Подготовка мембранных белков-функционализированных полимеров и полимер/липидных гибридов крупных и гигантских униламеллярных везикул.

Краткое содержание

Этот протокол демонстрирует реформирование мембранного белка, цитохрома bo3 убихинолоксидазы, опосредованного детергентом, в крупные униламеллярные везикулы, состоящие из PDMS-g-PEO, и их превращение в гигантские везикулы посредством термоядерного электроформирования. Полученные функциональные полимерные компартменты подходят для передовых биохимических и биофизических исследований.

Аннотация

Везикулы, образованные из амфифильных сополимеров, отдельно или смешанных с фосфолипидами, обеспечивают лучшую механическую и химическую стабильность по сравнению с обычными липидными везикулами. Это делает их привлекательным корпусом, который можно дальше развивать и расширять для реализации конкретных применений, таких как доставка лекарств, диагностическое биосенсорирование, создание искусственных клеток и биовдохновлённые микро- и нанореакторы. В частности, функционализация через включение мембранных белков важна для многих из этих приложений. Здесь мы представляем протокол подготовки мембранных белков функционализированных крупных униламеллярных везикул (LUVs) из трансплантатного сополимера PDMS-g-PEO посредством детергентной реконструкции. Кроме того, мы описываем, как эти крупные везикулы могут быть преобразованы в гигантские униламеллярные везикулы (GUV) с помощью метода термоядерного синтеза и электроформирования. Протокол охватывает флуоресцентную маркировку мембранных белков, приготовление полимерных и гибридных LUV, восстановление мембранных белков, анализ распределения размеров с помощью динамического рассеяния света (DLS), оценку активности белка с помощью измерений потребления кислорода, подготовку функционализированных белковыми GUV и анализ активности ввода белков и протонной накачки в GUV с помощью конфокальной микроскопии. Репрезентативные результаты демонстрируют формирование монодисперсных протео-ЛУП с индексом полидисперсности (PDI) ниже 0,2 и успешное получение протео-ГУВов диаметром от 5 до 35 мкм. Активность белка подтверждается измерениями потребления кислорода как в полимерных LUV (18,2 нмоль/мин/мл), так и в гибридных LUV (26,9 нмоль/мин/мл). Вставка белка в GUV измеряется с помощью флуоресцентной интенсивности, что даёт 20,6 ± 3,7 a.u. для полимерных GUV и 26,2 ± 5.0 a.u. для гибридных GUV. Активность протонного насоса в GUV, контролируемая с помощью инкапсулированного pH-чувствительного красителя, соответствует белковой функциональности, при этом доминирует внутренний протонный насос. Механическая мягкость сополимера и липидноподобная толщина бислоя (~5,3 нм) обеспечивают эффективное введение белков и сохранение функциональности.

Введение

Амфифильные блочные сополимеры могут самособираться в водном растворе в мембраны, которые спонтанно изгибаются и замыкаются друг с другом, образуя сферические мембранные компартменты, известные как полимеромы (полимерные везикулы). По сравнению с липидными мембранами, полимерные компартменты обеспечивают повышенную химическую универсальность и повышенную^{химическую стабильность 1} и^{механическую стабильность 2}, что делает их очень привлекательными для таких применений, как доставка лекарств, нано- и микрореакторы, а также создание прочных искусственных ячеек. И наша группа, и другие функционализировали полимерные мембраны, вставляя мембранные белки для создания искусственных органелл и^{клеток 1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}. Полимеры, содержащие гидрофобное ядро поли(диметилсилоксан) (PDMS), особенно хорошо подходят для интеграции мембранных белков благодаря высокой гибкости цепочек и возможности настроить гидрофобную толщину мембраны для лучшего соответствия трансмембранному^{домену белка 5}. В то время как наша лаборатория в основном сосредоточилась на сополимере трансплантата поли(диметилсилоксан)-графт-поли(этиленоксид) (PDMS-g-PEO), который образует высокодинамические ^{мембраны 4,16,17}, мягче обычных липидных билейров и имеющих толщину примерно 5,3^нм1, другие группы успешно применяли триблоковые сополимеры на основе PDMS, такие как PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA^5,6,7,8,9,10,11 и PEtOz-b-PDMS-b-PEtOz¹² для восстановления мембранного белка. Даже сравнительно жёсткие диблок-сополимеры, такие как PBD-b-PEO, особенно в гибридных системах, смешанных с липидами, были использованы для успешного включения^{белков 13}. Эти примеры подчёркивают универсальность полимерных мембран как платформ восстановления, которые также могут обеспечить повышенную химическую^{стабильность 1} и продление функционального срока службы¹⁴ для встроенных мембранных белков. Хотя гибридные полимерно-липидные мембраны не всегда соответствуют химической стабильности чистых^{полимерных систем 1}, они предлагают привлекательный компромисс, сочетая механическую прочность полимеров с биологической значимостью липидов. Это приводит к созданию среды мембраны, которая более близко имитирует нативные биологические мембраны, сохраняя при этом ключевые преимущества синтетических материалов. Такие гибридные архитектуры могут предлагать дополнительные преимущества, включая снижение протонной проницаемости в результате наномасштабного^{перестройки 1} и формирования доменов внутри^{мембраны 15}.

Существует несколько методов реконструкции мембранных белков в наноразмерные везикулы (LUV), включая органическое растворительное восстановление (например, обратнофазное испарение, регидратация липидных белковых пленок), механические подходы (например, соникация, френч-пресс, заморозка-оттаивание) и детергентное восстановление (через удаление, разбавление или прямое включение)¹⁸, а также более современные стратегии, такие как прямой перенос с нанодисков стирол-малеиновой кислоты¹⁹. В то время как порины успешно интегрировались в полимерные LUV путём прямой вставки, например, путем добавления белка в полимерную пленку во время^{регидратации, 8}. Такой подход обычно приводит к низкой эффективности вставки для более крупных или сложных мембранных белков и часто приводит к случайной ориентации белков. Таким образом, наиболее распространённым методом остаётся методом восстановления с помощью моющего средства с контролируемым добавлением моющего средства и его удалением. Это также предпочтительная стратегия для включения крупных мембранных белков в полимерные LUV, особенно для асимметричных белков, где контролируемая ориентация имеет решающее значение для функции. В этом подходе мембраны везикул сначала насыщаются выбранным детергентом (концентрация насыщающего детергента обозначается как R_sat), частично растворяются (сосуществование везикул и мицелл) или полностью растворяются, то есть расщепляются на мицеллы (концентрация детергента обозначается как R_sol). После этой мембранной обработки следует добавление белка, инкубация и удаление детергентных средств¹⁸. Последняя может быть достигнута с помощью диализа, хроматографии с исключением размера или адсорбции на гидрофобные полистироловые шарики (например, био-бусины). Выбор моющего средства, его концентрация и способ удаления оптимизируются для каждого типа мембраны и белка для максимизации эффективности внедрения и контроля ориентации^{белка 20}.

