Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание устройства «орган-на-чипе» с вертикально расположенным дентинно-пульпным комплексом с использованием человеческого диска дентина

110 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71713

⸱

14 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе описывается процесс изготовления и сборки устройства «орган-на-чипе» с вертикально расположенным комплексом «дентин–пульпа», включающего диск человеческого дентина и микроканалы, созданные методом фотолитографии, с последующим посевом и культивированием стволовых клеток пульпы зуба.

Аннотация

Традиционные доклинические модели, используемые в стоматологических исследованиях, включая модели на животных и статические клеточные культуры, имеют существенные ограничения в воспроизведении физиологических условий интерфейса «дентин–пульпа» и прогнозировании биологических реакций организма человека на стоматологические биоматериалы. Технология «орган-на-чипе» (OoC) предлагает альтернативный подход, позволяя воссоздавать тканеспецифичные микроокружения внутри контролируемых микрофлюидных систем. В данной работе представлен пошаговый протокол изготовления и сборки устройства OoC комплекса «дентин–пульпа», включающего диск человеческого дентина внутри трехслойной микрофлюидной платформы из полидиметилсилоксана (PDMS). Протокол включает подготовку диска дентина, изготовление микроструктурированных форм с помощью фотолитографии, литье и отверждение PDMS, связывание слоев с помощью плазменной обработки, сборку устройства, проверку на герметичность и посев стволовых клеток пульпы зуба в условиях статического культивирования. Обсуждаются критические параметры изготовления, влияющие на работу устройства, включая контроль толщины слоя PDMS, плазменную обработку поверхности и интеграцию диска дентина в устройство для минимизации утечек. Адгезия и жизнеспособность клеток внутри устройства оценивались с помощью сканирующей электронной микроскопии и конфокального окрашивания живых/мертвых клеток. Репрезентативные результаты демонстрируют успешную интеграцию диска дентина в микрофлюидную сборку, поддержание герметичности и адгезию жизнеспособных стволовых клеток пульпы зуба к поверхности дентина. Данный протокол предлагает воспроизводимый метод создания платформы OoC комплекса «дентин–пульпа», которая может быть использована в будущих исследованиях клеточных ответов на стоматологические биоматериалы и микроокружающие стимулы.

Введение

Эксперименты на животных долгое время служили важным инструментом для углубления понимания патологических и физиологических процессов и играли центральную роль на ранних этапах разработки лекарственных средств1. В течение XX века ожидаемая продолжительность жизни людей существенно увеличилась, и хотя невозможно точно количественно оценить, в какой степени это улучшение обусловлено исключительно исследованиями на животных, общепризнано, что многие современные методы лечения были разработаны или подтверждены с использованием животных моделей2. Заметными примерами являются разработка вакцин против полиомиелита, кори и гепатита B, оценка безопасности и эффективности пенициллина, а также производство инсулина. В области исследований стоматологических и биоматериалов эти модели имели решающее значение для изучения процесса развития кариеса, биологии и регенерации дентинно-пульпарного комплекса, а также физиопатологии тканей периодонта3,4.

Несмотря на широкое применение этих методологий, текущий процесс разработки лекарственных средств по-прежнему характеризуется высоким уровнем неудач: многие препараты-кандидаты терпят поражение на этапе клинических испытаний, несмотря на подтвержденную эффективность и безопасность в условиях доклинических лабораторных исследований и на моделях животных5. Это несоответствие связывают с межвидовыми различиями, которые могут ограничивать трансляционную предсказательную способность моделей животных из-за анатомических, генетических и физиологических различий между видами6. Кроме того, разработка новых терапевтических подходов остается трудоемким и дорогостоящим процессом7. Более того, традиционные модели in vitro преимущественно используют упрощенные двухмерные (2D) монослойные культуры на нефизиологических пластиковых подложках, которые не воспроизводят биохимические и физические сигналы, межклеточные взаимодействия и сигнализацию внеклеточного матрикса (ECM), присутствующие в полости рта человека8,9. Хотя 2D-модели обладают определенными экспериментальными преимуществами, они по своей природе не способны воспроизвести сложные взаимодействия, происходящие между несколькими компонентами одновременно, такими как биопленки, биоматериалы, дентин и клетки пульпы10. Следовательно, растет интерес к разработке альтернативных экспериментальных платформ, способных более точно воспроизводить биологические реакции человека. В 2022 году Закон о модернизации FDA 2.0 отменил обязательное требование о тестировании на животных в процессе одобрения лекарств и признал возможность использования альтернативных платформ, включая технологии «орган-на-чипе» (OoC), в доклинических исследованиях11.

