SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology): интегрированная вычислительная платформа для оптимизации рабочего процесса криоэлектронной микроскопии

Краткое содержание

Этот протокол демонстрирует пошаговый рабочий процесс криоэлектронной микроскопии с использованием интегрированной программной платформы (SMART), которая объединяет сбор данных, трёхмерную реконструкцию и построение атомарных моделей в одном браузерном интерфейсе. В качестве примера структура человеческого TRPML1 определяется с разрешением 2,38 Å.

Аннотация

Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) стала центральным инструментом в структурной биологии, однако современные рабочие процессы обычно требуют нескольких специализированных программных пакетов для сбора данных, трёхмерной (3D) реконструкции и построения атомных моделей, что приводит к фрагментированным конвейерам и частому ручному вмешательству. Здесь мы представляем SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology) — интегрированную программную платформу, объединяющую три модуля — DataSmart для автоматизированного сбора данных, CryoSmart для обработки изображений и 3D-восстановления, а также ModelSmart для построения атомарных моделей на основе глубокого обучения — в едином интерфейсе, доступном для браузера. Этот протокол предоставляет пошаговые инструкции по работе со всеми тремя модулями. Рабочий процесс включает автоматизированную навигацию и сбор данных по образцам, коррекцию движения, оценку по функции передачи контраста (CTF), подбор частиц, двумерную (2D) классификацию, 3D-доработку, улучшение карт и генерацию атомных моделей. В качестве примера мы применили полный рабочий процесс для определения структуры человеческого TRPML1 — лизосомного катионного канала Ca²⁺, достигающего глобального разрешения 2,38 Å по корреляции оболочки Фурье (FSC) по критерию 0,143. Все три модуля (DataSmart, CryoSmart и ModelSmart) были последовательно применены к одному и тому же набору данных TRPML1 в рамках этого исследования. Протокол разработан так, чтобы быть доступным пользователям с разным уровнем опыта крио-ЭМ.

Введение

Криоэлектронная микроскопия: технологическая эволюция и биологическое воздействие. Определение трёхмерной структуры белка остаётся центральной задачей в молекулярной биологии, поскольку биологическая функция тесно связана с пространственным расположением аминокислотных остатков. Разъяснение этих структурных конфигураций крайне важно для расшифровки ферментативных механизмов, взаимодействий лигандов и клеточных сигнальных путей с атомарным разрешением. Этот императив стал стимулом преобразующих разработок крио-ЭМ, который стал широко принятым методом структурной^{биологии 1,2}.

Крио-ЭМ-анализ одиночных частиц (SPA) служит мощным подходом для получения биологических данных по различным типам образцов путём разрешения высококачественных структур изолированных^{комплексов 3}. К ним относятся вирусы, мембранные белки, спиральные сборки и другие динамические и гетерогенные макромолекулярные комплексы, охватывающие широкий диапазон молекулярных размеров — от примерно 50 кДа до десятков мегадальтонов.

Cryo-EM SPA стал краеугольным методом для разрешения трёхмерных (3D) архитектур биологических макромолекул, включающий три взаимозависимых вычислительных этапа: сбор данных, 3D-реконструкция и построение атомарных моделей (рисунок 1).

Во время сбора данных витрификация образцов снимается в условиях низкой дозы для получения микрофотографических фильмов, фиксирующих тысячи проекций частиц в близкородных состояниях. Эти необработанные наборы данных затем обрабатываются с помощью итеративных алгоритмов выравнивания и классификации для восстановления карт объемной плотности. Наконец, создаются и дорабатываются атомные модели, чтобы соответствовать плотности, проясняя молекулярные взаимодействия с почти атомарным разрешением.

Приведённый выше анализ показывает, что выход крио-ЭМ представляет собой лишь отправную точку структурного конвейера. Преобразование этих исходных данных в интерпретируемые атомарные модели требует целого спектра специализированных вычислительных программных инструментов. Таким образом, программное обеспечение служит ключевым мостом, превращая исходные данные в атомарные модели.

