Одноклеточная масс-спектрометрия с использованием десорбционной электрораспылительной ионизации, связанной с масс-спектрометрами Orbitrap

Краткое содержание

Этот протокол описывает масс-спектрометрическую визуализацию клеток OVCAR-8 с использованием десорбционной электроспрей ионизации в сочетании с масс-спектрометрами Orbitrap для высокопространственного метаболомного анализа.

Аннотация

Десорбционная электроспреевая ионизация с масс-спектрометрией (DESI–MSI) позволяет проводить молекулярную визуализацию без матрици с минимальной подготовкой образца. Этот протокол описывает рабочий процесс для одноклеточного MSI клеток OVCAR-8 с использованием DESI в связи с масс-спектрометрами Orbitrap. Система интегрирует DESI-распылитель, модифицированный интерфейс масс-спектрометра, моторизованный ступень XYZ и оптическую макетную плату для высокопространственного разрешения. Клетки культивируются на сетчатых стеклянных накладках, промываются раствором аммония формиата для уменьшения соляных помех, сушат и анализируются в условиях окружающей среды. Растворитель подаётся непрерывно с помощью системы наножидкой хроматографии, а небулайзерный азот регулируется для поддержания стабильности распыления. Протокол также описывает растровую визуализацию, управление пикселями и регистрацию изображений от оптической к масс-спектрометрии для локализации по одной ячейке. Высокое разрешение по массе и точность массы, обеспечиваемые обнаружением Orbitrap, позволяют дифференцировать близкородственные молекулярные виды и поддерживают метаболомный анализ на основе отдельных клеток. Этот протокол обеспечивает адаптивную стратегию реализации одноклеточного MSI с высоким пространственным разрешением с использованием нескольких платформ масс-спектрометра Orbitrap.

Введение

Метаболомика стремится всесторонне охарактеризовать маломолекулярные метаболиты, отражающие функциональное состояние биологических^систем 1,2,3,4,5. Поскольку метаболиты являются прямыми продуктами ферментативной активности, они обеспечивают динамическое отсчёта клеточного фенотипа и биохимической регуляции. Однако традиционные метаболомные процессы обычно опираются на методы массовой экстракции, которые усредняют сигналы между тысячами и миллионами клеток, тем самым скрывая клеточную^{гетерогенность 6,7,8}.

Одноклеточная метаболомика решает это ограничение, позволяя молекулярное профилирование на уровне отдельных клеток, выявляя метаболическое разнообразие в сложных популяциях и улучшая механистическое понимание прогрессирования заболевания, ответа лекарств и клеточной дифференцировки. Масс-спектрометрия (МС) является незаменимым инструментом для молекулярного анализа биологических образцов. Недавние достижения в методах РС, включая подготовку образцов, инструментирование и анализ данных, позволяют проводить исследования метаболомики РС на уровне отдельных^клеток 9,10,11,12.

MS imaging (MSI), позволяющая проводить пространственно разрешённый молекулярный анализ биологических образцов, интегрирует точное движение образца, минимизирует отбор проб, эффективную ионизацию и визуализацию данных, получая полный масс-спектр на каждой определённой пространственной координате поверхности^{образца} 12,13,14. Изображения MS восстанавливаются путём нанесения интенсивности выбранных значений соотношения массы к заряду (m/z) по координатам x–y, сохраняя химическую пространственную информацию внутри сложных биологических^систем 12,13,15,16,17,18. Для достижения пространственно разрешённой одноклеточной метаболомики необходимы аналитические платформы, способные сохранять молекулярную локализацию при сохранении достаточной чувствительности и массового разрешения для обнаружения малочисленных^{видов 9,12,19,20}.

Одноклеточная MSI представляет дополнительные сложности, поскольку диаметр отдельных клеток обычно варьируется от 5 до 20 мкм^{, 8,21}. На этом пространственном масштабе количество анализируемых материалов на одно событие выборки крайне ограничено. Поэтому множество факторов, включая точное управление движением образца, минимизацию выборки, высокую эффективность ионизации и эффективную передачу ионов, одинаково важны для получения интерпретируемой молекулярной информации от отдельных^{клеток 14,22}. Матричная лазерная десорбция/ионизация (MALDI)–MSI, вакуумная технология, регулярно используемая для высокопространственных исследований MSI, требует матричного осаждения и вакуумной работы; однако кристаллизация матрицы в MALDI может ввести делокализацию и вариативность анализируемых элементов на уровне^{23, 24, 25, 26, 27}. В отличие от этого, методы окружающей среды MSI работают в условиях окружающей среды, и образцы сохраняют почти родные химические состояния, поскольку подготовка образца требуется мало или вовсе отсутствует. Среди методов окружающей среды MSI ранее применялись DESI²⁸, nano-DESI²¹, пневматически ассированный нано-DESI²⁹ и Single-probe 8,30,31,32,33,34,35 для исследований одноклеточных MSI. Хотя методы, основанные на экстракции микрожидкости, включая nano-DESI, пневматически асистированный nano-DESI и Single-probe, обеспечивают высокую эффективность отбора проб и ионизации, они опираются на поддержание стабильного жидкого моста на кончике пробного зонда, тогда как возмущения жидкого моста, такие как изменения морфологии поверхности или засор зонда, могут влиять на качество экспериментов^{MSI 5,8, 21, 30, 35}.