Хотя LUV хорошо подходят для измерения объёмной активности, исследования на одной пузырьке и анализ на основе оптической микроскопии требуют реконструкции мембранных белков в гигантские однообразные везикулы (GUV). Для включения белка в GUV используются пять основных подходов: кообразование в присутствии белка и органического^{растворителя 21}, кообразование в присутствии детергента²², вставление в готовые GUV с помощью детергентного^{разведения 23}, вставка через мембранное слияние с протео-LUVs^16,24 и термо-электроформация²⁵. Хотя эти подходы успешно применяются к липидным GUV, их перенос в полимерные или полимерно-липидные гибридные GUV часто является сложным. В частности, методы кообразования и разведения детергента часто приводят к низкой эффективности вставки в полимерные мембраны или несовместимы с определёнными полимерными^{составами 15}. Стратегии на основе^{синтеза} 4,16,24,26,27, основанные на дополнительных фузогенных агентах, также могут представлять проблему, поскольку синтетические катионные липиды/полимеры или фузогенные пептиды могут нарушать стабильность белка мембраны, изменять свойства мембраны или снижать эффективность включения целевой белка. Термоядерное электроформирование преодолевает многие из этих ограничений и доказало свою надёжность и эффективность для включения мембранных белков в полимерные и полимерно-липидные гибридные GUV ^1,5,15. Этот подход позволяет контролируемое включение белков при сохранении целостности мембраны и функциональности белка, что делает его особенно подходящим для генерации полимерных GUV, функционализированных белками.

Реконструкция протонных насосов в полимерные везикулы крайне важна для создания прочных искусственных клеток, поскольку позволяет генерировать трансмембранные протонные градиенты — фундаментальную энергетическую валюту живых систем. Воссоздавая преобразование химиосмотической энергии в контролируемой минимальной мембранной^{среде 28}, эти везикулы могут стимулировать синтез АТФ, активный транспорт и метаболические реакции, создавая энергетическую основу, необходимую для автономной, живой функционирования. Одним из представителей протонного насоса, используемого в таких системах, является цитохром _{бо3оксидаза} из E. coli — терминального респираторного фермента, который связывает восстановление кислорода с транслокацией протона через мембрану. Поскольку перенос электронов и насос протонов тесно связаны, их активность в синтетических везикулах можно количественно контролировать либо по потреблению^{кислорода 1,20}, либо отслеживая формирование градиента^{протона 1}.

В этом протоколе мы представляем подробный рабочий процесс подготовки LUV на основе PDMS-g-PEO, включая чистые полимерные и полимерно-липидные гибридные мембраны, их функционализацию с помощью мембранных белков, масштабирование до GUV, а также измерения активности восстановленной цитохром-оксидазы протонного насоса bo₃ с помощью анализов объемного потребления кислорода и измерений протонного насоса с использованием одиночных пузырьков.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все опасные химические отходы, образующиеся в рамках этого протокола, должны утилизироваться в соответствии с институциональными и местными нормативами.

1. Подготовка биошариков SM-2

ПРИМЕЧАНИЕ: Bio-Beads SM-2 предварительно промываются с метанолом для удаления консервантов и органических загрязнителей перед адсорбцией детергента.

1. Положите фильтровую бумагу в стеклянную воронку, установленную над чистой стеклянной стаканом или флягой.
2. Добавьте не менее 600 мг Bio-Beads SM-2 в воронку (достаточно для 3 повторов восстановления как для гибридных, так и для полимерных LUV).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой реконструкции требуется минимум 90 мг Bio-Beads SM-2, как указано в шаге 4.4.1. Можно подготовить большее количество вариантов, если будут запланированы новые реконструкции.
3. Промывайте бусины три раза чистым метанолом, используя достаточный объём для полного погружения бусин.
   ВНИМАНИЕ: Выполняйте все этапы обращения с метанолом в химической вытяжке.
4. Сразу же промой шарики три раза водой Milli-Q, чтобы удалить остатки метанола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте бусинам высохнуть во время стирки. При снятии растворов для промывки убедитесь, что шарики остаются влажными и не дают полностью высохнуть.
5. Переместите промытые шарики в подходящий контейнер для хранения (например, стерильную полипропиленовую центрифугную трубку или стеклянную бутылку с плотно закрытой крышкой), добавьте воду Milli-Q до полного погружения бусины и храните при 4 °C до 3 месяцев.

2. Флуоресцентное метирование мембранных белков.

1. Разбавление белка
   1. Растворить цитохром bo₃ оксидазу до 2,2 мг/мл в буфере HEPES 20 мм, содержащем 0,05% н-додецил β-D-мальтозид (DDM) (w/v), pH 8,3. Этот pH обеспечивает достаточную долю непротонированных (реактивных) первичных аминов для эффективной маркировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального маркировки красителями ATTO N-гидроксисукцинимидил (NHS) поддерживайте pH буфера в диапазоне от 8,3 до 8,5. Для других красителей следуйте инструкциям производителя по конъюгации белков, включая рекомендуемые условия маркировки.
2. Добавление красителя
   1. Добавьте в белковый раствор восьмикратный молярный избыток аминреактивного эфира ATTO 643 N-гидроксисукцинимидил (NHS), растворённого в 2 мг/мл в безводном DMSO.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для других красителей следуйте инструкциям производителя по конъюгации белка, включая рекомендуемый избыток моляров красителя в белок.
   2. Аккуратно перемешивайте, постукивая по трубке микроцентрифуги три раза, чтобы обеспечить однородное распределение красителя.
3. Инкубация
   1. Инкубировать реакционную смесь при комнатной температуре (20–25 °C) в течение 1,5 часа при мягком перемешивании (250 об/мин) в термомиксере, в темноте, чтобы предотвратить фотоотбеливание.
4. Удаление не связанного красителя
   1. Уравновесить колонку Superdex 200 10/300 GL (CV: 23,562 мл) с как минимум двумя столбцами (примерно 48 мл) мембранного буфера элюирования белка (20 мМ HEPES, pH 7,5, 200 мМ KCl, 0,05% DDM (w/v)) при расходе 0,3 мл/мин с использованием системы очистки ÄKTA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для удаления избыточного флуоресцентного красителя обычно достаточно коротких гелевых фильтрационных колонн (длиной слоя 10–20 см), особенно для менее гидрофильных красителей. Производитель красителя рекомендует обезсоливать с помощью матрицы Sephadex G-25. В этом исследовании использовалась колонка Superdex 200 10/300 GL из-за доступности прибора.
   2. Загрузите до 500 мкл маркированного белка с помощью капиллярной петли объемом 1 мл и элюируйте тем же буфером при 0,3 мл/мин.
   3. Отслеживайте элюцию, измеряя поглощение на 280 нм для белка и 643 нм для красителя ATTO 643.
   4. Соберите 0,5 мл фракций по объёмам 1,5 столбца. Определите фракции, содержащие как белок, так и краситель. Используйте напрямую, если концентрация достаточно концентрирована, или концентрируйте с помощью центробежных фильтров Amicon. Для концентрации с помощью амикон-фильтров используйте центробежный фильтр с срезом молекулярной массы 30 кДа и центрифугу при 14 000 × г в течение 30 минут при 4 °C.
5. Определение концентрации белка и степени маркировки (DOL)
   1. Измеряйте спектры поглощения очищенного сопряжённого вещества.
   2. Вычислите концентрацию белка и среднее количество молекул красителя на фермент с помощью следующих веществ:
      
      где _{A max} — это поглощение сопряжённого вещества при максимальном поглощении красителя (λ_abs; ATTO 643, λ = 643 нм), A₂₈₀ — это поглощение при 280 нм (максимум поглощения белков), ε_prot — молярный коэффициент вымирания денатурированной цитохрома bo₃ оксидазы (184 720 М⁻¹см⁻¹), ε_{краситель} — это молярный коэффициент вымирания красителя (150 000 М⁻¹см⁻¹), а CF₂₈₀ — корректирующий фактор для поглощения ATTO 643 при 280 нм (0,04).

