Влияние вермикулита и Azospirillum brasilense на рост и физиологию пшеницы под кадмийским стрессом

Краткое содержание

Применение вермикулита и Azospirillum brasilense, особенно в сочетании, улучшает рост пшеницы, урожайность зерна, скорость фотосинтеза, проводимость устьица и содержание хлорофилла, при этом снижая утечку электролитов и накопление Cd в тканях растений под кадмийским (Cd) стрессом.

Аннотация

Загрязнение кадмием (Cd) в сельскохозяйственных почвах представляет серьёзную угрозу продуктивности сельскохозяйственных культур и здоровью человека. В этом исследовании оценивался потенциал вермикулита и бактерии, стимулирующей рост растений Azospirillum brasilense , для снижения токсичности Cd в пшенице (Triticum aestivum L.). Был проведён эксперимент с тремя репликациями и девятью методами обработки: T0 (контрольный), T1 (Cd 100 мг/кг), T2 (Cd 100 мг/кг + вермикулит), T3 (Cd 100 мг/кг + A. brasilense), T4 (Cd 100 мг/кг + вермикулит + A. brasilense), T5 (Cd 200 мг/кг), T6 (Cd 200 мг/кг + вермикулит), T7 (Cd 200 мг/кг + A. brasilense), и T8 (Cd 200 мг/кг + вермикулит + A. brasilense). Более высокий уровень Cd приводил к более серьёзному тормозу роста пшеницы. Однако обработка вермикулитом и A. brasilense значительно улучшила рост растений, уменьшила накопление Cd в тканях растений и повысила активность антиоксидантных ферментов (SOD, CAT). Примечательно, что совместное применение вермикулита и A. brasilense (T4 и T8) показало наиболее эффективное снижение стресса Cd. При содержании 100 мг/кг Cd (T4) пшеничные растения показали увеличение высоты на 10,67%, длину колона на 10,21% и на 19,87% более высокий урожай зерна по сравнению с обработкой только с Cd. При уровне стресса Cd (T8) при уровне 200 мг/кг та же комбинация привело к увеличению высоты растения на 44,83%, увеличению длины шипа на 17,63% и увеличению урожайности на 44,83% по сравнению с необработанными растениями, испытывающими стресс Cd (T5). Эти результаты показывают, что синергетическое использование вермикулита и Azospirillum brasilens повышает устойчивость пшеницы к токсичности Cd. Их совместное применение улучшает параметры роста, физиологические особенности и урожайность в условиях стресса с Cd, обеспечивая экологически чистый подход к очистке почв, загрязнённых Cd, и поддержанию урожайности пшеницы.

Введение

Пшеница (Triticum aestivum L.) — жизненно важная основная пищевая культура, которая обеспечивает основной источник энергии для миллионов людей¹. Как основной источник пищи, он выращивается на обширных сельскохозяйственных землях, особенно в умеренных регионах. Универсальность, питательная ценность и адаптивность пшеницы к различным условиям окружающей среды делают её краеугольным камнем продовольственной^{безопасности 2}. Однако потенциал урожайности пшеницы часто снижается из-за различных абиотических и биотических стрессов, что приводит к значительной потере урожайности. Одной из острых проблем сегодняшнего производства пшеницы является загрязнение почвы тяжёлыми металлами, особенно кадмием (Cd)^2,3. Кадмий, токсичный тяжёлый металл, может вводиться в сельскохозяйственные почвы через промышленную деятельность, использование фосфатных удобрений и орошение загрязнённой водой. Оказавшись в почве, Cd легко всасывается пшеничными растениями, где накапливается в различных тканях, вызывая окислительный стресс, нарушающие физиологические функции и замедляя рост³. Токсичное воздействие Cd на пшеницу не только снижает урожайность, но и вызывает проблемы со здоровьем человека из-за потребления загрязнённого зерна. Токсичность тяжёлых металлов и другие факторы, такие как дефицит питательных веществ, плохая структура почвы, стресс от засухи и неоптимальные агрономические практики, способствуют низкому урожаю^{пшеницы 4}. Постоянная угроза изменения климата усугубляет эти проблемы, делая всё более трудным достижение устойчивого производства^{пшеницы 5}.