Фрагментированная экосистема программного обеспечения крио-ЭМ: современные инструменты и ограничения. Современные рабочие процессы крио-ЭМ основаны на лоскутном наборе специализированных программных инструментов, каждый из которых адресован дискретным этапам:

Сбор данных. Хотя многочисленные программные пакеты для сбора данных крио-EM доступны публично — включая Leginon ^4,5,^{SerialEM 6}, UCSFImage4⁷, TFS^{EPU 8,9}, Gatan Latitude, JEOL JADAS¹⁰ и Auto-EMation¹¹ — эти инструменты преимущественно выводят сырые видеоданные с ограниченными возможностями обработки после получения. Критические шаги рабочего процесса, такие как настройка параметров, настройка шаблонов, по-прежнему требуют трудоёмких ручных операций, часто требующих слишком большого количества параметров в каждом наборе данных. Такая зависимость от экспертного вмешательства создаёт проблемы воспроизводимости и неэффективность рабочих процессов, особенно в сценариях с высокой пропускной способностью.

3D-реконструкция. крио-ЭМ достиг значительных достижений в программном обеспечении для 3D-реконструкции, позволяя почти атомарно разрешать биологические макромолекулы. Среди наиболее широко используемых инструментов — RELION, cryoSPARC и EMAN2, каждый из которых имеет свои преимущества и ограничения. RELION применяет байесовский подход к итеративной доработке, отлично справляясь с гетерогенными наборами данных и достигая высокоразрешающих^{реконструкций 12}. Однако его вычислительная интенсивность и крутая кривая обучения часто требуют вмешательства экспертов. cryoSPARC, использующий ускорение GPU и глубокое обучение, значительно сокращает время обработки и является удобным^{для пользователя 13}. EMAN2 предоставляет комплексный набор для отбора частиц и 3D-реконструкции, но требует обширной ручной настройки и отсутствует возможности обратной связи в реальном^{времени 14}. Хотя эти инструменты превосходны в отдельных аспектах 3D-реконструкции, они остаются ограниченными уникальными функциями, не интегрируя с восходящим собранием данных или атомарным моделированием вниз. Например, RELION и cryoSPARC требуют ручной передачи данных из программного обеспечения управления микроскопом, что приводит к неэффективности и возможным ошибкам. Кроме того, ни один из этих инструментов не обеспечивает точную оценку качества в реальном времени во время сбора данных или бесшовного перехода к построению атомарных моделей, что приводит к фрагментированным рабочим процессам, затрудняющим пропускную способность и воспроизводимость.

Последний вычислительный этап в структурном определении на основе крио-ЭМ — построение атомных моделей, когда молекулярные координаты итеративно встраиваются в реконструированные карты плотности для прояснения атомных взаимодействий.

Хотя традиционные методы построения моделей используют алгоритмы минимизации энергии на основе физики — включая электростатические потенциалы, взаимодействия ван дер Ваальса и ограничения ковалентной геометрии связей — они остаются сильно зависими от ручного вмешательства для начального размещения модели, интерпретации плотности и стереохимической валидации 15,16,17,18. Эта зависимость от профессионального кураторства не только ограничивает пропускную способность, но и вводит субъективные искажения, особенно в низкоразрешённых режимах (< 4 Å), где характеристики плотности неоднозначны.

Для преодоления этих ограничений появились методологии глубокого обучения (DL) как трансформирующие решения, использующие нейронные сети для автоматизации извлечения признаков, инициализации и доработки моделей. Эти подходы демонстрируют улучшенную производительность при обработке шумных или неполных карт плотности, при этом значительно снижая ручное вмешательство, что подтверждается недавними бенчмарками, показывающими сокращение на 40–60% шагов, зависящих от пользователя, по сравнению с обычными конвейерами^{19, 20, 21, 22}.