3. Подготовка крупных униламеллярных пузырьков (LUV)

1. Подготовка тонкой полимерной или полимерной/липидной пленки
   1. Используйте пипетки с положительным смещением и растворительно-устойчивыми наконечниками или газонепроницаемые стеклянные шприцы для переноса растворов полимера, липидов и флуоресцентных красителей, растворённых в хлороформе:метаноле (2:1, v/v) в чистый стеклянный флакон согласно составу, указанному в Таблице 1.
      ВНИМАНИЕ: Все контакты с растворителями проводите под вытяжной вытяжкой, надевая защитные перчатки и очки безопасности.
   2. Тщательно перемешайте раствор с помощью мягкого вихря, держа флакон вертикально для обеспечения однородности.
      ВНИМАНИЕ: Аккуратно регулируйте скорость вихря, чтобы жидкость не брызгала или не выбрызгивалась из флакона на ваши руки.
   3. Испарить органические растворители под мягким струёй азота в выхлопчике примерно 1 час, пока на стенке флакона не образуется равномерная тонкая пленка (рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте поток азота так, чтобы жидкость двигалась плавно, не разбрызгиваясь; слишком высокий поток может привести к неравномерному образованию пленки. Через 5–10 минут поток можно немного увеличить, чтобы обеспечить полное высыхание и равномерное распределение смеси пузырьков по дну флакона.
2. Плёночная регидратация
   1. Регидратировать засохшую пленку с помощью 1 мл буфера регидратации (1 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 200 мМ сахарозы) для получения конечной концентрации амфифилов 5 мг/мл (что соответствует 1,67 мМ для полимером и 2,14 мМ для гибридных везикул). Если полимеромы используются для восстановления, дополните буфер регидратации 0,1% натриевым холатом.
      ВНИМАНИЕ: Холат натрия — лёгкий раздражитель. Избегайте длительного контакта с кожей и вдыхания порошка. Обращайтесь согласно спецификации безопасности производителя (SDS).
   2. Вихрь энергично, пока плёнка полностью не отсоединится и не будет подвешена, образуя мультиламеллярные пузырьки (MLV).
3. Циклы заморозки и оттаивания (только гибридные везикулы)
   1. Гибридные MLV суспензии подвергаются пяти циклам заморозки и оттаивания следующим образом: заморозить образцы в жидком азоте на 1 минуту, затем разморозить их в водяной бане при температуре 35 °C до полного таяния и создать вихрь при 2500–3000 об/мин в течение 30 секунд с помощью трубчатого шейкера. Повторяйте эту процедуру в общей сложности пять циклов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пропустите этот шаг для чистых полимерсом.
      ВНИМАНИЕ: Жидкий азот (−196 °C) может вызвать тяжёлые криогенные ожоги. Обращайтесь в хорошо проветриваемом помещении в подходящих СИЗ (криогенные перчатки, защитные очки и лабораторный халат). Избегайте контакта с кожей и глазами.
4. Экструзия
   1. Перенесите подвеску везикулы на мини-экструдер, оснащённый поликарбонатной мембраной диаметром 100 нм пор.
   2. Экструдируйте подвеску 21 раз, чтобы получить однородные по размеру LUV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что последний этап экструзии оставляет подвеску LUV в шприце напротив начального загрузочного шприца. Это минимизирует загрязнение конечного образца более крупными пузырьками или остаточным материалом, который мог пройти через мембрану ещё не полностью.
5. Хранение
   1. Храните LUV-суспензию при 4 °C и используйте её в течение недели для поддержания распределения размеров пузырьков и предотвращения агрегации или микробного роста в буфере, содержащем сахарозу.
   2. Перед использованием аккуратно униформизуйте подвеску LUV с помощью вихря.

4. Восстановление мембранного белка в LUV

1. Предварительная обработка пузырьков моющим средством
   1. Перенесите 200 мкл LUV в микроцентрифугную трубку объёмом 2 мл (рисунок 1). При использовании гибридных LUV добавьте 1 мкл холата натрия 20% (w/v) для получения конечной концентрации детергента 0,1% (w/v). Если использовать полимерные LUV, дополнительное моющее средство не требуется, так как холат натрия уже присутствует.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте моющее средство в том же буфере, что и для экспериментов, чтобы обеспечить совместимость с везикулами.
   2. Аккуратно перемешайте, слегка постукая по трубке микроцентрифуги три раза. Избегайте сильного перемешивания или вихря, которые могут образовывать пену и появляться пузырьки воздуха.
2. Введение белка в везикулы, обработанные детергентом
   1. Добавьте цитохром bo 3 оксидазу (для измерения активности) или цитохром bo 3 оксидазу — ATTO 643 (для флуоресцентной визуализации) к детергентно-дестабилизированным везикулам для достижения следующих конечных концентраций белка: для полимерсомов — 0,556 мкм для экспериментов с LUV и 1,112 мкм для экспериментов с GUV; для гибридных везикул — 0,714 мкм для экспериментов с LUV и 1,428 мкм для экспериментов с GUV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти концентрации соответствуют молярному соотношению белка к полимеру 1:3 000 для LUV и 1:1 500 для GUV.
   2. Добавляйте белок медленно, аккуратно перемешивая, чтобы равномерно распределить его по раствору и избежать локальной чрезмерной концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объём добавленного белка может варьироваться между фракциями из-за различий в концентрации белкового запаса.
3. Сборка белок-детергентно-полимерных комплексов
   1. Инкубировать смесь при 4 °C в течение 30 минут с мягким перемешиванием (400 об/мин) в термомиксере, чтобы сформировать смешанные белково-детергентно-полимерные соединения перед удалением моющего средства.
4. Удаление моющего средства
   1. Удаляйте моющее средство последовательно добавляя Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad). Удалите 30 мг биошариков из раствора для хранения, убедившись, что они остаются влажными (влажными, но без избыточной жидкости). Добавьте шарики в образец и инкубуйте 30 минут при 4 °C с мягким перемешиванием при 600 об/мин в термомиксере. Повторите этот шаг ещё два раза, в общей сложности 90 мг биошариков и общее время инкубации 1,5 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только полностью гидратированные биошарики. Не переносите сухие бусины, бусины, прилипшие к стенкам трубки Bio-Beads или бусины, плавающие на поверхности. Если шарики прилипают к стенке реконструктивной реактивной трубки выше уровня жидкости после добавления, кратковременно центрифугуйте трубку (например, 3–5 секунд в настольной миницентрифуга), чтобы собрать шарики внизу перед инкубацией.
   2. Гранулируйте биошарики центрифугой при 2000 × г в течение 2 минут с помощью мини-центрифуги. Аккуратно соберите супернатант, не трогая гранулу бусин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы центрифугированию дайте шарикам осеть под действием гравитации примерно 5 минут, затем аккуратно удалите супернатант.
5. Хранение
   1. Храните восстановленные bo_3-LUV при 4 °C и используйте их в тот же день для измерения активности белка.

5. Размер и рассеяние LUV при динамическом рассеянии света (DLS)

1. Загрузка LUV для измерений DLS
   1. Переложите 45 мкл неразбавленной LUV или протео-LUV суспензии в чистый кварцевый кювет. Убедитесь, что на кювете нет пыли, отпечатков пальцев или других остатков, чтобы минимизировать артефакты рассеивания света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте появления пузырьков воздуха, так как они могут мешать измерениям DLS. Чтобы предотвратить появление пузырей, медленно пипетируйте образец вдоль стенки кюветки и не выталкивайте последнюю каплю сильно. Если образуются мелкие пузырьки, дайте им подняться и рассеяться перед измерением.
2. Определение размера и расселения LUV с помощью DLS
   1. Измерьте гидродинамический диаметр и индекс полидисперсности (PDI) с помощью прибора DLS, оснащённого гелий-неоновым лазером 633 нм и детектором обратного рассеяния под фиксированным углом 173°.
   2. Проведите как минимум три независимых измерения на образец для обеспечения воспроизводимости.
   3. Анализируйте данные с помощью универсальной (нормальной модели) для получения среднего размера и PDI.