Орган-на-чипе (OoC) представляет собой микрофлюидное устройство, разработанное для воспроизведения структуры, функции и микроокружения конкретного органа или компонента ткани12. Эти устройства заселяют живыми клетками и тканями, культивируемыми в сконструированных микроканалах, которые воссоздают ключевые аспекты физиологической микросреды, в которой клетки находятся в естественных условиях. Помимо структурного подражания, микроканалы обеспечивают пространственно-временной контроль клеточного окружения и поддерживают сохранение тканеспецифических функций, создавая тем самым экспериментальные условия, которые могут более точно соответствовать физиологии in vivo, чем традиционные системы культивирования12. Особое значение имеет то, что микроканалы в устройствах OoC обеспечивают контролируемый поток культуральной среды, который оказывает напряжение сдвига на резидентные клетки13. Эти механические стимулы влияют на клеточные реакции, включая адгезию, пролиферацию, миграцию, экспрессию генов и межклеточные взаимодействия14,15. Кроме того, непрерывный поток среды способствует поддержанию микроокружения за счет подачи питательных веществ и удаления продуктов метаболизма16. Более того, сообщается, что некоторые платформы OoC по сравнению с традиционными 2D-культурами позволяют улучшить контроль показателей, связанных с окислительным стрессом, включая внутриклеточные активные формы кислорода и жизнеспособность клеток, в трехмерных (3D) моделях на чипе17. Таким образом, системы OoC стали перспективными платформами для изучения физиологии тканей, взаимодействий с биоматериалами и патологических процессов в контролируемых экспериментальных условиях18. В стоматологических исследованиях технология OoC постепенно применяется для моделирования все более сложных интерфейсов тканей полости рта19. Ранние платформы «зуб-на-чипе» имитировали интерфейс «биоматериал–дентин–пульпа»20, в то время как более совершенные итерации с тех пор включают сосудистую сеть и тройничное иннервационное обеспечение для более точного воспроизведения структурной и функциональной сложности пульпо-дентинного комплекса21. Помимо пульпы, 3D-модели недоразвитых корневых каналов позволили оценить действие эндодонтических ирригантов и ангиогенное прорастание стволовых клеток из апикальной папиллы22,23. На уровне периодонта платформы «десна-на-чипе» использовались для исследования взаимодействий между хозяином и микробами, а также для оценки иммуномодулирующего потенциала пробиотиков в качестве терапевтических средств24, в то время как устройства «периодонтальная связка-на-чипе» продемонстрировали, как поток интерстициальной жидкости модулирует формирование сосудистой сети и остеогенную дифференцировку сфероидов стволовых клеток периодонтальной связки25,26. В дополнение к этим моделям специализированные системы «слизистая оболочка полости рта-на-чипе» и «зубной имплантат-на-чипе» еще больше расширили сферу микрофлюидных стоматологических исследований, позволив охарактеризовать взаимодействия «хозяин–материал» и цитотоксичность стоматологических мономеров в физиологически значимых условиях27,28.

Несмотря на то, что системы «орган-на-чипе» (OoC) все чаще применяются в стоматологических, оральных и краниофациальных исследованиях, дальнейшие усилия по стандартизации и обеспечению воспроизводимости рабочих процессов изготовления остаются важными. В литературе описано несколько моделей «зуб-на-чипе»20,29,30,31, демонстрирующих различные конфигурации устройств и варианты их экспериментального применения. Однако различия в архитектуре устройств, методах изготовления, способах включения дентина и описании экспериментальных параметров могут ограничивать воспроизводимость и возможность прямого сравнения исследований. В частности, различия в геометрии микроканалов, стратегиях интеграции дентина и подходах к изготовлению могут влиять на биологическую и механическую микросреду внутри устройства. В некоторых описанных моделях используется дентин для воспроизведения аспектов интерфейса «дентин–пульпа»20,29,30, тогда как в других применяются альтернативные конфигурации31. Кроме того, методы изготовления, такие как фотолитография, лазерная резка, микрофрезерование и 3D-печать, имеют свои специфические преимущества и ограничения в зависимости от предполагаемого дизайна и применения устройства. Более того, критическим определяющим фактором биологической применимости является архитектурная ориентация устройства, а именно — расположены ли каналы и срез дентина в горизонтальной или вертикальной конфигурации19,32. В горизонтально-стековых конфигурациях отсеки, расположенные бок о бок, облегчают латеральную компартментализацию и визуализацию клеток в режиме реального времени, что делает их особенно подходящими для моделирования тканей с изначально латеральной пространственной организацией, таких как периодонтальный комплекс24,32. Однако этот дизайн по определению ограничен в способности воссоздавать перпендикулярные биологические интерфейсы, такие как комплекс «биоматериал–дентин–пульпа», поскольку латеральное расположение отсеков неточно воспроизводит ориентацию дентинного барьера in vivo между полостью и пульпой20,32. Вертикально-стековые конфигурации устраняют эти ограничения путем наложения двух отсеков вдоль оси y, разделенных нативным срезом дентина, что позволяет одновременно количественно оценивать молекулярный транспорт через неповрежденный дентин и в режиме реального времени контролировать реакции клеток пульпы, измеряемые в выходящей среде30. Тем не менее, признанным ограничением такой ориентации является получение поперечных изображений интерфейса «дентин–клетка», так как получение таких изображений в одной фокальной плоскости остается технически более сложной задачей, чем в горизонтально-стековых конфигурациях, где клетки и внеклеточный матрикс расположены латерально. Хотя в литературе описано множество моделей комплекса «дентин–пульпа» на чипе, большинство из них используют горизонтально-стековую конфигурацию, в которой отсеки расположены бок о бок в одной плоскости10,20,21,29, в то время как относительно немногие из них включали нативный срез дентина в вертикально-стековую конфигурацию30. Тем не менее, различия в подходах к изготовлению и параметрах описания в этих моделях по-прежнему ограничивают воспроизводимость и возможность межисследовательских сравнений33. Целью данной рукописи является повышение методологической воспроизводимости путем предоставления подробного протокола изготовления вертикально-стекового устройства «зуб-на-чипе», что будет способствовать более широкому внедрению данной платформы в стоматологическом исследовательском сообществе.

В данной работе представлен пошаговый протокол изготовления и сборки устройства «орган-на-чипе» (OoC) с вертикально ориентированным комплексом «дентин–пульпа», включающим диск человеческого дентина внутри трехслойной микрофлюидной платформы из полидиметилсилоксана (PDMS), изготовленной с использованием формы, полученной методом фотолитографии. Протокол также описывает посев и культивирование стволовых клеток пульпы зуба внутри устройства в статических условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией и было одобрено Комитетом по этике Universidad de La Frontera для исследований с использованием образцов человека.

1. Получение диска дентина

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте конструкцию устройства перед началом выполнения протокола (Рисунок 1A–1C).