Вермикулит — это природный минерал, который привлёк значительное внимание в сельском хозяйстве благодаря своим уникальным свойствам и преимуществам в качестве дополнения почвы. Состоящий преимущественно из гидратированного магния-алюминия-железного силиката, вермикулит известен своей способностью расширяться при нагревании, что приводит к легкому и высокопористому^{материалу 6}. Эта расширенная форма вермикулита обладает отличными способностями удерживать воду и аэрировать, что делает её идеальной средой для улучшения структуры почвы и ускорения роста растений. В сельскохозяйственных приложениях вермикулит является критически важным компонентом в почвенных смесях, особенно в районах с низким качеством почвы или в условиях, требующих усиленного управления водой и питательными^{веществами 7}. Вермикулит способен удерживать воду в почве и поддерживать влажность почвы под водным стрессом. Он ценен для предотвращения увлажнения и обеспечения стабильного прибытия влаги для корней растений. Кроме того, высокая способность вермикулита к катионному обмену (CEC) позволяет ему обеспечивать растениям такие питательные вещества, как калий (K), кальций (Ca) и магний (Mg), которые со временем ^{доступны растениям 8}. Роль вермикулита в снижении факторов экологического стресса, таких как загрязнение тяжелыми металлами, представляет особый интерес в устойчивом сельском^{хозяйстве 6}. Благодаря высокой площади поверхности и склонности к тяжёлым металлам вермикулит может адсорбировать и обездвиживать токсичные элементы, такие как кадмий (Cd), в почве, снижая их биодоступность для растений. Это не только защищает культуры от вредных последствий токсичности металлов, но и помогает поддерживать здоровье почвы, удаляя вредные вещества ^6,9.

Azospirillum brasilense — известная ризобактерия, способствующая росту растений (PGPR), которая привлекла значительный интерес в сельскохозяйственных исследованиях и практике благодаря своей способности улучшать рост и устойчивость растений при различных стрессовых^{условиях 10}. Изначально выделенная из ризосферы тропических трав, A. brasilense — это свободно живущая бактерия, которая колонизирует корни широкого спектра культур, включая пшеницу (Triticum aestivum L.), где она устанавливает благоприятные отношения с растением-хозяином¹¹. Основные механизмы, с помощью которых A. brasilense способствует росту сельскохозяйственных культур, связаны с фиксацией атмосферного_N2 (азота), который он легко поглощает и использует для работы растениями. Эта биологическая фиксация азота снижает потребности синтетических удобрений для роста растений, способствуя более устойчивым сельскохозяйственным^{практикам 1,11}. A. brasilense известен производством индол-3-уксусной кислоты (IAA), которая является фитогормоном и способствует развитию корней; Такое развитие корней может улучшить усвоение питательных веществ. Помимо стимуляции роста, A. brasilense также может повысить устойчивость растений к токсичности тяжёлых^{металлов 12}. В загрязнённых почвах A. brasilense может модулировать физиологические и биохимические реакции растения, снижая поглощение и накопление металлов, таких как кадмий (Cd). Бактерия достигает этого с помощью нескольких механизмов, таких как изменение паттернов экссудации корней, повышение активности антиоксидантных ферментов и производство внеклеточных полимерных веществ, способных связываться с тяжёлыми металлами, тем самым снижая их доступность для^{растений 13}. Потенциал A. brasilense в снижении токсичности Cd в пшенице особенно значим в современном сельском хозяйстве, где загрязнение почвы тяжёлыми металлами представляет растущую угрозу для урожайности культур и безопасности продуктов питания. Используя природные возможности A. brasilense, фермеры могут улучшить здоровье и урожайность пшеницы даже в сложных условиях, способствуя продовольственной безопасности и экологической^{устойчивости 11,13,14}.