Однако эти методы неизбежно требуют экспорта карт плотности из программного обеспечения для 3D-реконструкции и их импорта в системы построения моделей. Перед импортом могут потребоваться дополнительные этапы предварительной обработки — часто с участием сторонних инструментов — для оптимизации карт плотности. Такой фрагментированный рабочий процесс требует повторяющихся передач данных и преобразования форматов, что приводит к неэффективности. Кроме того, если начальные результаты создания модели неудовлетворительны, исследователям приходится возвращаться к этапу реконструкции для повторного расчёта, за которым следует новый этап создания и валидации модели. Такие итеративные циклы значительно затрудняют пропускную способность и операционную эффективность трубопроводов структурного определения крио-ЭМ.

1.3 SMART: Интегрированное решение для сквозной крио-ЭМ

Несмотря на значительный прогресс в области крио-ЭМ SPA, отсутствие полностью интегрированных вычислительных решений продолжает препятствовать его потенциалу для высокопроизводительной структурной биологии. Существующие программные пакеты, хотя и отлично автоматизируют изолированные компоненты рабочих процессов — такие как сбор данных или 3D-реконструкция — не справляются с критическими разрывами между сбором необработанных микрофотографий, уточнением карт плотности и построением атомарных моделей. Эта фрагментация требует ручной передачи данных, преобразования форматов и резервной настройки параметров, что приводит к неэффективности, которая накапливается с масштабированием наборов данных.

Для устранения этих ограничений мы представляем Интегрированную платформу рабочего процесса крио-EM — интегрированную вычислительную платформу, объединяющую весь конвейер крио-EM SPA в единый рабочий процесс, управляемый ИИ. Интегрированная платформа объединяет три основных модуля: DataSmart (автоматизированный сбор данных), CryoSmart (гибридная 3D-реконструкция с поддержкой нейронных сетей) и ModelSmart (атомарное моделирование на основе глубокого обучения).

Три вычислительных модуля платформы связаны между собой через стандартизированный поток данных, обеспечивая оптимизированный поток данных, при котором выход одного модуля может информировать корректировку параметров на последующих этапах обработки. Эта интеграция направлена на сокращение количества ручных шагов и передачи данных, необходимых в традиционных рабочих процессах крио-ЭМ, что потенциально повышает доступность и эффективность лабораторий структурной биологии.

Протокол

Клеточная линия Expi293F, используемая для экспрессии белка TRPML1 человека, была приобретена у компании Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd (каталожный номер: SC0236058). Идентичность ячейки была корректно аутентифицирована с помощью профилирования короткого тандемного повтора (STR) (Дополнительный файл 1).

Этическое заявление
В этом исследовании не участвовали люди, животные или образцы, полученные непосредственно от людей или животных. Человеческий белок TRPML1 вырабатывался с помощью рекомбинантной экспрессии и очищался in vitro. Клеточная линия Expi293F, используемая для экспрессии рекомбинантных белков, является коммерчески доступной, устоявшейся бессмертной клеточной линией. Следовательно, институциональное этическое одобрение и письменное информированное согласие не требовались.

ПРИМЕЧАНИЕ: Интегрированная платформа рабочего процесса крио-EM структурирована в три основных модуля: модуль автоматизированного сбора данных, гибридный модуль 3D-реконструкции с поддержкой нейронных сетей и модуль атомарного моделирования на основе глубокого обучения, при этом данные служат интерфейсом связи между этими программными компонентами, как показано на рисунке 2. Интегрированная система платформы рабочих процессов крио-EM использует архитектуру браузер-сервер (B/S), позволяющую пользователям выполнять все операции через веб-интерфейс, обеспечивая удобство использования и операционную доступность.

1. Автоматизированный сбор данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Интегрированная платформа рабочих процессов крио-EM состоит из трёх основных модулей: автоматизированного модуля сбора данных, гибридного модуля 3D-реконструкции с поддержкой нейронных сетей и модуля атомарного моделирования на основе глубокого обучения. Данные служат интерфейсом связи между этими программными компонентами (рисунок 2). Система использует архитектуру браузер-сервер (B/S), которая позволяет выполнять все операции через веб-интерфейс.