6. Анализ потребления кислорода в LUV

1. Настройка температуры
   1. Установите измерительную камеру системы кислородных электродов типа Кларка на 22 °C и дайте системе уравновеситься.
2. Добавление буфера
   1. Добавьте 1 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 200 мМ сахарозного буфера в измерительную камеру до общего объёма 1 000 мкл. Отрегулировать объём буфера в зависимости от типа образца: 942,9 мкл для полимерных bo_3-LUV и 953,7 мкл для гибридных bo_3-LUV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшийся объём будет занят LUV и смесью DTT/Q₁ для достижения конечного объёма измерения.
3. Добавление LUV
   1. Добавьте bo_3-LUV в измерительную камеру и начните аккуратно перемешивание с помощью магнитной мешалки при 100 об/мин и 22 °C. Отрегулировать объём bo_3-LUV для достижения теоретической концентрации оксидазы bo₃ примерно 27 нМ: 48,6 мкл для полимерных bo_3-LUV и 37,8 мкл для гибридных bo_3-LUV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для отрицательного контроля замените bo_3-LUV на эквивалентный объём безбелковых LUV с тем же составом и концентрацией липидов/полимеров. Все последующие шаги остаются идентичными.
4. Исходное измерение
   1. Дайте концентрации кислорода стабилизироваться и измерить в течение 3 минут при постоянном помешивании при 22 °C, чтобы получить стабильную базовую точку.
5. Приготовление смеси восстанавливающей/хинона
   1. Свежеприготовление смеси DTT/Q₁ непосредственно перед использованием, смешав 9,6 мкл 1 М DTT в воде Milli-Q с 0,6 мкл 80 мМ убихинона-1 (Q₁) в DMSO, затем тщательно провлекайте вихрь для обеспечения однородности.
6. Активация ферментов
   1. Активируйте оксидазу_{bo 3} , добавив 8,5 мкл свежеприготовленной смеси DTT/Q₁ в измерительную камеру, что приводит к итоговой концентрации 8 мМ DTT и 40 мкм Q₁.
7. Репликаты
   1. Измерьте каждый образец три раза для обеспечения воспроизводимости.
8. Анализ данных
   1. Сопоставьте концентрацию кислорода по сравнению со временем. Определите наклон линейной части кривой, которая соответствует скорости потребления кислорода.
9. Репортажи
   1. Указывайте скорость потребления кислорода как среднее по трём измерениям со стандартным отклонением.

7. Подготовка белок-функционализированных GUV

1. Плазменная очистка стеклянных стеклян с покрытием ITO
   1. Поместите стеклянные стекла, покрытые оксидом индия (ITO), в очиститель плазмы так, чтобы проводящая (покрытая ITO) сторона была направлена вверх. Плазма очищает их на 1 минуту при высокой мощности («HI») (230 В, максимальная RF мощность 18 Вт) и давлении примерно 0,5 мбар.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное зажигание плазмы можно подтвердить визуально появлением розово-фиолетового свечения внутри камеры.
2. Частичное обезвоживание протео-LUV
   1. Смешайте 20 мкл безбелковых LUV с 20 мкл протео-LUV, содержащих восстановленную _bo3 оксидазу-ATTO 643. Аккуратно прокручивайте вихрь для однородного смешивания.
   2. Нанесите семь капель по 2 мкл полученной суспензии LUV/протео-LUV с концентрацией 5 мг/мл на проводящую (покрытую ITO) поверхность каждого стекла, используемого для электроформирования (рисунок 2A). Равномерно распределяйте капли по поверхности 160,6^{мм 2} , разделяя их для равномерного образования пленки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для других полимерных систем концентрация LUV и объём капель могут потребовать оптимизации (типичный диапазон: 5–100 мг/мл LUV; 0,2–2 мкл капель).
   3. Дайте каплям частично обезвоженить при комнатной температуре (∼22 °C) и влажности ∼20% примерно в течение 40 минут или до образования белого кольца по периметру капли (рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обезвоживание зависит от влажности окружающей среды. Если относительная влажность выше 40%, продлевайте время обезвоживания по мере необходимости (до 20 минут). Определите конечную точку на основе появления белого кольца на периметре капли, а не по фиксированному времени. При постоянных условиях окружающей среды (температура и влажность) требуемое время обезвоживания воспроизводимо. Избегайте чрезмерного высыхания, которое проявляется в виде полностью плоских, равномерно белых капель, так как это может вызвать образование белка.
3. Сборка камеры электроформирования
   1. Собрать электроформационную камеру путём размещения двух затворов с покрытием ITO (покрытые боковыми сторонами, направленными внутрь), разделённых силиконовой прокладкой толщиной 1,81 мм с вырезом с одной стороны, что позволяет добавлять или снимать буфер во время наполнения и сбора.
   2. Заполните камеру буфером для регидратации (1 мМ Tris-HCl, pH 7,5; сахарозы 200 мМ).
      Для экспериментов с чувствительностью к pH добавьте в буфер 10 мкм пиранина (8-гидроксипирен-1,3,6-трисульфоновая кислота-тринатриевая соль, HPTS).
4. Электроформация
   1. Примените синусоидальное переменное электрическое поле с помощью следующей программы: 50 Гц при 50, 100, 200, 300, 500, 700 и 900 мВ по 6 минут каждая; 50 Гц при 1,1 В в течение 2 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для стимулирования формирования более крупных протео-GUV этот шаг можно увеличить до 12 ч, а 4 Гц при 2 В на 30 минут для этапа отсоединения. Когда в буфере содержится 10 мкм пиранина, увеличивайте частоту до 500 Гц на первых двух этапах повышения напряжения.
5. Коллекция GUV
   1. Аккуратно откройте камеру с помощью пинцета и собирайте GUV с помощью пипеток FineTip Ultra-Micro Pastette (или аналогичных пипеток с низким сдвигом), чтобы минимизировать механические нагрузки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования стандартных наконечников малого объёма пипеток с объёмом ниже 200 мкл, так как они могут разорвать крупные GUV. В качестве альтернативы можно обрезать стандартные наконечники на конце, чтобы расширить отверстие и уменьшить сдвиг при сборе.
6. Хранение
   1. Храните протео-GUV при 4 °C и используйте их в течение 48 часов для поддержания активности белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потери активности зависит от типа и стабильности восстановленного мембранного белка, а также от состава мембраны.