Растущая проблема загрязнения кадмием (Cd) в сельскохозяйственных почвах представляет серьёзную угрозу устойчивому производству сельскохозяйственных культур, особенно основных культур, таких как^{пшеница.} Cd — это токсичный тяжёлый металл, который не только затрудняет рост растений, но и может накапливаться в съедобных частях культур. По мере того как сельскохозяйственные практики всё больше сталкиваются с двойным давлением — загрязнением окружающей среды и необходимостью повышения производительности, необходимы инновационные и устойчивые стратегии для смягчения воздействия тяжёлых металлов, таких как Cd, на здоровье^{сельскохозяйственных культур 15}. Совместное применение вермикулита и Azospirillum brasilense предлагает перспективный подход к устранению токсичности Cd в^{пшенице} 7,9,14,16. Вермикулит благодаря высокой способности к катионному обмену и свойствам удерживания воды улучшает структуру почвы, повышает доступность питательных веществ и снижает подвижность металлов, таких как Cd, в^{почве 8}. С другой стороны, A. brasilense, ризобактерия, способствующая росту растений, повышает устойчивость растений к токсичности тяжёлых металлов, модулируя физиологию корней, вырабатывая фитогормоны и снижая биодоступность токсичных металлов через различные биохимические^{пути 14}. Интеграция вермикулита и A. brasilense в единую стратегию управления использует сильные стороны обоих компонентов, создавая синергетический эффект, более эффективный, чем использование одного из компонентов^{по отдельности.} Способность вермикулита обездвиживать Cd в почве дополняет роль A. brasilense в усилении защитных механизмов растений от стресса Cd. Кроме того, вермикулит может создавать более благоприятные условия для процветания A. brasilense, улучшая аэрацию почвы и уровень влажности, что критически важно для выживания и активности бактерии в^{ризосфере 11,14}. Однако совокупное влияние вермикулита и A. brasilense на рост пшеницы и физиологические показатели при стрессе Cd систематически не исследовано.

Необходимость такого совместного применения возникает из-за ограничений традиционных подходов к управлению токсичностью Cd. Традиционные методы, такие как химические добавки, часто обеспечивают лишь временное облегчение и могут иметь негативные экологические последствия. Совместное использование вермикулита и A. brasilense может предложить более устойчивое решение, которое не только снижает токсичность Cd, но и улучшает общее состояние почвы и рост растений, что приводит к улучшению урожайности, физиологии и качества пшеницы. Совместное применение вермикулита и A. brasilense для роста пшеницы и физиологической эффективности при стрессе Cd не было систематически изучено. Для устранения этого пробела в знаниях в данном эксперименте с горшком были проверены следующие гипотезы: (H₁) применение вермикулита снижает накопление Cd в тканях пшеницы и улучшает рост и урожайность; (H₂) Инокуляция A. brasilens улучшает физиологические показатели (скорость фотосинтеза, проводимость устьиц, содержание хлорофилла) и усвоение питательных веществ; и (H₃) Совместное применение даст больше улучшений, чем одно из этих изменений, связанное с более высокой колонизацией бактериальных корней. Это исследование не претендует на предоставление прямых рекомендаций по применению в полевых условиях, поскольку эти вопросы требуют полевых испытаний, выходящих за рамки контролируемого эксперимента.

Протокол

В этом исследовании были соблюдены все местные, национальные и международные руководящие принципы и законодательство по использованию растений. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