1. Инициализация проекта
   1. Создайте новый проект в программной платформе автоматизированного модуля сбора данных.
   2. Выберите опцию наследования настроек конфигурации из недавнего проекта, если хотите. Повторное использование унаследованных параметров для установки электронного микроскопа вместо создания новой конфигурации.
2. Проверка смещения луча
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните регулировку смещения луча в программном обеспечении управления пропускающим электронным микроскопом (TEM).
   1. Проверка с низким увеличением (Atlas и GridSquare)
      1. Откройте модуль скрининга . Получите изображения с помощью увеличений Atlas и GridSquare.
      2. Убедитесь, что изображения хорошо освещены и не имеют смещения луча. Убедитесь, что центр изображения не расположен над сеткой.
   2. Проверка увеличения при получении данных
      1. Получайте изображения при увеличении сбора данных (например, 60K или 100K). Оцените выравнивание балок.
      2. Исправьте сдвиг пучка перед тем, как продолжить, если получение изображения не удалось или наблюдается значительный сдвиг пучка.
   3. Проверка евцентрического увеличения отверстия
      1. Получайте изображения при отверстии/эуцентрическом увеличении (обычно 8K). Регулировать смещение луча до центрирования точки освещения, если луч не по центру.
      2. Не изменяйте положение диафрагмы. Проверьте, совпадает ли размер диафрагмы с используемой при сборе данных.
3. Регулировка Z-высоты
   1. Авто-Eucentric Корректировка
      1. Перейдите на страницу отбора . Переместите сцену в область чистой углеродной пленки при увеличении на высоте отверстия/эвцентрика. Откройте модуль Auto-Eucentric на странице AutoFunction .
      2. Нажмите «Старт». Следите за панелью логов для получения обратной связи. Переместитесь в другую зону и повторите процедуру, если операция не сработает.
   2. Регулировка автофокуса
      1. Откройте модуль AutoFocus на странице AutoFunction. Нажмите «Старт».
      2. Прочитайте сообщения в журнале. Отрегулируйте параметры по указанию или повторите раздел 1.3.1, если автофокус не работает.
4. Проверка выравнивания увеличения
   1. Инспекция развал-схождения
      1. Найдите различимый элемент на увеличении данных и получите изображение. Получите изображение при увеличении Hole/EucentrricHeight.
      2. Сравните центральные области обоих изображений. Переходите к калибровке, если наблюдается несогласование увеличений данных и отверстия.
      3. Проверьте выравнивание между увеличениями Hole и GridSquare, если увеличения Data и Hole совпадают. Продолжайте без калибровки, если все уровни увеличения совпадают.
   2. Калибровка сдвига увеличения
      1. Перейдите на страницу калибровки . Откройте модуль Сдвига Увеличения . Начните с увеличения данных или наименьшего смещённого увеличения.
      2. Получите изображение с большим увеличением, содержащее уникальный элемент. Получите соответствующее изображение с малым увеличением. Оцените смещение между двумя изображениями.
      3. Кликните правой кнопкой мыши по месту, соответствующему центру объекта на изображении с малым увеличением. Выберите «Переместить здесь». Заново получите изображение с большим увеличением и проверьте выравнивание.
      4. При необходимости повторяйте корректировку. Нажмите « Далее », чтобы перейти к следующей паре увеличения после выравнивания. Повторите процедуру калибровки для всех оставшихся пар несогласованного увеличения.
5. Подготовка к сбору данных
   1. Выполняйте получение атласа, выбор квадратов, изображение квадратов и выбор отверстий
      1. Откройте модуль Atlas . Оставьте поле тайлов пустым, чтобы собрать все 81 тайл, или введите нужное количество плиток для получения.