DESI — это метод внешней ионизации, при котором капли заряженного растворителя попадают на поверхность, извлекают анализируемые вещества и образуют вторичные капли с ионизированным^{видом 36}. DESI обеспечивает бесконтактную, без засоров отбор проб с совместимостью для растровых рабочих процессов визуализации, что делает его отлично подходящим для высокоразрешающего многоионного молекулярного картирования оптически идентифицированных отдельных ячеек при подключении к высокоразрешённым платформам Orbitrap^{20, 37, 38, 39, 40}. DESI широко используется для визуализации тканей, но редко применяется к одноклеточным MSI, в основном из-за технических^{сложностей 20,28}. Недавние исследования, проведённые с использованием коммерческой установки, состоящей из Waters DESI XS, связанного с циклическим масс-спектрометром серии SELECT SERIES, показали, что разрешение с одной ячейкой можно достичь для нескольких клеточных линий. Для достижения высокого пространственного разрешения в DESI–MSI требуется скоординированное управление эффективностью ионизации, пропусканием ионов, скоростью набора и выравниванием^{распылителя} 12,20,28. В частности, достижения в проектировании новых поколений DESI-распылителей, включая DESI XS и десорбционную электро-фло-фокусировочную ионизацию (DEFFI), значительно сократили площадь отбора^{пробы — 41,42}. Кроме того, снижение скорости потока растворителя, таких как поток нанолитров в минуту, подаваемые насосами наножидкой хроматографии (LC), может значительно улучшить пространственное удержание для достижения одноклеточного молекулярного^{разграничения 28}. Хотя этот подход достиг MSI с одноячейковым разрешением, он опирается на инструменты от конкретного поставщика (Waters). Более широкая реализация одноэлементного DESI–MSI требует стратегий, которые можно интегрировать с широко доступными масс-спектрометрами высокого разрешения, такими как системы Orbitrap, чтобы обеспечить высокую чувствительность, точность массы и разрешительную способность. Объединение DESI с масс-спектрометрами Orbitrap открывает новые возможности для исследований одиночных клеток MSI, включая дифференциацию близко расположенных и изобарических видов в сложных клеточных^{экстрактах} 20,43,44.

Этот протокол описывает модульную стратегию интеграции опрыскивателя Waters DESI XS с масс-спектрометрами Orbitrap для одноклеточных исследований MSI. Рабочий процесс интегрирует сетчатые накладки для крепления ячеек и оптической корреляции, моторизованный ступень XYZ для контролируемого растрового сканирования, доставку растворителя наномасштаба для стабильного образования распыления и высокоразрешающую детектировку Orbitrap. Хотя в качестве платформы был выбран масс-спектрометр Thermo Orbitrap Tribrid Lumos, многие другие модели масс-спектрометра Orbitrap, оснащённые совместимыми геометриями интерфейса источник-интерфейс, потенциально могут быть объединены с аналогичными индивидуальными конфигурациями DESI XS после соответствующей механической адаптации и оптимизации.

Протокол

Клетки OVCAR-8 были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC). Все процедуры по культуре клеток проводились в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности. Клетки регулярно тестировались на загрязнение микоплазмой с помощью набора для обнаружения микоплазмы согласно инструкциям производителя.

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все процедуры в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты. Работайте с органическими растворителями в вытяжной вытяжке с химическими выпарителями.

1. Культивировать и подготовить клетки OVCAR-8 на сетчатых покрытиях

1. Подготовьте полную среду, добавив RPMI-1640 среднюю сыворотку из 10% плодовой бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина. Разогрейте средний до 37°C.
2. Содержать клетки OVCAR-8 в 10-сантиметровых контейнерах с 10 мл полной среды. Инкубировать клетки при 37°C в увлажнённом инкубаторе с 5%_CO2.
3. Проходят клетки, когда примерно 80% поверхности культуры визуально заняты приклеенными клетками, обычно каждые 2 дня при описанных условиях культуры.
   1. Аспирируйте среду из 10-сантиметровой культурной чашки и промывайте клетки 5 мл 1× фосфатно-буферного физиологического раствора.
   2. Добавьте 2 мл 0,25% трипсина–этилендиаминтетрауксусной кислоты в чашку для посевов. Инкубировать клетки при 37°C примерно в течение 3 минут или до тех пор, пока большинство клеток заметно не отсоединятся от поверхности культуры при осмотре под микроскопом.
   3. Добавьте 8 мл предварительно подогретого полного материала в блюдо, чтобы нейтрализовать трипсин. Используя серологическую пипетку объемом 10 мл, аккуратно подвешивайте суспензию клетки примерно 15–20 раз, чтобы рассеять клетки.
   4. Перенесите 1 мл подвески в 9 мл свежей полной среды.
   5. Считайте ячейки с помощью автоматического счётчика ячеек. Загрузите 10 мкл суспензии ревзвешенной ячейки непосредственно в счётный затвор без дополнительного разбавления и выполните подсчёт ячеек согласно инструкциям производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Красители для жизнеспособности клеток, такие как трипан-синий, не использовались в этом протоколе. Визуально оценивайте состояние клетки, отслеживая морфологию и прикрепление до трипсинизации.
4. Посейте ячейки на ковверслипах.
   1. Разведите клетки до конечной концентрации ~1 × 10⁶ клеток/мл, используя полную среду. Вычислите требуемый объём суспензии ячейки с помощью C₁V₁ = C₂V₂, где C₁ — считаемая концентрация ячейки, V₁ — объём необходимой суспензии ячейки, C₂ — целевая концентрация, а V₂ — желаемый конечный объём.
   2. Поместить отдельные стеклянные стеклянные покрытия диаметром 28 мм с расстоянием между сетками 50 мкм в колодцы пластины с 6 лунками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием для клеточной культуры используйте стеклянные покрытия автоклавом. Разместите сторону сетки вниз, чтобы минимизировать помехи росту клетки.
   3. Добавьте 2 мл полной среды и 200 мкл суспензии ячейки (~2 × 10⁵ клеток/скважину) в каждую яму. Аккуратно покачивайте пластину с 6 лунками по схеме «X», чтобы равномерно распределить ячейки по поверхности скольжения.
   4. Инкубировать клетки примерно 15–20 часов, чтобы обеспечить прикрепление клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Регулярно контролируйте морфологию клеток с помощью микроскопа, чтобы обеспечить нормальный рост клетки. Если клетки растут плохо, проверьте возможное загрязнение микоплазмы с помощью комплекта для обнаружения микоплазмы.

