью фиксации азота. Было показано, что клубеньки с большей долей инфицированных клеток фиксируют азот лучше, чем те, в которых бактериями заселено меньше клеток25. Кроме того, жизнеспособность клубенька зависит от степени развития сосудистой системы, а нарушение или ограничение васкуляризации указывает на дефектность клубеньков и ухудшение состояния растения26. Благодаря возможности визуализации степени заселенности и архитектуры сосудов, микроКТ восполняет важный пробел в области исследований фиксации азота. Данный рабочий процесс делает неразрушающую визуализацию внутренних и внешних структур корневых клубеньков доступной для рутинного использования, при этом данные структуры являются прямыми детерминантами эффективности фиксации, обеспечивающей симбиотический азотный обмен в сельскохозяйственных культурах.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о наличии конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Стефани Сейдж за помощь в подготовке растений. Сяо Чжао помогла с заливкой образцов. Мы признательны Мэди Митчелл за первоначальное обсуждение проекта. Мы хотели бы поблагодарить Тома Клайста и Кэкси И за советы по интерпретации данных. Мы также благодарим Кита Данкана (Центр растительных наук имени Дональда Данфорта) за советы по протоколу. Данный проект финансируется Институтом медицинских исследований Стоуэрса.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стеклянный флакон объемом 20 млSigma-AldrichZ190527Используется для удержания узелков при фиксации и окрашивании.
200 µL Наконечники для дозаторовFisherbrand02-717-144Используется для фиксации узелков при визуализации.
Чашка с микролунками 35 ммFisher Scientific507532924Используется для промывки узелков после окрашивания.
Программное обеспечение DragonflyComet Technologies Canada Inc.V2022.2Используется для визуализации и манипулирования 2D-реконструкциями в 3D-представлении.
ЭтанолDecon LabsV1001Используется для фиксации и промывки узелков.
Прецизионный пинцетДюмонAA-Inox-EИспользуется для регулировки узлов в наконечнике пипетки.
Наконечник для нанесения образцов на гельCorning (Costar)4853Используется для манипулирования узелком в агарозе внутри наконечника пипетки.
Плитка нагревательнаяMirakSP72725Используется для плавления парафина и растворения низкоплавкого агарозы.
низкоплавкий агарозGeneMate490001-602Используется для заливки корневых клубеньков с целью сохранения их ориентации и увлажненности.
МикроКТBrukerBruker SkyScan 1272Используется для сканирования узла.
Программное обеспечение NReconBrukerV2.2.0.6Используется для реконструкции 2D-проекций.
Орбитальный шейкерVWR77591-858Используется для встряхивания корневых клубеньков с целью ускорения проникновения красителя.
ПарафинMcCormick Scientific39503002Используется для герметизации узкого конца наконечника пипетки.
ПарафильмAlkali ScientificPM996Используется для герметизации наконечников дозатора с целью предотвращения высыхания образца.
Фосфовольфрамовая кислотаНаука об электронной микроскопии (EMS)19500Используется для окрашивания узелков.
Держатель образца — L 3,4 см, D 0,63 ммBrukerКомплект от Bruker с оборудованиемИспользуется для фиксации наконечника пипетки и образца во время визуализации.
СкальпельFisher ScientificS07890Используется для сбора корневых клубеньков.
Программное обеспечение SkyscanBrukerv1.5.1.0Используется для управления микро-КТ.
Водяная баняГрант Букеля640013001Используется для поддержания агарозы в жидком состоянии при включении узелков.

