Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подготовка мембранных белков-функционализированных полимеров и полимер/липидных гибридов крупных и гигантских униламеллярных везикул.

159 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71699

⸱

7 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Process Systems Engineering, Max Planck Institute for Dynamics of Complex Technical Systems, 2Max Planck School Matter to Life, 3Process Systems Engineering, Otto von Guericke University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол демонстрирует реформирование мембранного белка, цитохрома bo3 убихинолоксидазы, опосредованного детергентом, в крупные униламеллярные везикулы, состоящие из PDMS-g-PEO, и их превращение в гигантские везикулы посредством термоядерного электроформирования. Полученные функциональные полимерные компартменты подходят для передовых биохимических и биофизических исследований.

Аннотация

Везикулы, образованные из амфифильных сополимеров, отдельно или смешанных с фосфолипидами, обеспечивают лучшую механическую и химическую стабильность по сравнению с обычными липидными везикулами. Это делает их привлекательным корпусом, который можно дальше развивать и расширять для реализации конкретных применений, таких как доставка лекарств, диагностическое биосенсорирование, создание искусственных клеток и биовдохновлённые микро- и нанореакторы. В частности, функционализация через включение мембранных белков важна для многих из этих приложений. Здесь мы представляем протокол подготовки мембранных белков функционализированных крупных униламеллярных везикул (LUVs) из трансплантатного сополимера PDMS-g-PEO посредством детергентной реконструкции. Кроме того, мы описываем, как эти крупные везикулы могут быть преобразованы в гигантские униламеллярные везикулы (GUV) с помощью метода термоядерного синтеза и электроформирования. Протокол охватывает флуоресцентную маркировку мембранных белков, приготовление полимерных и гибридных LUV, восстановление мембранных белков, анализ распределения размеров с помощью динамического рассеяния света (DLS), оценку активности белка с помощью измерений потребления кислорода, подготовку функционализированных белковыми GUV и анализ активности ввода белков и протонной накачки в GUV с помощью конфокальной микроскопии. Репрезентативные результаты демонстрируют формирование монодисперсных протео-ЛУП с индексом полидисперсности (PDI) ниже 0,2 и успешное получение протео-ГУВов диаметром от 5 до 35 мкм. Активность белка подтверждается измерениями потребления кислорода как в полимерных LUV (18,2 нмоль/мин/мл), так и в гибридных LUV (26,9 нмоль/мин/мл). Вставка белка в GUV измеряется с помощью флуоресцентной интенсивности, что даёт 20,6 ± 3,7 a.u. для полимерных GUV и 26,2 ± 5.0 a.u. для гибридных GUV. Активность протонного насоса в GUV, контролируемая с помощью инкапсулированного pH-чувствительного красителя, соответствует белковой функциональности, при этом доминирует внутренний протонный насос. Механическая мягкость сополимера и липидноподобная толщина бислоя (~5,3 нм) обеспечивают эффективное введение белков и сохранение функциональности.

Введение

Амфифильные блочные сополимеры могут самособираться в водном растворе в мембраны, которые спонтанно изгибаются и замыкаются друг с другом, образуя сферические мембранные компартменты, известные как полимеромы (полимерные везикулы). По сравнению с липидными мембранами, полимерные компартменты обеспечивают повышенную химическую универсальность и повышеннуюхимическую стабильность 1 имеханическую стабильность 2, что делает их очень привлекательными для таких применений, как доставка лекарств, нано- и микрореакторы, а также создание прочных искусственных ячеек. И наша группа, и другие функционализировали полимерные мембраны, вставляя мембранные белки для создания искусственных органелл иклеток 1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Полимеры, содержащие гидрофобное ядро поли(диметилсилоксан) (PDMS), особенно хорошо подходят для интеграции мембранных белков благодаря высокой гибкости цепочек и возможности настроить гидрофобную толщину мембраны для лучшего соответствия трансмембранномудомену белка 5. В то время как наша лаборатория в основном сосредоточилась на сополимере трансплантата поли(диметилсилоксан)-графт-поли(этиленоксид) (PDMS-g-PEO), который образует высокодинамические мембраны 4,16,17, мягче обычных липидных билейров и имеющих толщину примерно 5,3нм1, другие группы успешно применяли триблоковые сополимеры на основе PDMS, такие как PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA5,6,7,8,9,10,11 и PEtOz-b-PDMS-b-PEtOz12 для восстановления мембранного белка. Даже сравнительно жёсткие диблок-сополимеры, такие как PBD-b-PEO, особенно в гибридных системах, смешанных с липидами, были использованы для успешного включениябелков 13. Эти примеры подчёркивают универсальность полимерных мембран как платформ восстановления, которые также могут обеспечить повышенную химическуюстабильность 1 и продление функционального срока службы14 для встроенных мембранных белков. Хотя гибридные полимерно-липидные мембраны не всегда соответствуют химической стабильности чистыхполимерных систем 1, они предлагают привлекательный компромисс, сочетая механическую прочность полимеров с биологической значимостью липидов. Это приводит к созданию среды мембраны, которая более близко имитирует нативные биологические мембраны, сохраняя при этом ключевые преимущества синтетических материалов. Такие гибридные архитектуры могут предлагать дополнительные преимущества, включая снижение протонной проницаемости в результате наномасштабногоперестройки 1 и формирования доменов внутримембраны 15.