2. Промывка элементов раствором аммонийного формиата (AF)

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым использованием готовьте свежий раствор автофокуса.

1. Подготовьте изотонический буфер для промывания автофокуса непосредственно перед использованием. Взвесить 0,45 г AF и растворить его в 50 мл воды класса LC/MS для получения конечной концентрации AF 0,14 м (0,9% w/w). Не регулируйте^{pH 5,45}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежеприготовленный раствор AF в тот же день подготовки. Держите раствор ледяным (0°C–4°C) до использования.
2. Аспирируйте культурную среду из каждой колодцы пластины с 6 колодцами. Сразу добавьте 2 мл раствора холодного автофокуса в каждую скважину.
3. Используя стерильные щипцы, аккуратно поднимите каждое покрытие с приклеенными клетками из колодца, сохраняя покрытую клеточной поверхностью вверх. Кратко поместите накладку на 2–3 секунды в отдельную яму, предварительно заполненную 2 мл холодного раствора 0,9% автофокуса.
4. Повторяйте процесс промывания в общей сложности два раза, используя свежий раствор автофокуса для каждого полоскания. После окончательного промывания удалите накладку из раствора автофокуса и дайте ему высохнуть на воздухе при комнатной температуре в химическом выхлопчике примерно 20–30 минут перед анализом DESI–MSI.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно промывайте клетки, чтобы не беспокоить их во время промывания.

3. Изготовление модифицированного интерфейса MS на базе FAIMS

1. Разберите адаптер корпуса ионного источника электрода FAIMS Pro, чтобы получить доступ к внутренней области электрода. Убедитесь, что адаптер совместим с масс-спектрометрами Thermo Orbitrap, оснащёнными конфигурацией интерфейса FAIMS Pro.
2. Удалите компоненты электрода FAIMS, включая внутренние провода, электродные сборки, уплотнительные кольца и поддерживающие внутренние конструкции. Сохранить внешний корпус, крепящие фланци и интерфейсный контакт для распознавания адаптера масс-спектрометра.
3. Модифицировать круглое отверстие с использованием стандартных методов механической обработки в цехе. Увеличьте отверстие, пока оно не создаёт достаточное пространство вокруг выступающего входа/ионных воронок Orbitrap.
4. Выровняйте и удаляйте заусенцы с обработанного края после резки. Подтвердите, что модифицированное отверстие позволяет свободно размещать адаптер корпуса на масс-спектрометре.
5. Модифицируйте длину двух опор адаптера корпуса с помощью пилы. Подрежьте ножки до конечной длины примерно 2 1/4 дюйма, чтобы обеспечить подключение к оптической макетной плате.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соответствующие инструменты для механической обработки и избегайте повреждения структурной целостности оставшегося корпуса.
6. Подготовьте алюминиевую оптическую макетную плату (10 дюймов × 12 дюймов × 0,5 дюйма, 1/4"-20 отверстия с резками). Разместите макетную плату горизонтально под модифицированным адаптером FAIMS.
7. Используйте два крепления, чтобы соединить модифицированный адаптер FAIMS с оптической макетной платой. Обрезайте кронштейны по мере необходимости, чтобы уменьшить вес и обеспечить правильное расположение макетной платы относительно входа Orbitrap.
8. Закрепите модифицированный интерфейс FAIMS на оптической макетной плате с помощью механически совместимого монтажного оборудования, выровненного с отверстием с отверстиями 1/4"-20 на макетной плате. Обеспечьте стабильное позиционирование во время экспериментов с визуализацией.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что интерфейс жёстко фиксирован, чтобы минимизировать вибрацию при движении ступенях и сборе данных.
9. Сделайте машиной или вырезьте неглубокий паз в оптической макетной плате непосредственно под контактной областью корпуса FAIM. Размер и расположение канавки для обеспечения достаточного зазора для стабильного сидения и выравнивания модифицированного корпуса FAIMS относительно входа Orbitrap.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер канавки с учётом основания адаптера корпуса FAIMS и улучшить воспроизводимость позиции.
10. Выровняйте установленный интерфейс с входом масс-спектрометра. Убедитесь, что удерживаемый крепящий фланец правильно сидит на приборе и что оптическая макетная плата остаётся ровной под интерфейсом.
11. Проверьте, обеспечивает ли модифицированное круглое отверстие свободный зазор вокруг входа/ионной воронки Orbitrap перед установкой распылителя DESI.