Ссылки

  1. Oldroyd GED, Murray JD, Poole PS, Downie JA. The rules of engagement in the legume-rhizobial symbiosis. Annu Rev Genet. 2011;45:119-44.
  2. Gibson KE, Kobayashi H, Walker GC. Molecular determinants of a symbiotic chronic infection. Annu Rev Genet. 2008;42:413-41.
  3. Porter SS, et al. Host-imposed control mechanisms in legume-rhizobia symbiosis. Nat Microbiol. 2024;9:1929-39.
  4. Guerra-García FJ, Sankari S. NCR peptides in plant-bacterial symbiosis: applications and importance. Trends Microbiol. 2025;33(2):147-50.
  5. Rae AE, Rolland V, White RG, Mathesius U. New methods for confocal imaging of infection threads in crop and model legumes. Plant Methods. 2021;17:24.
  6. Nakhforoosh A, et al. Visualization and quantitative evaluation of functional structures of soybean root nodules via synchrotron X-ray imaging. Plant Phenomics. 2024;6.
  7. Nierenberger M, Rémond Y, Ahzi S, Choquet P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. C R Biol. 2015;338(7):425-33.
  8. Livingston D, Tuong T, Nogueira M, Sinclair T. Three-dimensional reconstruction of soybean nodules provides an update on vascular structure. Am J Bot. 2019;106(3):507-13.
  9. Warner CA, et al. An optical clearing technique for plant tissues, allowing deep imaging and compatible with fluorescence microscopy. Plant Physiol. 2014;166(4):1684-7.
  10. Indore NS, Karunakaran C, Jayas DS. Synchrotron tomography applications in agriculture and food sciences research: a review. Plant Methods. 2022;18:101.
  11. Novák K. Determination of symbiotic nodule occupancy in the model Vicia tetrasperma using a fluorescence scanner. Ann Bot. 2011;107(4):709-15.
  12. Martin L, et al. Cancer cachexia in the age of obesity: Skeletal muscle depletion is a powerful prognostic factor, independent of body mass index. J Clin Oncol. 2013;31(12):1539-47.
  13. Liguori C, et al. Emerging clinical applications of computed tomography. Med Devices (Auckl). 2015;8:265-78.
  14. Duncan KE, et al. X-ray microscopy enables multiscale high-resolution 3D imaging of plant cells, tissues, and organs. Plant Physiol. 2022;188(2):831-45.
  15. Wang J, et al. A deep learning-based micro-CT image analysis pipeline for nondestructive quantification of the maize kernel internal structure. Plant Phenomics. 2025;7(1).
  16. Brackin R, Atkinson BS, Sturrock CJ, Rasmussen A. Roots-eye view: Using microdialysis and microCT to non-destructively map root nutrient depletion and accumulation zones. Plant Cell Environ. 2017;40(12):3135-42.
  17. Brodersen CR, Roddy AB. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. Am J Bot. 2016;103(2):184-8.
  18. Schoborg TA, et al. Micro-computed tomography as a platform for exploring Drosophila development. Development. 2019;146(23).
  19. Wang M, et al. Nanoplastics causes extensive congenital malformations during embryonic development by passively targeting neural crest cells. Environ Int. 2023;173.
  20. Brodersen CR, et al. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiol. 2010;154(3):1088-95.
  21. Brodersen CR, et al. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiol. 2013;161(4):1820-9.
  22. Nolf M, et al. Visualization of xylem embolism by X-ray microtomography: a direct test against hydraulic measurements. New Phytol. 2017;214(2):890-8.
  23. Karahara I, Yamauchi D, Uesugi K, Mineyuki Y. Three-dimensional visualization of plant tissues and organs by X-ray micro-computed tomography. Microscopy (Oxf). 2023;72(4):310-25.
  24. Staedler YM, Masson D, Schönenberger J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 2013;8(9).
  25. Sánchez-Cañizares C, et al. Developmental fates and N2-fixing efficiency of terminally-differentiated versus undifferentiated bacteroids from legume nodules. Plant Physiol. 2026;200(3).
  26. Pepper AN, Morse AP, Guinel FC. Abnormal root and nodule vasculature in R50 (sym16), a pea nodulation mutant which accumulates cytokinins. Ann Bot. 2007;99(4):765-76.

Перепечатки и разрешения

Теги

Трехмерная реконструкциягистология растенийнеразрушающая визуализацияусиление контрастасохранение тканейорганизация бактерийсимбиоз бобовых

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.