      2. Перейдите к интерфейсу Square Select . Кликните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать подходящие квадраты.
      3. Перейдите на страницу выбора лунок . Нажмите «Подготовить всё». Следите за окном журнала до завершения получения изображений.
      4. Выберите запечатленое квадратное изображение из списка изображений. Используйте функцию Find Holes для автоматического выбора отверстия, когда отверстия хорошо видны.
         ВНИМАНИЕ: Автоматическое обнаружение отверстин может сработать на сетках с толстым льдом или загрязнением поверхности. Визуально проверяйте обнаруженные отверстия перед их получением и используйте полуавтоматический метод выбора отверстия, если автоматическое обнаружение ненадёжно.
      5. Используйте функцию выбора на основе семян , когда толстый лёд или загрязнение мешают надёжному автоматическому отбору (рисунок 3).
         1. Выберите центральное отверстие. Выберите два соседних отверстия, образующих прямой угол.
         2. Выберите два удалённых отверстия вдоль направлений, определённых вторым и третьим отверстиями.
         3. Нажмите «Отправить». Включите Move All при обработке другой клетки. Перетащите одно из пяти отверстий для семян в прозрачное отверстие. Нажмите «Отправить».
   2. Определение шаблона
      1. Перейдите на страницу определения шаблона . Нажмите «Приобрети », чтобы получить изображение. Проверьте, содержит ли изображение полное отверстие.
      2. Кликните правой кнопкой мыши по целевой области и выберите MoveStageTo , если полная дыра не видна. Заново получите шаблонное изображение. Укажите позицию изображения и автофокус, перетаскивая соответствующие маркеры.
      3. Введите количество кадров на отверстие. Введём желаемое значение дефокуса (например, −1,5 мкм). Проверьте все параметры получения (рисунок 4).
6. Повторная проверка смещения луча
   1. Повторите раздел 1.2 после завершения всех процедур подготовки.
7. Астигматизм и коррекция комы
   1. Коррекция астигматизма
      1. Переместите сцену на чистую углеродную плёнку. Отрегулируйте высоту с помощью автофокуса до желаемого значения дефокусировки (например, −1,5 мкм). Откройте модуль Autostigmate на странице AutoFunction .
      2. Нажмите «Старт». Следите за выходом Ctffind в панели журнала. Проанализируйте значения астигматизма и соответствия резолюция. Повторите процедуру в другой области, если астигматизм остаётся высоким.
   2. Коррекция комы
      1. Откройте модуль Autocoma, если результаты Autostigmate остаются неоптимальными после нескольких попыток. Нажмите «Старт».
8. Автоматизированный сбор данных
   1. Перейдите на страницу AutoCollect . Нажмите «Старт ».Позволить системе автоматически выполнять калибровку AutoEmission и AutoZLP .
   2. Собирайте данные, используя параметры, определённые в настройках Скрининг, Сбор данных и Подготовка. Мониторинг автоматизированного процесса сбора (рисунок 5).
      ТОЧКА ПАУЗЫ: После завершения сбора данных полученные стеки фильмов можно сохранить, а протокол возобновить на этапе обработки изображений позже, не влияя на дальнейшие результаты.
9. Мгновенный удалённый мониторинг
   1. Отслеживайте ход сбора с помощью модуля удалённого мониторинга. Просмотрите результаты коррекции движения в реальном времени, полученные с помощью MotionCor2²³. Проверьте измерения астигматизма и дефокуса в реальном времени.
   2. Поделитесь URL мониторинга с авторизованными пользователями. Получить доступ к информации о статусе коллекции и качестве данных с компьютера или мобильного устройства. Рассмотрите пример функциональности удалённого мониторинга на рисунке 6.