Экспериментальная планировка и материал
Эксперимент с горшком был проведён на крыше здания кафедры сельскохозяйственной инженерии Университета инженерии и информационных технологий Хваджи Фарид в Пакистане (28,42° с.ш., 70,30° в.д.) для изучения роли вермикулита и Azospirillum brasilense для снижения токсичности кадмия (Cd) в посеве пшеницы в зимний сезон 2023–2024 годов. Для этого эксперимента использовалась полностью рандомизированная конструкция (CRD) с тремя повторениями. Одобренный сорт пшеницы «Дилкаш-20» был получен на ферме Adoptive Research Farm Rahim Yar Khan, который подходит для местного региона. Использовался горшок размером 1 x 1 x 1 фут (30,48 см × 30,48 см × 30,48 см), содержащий 12 кг почвы. Стерилизация семян была проведена перед экспериментом в агрономической лаборатории с 70% этанолом. Семена были посеяны 10^ноября 2023 года. В каждый горшок помещали по 8 семян пшеницы, а 4 растения поддерживались на стадии обработки. Вермикулит получался на местном рынке и вносился во время добавления почвы в содержании 150 г/кг почвы. Azospirillum brasilense была получена в Государственном колледже Университета Лахора (GCUL), Лахор, Пакистан. Azospirillum brasilense применялся вместе с инокуляцией семян в пшенице по стандартной процедуре, как сообщают Zaheer и ^{др. 17}. Эксперимент состоял из 9 обработок (T₀ = Контроль (без добавки почвы, без токсичности Cd),_{T 1} = токсичность Cd 100 мг/кг почвы,_{T 2} = Cd 100 мг/кг почвы + вермикулит,_{T 3} = Cd 100 мг/кг почвы + A. brasilense,_{T 4} = Cd 100 мг/кг почвы + вермикулит + A. brasilense,_{T 5} = токсичность Cd 200 мг/кг почвы, T₆ = Cd 200 мг/кг почвы + вермикулит,_{T 7} = Cd 200 мг/кг почвы + A. brasilense,_{T 8} = Cd 200 мг/кг почвы + вермикулит + A. brasilense). Средняя месячная температура в °C и влажность в % на экспериментальном участке показаны в таблице 1. Перед началом эксперимента был проведен анализ почвы, и свойства почвы показаны в таблице 2. Орошение применялось в соответствии с требованиями на этапах культивации, обувки, антезиса и наполнения зерна, а удобрения также применялись равномерно согласно рекомендациям. Орошение проводилось вручную с помощью банки с водой и поддерживало 70% влажности почвы в каждом горшке, без стресса от засухи. Удобрения были внесены в соответствии с рекомендациями сельскохозяйственного департамента (120-80-60 кг NPK га-1). Удобрения рассчитывались в зависимости от размера каждого горшка. Полные дозы P и K и половина дозы азота вносились во время посева, а оставшаяся половина дозы азота — на этапе рассеяния. Деструктивный отбор проб для измерения длины корней и побегов (через 30 дней после посева) проводился на отдельных горшках, предназначенных для раннего сбора урожая; Эти контейнеры не использовались для окончательных измерений выхода, поэтому ранний разрушительный отбор проб не повлиял на последующие данные о выходе. Схематическая хронология эксперимента следующая: 0-й день (подготовка почвы, выделение Cd, смешивание вермикулита, инокуляция семян, посев), 10–30-й день (отбор корней для qPCR), 30-й день (длина корней и побегов), 85-й день (антезис: физиологические измерения) и 120-й день (урожай: параметры урожайности). Образцы растений были собраны в трёх временных точках. Через 10, 20 и 30 дней после посева (DAS) корни собирались из отдельных горшков. При 30 DAS отдельные горшки были разрушительно собраны по длине корней и побегов. При 85 DAS (антезисе) физиологические параметры измерялись неразрушительно. При 120 DAS были зафиксированы окончательные параметры выхода. Потенциометры, используемые для раннего разрушительного отбора проб (10–30 DAS), не применялись для измерения выхода выхода.