Существует несколько методов реконструкции мембранных белков в наноразмерные везикулы (LUV), включая органическое растворительное восстановление (например, обратнофазное испарение, регидратация липидных белковых пленок), механические подходы (например, соникация, френч-пресс, заморозка-оттаивание) и детергентное восстановление (через удаление, разбавление или прямое включение)18, а также более современные стратегии, такие как прямой перенос с нанодисков стирол-малеиновой кислоты19. В то время как порины успешно интегрировались в полимерные LUV путём прямой вставки, например, путем добавления белка в полимерную пленку во времярегидратации, 8. Такой подход обычно приводит к низкой эффективности вставки для более крупных или сложных мембранных белков и часто приводит к случайной ориентации белков. Таким образом, наиболее распространённым методом остаётся методом восстановления с помощью моющего средства с контролируемым добавлением моющего средства и его удалением. Это также предпочтительная стратегия для включения крупных мембранных белков в полимерные LUV, особенно для асимметричных белков, где контролируемая ориентация имеет решающее значение для функции. В этом подходе мембраны везикул сначала насыщаются выбранным детергентом (концентрация насыщающего детергента обозначается как Rsat), частично растворяются (сосуществование везикул и мицелл) или полностью растворяются, то есть расщепляются на мицеллы (концентрация детергента обозначается как Rsol). После этой мембранной обработки следует добавление белка, инкубация и удаление детергентных средств18. Последняя может быть достигнута с помощью диализа, хроматографии с исключением размера или адсорбции на гидрофобные полистироловые шарики (например, био-бусины). Выбор моющего средства, его концентрация и способ удаления оптимизируются для каждого типа мембраны и белка для максимизации эффективности внедрения и контроля ориентациибелка 20.

Хотя LUV хорошо подходят для измерения объёмной активности, исследования на одной пузырьке и анализ на основе оптической микроскопии требуют реконструкции мембранных белков в гигантские однообразные везикулы (GUV). Для включения белка в GUV используются пять основных подходов: кообразование в присутствии белка и органическогорастворителя 21, кообразование в присутствии детергента22, вставление в готовые GUV с помощью детергентногоразведения 23, вставка через мембранное слияние с протео-LUVs16,24 и термо-электроформация25. Хотя эти подходы успешно применяются к липидным GUV, их перенос в полимерные или полимерно-липидные гибридные GUV часто является сложным. В частности, методы кообразования и разведения детергента часто приводят к низкой эффективности вставки в полимерные мембраны или несовместимы с определёнными полимернымисоставами 15. Стратегии на основесинтеза 4,16,24,26,27, основанные на дополнительных фузогенных агентах, также могут представлять проблему, поскольку синтетические катионные липиды/полимеры или фузогенные пептиды могут нарушать стабильность белка мембраны, изменять свойства мембраны или снижать эффективность включения целевой белка. Термоядерное электроформирование преодолевает многие из этих ограничений и доказало свою надёжность и эффективность для включения мембранных белков в полимерные и полимерно-липидные гибридные GUV 1,5,15. Этот подход позволяет контролируемое включение белков при сохранении целостности мембраны и функциональности белка, что делает его особенно подходящим для генерации полимерных GUV, функционализированных белками.

Реконструкция протонных насосов в полимерные везикулы крайне важна для создания прочных искусственных клеток, поскольку позволяет генерировать трансмембранные протонные градиенты — фундаментальную энергетическую валюту живых систем. Воссоздавая преобразование химиосмотической энергии в контролируемой минимальной мембраннойсреде 28, эти везикулы могут стимулировать синтез АТФ, активный транспорт и метаболические реакции, создавая энергетическую основу, необходимую для автономной, живой функционирования. Одним из представителей протонного насоса, используемого в таких системах, является цитохром бо3оксидаза из E. coli — терминального респираторного фермента, который связывает восстановление кислорода с транслокацией протона через мембрану. Поскольку перенос электронов и насос протонов тесно связаны, их активность в синтетических везикулах можно количественно контролировать либо по потреблениюкислорода 1,20, либо отслеживая формирование градиентапротона 1.

В этом протоколе мы представляем подробный рабочий процесс подготовки LUV на основе PDMS-g-PEO, включая чистые полимерные и полимерно-липидные гибридные мембраны, их функционализацию с помощью мембранных белков, масштабирование до GUV, а также измерения активности восстановленной цитохром-оксидазы протонного насоса bo3 с помощью анализов объемного потребления кислорода и измерений протонного насоса с использованием одиночных пузырьков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все опасные химические отходы, образующиеся в рамках этого протокола, должны утилизироваться в соответствии с институциональными и местными нормативами.

1. Подготовка биошариков SM-2

ПРИМЕЧАНИЕ: Bio-Beads SM-2 предварительно промываются с метанолом для удаления консервантов и органических загрязнителей перед адсорбцией детергента.

  1. Положите фильтровую бумагу в стеклянную воронку, установленную над чистой стеклянной стаканом или флягой.
  2. Добавьте не менее 600 мг Bio-Beads SM-2 в воронку (достаточно для 3 повторов восстановления как для гибридных, так и для полимерных LUV).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой реконструкции требуется минимум 90 мг Bio-Beads SM-2, как указано в шаге 4.4.1. Можно подготовить большее количество вариантов, если будут запланированы новые реконструкции.
  3. Промывайте бусины три раза чистым метанолом, используя достаточный объём для полного погружения бусин.
    ВНИМАНИЕ: Выполняйте все этапы обращения с метанолом в химической вытяжке.
  4. Сразу же промой шарики три раза водой Milli-Q, чтобы удалить остатки метанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте бусинам высохнуть во время стирки. При снятии растворов для промывки убедитесь, что шарики остаются влажными и не дают полностью высохнуть.
  5. Переместите промытые шарики в подходящий контейнер для хранения (например, стерильную полипропиленовую центрифугную трубку или стеклянную бутылку с плотно закрытой крышкой), добавьте воду Milli-Q до полного погружения бусины и храните при 4 °C до 3 месяцев.

2. Флуоресцентное метирование мембранных белков.