2. Трёхмерная реконструкция

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте модуль 3D-реконструкции для проведения трёхмерной реконструкции из ранее полученных наборов изображений. Рабочий процесс включает создание проектов, импорт микрофотографий, оценку контрастной передаточной функции (CTF), подбор частиц, экстракция частиц, двумерную классификацию, начальную генерацию модели и 3D-доработку (рисунок 7).

1. Создание проекта
   1. Перейдите на главную страницу модуля 3D-реконструкции. Нажмите «Проекты », чтобы открыть страницу управления проектами. Нажмите НОВЫЙ ПРОЕКТ.
   2. Введите имя проекта и укажите место хранения. Нажмите СОЗДАТЬ ПРОЕКТ. Нажмите «Открыть» рядом с новым проектом. Нажмите НОВЫЙ эксперимент , чтобы создать новый эксперимент.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проект представляет собой общую сессию обработки данных, а эксперимент — индивидуальный рабочий процесс внутри проекта. В рамках одного проекта можно создать несколько экспериментов.
2. Импортные файлы
   1. Нажмите «Новая работа». Выберите «Импортировать» и нажмите «Создать». Выберите подходящий тип файла. Импортировать .mrc-файлы, сгенерированные при сборе данных. Введите размер пикселей, напряжение ускорения и количество процессоров. Нажмите «В очередь на работу».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы завершить выполняющееся задание, нажмите Kill, затем нажмите Clear , чтобы вернуть задание в состояние Building. Для завершённых или поставленных в очередь заданий нажмите «Очистить », чтобы сбросить статус работы.
3. Оценка CTF
   1. Нажмите «Новая работа». Выберите CTF Estimation и нажмите Создать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: модуль 3D-реконструкции поддерживает несколько алгоритмов оценки CTF. Этот протокол использует CTFFIND4.
   2. Нажмите кнопку Connect для экспозиций. Выберите импортированные микрофотографии. Установите контраст амплитуды на 0,1, минимальное разрешение для подгонки на 30 Å. максимальное разрешение на 4 Å, минимальное значение дефокуса на 5 000 Å, максимальное значение дефокуса на 50 000 Å и размер шага дефокуса на 500 Å.
   3. Нажмите «В очередь на работу».
4. Ручной набор частиц
   1. Нажмите «Новая работа». Выберите «Выбор частиц», а затем «Подборщик капель». Нажмите «Создать». Нажмите кнопку Connect для микрофотографий (экспозиции).
   2. Выберите импортированные микрофотографии. Введите необходимые параметры. Нажмите «В очередь на работу». Проверьте 3–4 репрезентативные микрофотографии. Выбирайте частицы левой кнопкой мыши.
   3. Снимайте выделение частиц правой кнопкой мыши. Определите диапазон диаметра частиц по выбранным частицам. Клик «Готов выбирать»! Извлекать частицы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте частицы как минимум с трёх микрофотографий.
5. Собиратель капель
   1. Нажмите «Новая работа». Выберите «Выбор частиц», а затем «Подборщик капель».Нажмите «Создать». Подключите вход Micrographs (Exposures).
   2. Выберите импортированные микрофотографии. Введите необходимые параметры. Нажмите «В очередь на работу».
6. Проверьте отборы частиц
   1. Нажмите «Новая работа». Выберите «Проверить отборы частиц». Нажмите «Создать». Подключите вход Micrographs (Exposures). Подключите вход частиц.
   2. Выберите соответствующие файлы. Введите необходимые параметры. Нажмите «В очередь на работу». Проверьте 3–4 репрезентативных изображения после завершения работы.