8. Микроскопия белок-функционализированных GUV

1. Установка микроскопа
   1. Включите конфокальный микроскоп. Если используете систему Leica, запустите программное обеспечение LAS X. Для других брендов микроскопов используйте рекомендованное производителем программное обеспечение для приобретения.
   2. Выберите объектив масляного погружения 63× (NA 1.40); при необходимости можно увеличить или уменьшить увеличение, в зависимости от размера GUV.
   3. Откройте два визуализационных канала, соответствующих флуорофорам: Rhodamine Red (мембрана) и ATTO 643 (восстановленный белок).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для флуорофоров с частично перекрывающимися спектрами выберите подходящие лазерные линии и узкие окна обнаружения, чтобы минимизировать спектральные перекрёстные помехи. Выбирайте каждый канал последовательно, чтобы предотвратить просачивание сигнала и обеспечить точную количественную оценку флуоресценции.
2. Осадкование GUV
   1. Поставьте силиконовый изолятор с прессом-уплотнением на чистый стеклянный слой No1.5 (толщиной 0.17 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для вертикальных (не инвертированных) микроскопов могут использоваться более толстые стеклянные стекла.
   2. Пипетта 60 мкл буфера (1 мМ Tris-HCl, pH 7,5; 200 мМ глюкозы) в центр спейсера.
   3. Аккуратно добавьте 20 мкл подвески GUV поверх буфера.
   4. Немедленно накройте камеру вторым стеклянным затвором, чтобы избежать испарения.
   5. Дайте GUV осадиться в течение ~5 минут перед снимком.
3. Получение изображений
   1. Сосредоточьтесь на нижней части камеры для захвата сечений GUV.
   2. Получите изображения различных GUV по всей камере, систематически сканируя с верхнего левого в нижний правый угол («змеиный узор»), чтобы получить репрезентативную популяцию (~100 GUV). Снимите все везикулы, обнаруженные во время сканирования, без предварительного отбора, независимо от размера или интенсивности флуоресценции, чтобы избежать смещения отбора и обеспечить воспроизводимость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторной съёмки одного и того же GUV, чтобы предотвратить фотоотбеливание.
4. Анализ изображений
   1. Количественно определить флуоресцентную интенсивность восстановленного белка, маркированного ATTO 643, проведя полилинию вдоль мембраны отдельных GUV. При использовании программного обеспечения LAS X выберите Quantify → Line Profile, затем выберите инструмент полилиний и обведите мембрану каждого GUV. Чтобы получить среднюю интенсивность флуоресценции, откройте Статистику и запишите среднее значение. Анализируйте только чистые, однообразные GUV; Исключить из анализа мультивезикулярные и агрегированные везикулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если измерения проводятся в разные дни, интенсивность флуоресценции должна быть нормализована до мощности лазера, измеряясь при одинаковых настройках изображения (длина волны и номинальная мощность). Для учёта ежедневных колебаний мощности лазера применяется следующая нормализация: , где F_a.u. — измеряемая интенсивность флуоресценции в произвольных единицах, P_— мощность лазера, измеренная в эталонный день, а — мощность лазера, измеренная в день получения. Эта коррекция предполагает линейную зависимость между мощностью лазера и интенсивностью флуоресценции при условиях ненасыщенного освещения. В данном исследовании все изображения были получены в один и тот же день, поэтому нормализация не требовалась.
   2. Сообщите о флуоресцентной интенсивности в среднем 100 GUV с соответствующим стандартным отклонением.

9. Анализ протонной накачки в протео-GUV

1. Установка микроскопа
   1. Включите конфокальный микроскоп и запустите соответствующее программное обеспечение для получения информации (например, LAS X для систем Leica).
   2. Выберите объектив масляного погружения 63× (NA 1.40). При необходимости можно увеличить или уменьшить увеличение, в зависимости от размера GUV.
   3. Настройте три канала визуализации, соответствующие флуорофорам. Для родамина красного (мембранный маркер) используйте возбуждение 561 нм и диапазон излучения 570–620 нм. Для пиранина (инкапсулированного pH-чувствительного красителя) используйте возбуждение на 448 нм и 405 нм и собирайте выбросы на расстоянии 499–551 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если доступен лазер 458 нм, используйте его вместо 448 нм для возбуждения депротонированной (базовой) формы пиранина.
   4. Регулируйте мощность лазера и усиление детектора, чтобы избежать насыщения пикселей и минимизировать фотоотбеливание. Сохраняйте настройки приобретения на протяжении всего эксперимента.
2. Осадкование GUV
   1. Добавьте 280 мкл буфера (1 мМ Tris-HCl, pH 7,5; 200 мМ глюкозы) в одну скважину затвора с 8 камерами (общий объём скважины: ~874 мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте менее 200 мкл, так как объёмы ниже 200 мкл увеличивают испарение и дрейф pH. Не превышайте 400 мкл, чтобы избежать пролива и обеспечить комфортное использование пипетки. Если используете другой формат камеры, регулируйте громкость соответственно. Для инвертированных микроскопов используйте камерные затворы, совместимые с толщиной скольжения #1.5H.
   2. Аккуратно добавьте 20 мкл подвески bo_3-GUV поверх буфера, не появляя воздушных пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для отрицательного контроля замените bo_3-GUV суспензию на эквивалентный объём (20 мкл) безбелковых GUV с таким же липидным/полимерным составом, подготовленных и осадочных при одинаковых условиях. Этот контроль учитывает любые неспецифические эффекты DTT и_{Q 1} на соотношение флуоресценции пиранина, которые не зависят от активности оксидазы bo₃ .
   3. Дайте GUV отложиться примерно в течение 5 минут перед визуализацией.
3. Базовое приобретение
   1. Сосредоточьтесь на нижней плоскости камеры, где отложены GUV.
   2. Отрегулировать зум так, чтобы получить 3–6 GUV в поле зрения.
   3. Зафиксируйте исходную флуоресценцию во всех каналах за 5 минут до активации.
4. Активация протонного насоса
   1. Приготовьте свежую смесь DTT–Q₁ непосредственно перед использованием, смешав 4,8 мкл 1 M DTT с 0,3 мкл 80 мМ Q₁ в DMSO, затем тщательно перемешайте с помощью вихря.
   2. Активируйте оксидазу цитохрома bo₃ , аккуратно добавляя 2,6 мкл смеси DTT–Q₁ на поверхность раствора без введения кончика пипетки в буфер, что приводит к получению конечных концентраций примерно 8 мМ DTT и 40 мкм Q₁ в камере.
   3. Мониторинг внутривезикулярной флуоресценции пиранина в течение 30 минут при непрерывном набирании.
5. Анализ внутривезикулярной флуоресценции пиранина
   1. Для каждого GUV определите область интереса (ROI) внутри просвета везикулы. В программном обеспечении LAS X перейдите в Quantify → Stack Profile, выберите Draw Ellipse и нарисуйте круглый ROI внутри каждого GUV.
   2. Чтобы определить среднюю интенсивность флуоресценции на расстоянии 499–551 нм для обоих длин волн возбуждения (448 нм и 405 нм), откройте в программном обеспечении раздел Statistics и запишите среднее значение.
   3. Вычислим коэффициент флуоресценции как R =_{I 448}/I₄₀₅.
   4. Постройте график отношения со временем, чтобы получить кинетические следы внутривезикулярного изменения pH.

Результаты

Цитохром bo 3 оксидаза E. coli экспрессировалась из плазмиды pETcyo в штаму E. coli C43 (DE3) ΔcyoABCDE и очищена, как описано^{ранее, 29}. Очищенная оксидаза bo₃ использовалась либо напрямую для измерения восстановления и активности, либо маркировалась флуоресцентными красителями, такими как ATTO 643 (это исследование) или другими красителями^{ATTO 1,15}. Для высокогидрофильных красителей, таких как ATTO 643, для эффективного отделения несвязанного красителя от маркированного белка использовался столбец диаметром 30 см (см. рисунок 3A). Степень маркировки (DOL), рассчитанная по спектрам поглощения, обычно варьировалась от 1,1 до 1,3 молекулы красителя на фермент, в зависимости от используемого красителя ATTO. Для оксидазы bo₃, маркированной ATTO 643, DOL составлял 1,16 (рисунок 3B).

Для восстановления белка LUV сначала готовились путём тонкоплёночной регидратации, затем циклов замораживания и оттаивания и экструзии для достижения равномерных размеров пузырьков. Для полимерсомов буфер для регидратации дополнялся моющим средством. Распределения размеров везикул анализировались с помощью динамического рассеяния света перед восстановлением (см. рисунок 4, таблица 2). Как гибридные, так и полимерные LUV обычно имели средний диаметр 85–95 нм с узким распределением размеров (PDI < 0,2). Ожидается, что везикулы на основе PDMS-g-PEO будут немного меньше номинального размера пор экструзионной мембраны. Типичные полимеромы демонстрировали очень однородные размеры, при этом значения PDI были ниже 0,1, тогда как гибридные везикулы образовывали достаточно однородные популяции с значениями PDI иногда выше 0,1, но стабильно ниже 0,2.