4. Собрать распылитель DESI и интерфейс Orbitrap

1. Установите распылитель DESI на интегрированную систему, состоящую из индивидуальной рамы FAIMS, моторизованного ступеня XYZ, газового регулятора и оптической макетной платы. Используйте моторизованный каскад, управляемый контроллером CONEX-MFACC.
2. Определите ось x как направление растрового сканирования слева направо, а ось y — как направление линейного шага сверху вниз. Установите положение оси z перед захватом и держите её неподвижной во время съёмки.
3. Используйте диапазон хода ступени примерно 1 мм в направлении x и 1 мм в направлении y. Не применяйте движение по оси z во время захвата.
4. Разместите DESI-распылитель под углом примерно 70° относительно поверхности образца. Разместите образец непосредственно под распылителем и расположите кончик как можно ближе к входу Orbitrap без физического контакта.
5. Подключите заземляющий металл DESI к источнику земли под масс-спектрометром. Управление растровым движением с помощью программного обеспечения управления уровнем (рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: DESI-распылитель, используемый в этом исследовании, доступен только пользователям с инструментами DESI–MSI.
6. Используйте моторизованный контроллер сцены XYZ для перемещения и позиционирования. Подключите линию напряжения, азотную газовую линию, линию растворителя и заземлюющую линию перед началом работы.
7. Установите специально изготовленную ионную трубку из нержавеющей стали (1/16 дюйма OD × 0,033 дюйма ID), предназначенную для соответствия входу ионного источника Orbitrap. Разместить ионную трубку так, чтобы она выровнялась прямо с входом Orbitrap, при этом достаточно вытянулась наружу, чтобы обеспечить беспрепятственный доступ к шлейфу DESI.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настройте ионную трансферную трубку в соответствии с конфигурацией масс-спектрометра. Изготовьте ионную передаточную трубку с использованием соответствующих методов обработки.
8. Используйте ионную трансферную трубку с изогнутой геометрией для улучшения положения DESI-распылителя относительно поверхности образца и входа Orbitrap.
9. Выровнять распылитель под углом примерно 70° относительно поверхности образца так, чтобы шлейф DESI пересекал область входа Orbitrap, не соприкасаясь с поверхностью образца.
10. Определите стабильный шлейф распыления по наличию стабильных масс-спектров и согласованных нормализованных уровней (NL) во время накопления. Регулировать положение распылителя до тех пор, пока не появится стабильный ионный сигнал.
11. Установите расстояние между распылителем и поверхностью примерно 1,0–1,5 мм в качестве начального условия. Вручную тонко корректируйте положение распылителя при мониторинге NL-значений для достижения максимального стабильного ионного сигнала.

Рисунок 1. Интегрированная система десорбционной электроспрей ионизации (DESI)–масс-спектрометрии (MSI) в сочетании с масс-спектрометром Orbitrap . Распылитель DESI установлен на интегрированной платформе, состоящей из модифицированного адаптера асимметричной асимметрии сигнальной формы (FAIMS ), моторизованной ступени XYZ, газового регулятора и оптической макетной платы. Растворитель подаётся с помощью системы наножидкой хроматографии, а азотный газ подаётся при давлении примерно 12 psi для стабилизации распыления. На рисунке также показаны соединение ионизационного напряжения, линия растворителя и расположение распылителя относительно входа Orbitrap. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

5. Настройте условия подачи растворителя и распыления

1. Перед анализом DESI–MSI подготовьте свежий распылительный растворитель, состоящий из метанола/воды/муравьиной кислоты (98:2:0.1, v/v/v).
   ПРИМЕЧАНИЕ: После оптимизации могут использоваться и другие системы растворителей, совместимых с DESI, включая растворители на основе ацетонитрила и различные соотношения метанола и воды. Метанол/вода/муравиная кислота (98:2:0.1, v/v/v) использовалась в качестве стандартного стартового условия в этом протоколе, поскольку обеспечивала стабильное образование шлейфа, снижение распространения растворителя и воспроизводимые липидные сигналы положительного ионного режима во время одноклеточных экспериментов DESI–MSI.
   ВНИМАНИЕ: Метанол горючий и токсичен. Муравьиная кислота коррозийна. Работайте с растворителями в химическом выхлопчике.
2. Растворитель доставляется с помощью системы Ultimate 3000 nano-LC, работающей как изократический растворительный насос со скоростью 750 нл/мин, для описанных экспериментов. Подключите розетку nano-LC к распылителю DESI с помощью трубки PEEK (1/16 дюйма OD × 0,005 дюйма ID).
3. Установите колонку C18 (например, nanoEase M/Z Peptide BEH; 130 Å, 1,7 мкм, 300 мкм × 150 мм) для обеспечения достаточного обратного давления для стабильного образования распыления при низких расходах.
4. Установите метод масс-спектрометра в режим положительных ионов с обнаружением Orbitrap, напряжением распыления 0,85 кВ, разрешением Orbitrap 120 000 при m/z 200 и диапазоном m/z 150–1200.
5. Установите нормализованную мишень AGC на 100%, максимальное время инъекции на 100 мс, RF-линзу на 45%, а микросканирование на 1. Отключить квадрупольную изоляцию и фрагментацию источника.
6. Подавайте азотный оболочный газ от генератора азота или источника жидкого азота примерно при давлении 12 psi для стабилизации струи DESI. Используйте 12 psi в качестве начального рабочего давления и вносите небольшие ручные корректировки только при необходимости для улучшения значения NL и поддержания стабильного массового спектра.