  1. Сбор и хранение зубов
    1. Соберите здоровые человеческие моляры или премоляры после получения информированного согласия пациента.
    2. Храните все образцы в 0,5% растворе хлорамина при 4°C, чтобы предотвратить дегидратацию дентина и денатурацию белков.
    3. Заменяйте раствор хлорамина один раз в неделю в течение периода хранения.
  2. Приготовление дисков дентина
    1. Рассеките каждый зуб горизонтально на уровне средней трети коронки, используя высокоскоростной наконечник, работающий на скорости 350,000 rpm и оснащенный цилиндрическим алмазным бором (диаметр 1 mm; размер зерна 100–150 µm).
    2. Выполняйте распил при непрерывном водяном охлаждении со скоростью потока примерно 50 mL/min.
    3. Расположите срез на уровне средней трети коронки, чтобы избежать попадания в пульповую камеру и затрагивания эмали в окклюзионных бороздах и фиссурах, чтобы получить диск, состоящий преимущественно из ткани дентина.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Выполняйте распил зуба при непрерывном охлаждении и используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки, маску и защитные очки.
  3. Финишная обработка дисков дентина
    1. Отполируйте диск дентина, используя последовательно диски для финишной обработки с уменьшающимся размером зерна.
    2. Продолжайте полировку до достижения конечной толщины дентина примерно 0,8 mm (±± 0,3 mm) и поперечных размеров примерно 5 mm × 5 mm (±± 0,3 mm) (Рисунок 1D).
  4. Хранение дисков дентина
    1. Храните подготовленные диски дентина в 0,5% растворе хлорамина при 4°C до момента сборки устройства OoC.

Схема сборки микрофлюидного устройства; этапы изготовления с использованием пинцета, пробойника, формирования каналов для жидкости.
Рисунок 1: Схема проектирования и изготовления устройства «орган-на-чипе» (OoC) дентинно-пульпарного комплекса. (A) Трехмерный дизайн устройства, демонстрирующий трехслойную архитектуру. (B) Вид сверху на дизайн устройства с указанием основных размеров. (C) Вид сбоку на трехслойную конфигурацию устройства. (D) Типичный дентинный диск, подготовленный с приблизительной толщиной 0.8 mm и поперечными размерами примерно 5 mm × 5 mm. (E) Кремниевая мастер-форма, изготовленная методом фотолитографии и используемая для отливки верхнего и нижнего слоев полидиметилсилоксана (PDMS). (F) Отделение отвержденного слоя PDMS от кремниевой формы после термической полимеризации. (G) Плазменная обработка поверхности PDMS перед склеиванием слоев. (H) Готовое трехслойное устройство OoC дентинно-пульпарного комплекса, собранное путем плазменного склеивания и включающее дентинный интерфейс. (I) Собранное устройство, подключенное к трубкам для проверки на герметичность и подготовки к микрофлюидным экспериментам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Изготовление устройства «дентин-пульпа комплекс на чипе» (OoC)