  1. Разбавление белка
    1. Растворить цитохром bo3 оксидазу до 2,2 мг/мл в буфере HEPES 20 мм, содержащем 0,05% н-додецил β-D-мальтозид (DDM) (w/v), pH 8,3. Этот pH обеспечивает достаточную долю непротонированных (реактивных) первичных аминов для эффективной маркировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального маркировки красителями ATTO N-гидроксисукцинимидил (NHS) поддерживайте pH буфера в диапазоне от 8,3 до 8,5. Для других красителей следуйте инструкциям производителя по конъюгации белков, включая рекомендуемые условия маркировки.
  2. Добавление красителя
    1. Добавьте в белковый раствор восьмикратный молярный избыток аминреактивного эфира ATTO 643 N-гидроксисукцинимидил (NHS), растворённого в 2 мг/мл в безводном DMSO.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для других красителей следуйте инструкциям производителя по конъюгации белка, включая рекомендуемый избыток моляров красителя в белок.
    2. Аккуратно перемешивайте, постукивая по трубке микроцентрифуги три раза, чтобы обеспечить однородное распределение красителя.
  3. Инкубация
    1. Инкубировать реакционную смесь при комнатной температуре (20–25 °C) в течение 1,5 часа при мягком перемешивании (250 об/мин) в термомиксере, в темноте, чтобы предотвратить фотоотбеливание.
  4. Удаление не связанного красителя
    1. Уравновесить колонку Superdex 200 10/300 GL (CV: 23,562 мл) с как минимум двумя столбцами (примерно 48 мл) мембранного буфера элюирования белка (20 мМ HEPES, pH 7,5, 200 мМ KCl, 0,05% DDM (w/v)) при расходе 0,3 мл/мин с использованием системы очистки ÄKTA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для удаления избыточного флуоресцентного красителя обычно достаточно коротких гелевых фильтрационных колонн (длиной слоя 10–20 см), особенно для менее гидрофильных красителей. Производитель красителя рекомендует обезсоливать с помощью матрицы Sephadex G-25. В этом исследовании использовалась колонка Superdex 200 10/300 GL из-за доступности прибора.
    2. Загрузите до 500 мкл маркированного белка с помощью капиллярной петли объемом 1 мл и элюируйте тем же буфером при 0,3 мл/мин.
    3. Отслеживайте элюцию, измеряя поглощение на 280 нм для белка и 643 нм для красителя ATTO 643.
    4. Соберите 0,5 мл фракций по объёмам 1,5 столбца. Определите фракции, содержащие как белок, так и краситель. Используйте напрямую, если концентрация достаточно концентрирована, или концентрируйте с помощью центробежных фильтров Amicon. Для концентрации с помощью амикон-фильтров используйте центробежный фильтр с срезом молекулярной массы 30 кДа и центрифугу при 14 000 × г в течение 30 минут при 4 °C.
  5. Определение концентрации белка и степени маркировки (DOL)
    1. Измеряйте спектры поглощения очищенного сопряжённого вещества.
    2. Вычислите концентрацию белка и среднее количество молекул красителя на фермент с помощью следующих веществ:
      figure-protocol-1
      где A max — это поглощение сопряжённого вещества при максимальном поглощении красителя (λabs; ATTO 643, λ = 643 нм), A280 — это поглощение при 280 нм (максимум поглощения белков), εprot — молярный коэффициент вымирания денатурированной цитохрома bo3 оксидазы (184 720 М⁻1см⁻1), εкраситель — это молярный коэффициент вымирания красителя (150 000 М⁻1см⁻1), а CF280 — корректирующий фактор для поглощения ATTO 643 при 280 нм (0,04).

3. Подготовка крупных униламеллярных пузырьков (LUV)

  1. Подготовка тонкой полимерной или полимерной/липидной пленки
    1. Используйте пипетки с положительным смещением и растворительно-устойчивыми наконечниками или газонепроницаемые стеклянные шприцы для переноса растворов полимера, липидов и флуоресцентных красителей, растворённых в хлороформе:метаноле (2:1, v/v) в чистый стеклянный флакон согласно составу, указанному в Таблице 1.
      ВНИМАНИЕ: Все контакты с растворителями проводите под вытяжной вытяжкой, надевая защитные перчатки и очки безопасности.
    2. Тщательно перемешайте раствор с помощью мягкого вихря, держа флакон вертикально для обеспечения однородности.
      ВНИМАНИЕ: Аккуратно регулируйте скорость вихря, чтобы жидкость не брызгала или не выбрызгивалась из флакона на ваши руки.
    3. Испарить органические растворители под мягким струёй азота в выхлопчике примерно 1 час, пока на стенке флакона не образуется равномерная тонкая пленка (рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте поток азота так, чтобы жидкость двигалась плавно, не разбрызгиваясь; слишком высокий поток может привести к неравномерному образованию пленки. Через 5–10 минут поток можно немного увеличить, чтобы обеспечить полное высыхание и равномерное распределение смеси пузырьков по дну флакона.
  2. Плёночная регидратация
    1. Регидратировать засохшую пленку с помощью 1 мл буфера регидратации (1 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 200 мМ сахарозы) для получения конечной концентрации амфифилов 5 мг/мл (что соответствует 1,67 мМ для полимером и 2,14 мМ для гибридных везикул). Если полимеромы используются для восстановления, дополните буфер регидратации 0,1% натриевым холатом.
      ВНИМАНИЕ: Холат натрия — лёгкий раздражитель. Избегайте длительного контакта с кожей и вдыхания порошка. Обращайтесь согласно спецификации безопасности производителя (SDS).
    2. Вихрь энергично, пока плёнка полностью не отсоединится и не будет подвешена, образуя мультиламеллярные пузырьки (MLV).
  3. Циклы заморозки и оттаивания (только гибридные везикулы)
    1. Гибридные MLV суспензии подвергаются пяти циклам заморозки и оттаивания следующим образом: заморозить образцы в жидком азоте на 1 минуту, затем разморозить их в водяной бане при температуре 35 °C до полного таяния и создать вихрь при 2500–3000 об/мин в течение 30 секунд с помощью трубчатого шейкера. Повторяйте эту процедуру в общей сложности пять циклов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пропустите этот шаг для чистых полимерсом.
      ВНИМАНИЕ: Жидкий азот (−196 °C) может вызвать тяжёлые криогенные ожоги. Обращайтесь в хорошо проветриваемом помещении в подходящих СИЗ (криогенные перчатки, защитные очки и лабораторный халат). Избегайте контакта с кожей и глазами.
  4. Экструзия
    1. Перенесите подвеску везикулы на мини-экструдер, оснащённый поликарбонатной мембраной диаметром 100 нм пор.
    2. Экструдируйте подвеску 21 раз, чтобы получить однородные по размеру LUV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что последний этап экструзии оставляет подвеску LUV в шприце напротив начального загрузочного шприца. Это минимизирует загрязнение конечного образца более крупными пузырьками или остаточным материалом, который мог пройти через мембрану ещё не полностью.
  5. Хранение
    1. Храните LUV-суспензию при 4 °C и используйте её в течение недели для поддержания распределения размеров пузырьков и предотвращения агрегации или микробного роста в буфере, содержащем сахарозу.
    2. Перед использованием аккуратно униформизуйте подвеску LUV с помощью вихря.