   3. Проверьте правильный выбор частиц. Клик «Готов выбирать»! Локации выхода.
7. Извлечение частиц из микрофотографий
   1. Нажмите «Новая работа». Выберите «Извлечение из микрофотографий». Нажмите «Создать». Подключите вход Micrographs (Exposures). Подключите вход частиц. Выберите соответствующие файлы.
   2. Установите размер коробки для экстракции в 2–3 раза больше диаметра частицы. Используйте коробку для извлечения размером 400 пикселей для TRPML1. Установите размер Фурье на четверть или половину размера коробки для экстракции.
   3. Используйте обрезку Фурье размером 100 пикселей для TRPML1. Нажмите «В очередь на работу».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшение размера культуры Фурье снижает вычислительные нагрузки на GPU.
8. Двумерная классификация
   1. Нажмите «Новая работа». Выберите 2D-классификацию. Нажмите «Создать». Подключите вход частиц.
   2. Импортируйте стек частиц. Введите необходимые параметры. Нажмите «В очередь на работу».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите 50–200 классов. Используйте меньше классов для меньших наборов данных и больше классов для больших наборов данных.
9. Выберите двумерные классы
   1. Нажмите «Новая работа». Выберите выбрать 2D-классы. Нажмите «Создать». Подключите вход частиц. Подключите входные данные шаблонов.
   2. Импортируйте необходимые файлы. Нажмите «В очередь на работу». Ждите, пока работа не перейдёт в состояние ожидания. Нажмите «Ожидание».
   3. Выберите чёткие и чётко очерченные 2D-классы. Нажмите «Готово».
10. Начальная генерация моделей
    1. Нажмите «Новая работа». Выберите Abinit Reconstruction. Подключите вход частиц. Импортируйте выбранные частицы.
    2. Введите количество начальных курсов. Вводим параметр симметрии. Нажмите «В очередь на работу».
11. Гетерогенная Утончённость
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте гетерогенное рафинирование для гетерогенных образцов и однородное рафинирование для однородных образцов.
    1. Нажмите «Новая работа». Создайте работу Heterogene Refinement. Подключите вход частиц. Подключите вход громкости.
    2. Выберите соответствующие файлы. Введите параметры уточнения. Закажите соответствующую симметрию (например, C1). Нажмите «В очередь на работу».
12. Однородная очистка
    1. Нажмите «Новая работа». Создайте работу с однородной доработкой. Подключите вход частиц. Подключите вход громкости.
    2. По желанию подключите вход Mask. Импортируйте стек частиц и лучший класс объёма из предыдущего шага уточнения. Введите необходимые параметры.
    3. Укажите соответствующую симметрию (например, O или C1). Нажмите «В очередь на работу». Нажмите «Вывод» после завершения задания. Проверьте восстановленную карту плотности в интерфейсе браузера (рисунок 8).
13. Улучшение карты
    ПРИМЕЧАНИЕ: Усилитель карты использует DeepEMhancer²⁴. Используйте полукарты, когда это возможно. Посттрансляционные модификации и молекулы лиганда не были включены в тренировочный набор DeepEMhancer и могут быть неточно улучшены. Map Enhancer выполняет локальную заточку, автоматизированное маскирование и обезвреживание шума.
    1. Нажмите «Новая работа». Создайте задание для улучшения карты. Импортировать объём, полученный в ходе однородной очистки.
    2. Импортируйте соответствующую маску. Импортируйте файлы карт через опцию Map Data Path при необходимости. Выполните работу.