  1. Подготовка рабочего пространства и материалов
    1. Подготовка материалов и оборудования
      1. Перед началом изготовления устройства подготовьте все материалы и оборудование, перечисленные в Таблице материалов.
      2. Подготовьте биопсийные просекатели перед сборкой устройства.
      3. Выполняйте все процедуры изготовления в чистой, обеспыленной среде.
      4. На протяжении всего процесса изготовления и сборки устройства используйте перчатки, защитные очки и соответствующие средства индивидуальной защиты.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте форму, изготовленную методом фотолитографии, до начала выполнения протокола (Рисунок 1E).
  2. Изготовление микроструктурированной формы
    1. Подготовка кремниевой пластины
      1. Изготовьте форму на 4-дюймовой кремниевой пластине с односторонней полировкой (n-тип, легированная As, метод роста CZ, ориентация <100>, толщина 500 ± 25 µm, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, удельное сопротивление 0,001–0,005 Ω·cm).
      2. Последовательно очистите пластину в ацетоне, изопропаноле и ультрачистой воде по 10 мин в каждом растворе при ультразвуковом воздействии.
      3. Высушите пластину сжатым воздухом.
      4. Прокалите пластину при 200°C в течение 10 мин на нагревательном столике для удаления остаточной влаги.
      5. Дайте пластине остыть до комнатной температуры (RT; 20°C–25°C).
    2. Активация поверхности и нанесение фоторезиста
      1. Активируйте поверхность кремниевой пластины с помощью вакуумного плазменного очистителя, используя воздушную плазму на уровне 7 в течение 120 с.
      2. Нанесите негативный фоторезист на эпоксидной основе GM 1060 методом центрифугирования при 300 rpm в течение 10 с.
      3. Продолжите центрифугирование при 565 rpm в течение 100 с и при 965 rpm в течение 1 с с ускорением 200 rpm/s.
      4. Оставьте покрытую пластину в покое на 10 мин.
      5. Выполните предварительный обжиг при 65°C в течение 10 мин.
      6. Продолжите предварительный обжиг при 95°C в течение 1 ч.
      7. Дайте пластине остыть до RT.
    3. Экспонирование и проявление
      1. Экспонируйте фоторезист с помощью системы прямой лазерной литографии при дозе 1 950 mJ/cm2.
      2. Выполните последующий обжиг при 65°C в течение 10 мин.
      3. Продолжите последующий обжиг при 95°C в течение 30 мин.
      4. Дайте пластине остыть до RT.
      5. Оставьте пластину в покое на 10 мин.
      6. Проявите рисунок в PGMEA в течение 4 мин.
      7. Увеличьте время проявления интервалами по 30 с, если остался остаточный фоторезист.
      8. Остановите проявление, промыв пластину изопропанолом.
      9. Высушите пластину сжатым воздухом.
    4. Финальный обжиг
      1. Выполните финальный обжиг при 135°C в течение 2 ч.
      2. В результате получится микроструктурированная мастер-форма, содержащая микроканалы шириной 1 mm и высотой 50 µm.
  3. Приготовление и дегазация смеси PDMS
    1. Приготовление смеси PDMS
      1. Смешайте основу PDMS и отвердитель в массовом соотношении 10:1.
      2. Перемешивайте смесь вручную стеклянной палочкой в пластиковом стакане примерно в течение 5 мин.
      3. При перемешивании совершайте медленные и непрерывные круговые движения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте попадания пузырьков воздуха во время перемешивания.
    2. Дегазация
      1. Поместите смесь PDMS в вакуумный эксикатор, подключенный к вакуумному насосу.
      2. Дегазируйте смесь при давлении примерно 700 mmHg в течение 5 мин.
      3. Кратковременно сбросьте вакуум, чтобы поверхностные пузырьки лопнули.
      4. Снова создайте вакуум.
      5. Повторяйте цикл до полного исчезновения видимых пузырьков.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время дегазации обычно составляет около 30 мин.
  4. Отливка PDMS в форму
    1. Подготовка формы
      1. Поместите форму на плоскую поверхность.
      2. Очистите форму сжатым воздухом.
      3. Избегайте прямого контакта с поверхностью с нанесенным рисунком.
      4. Убедитесь, что форма очищена от пыли и загрязнений.
    2. Дозирование PDMS
      1. Дозируйте примерно 8 g PDMS вокруг диска дентина для создания слоя иммобилизации дентина.
      2. Отрегулируйте высоту PDMS так, чтобы она соответствовала толщине диска дентина (0,8 ± 0,3 mm).
      3. Следите за тем, чтобы PDMS не покрывал поверхность дентина.
      4. Дозируйте примерно 0,26 g PDMS на одну единицу формы для создания каждого слоя микроканалов.
      5. Осторожно постучите по форме или примените вибрацию, чтобы облегчить заполнение микроструктур.
      6. Дайте PDMS распределиться по самым мелким элементам.
      7. Накройте форму крышкой или плоским покрытием, не касаясь поверхности PDMS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина слоя иммобилизации дентина составляет примерно 0,8 mm, а каждого слоя микроканалов — примерно 0,4 mm, что дает общую толщину устройства около 1,6 mm.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если планируется конфокальная визуализация, отрегулируйте толщину слоев в соответствии с рабочим расстоянием конфокального объектива.
  5. Отверждение
    1. Поместите формы в печь при 50°C.
    2. Отверждайте PDMS в течение 4 ч.
  6. Извлечение слоев PDMS
    1. Извлечение отвержденного PDMS
      1. Осторожно отделите отвержденные слои PDMS от формы (Рисунок 1F).
      2. Обращайтесь со слоями PDMS осторожно, чтобы не повредить микроструктуры.
  7. Склеивание слоев PDMS и изготовление входных и выходных портов
    1. Изготовление входных и выходных портов
      1. Сделайте перфорации в намеченных местах входа и выхода с помощью 1 mm биопсийного просекателя.
      2. При просекании расположите сторону с микроканалом вверх.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Положите слой PDMS на режущий мат, чтобы избежать повреждения структуры.
      3. Сделайте две перфорации в верхнем слое, соответствующие верхнему микроканалу.
    2. Очистка слоев PDMS
      1. Очистите слои PDMS с помощью изопропилового спирта или этанола.