4. Восстановление мембранного белка в LUV

  1. Предварительная обработка пузырьков моющим средством
    1. Перенесите 200 мкл LUV в микроцентрифугную трубку объёмом 2 мл (рисунок 1). При использовании гибридных LUV добавьте 1 мкл холата натрия 20% (w/v) для получения конечной концентрации детергента 0,1% (w/v). Если использовать полимерные LUV, дополнительное моющее средство не требуется, так как холат натрия уже присутствует.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте моющее средство в том же буфере, что и для экспериментов, чтобы обеспечить совместимость с везикулами.
    2. Аккуратно перемешайте, слегка постукая по трубке микроцентрифуги три раза. Избегайте сильного перемешивания или вихря, которые могут образовывать пену и появляться пузырьки воздуха.
  2. Введение белка в везикулы, обработанные детергентом
    1. Добавьте цитохром bo 3 оксидазу (для измерения активности) или цитохром bo 3 оксидазу — ATTO 643 (для флуоресцентной визуализации) к детергентно-дестабилизированным везикулам для достижения следующих конечных концентраций белка: для полимерсомов — 0,556 мкм для экспериментов с LUV и 1,112 мкм для экспериментов с GUV; для гибридных везикул — 0,714 мкм для экспериментов с LUV и 1,428 мкм для экспериментов с GUV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти концентрации соответствуют молярному соотношению белка к полимеру 1:3 000 для LUV и 1:1 500 для GUV.
    2. Добавляйте белок медленно, аккуратно перемешивая, чтобы равномерно распределить его по раствору и избежать локальной чрезмерной концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объём добавленного белка может варьироваться между фракциями из-за различий в концентрации белкового запаса.
  3. Сборка белок-детергентно-полимерных комплексов
    1. Инкубировать смесь при 4 °C в течение 30 минут с мягким перемешиванием (400 об/мин) в термомиксере, чтобы сформировать смешанные белково-детергентно-полимерные соединения перед удалением моющего средства.
  4. Удаление моющего средства
    1. Удаляйте моющее средство последовательно добавляя Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad). Удалите 30 мг биошариков из раствора для хранения, убедившись, что они остаются влажными (влажными, но без избыточной жидкости). Добавьте шарики в образец и инкубуйте 30 минут при 4 °C с мягким перемешиванием при 600 об/мин в термомиксере. Повторите этот шаг ещё два раза, в общей сложности 90 мг биошариков и общее время инкубации 1,5 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только полностью гидратированные биошарики. Не переносите сухие бусины, бусины, прилипшие к стенкам трубки Bio-Beads или бусины, плавающие на поверхности. Если шарики прилипают к стенке реконструктивной реактивной трубки выше уровня жидкости после добавления, кратковременно центрифугуйте трубку (например, 3–5 секунд в настольной миницентрифуга), чтобы собрать шарики внизу перед инкубацией.
    2. Гранулируйте биошарики центрифугой при 2000 × г в течение 2 минут с помощью мини-центрифуги. Аккуратно соберите супернатант, не трогая гранулу бусин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы центрифугированию дайте шарикам осеть под действием гравитации примерно 5 минут, затем аккуратно удалите супернатант.
  5. Хранение
    1. Храните восстановленные bo3-LUV при 4 °C и используйте их в тот же день для измерения активности белка.

5. Размер и рассеяние LUV при динамическом рассеянии света (DLS)

  1. Загрузка LUV для измерений DLS
    1. Переложите 45 мкл неразбавленной LUV или протео-LUV суспензии в чистый кварцевый кювет. Убедитесь, что на кювете нет пыли, отпечатков пальцев или других остатков, чтобы минимизировать артефакты рассеивания света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте появления пузырьков воздуха, так как они могут мешать измерениям DLS. Чтобы предотвратить появление пузырей, медленно пипетируйте образец вдоль стенки кюветки и не выталкивайте последнюю каплю сильно. Если образуются мелкие пузырьки, дайте им подняться и рассеяться перед измерением.
  2. Определение размера и расселения LUV с помощью DLS
    1. Измерьте гидродинамический диаметр и индекс полидисперсности (PDI) с помощью прибора DLS, оснащённого гелий-неоновым лазером 633 нм и детектором обратного рассеяния под фиксированным углом 173°.
    2. Проведите как минимум три независимых измерения на образец для обеспечения воспроизводимости.
    3. Анализируйте данные с помощью универсальной (нормальной модели) для получения среднего размера и PDI.