6. Выполнять растровую обработку и управление пикселями

1. Определите область интереса с оптически видимыми отдельными ячейками, используя сетчатые покрытия в качестве ориентира. Выбирайте изолированные клетки с чётким визуальным отделением от соседних клеток, с целостной адгезионной морфологией и без явного пересечения с обломками или кластерами клеток.
2. Определите растровую область с помощью программного обеспечения Fance Stage Controller⁴⁶. Установите размер шага растра на 0,01 мм, скорость уровня на 0,01 мм/с и время задержки на 20 с.
3. Используйте растровое сканирование слева направо, затем переход к следующей линии в направлении y. Установите ортогональный размер шага между растровыми линиями на 10 мкм.
4. Скорректируйте скорость ступени в соответствии со скоростью захвата Orbitrap, чтобы достичь желаемой размерности пикселя в направлении сканирования (например, примерно 2,5–6,5 мкм). Вычислите размерность пикселя по направлению сканирования по следующей связи: размерность пикселя направления сканирования = скорость этапа × время приобретения на сканирование.
5. Используя скорость ступени 0,01 мм/с (10 мкм/с), получите 376 сканов за 102 секунды, чтобы получить время приобретения 0,271 с на скан и соответствующую размерность пикселя направления сканирования примерно 2,7 мкм. Синхронизировать движение ступени и масс-спектральное приобретение, устанавливая время захвата Orbitrap немного короче совместных параметров движения ступени и времени задержки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размерность ортогонального пикселя определяется запрограммированным размером шага и физическими и механическими ограничениями ступени, тогда как размерность направления сканирования определяется скоростью ступени и частотой приобретения спектра.
6. Собрать изображения в выбранном массовом диапазоне до завершения заранее определённой растровой области. Для области изображения диаметром 1 мм × 1 мм, полученной с помощью линейного шага 0,01 мм и скорости ступени 0,01 мм/с, общее время захвата составляет примерно 4–5 ч.
7. Генерировать RAW файлы данных во время сбора и останавливать сбор после завершения указанных растровых координат x–y и соответствующей длительности метода инструмента. При условиях положительного ионного режима, описанных здесь, каждая растровая строка обычно генерирует примерно 50 МБ RAW-файл, что даёт примерно 5 ГБ общих данных для 101 растровой строки.

7. Регистрация изображений от оптики к MS

1. Зафиксировать яркие изображения клеток в выбранной области сетки после промывания и сушки автофокуса и до получения DESI с использованием микроскопа с объективом 10×.
2. Конвертируйте RAW файлы в mzML с помощью msConvert из ProteoWizard⁴⁸. Преобразуйте файлы mzML в формат imzML с помощью imzML Converter⁴⁹.
3. Используйте настройки преобразования центроида/профиля, соответствующие формату полученных данных. Загрузите файлы imzML напрямую в METASPACE (https://metaspace2020.eu)⁵⁰ для визуализации изображений.
4. Не применяйте нормализацию, удаление горячих точек или дополнительные коррекции обработки изображений до визуализации. Ручное выравнивание оптических и MS-изображений, используя сеточные ориентиры в качестве позиционных ориентиров.
5. Масштабируйте оптическое изображение, используя известные размеры изображения и расстояние между сетками. Вручную наложите изображение MS для оценки соответствия между оптически видимыми позициями ячеек и локализованными ионными сигналами.
6. Подтвердить локализацию одной клетки по визуальному согласованию между изолированными клетками на ярком изображении и соответствующими распределениями ионов MS.

Результаты

Успешное выполнение этого протокола даёт наборы данных DESI–MSI, в которых оптически идентифицированные отдельные клетки пространственно соответствуют локализованным молекулярным ионным сигналам (рисунок 2). Изображения яркой микроскопии, полученные до анализа DESI–MSI, позволяют визуально идентифицировать отдельные клетки OVCAR-8 и облегчают регистрацию изображения от оптической к MS с использованием сетчатого скольжения в качестве позиционного ориентира. Репрезентативные ионные изображения DESI–MSI демонстрируют локализованные ионные распределения, пространственно коррелирующие с отдельными клетками, идентифицированными на соответствующем ярком изображении (рисунок 2A–2D).

Рисунок 2. Сравнение яркой микроскопии и MSI клеток OVCAR-8. (A) Яркое микроскопическое изображение клеток OVCAR-8, полученное при увеличении 10×. (B–D) Изображения MS, полученные с помощью DESI–MSI с размером пикселя 5,5 мкм × 10 мкм. Репрезентативные ионные распределения показаны для (B) m/z 317.111, (C) m/z 808.562 и (D) m/z 788.616. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Отдельные клетки генерируют полные масс-спектры, содержащие несколько липидно-связанных ионов и малых молекул. Вместо того чтобы полагаться на один молекулярный маркер, каждая клетка демонстрирует мультиионный молекулярный профиль, который служит химическим отпечатком. Репрезентативные ионные изображения при m/z 317.111, m/z 808.562 и m/z 788.616 демонстрируют гетерогенное молекулярное распределение между соседними клетками, указывая на измеримую метаболическую гетерогенность на уровне одной клетки (рисунок 2B–2D). Аннотации на основе METASPACE показали, что ионы, обнаруженные в m/z 808.562 и m/z 788.616, в основном ассоциируются с видами липидов фосфатидилхолина и фосфатидилетаноламина, тогда как m/z 317.111 соответствует нескольким кандидатным малым молекулам и видам, родственным дипептидам. Эти результаты показывают, что платформа позволяет обнаруживать пространственно локализованные молекулярные особенности оптически идентифицированных отдельных клеток в условиях окружающей среды. Дополнительные результаты, включая предварительно аннотированные виды, виды, идентифицированные с РС/РС, репрезентативные изображения РС и масс-спектры, приведены в предыдущих^{исследованиях 20}.

Интегрированная платформа DESI–MSI состоит из распылителя DESI, модифицированного адаптера FAIMS, моторизованного ступеня XYZ и оптической макетной платы, установленной рядом с входом Orbitrap (см. рисунок 1). Эта установка обеспечивает стабильную подачу растворителя, контролируемое движение ступени и выравнивание DESI-шлейфа с входом масс-спектрометра для экспериментов с одноэлементной визуализацией. Персонализированная ионная трансферная трубка, показанная на рисунке 3 , позволяет пропускать ион между областью источника DESI и входом Orbitrap. Изогнутая капиллярная геометрия облегчает позиционирование DESI-распылителя относительно поверхности образца и области входа, при этом сохраняя при этом непрепятственный перенос ионов.