      2. Удалите остаточные частицы пыли с помощью стерильной клейкой ленты.
      3. Перед сборкой убедитесь, что все склеиваемые поверхности очищены от загрязнений.
    3. Плазменная активация поверхностей PDMS
      1. Расположите верхний и средний слои PDMS для плазменной обработки (Рисунок 1G).
      2. Активируйте поверхности с помощью ручного коронарного плазменного активатора, работающего при мощности примерно 25 W с использованием окружающего воздуха в качестве рабочего газа.
      3. Соблюдайте рабочее расстояние примерно 1 mm между источником плазмы и поверхностью PDMS.
        ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Проводите плазменную обработку при надлежащей вентиляции и избегайте прямого воздействия озона, образующегося при воздействии плазмы.
      4. Включите устройство плазменной обработки и дайте ему стабилизироваться в течение 5 с.
      5. Перед обработкой убедитесь в формировании равномерного плазменного луча.
      6. Обрабатывайте верхний слой PDMS в течение 10 с, совершая непрерывные возвратно-поступательные движения со скоростью примерно 5 mm/s.
      7. Обрабатывайте средний слой PDMS в течение 10 с, используя те же движения и расстояние.
      8. Непосредственно перед склеиванием подвергните верхний слой дополнительной плазменной обработке в течение 1 с.
    4. Склеивание верхнего и среднего слоев
      1. Сразу после плазменной обработки совместите верхний микроканал с диском дентина.
      2. Склейте верхний и средний слои вместе.
      3. Поместите склеенный узел в печь при 75°C на 5 мин.
      4. Укрепите соединение во время инкубации.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Диск дентина и микроканал видны невооруженным глазом, поэтому их можно совместить без дополнительных инструментов выравнивания.
    5. Изготовление портов нижнего микроканала
      1. Просеките две перфорации, соответствующие нижнему микроканалу, через склеенные верхний и средний слои.
      2. Выполняйте просекание через оба слоя одновременно для обеспечения соосности.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура создает четыре перфорации в верхнем слое и две перфорации в среднем слое.
      3. Перед просеканием положите склеенный узел на плотный режущий мат.
      4. Приложите равномерное давление вниз одним движением.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте вращательных или боковых усилий, чтобы минимизировать риск расслоения.
      5. Удалите остатки материала из мест перфорации с помощью безворсовой стерильной марли, смоченной изопропиловым спиртом.
      6. Осмотрите перфорации и окружающие склеенные области при достаточном освещении.
      7. Перед продолжением убедитесь в отсутствии расслоений, разрывов или незавершенных перфораций.
    6. Склеивание нижнего слоя
      1. Проведите плазменную обработку нижнего слоя, как описано в пункте 2.7.4.
      2. Совместите входные и выходные порты нижнего микроканала с перфорациями в верхнем и среднем слоях.
      3. Приклейте нижний слой, чтобы завершить сборку устройства.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения совмещения отметьте места входа и выхода на внешней поверхности нижнего слоя перед склеиванием.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Как сообщается в литературе36, плазменные камеры могут обеспечивать более прочное соединение, чем плазменные ручки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Готовое устройство представляет собой трехслойную микрофлюидную платформу, включающую интерфейс дентина (Рисунок 1H). Нижняя поверхность дентина представляет собой пульпарную сторону модели, в то время как верхняя поверхность дентина представляет собой коронковую сторону для воздействия стоматологических биоматериалов или бактериальных препаратов.
  8. Тестирование микрофлюидного устройства на герметичность
    1. Осмотр собранного устройства
      1. Осмотрите собранное устройство на предмет смещения слоев.
      2. Осмотрите сборку на предмет неполного склеивания и видимых утечек.
    2. Проверка на герметичность
      1. Подсоедините иглы Luer-lock 19G к входным портам (Рисунок 1E).
      2. Подсоедините иглы к трубкам микрофлюидного насоса.
      3. Осторожно вдавите основания игл в просеченные порты для обеспечения герметичности.
      4. Введите стерильный PBS или культуральную среду со скоростью потока 10 µL/min.
      5. Поддерживайте поток жидкости в течение не менее 5 мин.
      6. Во время потока осматривайте все склеенные интерфейсы, края каналов и границы диска дентина.
      7. Наблюдайте за устройством при достаточном освещении во время и после инъекции.
      8. Подтвердите отсутствие скопления жидкости, увлажнения или образования капель.
      9. Классифицируйте устройство как герметичное, если утечек не обнаружено.
      10. Утилизируйте устройства с признаками утечки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите проверку на герметичность каждого изготовленного устройства перед посевом клеток или экспериментальным использованием.
  9. Стерилизация и хранение микрофлюидного устройства
    1. Стерилизация
      1. Подвергните верхнюю поверхность собранного устройства воздействию УФ-излучения (254 nm) в течение 30 мин внутри ламинарного шкафа.
      2. Подвергните нижнюю поверхность воздействию УФ-излучения еще в течение 30 мин.
      3. Промойте микроканалы 70% этанолом в течение 20 мин.
      4. Трижды промойте микроканалы стерильным PBS для удаления остатков этанола.
    2. Хранение
      1. Используйте стерилизованное устройство немедленно для экспериментов с культурами клеток.
      2. В качестве альтернативы храните устройство, погруженным в стерильный PBS при 4°C в стерильном контейнере до использования.
        ​ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Не используйте хлорамин или другие дезинфицирующие растворы после сборки устройства, так как PDMS может абсорбировать эти соединения, что может негативно сказаться на жизнеспособности клеток.