6. Анализ потребления кислорода в LUV

  1. Настройка температуры
    1. Установите измерительную камеру системы кислородных электродов типа Кларка на 22 °C и дайте системе уравновеситься.
  2. Добавление буфера
    1. Добавьте 1 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 200 мМ сахарозного буфера в измерительную камеру до общего объёма 1 000 мкл. Отрегулировать объём буфера в зависимости от типа образца: 942,9 мкл для полимерных bo3-LUV и 953,7 мкл для гибридных bo3-LUV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшийся объём будет занят LUV и смесью DTT/Q₁ для достижения конечного объёма измерения.
  3. Добавление LUV
    1. Добавьте bo3-LUV в измерительную камеру и начните аккуратно перемешивание с помощью магнитной мешалки при 100 об/мин и 22 °C. Отрегулировать объём bo3-LUV для достижения теоретической концентрации оксидазы bo3 примерно 27 нМ: 48,6 мкл для полимерных bo3-LUV и 37,8 мкл для гибридных bo3-LUV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для отрицательного контроля замените bo3-LUV на эквивалентный объём безбелковых LUV с тем же составом и концентрацией липидов/полимеров. Все последующие шаги остаются идентичными.
  4. Исходное измерение
    1. Дайте концентрации кислорода стабилизироваться и измерить в течение 3 минут при постоянном помешивании при 22 °C, чтобы получить стабильную базовую точку.
  5. Приготовление смеси восстанавливающей/хинона
    1. Свежеприготовление смеси DTT/Q₁ непосредственно перед использованием, смешав 9,6 мкл 1 М DTT в воде Milli-Q с 0,6 мкл 80 мМ убихинона-1 (Q₁) в DMSO, затем тщательно провлекайте вихрь для обеспечения однородности.
  6. Активация ферментов
    1. Активируйте оксидазуbo 3 , добавив 8,5 мкл свежеприготовленной смеси DTT/Q₁ в измерительную камеру, что приводит к итоговой концентрации 8 мМ DTT и 40 мкм Q₁.
  7. Репликаты
    1. Измерьте каждый образец три раза для обеспечения воспроизводимости.
  8. Анализ данных
    1. Сопоставьте концентрацию кислорода по сравнению со временем. Определите наклон линейной части кривой, которая соответствует скорости потребления кислорода.
  9. Репортажи
    1. Указывайте скорость потребления кислорода как среднее по трём измерениям со стандартным отклонением.

7. Подготовка белок-функционализированных GUV

  1. Плазменная очистка стеклянных стеклян с покрытием ITO
    1. Поместите стеклянные стекла, покрытые оксидом индия (ITO), в очиститель плазмы так, чтобы проводящая (покрытая ITO) сторона была направлена вверх. Плазма очищает их на 1 минуту при высокой мощности («HI») (230 В, максимальная RF мощность 18 Вт) и давлении примерно 0,5 мбар.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное зажигание плазмы можно подтвердить визуально появлением розово-фиолетового свечения внутри камеры.
  2. Частичное обезвоживание протео-LUV
    1. Смешайте 20 мкл безбелковых LUV с 20 мкл протео-LUV, содержащих восстановленную bo3 оксидазу-ATTO 643. Аккуратно прокручивайте вихрь для однородного смешивания.
    2. Нанесите семь капель по 2 мкл полученной суспензии LUV/протео-LUV с концентрацией 5 мг/мл на проводящую (покрытую ITO) поверхность каждого стекла, используемого для электроформирования (рисунок 2A). Равномерно распределяйте капли по поверхности 160,6мм 2 , разделяя их для равномерного образования пленки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для других полимерных систем концентрация LUV и объём капель могут потребовать оптимизации (типичный диапазон: 5–100 мг/мл LUV; 0,2–2 мкл капель).
    3. Дайте каплям частично обезвоженить при комнатной температуре (∼22 °C) и влажности ∼20% примерно в течение 40 минут или до образования белого кольца по периметру капли (рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обезвоживание зависит от влажности окружающей среды. Если относительная влажность выше 40%, продлевайте время обезвоживания по мере необходимости (до 20 минут). Определите конечную точку на основе появления белого кольца на периметре капли, а не по фиксированному времени. При постоянных условиях окружающей среды (температура и влажность) требуемое время обезвоживания воспроизводимо. Избегайте чрезмерного высыхания, которое проявляется в виде полностью плоских, равномерно белых капель, так как это может вызвать образование белка.
  3. Сборка камеры электроформирования
    1. Собрать электроформационную камеру путём размещения двух затворов с покрытием ITO (покрытые боковыми сторонами, направленными внутрь), разделённых силиконовой прокладкой толщиной 1,81 мм с вырезом с одной стороны, что позволяет добавлять или снимать буфер во время наполнения и сбора.
    2. Заполните камеру буфером для регидратации (1 мМ Tris-HCl, pH 7,5; сахарозы 200 мМ).
      Для экспериментов с чувствительностью к pH добавьте в буфер 10 мкм пиранина (8-гидроксипирен-1,3,6-трисульфоновая кислота-тринатриевая соль, HPTS).
  4. Электроформация
    1. Примените синусоидальное переменное электрическое поле с помощью следующей программы: 50 Гц при 50, 100, 200, 300, 500, 700 и 900 мВ по 6 минут каждая; 50 Гц при 1,1 В в течение 2 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для стимулирования формирования более крупных протео-GUV этот шаг можно увеличить до 12 ч, а 4 Гц при 2 В на 30 минут для этапа отсоединения. Когда в буфере содержится 10 мкм пиранина, увеличивайте частоту до 500 Гц на первых двух этапах повышения напряжения.
  5. Коллекция GUV
    1. Аккуратно откройте камеру с помощью пинцета и собирайте GUV с помощью пипеток FineTip Ultra-Micro Pastette (или аналогичных пипеток с низким сдвигом), чтобы минимизировать механические нагрузки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования стандартных наконечников малого объёма пипеток с объёмом ниже 200 мкл, так как они могут разорвать крупные GUV. В качестве альтернативы можно обрезать стандартные наконечники на конце, чтобы расширить отверстие и уменьшить сдвиг при сборе.
  6. Хранение
    1. Храните протео-GUV при 4 °C и используйте их в течение 48 часов для поддержания активности белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потери активности зависит от типа и стабильности восстановленного мембранного белка, а также от состава мембраны.