Кадмий применялся в виде хлорида кадмия (CdCl₂•2,5H₂O, аналитический класс, чистота ≥98%). Требуемые количества для целевых концентраций 100 мг Cd kg⁻¹ почвы и 200 мг Cd kg⁻¹ почвы рассчитывались на основе сухого веса почвы (12 кг на горшок). CdCl₂ растворялся в 500 мл деионизированной воды в каждом горшке и тщательно смешивался с почвой с помощью механического миксера в течение 15 минут для обеспечения однородного распределения. После смешивания шиповатую почву помещали в горшки с пластиковой подкладкой и давали выравниваться в течение 14 дней при комнатной температуре (25 ± 2 °C) с периодическим смешиванием каждые 3 дня для стабилизации видообразования Cd и позреждения. Влажность почвы поддерживалась на уровне 70% от вместимости поля в период уравновешения. После уравновешения были собраны представительные образцы почвы (по 10 г на горшок), высушены на воздухе, переварены с помощью HNO₃/HClO₄ (4:1, v/v) и проанализированы на полную концентрацию Cd с помощью атомного абсорбционного спектрофотометра для подтверждения фактических уровней Cd. Измеренные концентрации Cd составили 98,4 ± 3,2 мг кг⁻¹ для лечения 100 мг кг⁻¹ и 197,6 ± 5,1 мг кг⁻¹ для лечения 200 мг кг⁻¹ , что подтверждает достижение целевых уровней. Физико-химические свойства и содержание тяжелых металлов вермикулита, используемого в этом исследовании, показаны в Таблице 3.

Месяц	Температура (°C)	Влажность (%)
Ноябрь, 2023	28	56
Декабрь, 2023	18	62
Январь, 2024	17	63
Февраль, 2024	18	32
Март 2024 года	21	25
Апрель, 2024	24	20

Таблица 1: Средняя температура и влажность экспериментального участка в период 2023–2024 годов.

Параметры	Ценности (2023-24)
Органическое вещество	0.56%
pH	7.42
EC	227 мкС/см
Т.С.С.	0.54%
Доступно-P	5,21 ppm
Доступно-К	119 ppm
Процент насыщения	34
Почва разделяет: песок, ил, глина (%)	36%, 40 %, 24 %

Таблица 2: Свойства почвы почвы, использованной для эксперимента перед посевом культуры.

Свойства	Ценность	Металл	Концентрация (мг кг⁻¹)
Оценка	Садоводческая категория	Кадмий (CD)	< 0,01 (ниже предела обнаружения)
Размер частиц	2-4 мм	Свинец (Pb)	2.1
pH (1:5 в H₂O)	7.2	Медь (Cu)	1.8
Ёмкость катионного обмена (CEC)	85.4 cmolc kg⁻¹	Цинк (Zn)	5.3
Водоёмкость (WHC)	450% (ч/б)	-	-
Плотность объёма	0,12 г см-3	-	-
Частота применения	150 г кг⁻¹ почвы (15% ч/ш)	-	-
Количество на горшок (12 кг почвы)	1,8 кг	-	-

Таблица 3: Физико-химические свойства и содержание тяжелых металлов вермикулита, используемые в данном исследовании.

Изученные черты
Все параметры, связанные с ростом растений, такие как высота растения, длина колоска, количество колосков на колос, зерна на колос, вес 1000 зерен и урожайность зерна на растение, фиксировались вручную с помощью стержня и весового баланса по стандартной процедуре. Биохимический анализ (определение активности антиоксидантных ферментов) и физиологический анализ (скорость фотосинтеза, проводимость устьиц, содержание хлорофилла, утечка электролитов (EL), темп роста культур (CGR) и индекс площади листьев (LAI)) проводились на стадии антезиса после 85 дней посева. Длина корней и побегов отмечалась после 30 дней роста пшеничных растений, когда растения удаляли, чтобы сохранить 4 растения в горшке после 20 дней посева. Для наблюдения скорости фотосинтеза, проводимости устьица и содержания хлорофилла использовались инфракрасный газоанализатор (Cl-340) и хлорофиллметр (CL-1). Утечка электролитов (EL) измерялась с использованием уравнения, представленного Масселлом и^{Стэплсом 18} , с использованием стандартной процедуры, описанной Захиром и ^{др. 14}. EL рассчитывался как: EL (%) = (Начальный EC / Конечный EC) × 100, где начальная EC — это электрическая проводимость, измеряемая после 24 часов инкубации при 25 °C, а конечная EC — проводимость, измеряемая после автоклавирования образцов при 121 °C в течение 20 минут.