Мембранный белок bo₃ оксидаза затем вводился в LUV в присутствии детергента (в данном исследовании холат натрия). Впоследствии моющее средство удалялось с помощью Bio-Beads. После восстановления размер полимера увеличился лишь незначительно (рисунок 4A), тогда как размер гибридной пузырьки остался неизменным (рисунок 4B). В обеих системах наблюдалось небольшое увеличение PDI (Таблица 2). Ожидаются такие незначительные изменения размера, поскольку растворение и удаление с помощью детергента могут реорганизовать полимерные цепочки в мембране. Активность белка оценивалась путём измерения потребления кислорода, что показывает, сохраняет ли белок функциональную активность (рисунок 5A). Отсутствие потребления кислорода в отрицательном контроле LUV без белка подтверждает, что наблюдаемый сигнал возникает именно из-за активности оксидазы bo₃ . При восстановлении, опосредованном холатом натрия, в используемых концентрациях активность белка обычно была немного выше в гибридных везикулах по сравнению с полимерсомами (рисунок 5B). Наблюдалась некоторая вариабельность активности белка между партиями очистки и даже между фракциями в одной партии. Поэтому для сравнительных исследований — например, для сравнения активности белка в разных мембранных системах — следует использовать одну и ту же долю очищенного белка для обеспечения стабильности.

Для получения белок-функционализированных PDMS-g-PEO и PDMS-g-PEO/соевых PC GUV был применён метод термоядерного электроформирования. В этом методе протео-LUV смешивались с безбелковыми LUV и наносили на стеклянные стекли с покрытием ITO, после чего следовало частичное обезвоживание для стимулирования слияния везикул и образования полимера/белка или полимера/липида/белкового пленки. Недостаточное обезвоживание приводило к низкому выходу протео-GUV, уменьшению размера GUV и наличию несплавленных (протео)LUV.

Успешное включение маркированного белка, bo₃ оксидазы–ATTO 643, в мембрану было подтверждено конфокальной микроскопией после седиментации GUV в градиент плотности сахарозы/глюкозы (см. рисунок 6A, B). Количественная оценка мембранно-ассоциированной флуоресценции с помощью простого линейного профиля может быть смещённой, так как измеряемая интенсивность зависит от угла, под которым проводится линия. Для минимизации этого эффекта интенсивность флуоресценции оценивалась с помощью полилинии, проведённой вдоль всего контура мембраны каждого GUV.

Для оценки возможных корреляций между размером пузырьков и включением белков параллельно анализировали диаметр GUV (рисунок 6C, D). Крупные GUV (более 20 мкм) обычно демонстрировали более низкую мембранно-ассоциированную флуоресценцию белка по сравнению с меньшими везикулами. Это наблюдение можно объяснить механизмом слияния–электроформирования: меньшие везикулы формируются раньше и могут эффективнее включать белки, тогда как крупные везикулы возникают в результате последующих событий слияния и роста мембраны, что потенциально приводит к разбавлению с материалом, бедным белком.

Общее включение белка определяется в первую очередь на ранней стадии восстановления в LUV, особенно по типу детергента, концентрации и ступени его добавления. Для полимерных LUV наблюдалось немного меньшее включение при добавлении детергента в готовые пузырьки по сравнению с добавлением во время формирования везикул (этап регидратации), что дало флуоресцентную интенсивность соответственно 18,9 ± 3,9 а.е. и 20,6 ± 3,7 а.е. (рисунок 6C, D, слева). Для гибридных систем, где после образования пузырьков добавляют детергентное средство, концентрация детергента играет заметную роль: увеличение холата натрия с 0,015% до 0,1% приводило к заметному увеличению инкорпорирования белка (22,1 ± 5,2 а.е. против 26,2 ± 5,0 а.е., рисунок 6C, D, справа). Сравнивая полимерные и гибридные системы, в гибридных GUV обычно наблюдалось немного более высокое включение оксидазы bo 3 в мембраны. Вероятно, это связано с наличием дефектов упаковки на границах полимер–липид, которые, помимо дефектов, вызванных детергентом, обеспечивают благоприятные места вставки мембранных белков.

При втором этапе электроформирования в 2 часа средний диаметр GUV, функционализированных _{оксидазой bo 3}, составлял примерно 14–15 мкм (13,5 ± 3,7 мкм для полимерных GUV и 15,4 ± 6,3 мкм для гибридных GUV), хотя присутствовали заметно крупные везикулы (рисунок 6C, D). Увеличение длительности второго этапа электроформирования до 12 часов привело к общему увеличению размера GUV^{на 1,27}.

Протокол термоядерного синтеза-электроформирования также позволяет инкапсулировать водорастворимые виды, такие как pH-чувствительные красители (например, пиранин), добавляя краситель в буфер регидратации во время электроформирования (рисунок 7A). Размер GUV обычно уменьшается, когда пузырьки образуются в присутствии водорастворимых красителей. Чтобы компенсировать этот эффект, частоту начальных этапов электроформирования следует увеличить с 50 до 500 Гц.

Инкапсуляция рациометрического pH-чувствительного красителя, такого как пиранин, позволяет проводить мониторинг протонной накачки по однопузырькам и даёт представление о ориентации протонных насосов. При закислении просвета везикулы соотношение флуоресценции пиранина, возбужденного на 448 нм и 405 нм, снижается. Это отношение отражает состояние протонирования пиранина и, следовательно, коррелирует с pH. Рациометрические измерения имеют преимущество, так как они в значительной степени нечувствительны к изменениям эффективности инкапсуляции красителя и фотоотбеливанию. Пример активности накачки протонов показан на рисунке 7B, где наблюдается снижение внутривезикулярного соотношения флуоресценции пиранина (I₄₄₈/I₄₀₅) в гибридных GUV, содержащих восстановленную оксидазу bo₃ после добавления донора электронов DTT и электронного медиатора Q₁. Соотношение флуоресценции начинает резко снижаться примерно через 1 минуту после активации и продолжает быстро снижаться примерно в течение 1 минуты, затем замедляется в течение следующих ~18 минут. Это поведение указывает на то, что большинство молекул оксидазы bo₃ ориентированы так, что протонная накачка происходит внутрь GUV. Безбелковые GUV, подвергшиеся аналогичным условиям, показали меньшее снижение соотношения флуоресценции, что стало отрицательным контролем и подтверждает, что большее снижение, наблюдаемое в bo_3-GUV, происходит именно из-за активности насоса протонов оксидазы bo 3, а не неспецифическим эффектам DTT и_Q1 на соотношение флуоресценции пиранина.