3. Оценка адгезии и жизнеспособности стволовых клеток зубного пульпы

  1. Предварительная подготовка поверхности дентина
    1. Введите 10% EDTA в устройство.
    2. Обеспечьте контакт раствора EDTA с поверхностью дентина в течение 15 мин.
    3. Вводите по 0.5 mL EDTA каждые 3 мин для поддержания движения жидкости внутри микроканала.
    4. Трижды промойте дентинный диск ультрачистой водой.
    5. Проводите каждую промывку в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка EDTA удаляет смазочный слой и обнажает белки матрикса дентина.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: При работе с растворами EDTA используйте перчатки и защитные очки во избежание раздражения кожи и слизистой оболочки глаз.
  2. Посев стволовых клеток пульпы зуба
    1. Экспансия стволовых клеток пульпы зуба
      1. Высейте стволовые клетки пульпы зуба во флакон T75 с плотностью 1 × 106 клеток на флакон.
      2. Инкубируйте клетки при 37°C и 5% CO2 до достижения примерно 80% конфлюэнтности.
      3. Отделите клетки с помощью трипсина.
      4. Нейтрализуйте трипсин, добавив полную питательную среду.
      5. Центрифугируйте клеточную суспензию для получения клеточного осадка.
      6. Оцените жизнеспособность клеток с помощью трипанового синего.
      7. Используйте клеточные суспензии с жизнеспособностью ≥90%.
    2. Приготовление клеточной суспензии
      1. Приготовьте предварительно прогретую до 37°C клеточную суспензию.
      2. Доведите концентрацию клеток до 100,000 клеток/mL в полной питательной среде.
      3. Приготовьте конечный объем суспензии 1–2 mL.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании использовались клетки 5-го пассажа.
    3. Посев клеток
      1. Введите клеточную суспензию во входной порт нижнего микроканала.
      2. Переверните устройство после посева клеток
        ПРИМЕЧАНИЕ: Переворачивание устройства способствует седиментации клеток к поверхности дентина и усиливает их адгезию.
    4. Инкубация
      1. Поместите перевернутое устройство в чашку Петри.
      2. Добавьте в чашку Петри 1 mL питательной среды для минимизации испарения.
      3. Инкубируйте устройство при 37°C и 5% CO2 в течение 24 ч.
      4. Поддерживайте условия статического культивирования на протяжении всего периода инкубации.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Валидация динамического потока в данном исследовании не проводилась.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Настоящий протокол описывает условия статического культивирования для первичной валидации устройства и оценки адгезии клеток.
    5. Первичная валидация устройства
      1. Оцените адгезию клеток с помощью сканирующей электронной микроскопии.
      2. Извлеките дентинный диск путем разборки устройства перед анализом.
  3. Подготовка образцов для сканирующей электронной микроскопии
    1. Извлечение и промывка образцов
      1. Разберите устройство после 24 ч инкубации.
      2. Извлеките дентинный диск и перенесите его в культуральную пластину или чашку Петри.
      3. Расположите диск засеянной клетками поверхностью вверх.
      4. Дважды промойте дентинный диск 1 mL PBS.
    2. Фиксация
      1. Добавьте 2 mL 2.5% глутаральдегида в 0.1 M фосфатном буфере Соренсена.
      2. Инкубируйте образец в течение 30 мин при RT.
        ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Глутаральдегид токсичен и может вызывать раздражение кожи, глаз и дыхательных путей. Проводите процедуры фиксации в вытяжном шкафу, используя соответствующие средства индивидуальной защиты.
    3. Промывка после фиксации
      1. Удалите раствор глутаральдегида.
      2. Трижды промойте дентинный диск ультрачистой дистиллированной водой при RT.
    4. СЭМ-анализ
      1. Проанализируйте образцы с помощью экологического сканирующего электронного микроскопа.
      2. Работайте на микроскопе в условиях низкого вакуума (25 Pa).
      3. Используйте ускоряющее напряжение 10.0 kV и рабочее расстояние 7.0 mm.
      4. Получите изображения в режиме 3D-детектирования обратнорассеянных электронов (BSE-3D).
      5. Сделайте снимки при увеличении ×200 (Рисунок 2A).
  4. Оценка жизнеспособности клеток с помощью конфокальной микроскопии
    1. Подготовка образцов
      1. Высейте и культивируйте клетки, как описано в шаге 3.2.
      2. Инкубируйте устройство в течение 24 ч при 37°C и 5% CO2.
      3. Разберите устройство, чтобы открыть доступ к поверхности дентина.
      4. Перенесите дентинный диск в многолуночный планшет, содержащий предварительно прогретый HBSS+/+ с добавлением Ca2+ и Mg2+.
    2. Промывка образцов
      1. Дважды промойте дентинный диск раствором HBSS+/+.
      2. Перед окрашиванием удалите остатки сыворотки и фенолового красного.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Остатки сыворотки и фенолового красного могут увеличить фоновую автофлуоресценцию.
    3. Окрашивание живых клеток
      1. Приготовьте свежий рабочий раствор Calcein AM с концентрацией 2 µM в HBSS+/+.
      2. Добавьте достаточное количество раствора для окрашивания, чтобы полностью покрыть поверхность дентина.
      3. Инкубируйте образец в течение 20 мин при 37°C в темноте.
      4. После инкубации удалите раствор для окрашивания.
    4. Окрашивание мертвых клеток
      1. Добавьте рабочий раствор пропидия иодида (1–2 µg/mL в HBSS+/+).
      2. Инкубируйте образец в течение 5–8 мин при 37°C в темноте.
      3. Не превышайте время инкубации 10 мин.
      4. Дважды промойте образец раствором HBSS+/+.
      5. Держите образец погруженным в буфер до момента получения снимков.
    5. Конфокальная микроскопия
      1. Получите конфокальные изображения в течение 30 мин после окрашивания.
      2. Последовательно получите изображения в зеленом и красном каналах.
      3. Для визуализации живых клеток используйте λex 490 nm и λem 515 nm.
      4. Для визуализации мертвых клеток используйте λex 535 nm и λem 617 nm.
        ​ПРИМЕЧАНИЕ: Защищайте флуоресцентные растворы для окрашивания и окрашенные образцы от воздействия света во время инкубации и процедур визуализации (Рисунок 2B).

Сравнение электронной и флуоресцентной микроскопии, анализ клеточной структуры.
Рисунок 2: Репрезентативная оценка адгезии и жизнеспособности стволовых клеток зубного пульпы в устройстве OoC комплекса дентин-пульпа. (A) Снимок сканирующей электронной микроскопии, демонстрирующий адгезированные стволовые клетки зубного пульпы (белая звездочка) на поверхности дентина после 24 h статической культуры в устройстве OoC. Через 24 h культуры адгезированные клетки покрывали 54.35 ± 0.92% поверхности дентина, открытой микроканалу. Клетки не наблюдаются в области дентина, перекрытой PDMS (черная звездочка), что указывает на эффективную герметизацию между слоями устройства. Масштабная линейка = 200 µm. (B) Снимок конфокальной микроскопии, демонстрирующий жизнеспособные стволовые клетки зубного пульпы, окрашенные в зеленый цвет и прикрепившиеся к поверхности дентина (белые стрелки) после 24 h статической культуры. Также наблюдаются нежизнеспособные клетки, окрашенные в красный цвет (синие стрелки). Масштабная линейка = 50 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешное изготовление устройства «зуб-на-чипе» проводилось в соответствии с рабочим процессом, показанным на рисунке 1A–1I, который включал подготовку диска дентина (рисунок 1D), изготовление формы методом фотолитографии (рисунок 1E), удаление отвержденных слоев PDMS (рисунок 1F), плазменную активацию перед склеиванием (рисунок 1G), сборку готового устройст...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данном исследовании представлен пошаговый протокол изготовления устройства «зуб на чипе» с вертикальным стеком, включающего дентин и стволовые клетки зубного пульпы, а также продемонстрированы репрезентативная адгезия и жизнеспособность клеток внутри устройства в условиях статического культивирования. Протокол был разработан для обеспечения воспроизводимого рабочего процесса изготовления и сборки платформы «орган-на-чипе» (OoC) комплекса дентин–пульпа, подходящей для исследований интерфейса дентина in vitro. Создание т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов и конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.