8. Микроскопия белок-функционализированных GUV

  1. Установка микроскопа
    1. Включите конфокальный микроскоп. Если используете систему Leica, запустите программное обеспечение LAS X. Для других брендов микроскопов используйте рекомендованное производителем программное обеспечение для приобретения.
    2. Выберите объектив масляного погружения 63× (NA 1.40); при необходимости можно увеличить или уменьшить увеличение, в зависимости от размера GUV.
    3. Откройте два визуализационных канала, соответствующих флуорофорам: Rhodamine Red (мембрана) и ATTO 643 (восстановленный белок).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для флуорофоров с частично перекрывающимися спектрами выберите подходящие лазерные линии и узкие окна обнаружения, чтобы минимизировать спектральные перекрёстные помехи. Выбирайте каждый канал последовательно, чтобы предотвратить просачивание сигнала и обеспечить точную количественную оценку флуоресценции.
  2. Осадкование GUV
    1. Поставьте силиконовый изолятор с прессом-уплотнением на чистый стеклянный слой No1.5 (толщиной 0.17 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для вертикальных (не инвертированных) микроскопов могут использоваться более толстые стеклянные стекла.
    2. Пипетта 60 мкл буфера (1 мМ Tris-HCl, pH 7,5; 200 мМ глюкозы) в центр спейсера.
    3. Аккуратно добавьте 20 мкл подвески GUV поверх буфера.
    4. Немедленно накройте камеру вторым стеклянным затвором, чтобы избежать испарения.
    5. Дайте GUV осадиться в течение ~5 минут перед снимком.
  3. Получение изображений
    1. Сосредоточьтесь на нижней части камеры для захвата сечений GUV.
    2. Получите изображения различных GUV по всей камере, систематически сканируя с верхнего левого в нижний правый угол («змеиный узор»), чтобы получить репрезентативную популяцию (~100 GUV). Снимите все везикулы, обнаруженные во время сканирования, без предварительного отбора, независимо от размера или интенсивности флуоресценции, чтобы избежать смещения отбора и обеспечить воспроизводимость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторной съёмки одного и того же GUV, чтобы предотвратить фотоотбеливание.
  4. Анализ изображений
    1. Количественно определить флуоресцентную интенсивность восстановленного белка, маркированного ATTO 643, проведя полилинию вдоль мембраны отдельных GUV. При использовании программного обеспечения LAS X выберите Quantify → Line Profile, затем выберите инструмент полилиний и обведите мембрану каждого GUV. Чтобы получить среднюю интенсивность флуоресценции, откройте Статистику и запишите среднее значение. Анализируйте только чистые, однообразные GUV; Исключить из анализа мультивезикулярные и агрегированные везикулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если измерения проводятся в разные дни, интенсивность флуоресценции должна быть нормализована до мощности лазера, измеряясь при одинаковых настройках изображения (длина волны и номинальная мощность). Для учёта ежедневных колебаний мощности лазера применяется следующая нормализация: figure-protocol-2, где Fa.u. — измеряемая интенсивность флуоресценции в произвольных единицах, P— мощность лазера, измеренная в эталонный день, а — мощность лазера, измеренная в день получения. Эта коррекция предполагает линейную зависимость между мощностью лазера и интенсивностью флуоресценции при условиях ненасыщенного освещения. В данном исследовании все изображения были получены в один и тот же день, поэтому нормализация не требовалась.
    2. Сообщите о флуоресцентной интенсивности в среднем 100 GUV с соответствующим стандартным отклонением.