Рисунок 1. Схематическое представление образования крупной униламеллярной везикулы (LUV), реформирования мембранного белка цитохром bo₃ оксидазы в LUV и формирование гигантских униламеллярных везикул, функционализированных bo₃ оксидазой (GUV) с помощью метода термосинтеза-электроформирования. LUV готовятся с помощью тонкоплёночной регидратации, циклов замораживания-оттаивания и экструзии через мембрану диаметром 100 нм. Восстановление цитохрома bo₃ оксидазы проводится в присутствии детергента, который затем удаляется с помощью био-бусин. bo_3-GUV образуются путём отложения bo_3-LUV на стеклянные стекла, покрытые оксидом индия (ITO), после чего происходит частичная обезвоживание и регидратация в присутствии электрического тока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Образование сросшейся большой пленки униламеллярной везикулы (LUV) путём обезвоживания. Семь капель по 2 мкл смешанных протео-LUV и LUV были отложены на стеклянных стеклах, покрытых оксидом индия (ITO): (A) сразу после осаждения и (B) после частичного обезвоживания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Флуоресцентная маркировка оксидазы цитохрома bo₃. (A) Хроматограмма (профиль элюирования) оксидазы-ATTO 643 bo 3, очищенная на колонке Superdex 200 10/300 GL. Фракции, выделенные серым цветом, были собраны и затем концентрированы. (B) Спектры поглощения концентрированной bo₃ оксидазы-ATTO 643, показывающие пики на 280 нм (белок), 400 нм (зоны гемных кофакторов в оксидазе bo₃) и 643 нм (краситель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Распределение размеров крупных униламеллярных везикул (LUV) до и после восстановления белка: (A) поли(диметилсилоксан)-трансплантат-поли (оксид этилена) (PDMS-g-PEO) полимера и (B) гибридных везикул PDMS-g-PEO/соевого фосфатидилхолина (PC). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Потребление кислорода оксидазой bo₃, восстановленное в крупных униламеллярных везикулах (LUVs). (A) Репрезентативные следы концентрации кислорода со временем после активации восстановленной цитохромной bo₃ оксидазы с добавлением дитиотрейтола (DTT) и убихинона-1 (_Q1). Зелёный след соответствует восстановленным белком LUV, а серый — отрицательному контролю (LUV без белка). (B) Нормы потребления кислорода (OCR) оксидазы bo₃, реконструированной в поли(диметилсилоксан)-трансплантат-поли (этиленоксид) (PDMS-g-PEO) и PDMS-g-PEO/соевый фосфатидилхолин (PC) LUV. Бары представляют среднее ± стандартное отклонение (SD) трёх независимых измерений (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6. Вставка флуоресцентно маркированной оксидазы bo₃ в гигантские униламеллярные везикулы (GUV). Репрезентативные микрофотографии (A) поли(диметилсилоксан)-трансплантат-поли(этиленоксид) (PDMS-g-PEO) и (B) PDMS-g-PEO/соевого фосфатидилхолина (PC) GUV (мембраны с маркировкой фосфатидилетаноламин-родамина (PE-Rho), красные), содержащие восстановленный цитохром bo₃ оксидаза-ATTO 643 (маджента). Количественная оценка интенсивности флуоресценции bo₃ оксидазы-ATTO 643 в зависимости от размера GUV (N = 100) для различных условий реконструкции: (C) добавление 0,2% холата натрия (SC) к преформированным полимерным крупным униламеллярным пузырькам (LUV) и 0,015% SC к преформированным гибридным LUV; (D) полимерные LUV, образованные в присутствии 0,1% SC, и гибридные LUV, обработанные 0,1% SC после образования. Значения отражают интенсивность флуоресценции отдельных GUV (N = 100 на каждое условие). Средние значения ± стандартного отклонения (SD) приведены в тексте. Сравнения носят описательный характер; Формальное статистическое тестирование не проводилось. A.U. (произвольные единицы). Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7. Протонная накачка с помощью bo₃ оксидазы, воссозданная в гигантских униламеллярных везикулах (GUV). (A) Репрезентативная флуоресцентная микрофотография поли(диметилсилоксан)-графт-полиполи (этиленоксид) (PDMS-g-PEO)/соевого фосфатидилхолина (PC) ГУВ, с мембранами, маркированными 0,05 моль% фосфатидилетаноламина-родамина (PE-Rho, красный), содержащим восстановленную цитохром bo 3 оксидазу и инкапсулированный pH-чувствительный краситель пиранина (возбуждение на 405 и 448 нм; синие и зелёные каналы), осадочные в камерном стеклянном стекле. (B) изменение внутривезикулярного соотношения флуоресценции пиранина при активации дитиотрейтолом (DTT) и убихиноном-1 (_Q1) в GUV PDMS-g-PEO/соевого PC, содержащих восстановленную _{bo3-оксидазу}. Зелёный след соответствует белковым реконструированным GUV, а серый — отрицательному контролю (GUV без белка). Этот след представляет среднее ± стандартное отклонение (SD) (n = 3 везикулы). Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

	Компонент	Запас	Сумма	Окончательный состав мембраны
Polymersomes	PDMS-g-PEO в хлороформе:метаноле (2:1, v/v)	10 мг/мл	499,9 мкл	99,95 моль%
	PE-родамин в хлороформе	1 мг/мл	1,1 мкл	0,05 моль%
Гибридные везикулы	PDMS-g-PEO в хлороформе:метаноле (2:1, v/v)	10 мг/мл	450,1 мкл	70 моль%
	Soy PC (95%) в хлороформе	10 мг/мл	49,8 мкл	29,95 моль%
	PE-родамин в хлороформе	1 мг/мл	1,4 мкл	0,05 моль%

Таблица 1: Запасные растворы и объёмы, используемые для подготовки тонкоплёнки для образования крупной униламеллярной пузырькой (LUV).Концентрации запасов указаны в мг/мл. Объёмы рассчитываются для общей концентрации пленки 5 мг/мл. Итоговый состав мембраны выражается в mol%. PDMS-g-PEO: поли(диметилсилоксан)-трансплантат-поли (оксид этилена); ПЭ-родамин: фосфатидилэтаноламин-родамин; соевый PC: соевый фосфатидилхолин; V/V: громкость/громкость.

	Условие восстановления	Диаметр (нм)	PDI
Polymersomes	До восстановления	84,34 ± 0,22	0.084
	После восстановления	100,73 ± 0,81	0.109
Гибриды	До восстановления	89,21 ± 0,77	0.129
	После восстановления	85.01 ± 0.42	0.17

Таблица 2: Средний размер везикулы и индекс полидисперсности (PDI) полимерсомов (поли(диметилсилоксан)-трансплантат-поли (оксид этилена), PDMS-g-PEO) и гибридных везикул (PDMS-g-PEO/соевый фосфатидилхолин (PC)) до и после восстановления. Данные представляют средние значения трёх независимых измерений.

Обсуждение

Полимеромы и гибридные везикулы полимер/липидов обладают повышенной химической и механической стабильностью по сравнению с обычными липидными везикулами, что делает их очень привлекательными для применений, таких как доставка лекарств и биосенсорирование до нано- и микрореакторов и искусственных клеток. Однако их уникальная мембранная архитектура и биофизические свойства часто препятствуют прямому переносу протоколов, оптимизированных для липидных везикул, в полимерные^{системы} 15,20,30. Представленный здесь протокол решает эти различия и обеспечивает оптимизированный рабочий процесс для восстановления мембранных белков в полимерные и гибридные LUV на основе PDMS-g-PEO, а затем масштабирование до GUV посредством термоядерного электроформирования.

Критическим этапом протокола является подготовка LUV с узким и воспроизводимым размерным распределением. Как и в случае с липидными пленками, пленки PDMS-g-PEO самособираются в везикулы при регидратации с помощью водного буфера. В отличие от липидных систем, которые часто дают смесь одно- и мультиламеллярных везикул, PDMS-g-PEO предпочтительно формирует униламеллярные^{структуры 1}, устраняя необходимость циклов замораживания–оттаивания, обычно используемых для снижения мультиламеллярности липидных препаратов. Экструзия выполняется для стандартизации распределения размеров везикул. Благодаря повышенной мягкости мембран PDMS-g-PEO по сравнению с липидными^{бислоями 1}, более низкие давления экструзии достаточно эффективны. Хотя 11 экструзионных проходов, рекомендованных производителем, обычно достаточно, увеличение количества проходов обычно приводит к уменьшению размера и улучшению воспроизводимости. Однако чрезмерная экструзия может привести к образованию пузырьков, немного меньше номинального размера пор мембраны. Повторная экструзия также может снизить выход везикулы из-за потери материала; ранее мы установили, что примерно 31% PDMS-g-PEO и 25% материала PDMS-g-PEO/соевого PC везикул терялись после 21 прохода через мембрану 100 нм^. Поэтому количество проходов экструзии должно быть оптимизировано для баланса однородности размеров с целостностью и выходом весикул.