Рисунок 3. Индивидуальная ионная трансферная трубка для Orbitrap MSI. Фотография специально изготовленной ионной трансферной трубки, используемой для соединения распылителя DESI с масс-спектрометром Orbitrap Fusion Lumos. На рисунке показана геометрия капилляра с изогнутым переносом и крепление, используемые для передачи ионов во время экспериментов с одноэлементными MSI с окружающей средой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

На рисунке 4 показан модифицированный адаптер FAIMS, интегрированный с оптической макетной платой и моторизованным ступенем XYZ. Вид сверху (рисунок 4A) иллюстрирует расположение каскады образца и модифицированного адаптера относительно входа Orbitrap, тогда как нижний вид (рисунок 4B) показывает монтажные кронштейны и сборку ступени, используемые для поддержки платформы для съёмки. Механическая устойчивость интегрированного узла важна для поддержания равномерного движения растра и минимизации позиционного дрейфа при захвате изображения.

Рисунок 4. Модифицированный адаптер с высокополевой асимметричной ионной подвижностью сигнальной формы (FAIMS), интегрированный с оптической макетной платой и моторизованной ступенью XYZ . (A) Вид сверху модифицированного адаптера, установленного рядом с входом и ступенью отбора проб Orbitrap. (B) Вид снизу, показывающий модифицированные кронштейны, оптическую макетную плату и моторизованную сборку ступени XYZ, используемую для поддержки и выравнивания платформы для изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Высокое разрешение по массе, обеспечиваемое обнаружением Orbitrap, позволяет различать близко расположенные и изобарические виды липид, тем самым повышая молекулярную специфичность и контраст изображения по сравнению с системами с более низкой массой. Малые размеры пикселей можно достичь за счёт синхронизации скорости ступеней и частоты спектрального приобретения. Например, размеры пикселей от 2,7 мкм × 10 мкм были достигнуты с помощью платформ быстрого приобретения Orbitrap и оптимизированных растровых^{параметров 42}. Высокопространственная визуализация позволяет молекулярно разграничить близко соседние клетки, минимизируя перекрытие сигналов между соседними клетовыми регионами.

Успешные эксперименты DESI–MSI характеризуются стабильными условиями распыления, постоянной интенсивностью ионов по растровым линиям и пространственной локализацией молекулярных сигналов, соответствующих отдельным клеткам на оптическом изображении. Неоптимальные эксперименты могут привести к диффузному распределению ионов, низкой интенсивности сигнала, несогласованности растровых рисунков или потере клеточной локализации из-за нестабильного образования распылителя, неправильного выравнивания распылителя, чрезмерного распространения растворителя или перемещения образца во время сбора образца. Тщательная оптимизация выравнивания распыления, скорости потока растворителя, скорости ступени и положения образца улучшает пространственную точность и стабильность ионного сигнала во время экспериментов с одноэлементарной визуализацией.

Обсуждение

Этот протокол позволяет создавать одноэлементные DESI–MSI с использованием масс-спектрометров Orbitrap с высоким разрешением массы за счёт интеграции точного управления ступенями, доставки наноуровневых растворителей, оптического наведения и анализа массы с высоким пространственным разрешением. Сочетание этих элементов решает множество технических барьеров, которые исторически ограничивали применение DESI–MSI на уровне одной ячейки. В частности, координированное управление стабильностью распыления, передачей ионов и временем их приобретения позволяет надёжно обнаруживать молекулярные сигналы из крайне малых объёмов отбора проб, соответствующих отдельным клеткам. Ключевым фактором, определяющим производительность этого рабочего процесса, является стабильность и удерживаемость DESI распыляющего шлейфа. При пространственном разрешении на уровне микрометров небольшие нарушения расхода растворителя, давления газа или расположение распылителя могут существенно изменить эффективную площадь отбора проб. Использование наномасштабной подачи растворителя в сочетании с соответствующим обратном давлением улучшает стабильность распыления и снижает его распространение, тем самым повышая пространственную точность. Кроме того, поддержание постоянного расстояния и угла между распылителем и поверхностью критически важно для воспроизводимой эффективности ионизации. Даже незначительные отклонения в геометрии могут привести к значительной вариации интенсивности сигнала, особенно при анализе гетерогенных клеточных образцов. На практике оптимизация условий распыления DESI проводилась эмпирически путём мониторинга общего ионного тока, спектральной стабильности и значений NL (обычно около 10⁵–10⁶) при получении. Воспроизводимое качество сигнала достигалось за счёт итеративной корректировки положения распылителя, стабильности потока растворителя, давления газа и выравнивания шлейфа DESI относительно входа Orbitrap.