9. Анализ протонной накачки в протео-GUV

  1. Установка микроскопа
    1. Включите конфокальный микроскоп и запустите соответствующее программное обеспечение для получения информации (например, LAS X для систем Leica).
    2. Выберите объектив масляного погружения 63× (NA 1.40). При необходимости можно увеличить или уменьшить увеличение, в зависимости от размера GUV.
    3. Настройте три канала визуализации, соответствующие флуорофорам. Для родамина красного (мембранный маркер) используйте возбуждение 561 нм и диапазон излучения 570–620 нм. Для пиранина (инкапсулированного pH-чувствительного красителя) используйте возбуждение на 448 нм и 405 нм и собирайте выбросы на расстоянии 499–551 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если доступен лазер 458 нм, используйте его вместо 448 нм для возбуждения депротонированной (базовой) формы пиранина.
    4. Регулируйте мощность лазера и усиление детектора, чтобы избежать насыщения пикселей и минимизировать фотоотбеливание. Сохраняйте настройки приобретения на протяжении всего эксперимента.
  2. Осадкование GUV
    1. Добавьте 280 мкл буфера (1 мМ Tris-HCl, pH 7,5; 200 мМ глюкозы) в одну скважину затвора с 8 камерами (общий объём скважины: ~874 мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте менее 200 мкл, так как объёмы ниже 200 мкл увеличивают испарение и дрейф pH. Не превышайте 400 мкл, чтобы избежать пролива и обеспечить комфортное использование пипетки. Если используете другой формат камеры, регулируйте громкость соответственно. Для инвертированных микроскопов используйте камерные затворы, совместимые с толщиной скольжения #1.5H.
    2. Аккуратно добавьте 20 мкл подвески bo3-GUV поверх буфера, не появляя воздушных пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для отрицательного контроля замените bo3-GUV суспензию на эквивалентный объём (20 мкл) безбелковых GUV с таким же липидным/полимерным составом, подготовленных и осадочных при одинаковых условиях. Этот контроль учитывает любые неспецифические эффекты DTT иQ 1 на соотношение флуоресценции пиранина, которые не зависят от активности оксидазы bo3 .
    3. Дайте GUV отложиться примерно в течение 5 минут перед визуализацией.
  3. Базовое приобретение
    1. Сосредоточьтесь на нижней плоскости камеры, где отложены GUV.
    2. Отрегулировать зум так, чтобы получить 3–6 GUV в поле зрения.
    3. Зафиксируйте исходную флуоресценцию во всех каналах за 5 минут до активации.
  4. Активация протонного насоса
    1. Приготовьте свежую смесь DTT–Q₁ непосредственно перед использованием, смешав 4,8 мкл 1 M DTT с 0,3 мкл 80 мМ Q₁ в DMSO, затем тщательно перемешайте с помощью вихря.
    2. Активируйте оксидазу цитохрома bo3 , аккуратно добавляя 2,6 мкл смеси DTT–Q₁ на поверхность раствора без введения кончика пипетки в буфер, что приводит к получению конечных концентраций примерно 8 мМ DTT и 40 мкм Q₁ в камере.
    3. Мониторинг внутривезикулярной флуоресценции пиранина в течение 30 минут при непрерывном набирании.
  5. Анализ внутривезикулярной флуоресценции пиранина
    1. Для каждого GUV определите область интереса (ROI) внутри просвета везикулы. В программном обеспечении LAS X перейдите в Quantify → Stack Profile, выберите Draw Ellipse и нарисуйте круглый ROI внутри каждого GUV.
    2. Чтобы определить среднюю интенсивность флуоресценции на расстоянии 499–551 нм для обоих длин волн возбуждения (448 нм и 405 нм), откройте в программном обеспечении раздел Statistics и запишите среднее значение.
    3. Вычислим коэффициент флуоресценции как R =I 448/I405.
    4. Постройте график отношения со временем, чтобы получить кинетические следы внутривезикулярного изменения pH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Цитохром bo 3 оксидаза E. coli экспрессировалась из плазмиды pETcyo в штаму E. coli C43 (DE3) ΔcyoABCDE и очищена, как описаноранее, 29. Очищенная оксидаза bo3 использовалась либо напрямую для измерения восстановления и активности, либо маркировалась флуоресцентными красителями, такими как ATTO 643 (это исследование) или другими красителямиATTO 1,15...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Полимеромы и гибридные везикулы полимер/липидов обладают повышенной химической и механической стабильностью по сравнению с обычными липидными везикулами, что делает их очень привлекательными для применений, таких как доставка лекарств и биосенсорирование до нано- и микрореакторов и искусственных клеток. Однако их уникальная мембранная архитектура и биофизические свойства часто препятствуют прямому переносу протоколов, оптимизированных для липидных везикул, в полимерныес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих финансовых интересах.

Благодарности

Это исследование проводилось в рамках программы Max Planck School Matter to Life, при поддержке Фонда Дитера Шварца в сотрудничестве с Обществом Макса Планка. Мы благодарны Клаудии Беднарц за выделение и очистку цитохрома bo3 оксидазы, а также Анне Кристин Вайнрих за помощь в подготовке пузырьков и микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

```html
Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ÄKTA pure™ chromatography systemCytiva29018224
18:1 Liss Rhod PEAvanti Research810150
8 well chambered coverglassCellvisC8-1.5H-N
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal FiltersSigma AldrichUFC5030
ATTO 643 NHS esterATTO-TECAD 643-31
Bio-Beads SM-2Bio-Rad1523920
Cholic acid-Na-salt (sodium cholate)Serva361-09-1
Coenzyme Q1TargetMolTGM-T19594
Confocal microscope STELLARIS 5Leica Microsystems603810
DTT (Dithiothreitol)Merck10197777001
Fine Tip Ultra Micro PastettePastetteLW4243
HPTS (pyranine, 8-Hydroxypyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid, Trisodium Salt) Sigma Aldrich6358-69-6
ITO-coated glass slides (25×75×1.1 mm, ≤20 Ohm/sq.)pgoCEC020S
LAS X softwareLeicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Mini centrifuge MCF-2360LMS24572
Mini-extruderAvanti Research610000
Oxytherm+P systemHansatech Instruments/
Plasma cleaner (benchtop)Harrick PlasmaPDC-32G-2
Polycarbonate membranes 0.1 μmAvanti Research610005
Press-to-seal silicone isolator (round, 20 mm diameter, 1 mm depth)Grace Bio-Labs 41161502
Silicone spacers (round, 24.2 mm outer diameter, 14.3 mm inner diameter, 1.8 mm depth)сделанные в лаборатории, вырезанные из силикона
Soy PC (95%)Avanti Research441601
Specord 50 PLUS spectrophotometerAnalytik Jena823-0200P-3
Superdex 200 10/300 GL column (column L × I.D. 30 cm × 10 mm)Cytiva28-9909-44
Test tube shaker (2800 rpm)IKA Lab Dancer3365000
Thermomixer comfort 5355Eppendorf5355000.011
Xiameter OFX-5329 (PDMS-g-PEO; MW 3000)Dow Corning000000000004109892
Zetasizer Nano ZS Malvern PanalyticalZEN3600
```