Восстановление с помощью моющего средства является ещё одним важным фактором, определяющим успех. Оптимальный тип и концентрация детергента зависят как от конкретного мембранного белка, так и от её^{состава 3,20}. В случае чистых полимерных мембран, при оптимальных условиях насыщения, включение детергента во время регидратации пленки даёт более высокие эффективности вставки, чем насыщение готовых пузырьков. Более жёсткие полимерные мембраны, такие как те, что формируются из PBD-b-PEO, требуют значительно более высоких концентраций детергента для мембранной^{растворимости 30}, что подчёркивает необходимость оптимизации специфичных для полимеров. Успешное введение должно быть подтверждено не только измерениями активности — по сравнению с детергентными мицеллами или липидными пузырьками, — но и с помощью структурного анализа, такого как крио-ТЭМ, для оценки глубины вставки и адаптации мембраны к гидрофобному^{несоответствию 1}. Ориентация белка столь же важна, особенно для протонных насосов, поскольку функциональный протонный градиент требует, чтобы большинство насосов были равномерно ориентированы. В идеале насосы должны транспортировать протоны внутрь для обеспечения взаимодействия с процессами, расходующими градиенты, такими как синтез^{АТФ 3,15}. Ориентацию можно оценить с помощью белковых меток, например, избирательно закалывая красители, подвергающиеся контакту с внешней частью везикулы, или путём замены флуоресцентных меток, прикреплённых к^{His-меткам 20}. Эти подходы представлены как общие рекомендации по оптимизации протокола и не были реализованы в данном исследовании.

Масштабирование от протео-LUV к протео-GUV с использованием термоядерного электроформирования требует тщательного контроля параметров осаждения и обезвоживания. Концентрация LUV и размер капель критически влияют на итоговый выход и чистоту GUV. Чрезмерно высокие концентрации LUV (≥10 мг/мл) могут привести к тому, что несплавленные LUV останутся в конечном образце, тогда как слишком низкие концентрации (<5 мг/мл) снижают выход GUV из-за недостатка отложенных материалов. Обезвоживание должно быть частичным, а не полным — о чём свидетельствует появление белого кольца на периметре капли, а не полностью белой капли — поскольку чрезмерное обезвоживание может ухудшить или устранить активность мембранных белков, особенно для протонных насосов. Поэтому контролируемая влажность и температура необходимы для достаточной дестабилизации мембран для слияния, сохраняя при этом функциональность белка.

Высокие белковые нагрузки могут уменьшить размер GUV, но этот эффект можно смягчить за счёт разбавления белок-функционализированных LUV на безбелковые LUV. Таким образом, плотность белка внутри мембран GUV может быть точно модулирована перед осадкой. Например, смешивание высоконагруженных bo_3-LUV с пустыми LUV (до 1:10, v/v) даёт GUV диаметром 5–30 мкм и регулируемым содержанием белка при сохранении равномерного распределения мембран²⁷. Хотя эта стратегия приводит к гетерогенным популяциям пузырьков по плотности белка, процедуры калибровки позволяют количественно оценить уровни^{инкорпорирования 23,31}. Важно отметить, что метод смешивания обеспечивает более высокую общую нагрузку белка без чрезмерного уменьшения размера GUV²⁷.

Функциональный анализ восстановленных белков может проводиться путём инкапсулирования pH-чувствительных красителей, таких как пиранин, в буфер электроформации для мониторинга внутривезикулярных изменений pH. Для надежной живой визуализации везикулы должны осадиться или иммобилизироваться, чтобы предотвратить движение, что может размыть сигналы флуоресценции и затруднить точную количественную оценку динамики внутривезикулярного pH. Иммобилизация через связь биотин–стрептавидин с использованием биотинилированных липидов и поверхностей, покрытых^{стрептавидином32}, обеспечивает стабильное прикрепление, но может изменять состав или натяжение мембраны. Полуиммобилизация в микрофлюидных ловушках предлагает альтернативу, которая избегает дополнительных компонентов мембраны и минимизирует^{возмущения 1,33}. Хотя объёмные флуоресцентные измерения возможны после удаления внешнего красителя путём повторного осадконакопления и буферного обмена, остаточные мембранные красители могут мешать показаниям; поэтому конфокальная микроскопия отдельных GUV обычно предпочтительна.

В сравнении с альтернативными методами, которые пытаются прямое вставление белков в готово сформированные GUV, стратегия термосинтеза-электроформирования позволяет самостоятельно оптимизировать условия восстановления на уровне LUV перед масштабированием до GUV. Такой модульный рабочий процесс повышает воспроизводимость и функциональный выход, особенно для полимерных и гибридных мембран, менее подверженных традиционным липидным протоколам. Метод совместим с широким спектром мембранных^{белков 1}, включая мультибелковые^{системы 15}, и позволяет функционализовать мембраны и коинкапсулировать дополнительные компоненты. Таким образом, она предоставляет универсальную платформу для создания надёжных искусственных ячеек, микрореакторов и моделей для исследования взаимодействия полимера и белка в контролируемых условиях.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ÄKTA pure™ chromatography system	Cytiva	29018224
18:1 Liss Rhod PE	Avanti Research	810150
8 well chambered coverglass	Cellvis	C8-1.5H-N
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters	Sigma Aldrich	UFC5030
ATTO 643 NHS ester	ATTO-TEC	AD 643-31
Bio-Beads SM-2	Bio-Rad	1523920
Cholic acid-Na-salt (sodium cholate)	Serva	361-09-1
Coenzyme Q1	TargetMol	TGM-T19594
Confocal microscope STELLARIS 5	Leica Microsystems	603810
DTT (Dithiothreitol)	Merck	10197777001
Fine Tip Ultra Micro Pastette	Pastette	LW4243
HPTS (pyranine, 8-Hydroxypyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid, Trisodium Salt)	Sigma Aldrich	6358-69-6
ITO-coated glass slides (25×75×1.1 mm, ≤20 Ohm/sq.)	pgo	CEC020S
LAS X software	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Mini centrifuge MCF-2360	LMS	24572
Mini-extruder	Avanti Research	610000
Oxytherm+P system	Hansatech Instruments	/
Plasma cleaner (benchtop)	Harrick Plasma	PDC-32G-2
Polycarbonate membranes 0.1 μm	Avanti Research	610005
Press-to-seal silicone isolator (round, 20 mm diameter, 1 mm depth)	Grace Bio-Labs	41161502
Silicone spacers (round, 24.2 mm outer diameter, 14.3 mm inner diameter, 1.8 mm depth)			сделанные в лаборатории, вырезанные из силикона
Soy PC (95%)	Avanti Research	441601
Specord 50 PLUS spectrophotometer	Analytik Jena	823-0200P-3
Superdex 200 10/300 GL column (column L × I.D. 30 cm × 10 mm)	Cytiva	28-9909-44
Test tube shaker (2800 rpm)	IKA Lab Dancer	3365000
Thermomixer comfort 5355	Eppendorf	5355000.011
Xiameter OFX-5329 (PDMS-g-PEO; MW 3000)	Dow Corning	000000000004109892
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical	ZEN3600