Благодарности

Данная работа была поддержана проектами DIM24-0004 и PP24-0031 управления по исследованиям (Dirección de Investigación) Университета Ла-Фронтера; грантом FONDECYT Regular № 1260116 и грантом FONDECYT de Iniciación № 11230701 Национального агентства по исследованиям и разработкам (ANID), Чили.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Биологические и химические материалы
АцетонExpertQSOLV 8Очистка кремниевой пластины
Культуральная среда Alpha MEMCytivaSH30265.02Среда для культивирования стволовых клеток зубного пульпы
Хлорамин (0,5%)Merck7080-50-4Раствор для хранения дисков дентина
Стволовые клетки зубного пульпыНе применимоНе применимоПервичная культура клеток. См. этапы 3.2.1 и 3.2.2
ЭДТА (10%)WinklerN2222158EУдаление смазочного слоя
Негативный фоторезист на эпоксидной основеGersteltecGM1060Изготовление формы методом фотолитографии
Глутаральдегид (2,5%) в 0,1 M фосфатном буфере Соренсена’Sigma-Aldrich210908-06Фиксация для СЭМ
Здоровые зубы человека (моляры или премоляры)Не применимоНе применимоОбразец человека
ИзопропанолExpertQSOLV 16Очистка пластин, остановка проявления и очистка PDMS
Набор для определения жизнеспособности LIVE/DEADSigma-Aldrich451Флуоресцентное окрашивание жизнеспособности. 
PBS (фосфатно-солевой буфер)Corning46-013-CMПромывка и тестирование на утечки
Основа PDMS и отвердитель (полидиметилсилоксан)DowSylgard 184Изготовление устройства
PGMEASigma Aldrich484431Проявление фоторезиста
Трипановый синийSigma Aldrich T8154-100mlОценка жизнеспособности клеток
ТрипсинCorning25-053-CIОткрепление клеток
Ультрачистая водаCytivaSH30529.01Раствор для промывки
Расходные материалы и лабораторная посуда
Иглы для шприцев 19GVmaticVCB19050Соединение устройства с микронасосом или шприцем
Биопсийный панч (диаметр: 1 mm)Harris UnicoreWHAWB100073Изготовление входного и выходного портов
Коврик для резкиNicecoolНе применимоЗащита поверхности при вырезании
Стоматологические отделочные диски (например, Sof-Lex)3MSof-LexПолировка дентина
Переходники с Luer на штуцер (female)Runze FluidicsRH-M016Соединение трубок
Стеклянная или пластиковая палочка для перемешиванияDuranНе применимоПеремешивание PDMS
Подкожные шприцыCranberrypc-12246Посев клеток и тестирование на утечки
Стерильная марля без ворсаLindersonНе применимоУдаление остатков после вырезания
Переходники Luer (male)Runze FluidicsRH-G016Соединение трубок
Сосуд для смешиванияDuranНе применимоПриготовление PDMS
Чашка Петри (140 mm × 20 mm)Deltalab2000219Культивирование клеток/инкубация
Политетрафторэтиленовая основаCCTValНе применимоИзготовление промежуточного слоя дентина
Кремниевая пластинаJiaozuo Commercial FineWinНе применимоИзготовление формы
Силиконовая трубкаRunze Fluidics96421Жидкостное соединение
Флакон T75Corning 353136Экспансия стволовых клеток зубного пульпы
Многолуночный планшетSPL Life Sciences30006Конфокальное окрашивание и подготовка к визуализации
Оборудование и инструменты
Осушитель воздухаMETALPLANTITAN-040Осушка сжатого воздуха
Источник сжатого воздухаSCHULZCSD-18.1Очистка формы и поверхности
Конфокальный микроскопOlympusНе применимоМодель: FV1000
Система прямой лазерной литографииHeidelberguPG 101Экспонирование фоторезиста
Экологический сканирующий электронный микроскопHitachiНе применимоМодель: Quanta 400 
Высокоскоростной наконечникNakanishiНе применимоМодель: Pana-max2
Плитка подогреваLabTechEH20A PlusЗапекание пластины и фоторезиста
Ламинарный шкафBioBaseBBS8V1708313DСтерилизация устройства
Микрофлюидный насосNew EraНе применимоМодель: 1002X-ES. Тестирование на утечки при 10 µL/min
Микроструктурированная форма (изготовленная методом фотолитографии)CCTValНе применимоСпецификации изготовления формы см. в этапе 2.2
Печь или инкубаторMemmertUN110Отверждение PDMS при 50°C и консолидация связи при 75°C
Вакуумная камера для плазменной очисткиFari PlasmaGD-5Плазменная активация пластины
Ручной коронный плазмотрон Aurora Pro ScientificAPS-CD-20ACПлазменная активация PDMS
Ультразвуковой очистительElma SonicS 10 (H)Очистка пластины
Вакуумная камера или эксикатор (250 mm)WinglassНе применимоДегазация PDMS
Вакуумный насосROCKER300Дегазация PDMS