Эффективность передачи ионов является ещё одним ключевым ограничением на уровне одной клетки, поскольку содержание анализируемых веществ в отдельных клетках по своей природе низкое. На этих пространственных масштабах эффективная передача ионов может стать более серьёзным практическим ограничением, чем эффективность ионизации, в некоторых реализациях, поскольку лишь очень малая часть десорбированных ионов в конечном итоге достигает входа масс-спектрометра. Поэтому эффективная передача ионов из области отбора проб в вход масс-спектрометра крайне важна. Модифицированный адаптер корпуса FAIM, используемый в этом протоколе, обеспечивает интерфейс между источником распыления DESI и термомасс-спектрометром, обеспечивая совместимость с несколькими моделями приборов, включая платформы серии Orbitrap Tribrid, Exploris и Astral. Интеграция модифицированного адаптера корпуса FAIMS с оптической макетной платой также обеспечивает механическую устойчивость, минимизируя несогласование во время длительных экспериментов с визуализацией. Синхронизация между движением ступени и масс-спектром столь же критична для достижения высокого пространственного разрешения. В DESI–MSI размерность пикселя в направлении сканирования определяется зависимостью между скоростью ступени и скоростью приобретения, тогда как ортогональное измерение определяется запрограммированным размером шага. Точный контроль этих параметров позволяет проводить точную выборку. Поскольку многие клетки млекопитающих обычно имеют диаметр примерно от 5 до 20 мкм, для минимизации перекрытия сигналов между соседними клетками и улучшения локализации молекулярных особенностей в отдельных клеточных областях требуются размеры пикселей, близкие к нескольким микрометрам. Однако номинальный размер пикселя не обязательно соответствует истинному отследу выборки, поскольку взаимодействие шлейфа растворителя с поверхностью образца может привести к боковому распространению и частичному перекрытию сигнала между соседними пикселями. Поэтому представленные размерности пикселей следует интерпретировать в контексте эффективного пространственного разрешения, а не строго геометрических определений. Индивидуальная ионная трансферная трубка, использованная в этом исследовании, была разработана в соответствии со стандартной ионной лампой для сохранения характеристик пропускания ионов и интеграции с конфигурацией источника DESI.

Высокая массовая способность и точность массы, обеспечиваемые масс-спектрометрами Orbitrap, необходимы для разрешения сложной смеси метаболитов и липидов внутри отдельных клеток. Многие обнаруженные молекулярные особенности были предварительно аннотированы с помощью точных измерений массы и анализа METASPACE. Поскольку несколько кандидатов могут соответствовать одному измеренному m/z значению, дополнительная валидация MS/MS и ортогональные молекулярно-подтверждающие стратегии могут дополнительно укрепить молекулярную идентификацию в будущих исследованиях. В положительном ионном режиме спектры DESI часто доминируют фосфолипидные виды с близко расположенными или изобарическими значениями m/z. Высокоразрешённое обнаружение Orbitrap позволяет дифференцировать эти виды, улучшая молекулярную специфичность и снижая спектральную неоднозначность. Эта возможность особенно важна для анализов на отдельных клетках, где зависимость от ограниченного числа ионов может привести к неправильному толкованию клеточной гетерогенности. Эта адаптивность говорит о том, что аналогичные стратегии могут быть применимы и к другим платформам масс-спектрометрии с соответствующими интерфейсами с соответствующими модификациями. Несмотря на эти преимущества, следует учитывать ряд ограничений. Во-первых, источник DESI, используемый в текущей работе, доступен только пользователям с системами DESI–MSI, и строительство систем DESI распылителей/Orbitrap может быть ограничено доступностью источников DESI. Однако альтернативные устройства DESI, включая DEFFI, также могут быть реализованы для высокопространственных исследований^{MSI 42,47}. Во-вторых, реализация этой платформы требует значительной кастомизации, включая обработку интерфейсов приборов и изготовление монтажных компонентов. Эти требования могут ограничивать доступ лабораторий без опыта в разработке приборов или механическом производстве. В текущей реализации интерфейсный корпус FAIMS служил удобной механической платформой для размещения узла распылителя DESI относительно входа Orbitrap. Следовательно, реализация описанной конфигурации более практична для лабораторий с доступом к совместимым с FAIMS системами Orbitrap и базовой поддержкой обработки. Однако более широкая концепция механического соединения источников DESI с входами Orbitrap может быть реализована с помощью альтернативных конструкций без модификации аппаратного обеспечения интерфейса FAIMS. В-третьих, хотя низкая скорость потока растворителя улучшает пространственное удержание, они также могут снижать общий выход ионов, что требует тщательной оптимизации для баланса чувствительности и пространственного разрешения.

Ещё одним важным фактором является потенциал делокализации анализируемых веществ во время отбора проб. Хотя DESI работает в условиях окружающей среды и не требует применения в матриксе, взаимодействие капель растворителя с поверхностью образца может привести к перераспределению анализируемых веществ, особенно для высокорастворимых видов. Минимизация объёма растворителя и оптимизация условий распыления критически важны для сохранения пространственной целостности на уровне одной ячейки. Аналогично, процедура промывки с использованием изотонного аммонийного формиата может снизить подавление ионов, связанных с солем, при сохранении целостности клетки и сохранении клеточных видов, как ранее сообщалось в одноклеточных рабочих процессах^{MS 5}.

Будущие разработки могут дополнительно повысить производительность и применимость этой платформы. Например, интеграция с более быстрыми системами сбора данных может позволить меньшие эффективные размеры пикселей и более производительные эксперименты MSI. Внедрение автоматизированных систем выравнивания или управления обратной связью в реальном времени может снизить вариабельность и повысить воспроизводимость. Кроме того, сочетание этого подхода с дополняющими методами, такими как флуоресцентная визуализация или стратегии целенаправленной маркировки, может улучшить идентификацию типов клеток и позволить проводить мультимодальные анализы.