Ссылки

  1. Marušič N, et al. Constructing artificial respiratory chain in polymer compartments: Insights into the interplay between bo3 oxidase and the membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117(26):15006-17.
  2. Bermudez H, Brannan AK, Hammer DA, Bates FS, Discher DE. Molecular Weight Dependence of Polymersome Membrane Structure, Elasticity, and Stability. Macromolecules. 2002;35(21):8203-8.
  3. Otrin L, et al. Toward Artificial Mitochondrion: Mimicking Oxidative Phosphorylation in Polymer and Hybrid Membranes. Nano Lett. 2017;17(11):6816-21.
  4. Otrin L, et al. En route to dynamic life processes by SNARE-mediated fusion of polymer and hybrid membranes. Nat Commun. 2021;12(1):4972.
  5. Itel F, Najer A, Palivan CG, Meier W. Dynamics of Membrane Proteins within Synthetic Polymer Membranes with Large Hydrophobic Mismatch. Nano Lett. 2015;15(6):3871-8.
  6. Goers R, et al. Optimized reconstitution of membrane proteins into synthetic membranes. Commun Chem. 2018;1(1):35.
  7. Nardin C, Thoeni S, Widmer J, Winterhalter M, Meier W. Nanoreactors based on (polymerized) ABA-triblock copolymer vesicles. Chem Commun. 2000;(15):1433-4.
  8. Einfalt T, et al. Stimuli-Triggered Activity of Nanoreactors by Biomimetic Engineering Polymer Membranes. Nano Lett. 2015;15(11):7596-603.
  9. Ranquin A, Versées W, Meier W, Steyaert J, Van Gelder P. Therapeutic Nanoreactors:  Combining Chemistry and Biology in a Novel Triblock Copolymer Drug Delivery System. Nano Lett. 2005;5(11):2220-4.
  10. Ihle S, et al. Nanocompartments with a pH release system based on an engineered OmpF channel protein. Soft Matter. 2011;7(2):532-9.
  11. Kumar M, et al. Highly permeable polymeric membranes based on the incorporation of the functional water channel protein Aquaporin Z. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(52):20719-20724.
  12. Choi HJ, Montemagno CD. Artificial Organelle: ATP Synthesis from Cellular Mimetic Polymersomes. Nano Lett. 2005;5(12):2538-42.
  13. Khan S,et al. Durable proteo-hybrid vesicles for the extended functional lifetime of membrane proteins in bionanotechnology. Chem Commun. 2016;52(73):11020-3.
  14. Kleineberg C, et al. Light-Driven ATP Regeneration in Diblock/Grafted Hybrid Vesicles. Chembiochem. 2020;21(15):2149-60.
  15. Otrin N, et al. Protein-Rich Rafts in Hybrid Polymer/Lipid Giant Unilamellar Vesicles. Biomacromolecules. 2024;25(2):778-91.
  16. Marušič N, et al. Increased efficiency of charge-mediated fusion in polymer/lipid hybrid membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022;119(20):e2122468119.
  17. Marušič N,et al. Fusion-Induced Growth of Biomimetic Polymersomes: Behavior of Poly(dimethylsiloxane)-Poly(ethylene oxide) Vesicles in Saline Solutions Under High Agitation. Macromol Rapid Commun. 2022;43(5):2100712.
  18. Rigaud JL, Pitard B, Levy D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta. 1995;1231(3):223-46.
  19. Catania R,et al. Detergent-Free Functionalization of Hybrid Vesicles with Membrane Proteins Using SMALPs. Macromolecules. 2022;55(9):3415-22.
  20. Otrin L. Bottom-up construction of the artificial mitochondrion [dissertation]. Magdeburg: Otto-von-Guericke-University; 2021.
  21. Manneville JB, Bassereau P, Ramaswamy S, Prost J. Active membrane fluctuations studied by micropipet aspiration. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 2001;64(2 Pt 1):021908.
  22. Dezi M, Di Cicco A, Bassereau P, Lévy D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(18):7276-81.
  23. Sjoholm J, et al. The lateral distance between a proton pump and ATP synthase determines the ATP-synthesis rate. Sci Rep. 2017;7(1):2926.
  24. Biner O, Schick T, Muller Y, von Ballmoos C. Delivery of membrane proteins into small and giant unilamellar vesicles by charge-mediated fusion. FEBS Lett. 2016;590(14):2051-62.
  25. Girard P,et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 2004;87(1):419-29.
  26. Nordlund G, Brzezinski P, von Ballmoos C. SNARE-fusion mediated insertion of membrane proteins into native and artificial membranes. Nat Commun. 2014;5(1):4303.
  27. Otrin N. A Modular Platform for Growth of Hybrid and Polymer Membrane Systems by Vesicle Fusion [dissertation]. Magdeburg: Otto-von-Guericke-University; 2022.
  28. Otrin L, et al. Artificial Organelles for Energy Regeneration. Adv Biosyst. 2019;3(6):1800323.
  29. Frericks HL, Zhou DH, Yap LL, Gennis RB, Rienstra CM. Magic-angle spinning solid-state NMR of a 144 kDa membrane protein complex: E. coli cytochrome bo3 oxidase. J Biomol NMR. 2006;36(1):55-71.
  30. Seneviratne R, et al. A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability. Methods. 2018;147:142-9.
  31. Aimon S,et al. Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles. PLoS One. 2011;6(10):e25529.
  32. Dolder N, Müller P, von Ballmoos C. Experimental platform for the functional investigation of membrane proteins in giant unilamellar vesicles. Soft Matter. 2022;18(31):5877-93.
  33. Zhao Z,et al. Super-Resolution Imaging of Highly Curved Membrane Structures in Giant Vesicles Encapsulating Molecular Condensates. AdvMater. 2022;34(4):2106633.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

234234PDMS g PEOLUVGUV

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.