Ссылки

  1. Schlüter KD. The use of animals in physiological science: the past, the present, and the future. Pflugers Arch. 2024;476(11):1653-63.
  2. Robinson NB, et al. The current state of animal models in research: a review. Int J Surg. 2019;72:9-13.
  3. Nakashima M, et al. Animal models for stem cell-based pulp regeneration: foundation for human clinical applications. Tissue Eng Part B Rev. 2019;25(2):100-13.
  4. Ribeiro AB, et al. Short-term effect of ligature-induced periodontitis on cardiovascular variability and inflammatory response in spontaneously hypertensive rats. BMC Oral Health. 2021;21(1):515.
  5. IQVIA Institute. Global trends in R&D 2022. IQVIA Institute; 2021.
  6. Loewa A, Feng JJ, Hedtrich S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. 2023;1:1-15.
  7. Paul SM, et al. How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 2010;9(3):203-14.
  8. Rosa V, et al. A critical analysis of research methods and biological experimental models to study pulp regeneration. Int Endod J. 2022;55(Suppl 2):446-55.
  9. França CM, et al. The tooth on-a-chip: a microphysiologic model system mimicking the biologic interface of the tooth with biomaterials. Lab Chip. 2020;20(2):405-13.
  10. Zhang H, et al. Research and development of microenvironment's influence on stem cells from the apical papilla: construction of novel research microdevices, tooth-on-a-chip. Biomed Microdevices. 2024;26(3):33.
  11. Han JJ. FDA Modernization Act 2.0 allows for alternatives to animal testing. Artif Organs. 2023;47(3):449-50.
  12. Leung C, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2:33.
  13. Whitesides GM. The origins and the future of microfluidics. Nature. 2006;442:368-73.
  14. Belin S, Zuloaga KL, Poitelon Y. Influence of mechanical stimuli on Schwann cell biology. Front Cell Neurosci. 2017;11:347.
  15. Jansen KA, et al. A guide to mechanobiology: where biology and physics meet. Biochim Biophys Acta. 2015;1853(11):3043-52.
  16. Atif AR, et al. A microfluidics-based method for culturing osteoblasts on biomimetic hydroxyapatite. Acta Biomater. 2021;127:327-37.
  17. Soragni C, et al. A versatile multiplexed assay to quantify intracellular ROS and cell viability in 3D on-a-chip models. Redox Biol. 2022;57:102488.
  18. Ingber DE. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nat Rev Genet. 2022;23(8):467-91.
  19. Huang C, et al. The application of organs-on-a-chip in dental, oral, and craniofacial research. J Dent Res. 2023;102(4):364-75.
  20. Rodrigues NS, et al. Biomaterial and biofilm interactions with the pulp-dentin complex-on-a-chip. J Dent Res. 2021;100(10):1136-43.
  21. Cordiale A, et al. An innovative "tooth-on-chip" microfluidic device emulating the structure and physiology of the dental pulp tissue. Adv Healthc Mater. 2025. doi:10.1002/adhm.202502080.
  22. Sanz-Serrano D, Mercade M, Ventura F, Sánchez-de-Diego C. Engineering a microphysiological model for regenerative endodontic studies. Biology. 2024;13(4):221.
  23. Qi Y, et al. Fabrication of tapered fluidic microchannels conducive to angiogenic sprouting within gelatin methacryloyl hydrogels. J Endod. 2021;47(1):52-61.
  24. Hu Q, et al. Gum-on-a-chip exploring host-microbe interactions: periodontal disease modeling and drug discovery. J Tissue Eng. 2025;16:20417314251314356.
  25. Svanberg S, et al. "Periodontal ligament-on-chip" as a novel tool for studies on the physiology and pathology of periodontal tissues. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2303942.
  26. Mishra A, et al. Fluid flow-induced modulation of viability and osteodifferentiation of periodontal ligament stem cell spheroids-on-chip. Biomater Sci. 2023;11(22):7432-44.
  27. Rahimi C, et al. Oral mucosa-on-a-chip to assess layer-specific responses to bacteria and dental materials. Biomicrofluidics. 2018;12(5):054106.
  28. Dhall A, et al. A dental implant-on-a-chip for 3D modeling of host-material-pathogen interactions and therapeutic testing platforms. Lab Chip. 2022;22(24):4905-16.
  29. Franca CM, et al. In vitro models of biocompatibility testing for restorative dental materials: from 2D cultures to organs-on-a-chip. Acta Biomater. 2022;150:58-66.
  30. Hu S, et al. Characterization of silver diamine fluoride cytotoxicity using microfluidic tooth-on-a-chip and gingival equivalents. Dent Mater. 2022;38(8):1385-94.
  31. Niu L, et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomater Sci Eng. 2019;5(9):4844-51.
  32. Sriram G, Makkar H. Microfluidic organ-on-chip systems for periodontal research: advances and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 2025;12:1490453.
  33. Pierfelice TV, et al. A systematic review on organ-on-a-chip in PDMS or hydrogel in dentistry: an update of the literature. Gels. 2024;10(2):102.
  34. Baeza-Fernández J, Bucchi C. Organ-on-a-chip devices to simulate the dentin-pulp complex: a qualitative systematic review. Ann Biomed Eng. 2026. doi:10.1007/s10439-026-04058-0.
  35. Arola D, et al. Transition behavior in fatigue of human dentin: structure and anisotropy. Biomaterials. 2007;28(26):3867-75.
  36. Kratz SRA, et al. A compression transmission device for the evaluation of bonding strength of biocompatible microfluidic and biochip materials and systems. Sci Rep. 2020;10(1):1400.
  37. Carvalho V, et al. 3D printing techniques and their applications to organ-on-a-chip platforms: a systematic review. Sensors (Basel). 2021;21(9):3304.
  38. LeGoff L, Lecuit T. Mechanical forces and growth in animal tissues. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;8(3):a019232.
  39. Akimoto S, et al. Laminar shear stress inhibits vascular endothelial cell proliferation by inducing cyclin-dependent kinase inhibitor p21(Sdi1/Cip1/Waf1). Circ Res. 2000;86(2):185-90.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.