Растворённый органический азот (DOC), растворённый органический углерод (DOC) и органический углерод в почве (SOC) измерялись по стандартной^{процедуре 19}. LAI и CGR были выявлены согласно^{процедуре 20}. Было зафиксировано поглощение N, P и K пшеничными растениями, как указано в процедуре, описанной в предыдущем^{отчёте 21}.

Статистический анализ
Все данные для этого исследования были собраны из трёх репликаций, собраны и усреднены. Данные анализировались статистически с использованием Statistic 8.1 и Microsoft Excel 2010. Данные анализировались с помощью одностороннего ANOVA, за которым последовал тест Фишера на наименее значимую разницу (LSD) при p ≤ 0,05 для среднего разделения. Разные буквы, отображаемые с данными и результатами, показывают статистическую разницу между каждым лечением.

Результаты

Высота растения (PH) существенно подвергалась изменениям почвы во всех изученных методах обработки (Таблица 4). Самый высокий pH был зафиксирован при T0 (199,44 см), когда не было подростков почвы и токсичности Cd, затем T4 (98,44 см), когда токсичность Cd составляла 100 мг/кг почвы при применении вермикулита и A. brasilense. Самый низкий pH (82,37 см) был зафиксирован в T5 при токсичности почвы Cd 200 мг/кг. Также было отмечено, что PH снижается с ростом токсич...

Обсуждение

Токсичность Cd значительно снизила все измеренные параметры роста и урожайности^{пшеницы 22}. Это подавление роста можно объяснить оксидативным стрессом, вызванным Cd, который нарушает деление и удлинение клеток, ухудшает усвоение питательных веществ и снижает эффективность фотосинтеза. Аналогично, количество колосков на колосок, зерен на колосок, вес зерен и урожайность на растение значительно снижалось под давлением Cd. Эти результаты совпадают с предыдущими исслед...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Спектрофотометр атомного поглощения (САФ)	PerkinElmer, США	AAnalyst 800	Проверка концентрации Cd в почве
Azospirillum brasilense	Government College University Lahore (GCUL), Пакистан	Штамм, доступный из коллекции культур GCUL	Инокуляция семян
Хлорид кадмия (CdCl2·2.5H2O)	Merck, Германия	CAS № 7790-78-5	Индукция стресса от Cd
Хлорофиллометр	Не указано	CL-1	Измерение содержания хлорофилла
DNeasy PowerSoil Kit	QIAGEN, Hilden, Германия	Кат. № 12888-100	Экстракция ДНК из корней
Excel 2010	Microsoft, США	Версия 14.0	Сбор данных и базовая статистика
Инфракрасный газовый анализатор (ИГА)	Не указано	CI-340	Фотосинтетическая скорость и проводимость устьиц
nifH-специфичные праймеры	Синтезированы по заказу	Последовательности предоставлены в тексте	qPCR амплификация
Нингидрин	Sigma-Aldrich, США	CAS № 485-47-2	Определение содержания пролина
QuantStudio 5 Real-Time PCR System	Applied Biosystems, США	QuantStudio 5	qPCR анализ
Спектрофотометр	Не указано	Не указано	Измерение содержания пролина
Statistik 8.1	Analytical Software, США	Версия 8.1	Статистический анализ (АНОВА, ЛСД)
SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems, США	Кат. № 4309155	qPCR обнаружение
Вермикулит (садовый сорт)	Местный рынок, Рахим Яр Хан, Пакистан	Не применимо	Улучшение почвы
Сорт пшеницы «Дилкаш-20»	Адаптивная исследовательская ферма, Рахим Яр Хан, Пакистан	Местный утвержденный сорт	Растительный материал