Помимо технических аспектов, эта платформа имеет широкое значение для биологических и биомедицинских исследований. Возможность характеризуть молекулярные профили на уровне отдельных клеток в условиях окружающей среды открывает новые возможности для изучения клеточной гетерогенности в сложных системах. DESI–MSI уже успешно применяется на уровне тканей в исследованиях микроокружения опухоли, неврологических заболеваний, взаимодействий хозяина и патогена, а также лекарственно-устойчивых клеточных^{популяций} 12,15,16,35. Расширение DESI–MSI на уровне одной клетки может дополнительно улучшить способность различать локализованную химическую гетерогенность между соседними клетками, выявлять редкие клеточные субпопуляции и выявлять молекулярные маркеры, которые в противном случае могли бы быть скрыты в объёмных измерениях тканей. Однако настоящее исследование было проведено с использованием упрощённой монослойной модели клеточной культуры, и необходимы дополнительные исследования для подтверждения совместимости с другими сложными биологическими системами, включая различные клеточные модели, ткани, органоиды и 3D-культуры. Текущий рабочий процесс может стать основой для расширения высокопространственных DESI-измерений в сторону всё более разнородных биологических сред после дальнейшей валидации и оптимизации. Поскольку этот метод сохраняет пространственный контекст и предоставляет детальную молекулярную информацию, он может служить мостом между визуализацией и подходами, основанными на омеке. В заключение, этот протокол устанавливает гибкую и адаптируемую основу для достижения одноклеточного разрешения DESI–MSI на масс-спектрометрах Orbitrap. Решая ключевые задачи, связанные с эффективностью ионизации, пропусканием ионов, пространственным контролем и разрешением массы, этот подход позволяет провести детальную молекулярную характеристику отдельных клеток. Хотя необходима дальнейшая оптимизация и валидация, методология служит основой для расширения использования окружающего MSI в одноклеточных и пространственных метаболомных исследованиях.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
−80 °C морозильник	Eppendorf New Brunswick	U700	Хранение биологических образцов перед подготовкой.
6" вертикальная кронштейновая скоба для пекарских досок, отверстия 1/4"-20 (2 штуки)	Millipore Sigma	VB01A	Механическая поддержка и стабилизация настраиваемой сборки крепления распылителя
Ацетонитрол	Fisher Chemical	240744	Органический растворитель для подготовки и оптимизации растворителя, совместимого с DESI
Формиат аммония	Thermo Fisher Scientific	401152500	Приготовление изотонического буферного раствора формиата аммония для промывания клеток перед DESI–MSI
Яркопольный микроскоп	Fisher Scientific	12575252	Оптическое изображение и визуализация адгезивных клеток перед получением DESI–MSI
Колонка C18	Waters	186009259	Создание обратного давления на линии для стабильного формирования распыления DESI с нанопотоком
Медный провод	N/A	N/A	Электрическое соединение и заземление при изготовлении крепления распылителя
Распылитель DESI XS	Waters	700014033	Амбиентальный источник ионизации DESI для экспериментов с одноклеточным DESI–MSI
Эпоксидная смола	Devcon	20945	Механическая стабилизация и фиксация компонентов настраиваемого крепления распылителя
Адаптер корпуса источника иона FAIMS Pro	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Модификация и изготовление настраиваемого интерфейса DESI, совместимого с Orbitrap
Муравьиная кислота	Ward’s Science	470301-120	Модификатор кислоты для приготовления растворителя для распылителя DESI
Метанол	Fisher Chemical	A456-4 Optima	Органический растворитель для приготовления растворителя для распылителя DESI
Регулятор газа	Millipore Sigma	23831-U	Регулирование давления защитного газа азота во время работы DESI
Стеклянное покрывало с сеткой	Ibidi	10817	Субстрат для культуры клеток и ссылочное позиционирование для регистрации оптического изображения в MS
Заземляющий провод	N/A	N/A	Электрическое заземление для распылителя DESI и сборки интерфейса
Инкубатор	HeraCell	51026282	Поддержка культур млекопитающих под контролируемыми температурными и CO2 условиями
Вода для LC/MS	Thermo Fisher Scientific	W6500	Приготовление буферного раствора формиата аммония и растворителя для распылителя DESI
Платформа METASPACE	METASPACE	https://metaspace2020.eu	Облачное визуализирование MS изображений и анализ пространственных метаболических данных
Настраиваемый интерфейс FAIMS	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Индивидуальный интерфейс для связи распылителя DESI с масс-спектрометрами Orbitrap
Моторизованная XY-Z площадка	Newport Corporation	CONEX-MFACC	Управляемое движение растрированной площадки во время получения DESI–MSI
Набор для обнаружения микоплазмы MycoAlert PLUS	Lonza	LT07-703	Рутинный мониторинг загрязнения микоплазмой в культурах клеток
Нано-жидкостная хроматографическая система	Thermo Fisher Scientific	5200.0355	Нанопоточная система подачи растворителя для генерации распылителя DESI
Оптическая пекарская доска	Thorlabs	MB1012	Механическая опорная платформа для распылителя DESI и модифицированной сборки интерфейса
Масс-спектрометр Orbitrap Fusion Lumos	Thermo Fisher Scientific	UVPD	Высокоразрешающий масс-спектрометр Orbitrap для получения данных DESI–MSI
Трубка из PEEK	IDEX	1535	Соединение линии растворителя между нано-LC системой и распылителем DESI
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15140-122	Антибиотическая добавка для среды культуры клеток млекопитающих
Фосфатно-буферный раствор (PBS)	VWR	0780-50L	Растворяющий раствор для культур клеток при пассажировании
Среда RPMI-1640	Gibco	11875093	Среда культуры клеток млекопитающих для поддержания клеток OVCAR-8
Программное обеспечение управления площадкой	Lasken Group	Версия 6	Управление программным обеспечением растрированного сканирования, движения площадки и параметров приобретения изображений
Трубка из нержавеющей стали	MicroGroup	316H16H	Индивидуально изготовленная труба для передачи ионов (1/16" наружный диаметр, 0,033" внутренний диаметр) для интеграции с интерфейсом Orbitrap
Шприц, 250 &микро;л	Hamilton	1725LTN250UL	Загрузка растворителя и подача растворителя с нанопотоком
Синтетическая сыворотка бычьего плода (FBS)	HyClone	SH3006603	Добавка сыворотки для приготовления полной среды