3. Атомное моделирование на основе глубокого обучения

ПРИМЕЧАНИЕ: Модуль атомного моделирования на основе глубокого обучения основан на ранее разработанной фреймворке^{SMARTFold 25} и поддерживает построение атомных моделей для белков и нуклеиновых кислот (РНК/ДНК) на основе карт плотности крио-ЭМ.

1. Запустите модуль атомарного моделирования на основе глубокого обучения
   1. Войдите в систему модулей атомарного моделирования на основе глубокого обучения. Откройте интерфейс подачи заданий. Загрузите карту плотности крио-ЭМ в левую панель.
   2. Введите необходимые входные параметры. Отправьте задание на моделирование.
2. Загрузка карты плотности Cryo-EM
   1. Загрузите карту плотности в форматах .mrc, .ccp4 или .map. Проверьте, что размер файла меньше 100 МБ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если плотность карты превышает 100 МБ, уменьшите размер файла перед загрузкой.
      1. Обрезайте карту плотности по интересующей области с помощью UCSF^{ChimeraX 26} с командой: volume zone. Перепробуйте карту до большего размера пикселя.
      2. Нанесите мягкую маску для удаления участков с растворителем.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Перед загрузкой проверьте карту плотности, чтобы обеспечить оптимальную производительность модели и снизить риск ошибок обработки.
3. Проверьте и подготовьте карту плотности
   1. Выполните обрезку карты плотности.Для этого обрезайте карту плотности, чтобы убрать ненужные регионы. Проверьте, что обрезанная карта содержит только регион, необходимый для построения модели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обрезка уменьшает размер файла и помогает предотвратить переполнение памяти при генерации модели.
   2. Потом проверьте на Mirror Inversion. Проверьте карту плотности на предмет возможной инверсии зеркала. Изучите α-спиральные области внутри карты. Проверьте, что α-спирали имеют правостороннюю конфигурацию и вращаются вверх против часовой стрелки. Перевернуть карту плотности, если обнаружена зеркальная структура.
4. Загрузка файла последовательности
   1. Загрузите соответствующий файл последовательности. Или введите последовательность вручную. Предоставить все белковые или нуклеиновые кислотные последовательности, включённые в реконструкцию.
   2. Указывайте информацию о гетеромерных или гомомерных последовательностях, когда это применимо. Введите название белка, если хотите (необязательный шаг).
5. Укажите разрешение карты. Вводите сообщаемое разрешение карты плотности крио-ЭМ. Выберите вычислительный раздел. Выберите GPU-вычислительный узел для генерации моделей.
6. Чтобы указать ресурсы процессора, введите количество выделенных процессоров. Не превышайте восемь процессоров. Проверьте все загруженные файлы и параметры. Нажмите ОТПРАВИТЬ , чтобы начать генерацию модели.
7. Изучить предсказанную атомную модель
   1. Откройте окно интерактивной визуализации после завершения задания. Поверните модель, чтобы осмотреть структурные особенности. Увеличивайте и уменьшайте масштаб, чтобы рассмотреть локальные и глобальные структурные детали.
   2. Осмотрите модель с разных ориентаций. Оценивать качество модели, пространственную конформацию и атомные характеристики. Используйте сгенерированную модель для анализа и валидации на последующих этапах.
   3. См. рисунок 9 для примера интерфейса визуализации.

Результаты

TRPML1, также известный как муколипин-1 (MCOLN1), является лизосомным катионным каналом, необходимым для поддержания ионного гомеостаза, регулирования везикулярного движения и поддержки аутофагии в млекопитающих ^27,28. Дисфункция TRPML1 из-за генетических мутаций напрямую связана с муколипидозом IV типа — тяжёлым нейродегенеративным лизосомным накопительным заболеванием, характеризующимся аномальным нейроразвитием, дегенерацией сетчатки и железодефицитной

Обсуждение

Структурное определение биологических макромолекул с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) по своей сути включает длительный, многоступенчатый рабочий процесс, требующий тесной интеграции вычислительных инструментов и опоры на экспертное вмешательство. Интегрированная платформа решает эту задачу, объединяя сбор данных, 3D-реконструкцию и атомарное моделирование в единую, вертикально интегрированную структуру — шаг к более упрощённым рабочим процессам крио-ЭМ. Внедряя алгоритмы на...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
CryoSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Модуль 3D-реконструкции платформы SMART; с гибридной нейронной сетью
Криоэлектронный микроскоп	Shuimu BioSciences Ltd.	SHUIMU TOTEM 300S	Используется для получения данных; оснащен энергетическим фильтром
DataSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Автоматизированный модуль получения данных платформы SMART
DeepEMhancer	Open source	V0.17	Обработка объемных данных крио-ЭМ с использованием глубокого обучения; интегрирован в CryoSmart Map Enhancer
Прямой электронный детектор	Gatan	GATAN K3 (6k x 4k)	Камера, используемая для записи видео
Сетка	Quantifoil	Au R1.2,1.3	Сетка для крио-ЭМ образцов
ModelSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Модуль атомного моделирования на основе глубокого обучения платформы SMART; расширяет рамки SMARTFold
Платформа SMART	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Интегрированная крио-ЭМ платформа; архитектура браузер-сервер (B/S); включает модули DataSmart, CryoSmart и ModelSmart
Программное обеспечение управления ЭМ	Shuimu BioSciences Ltd.	V1.0	Программное обеспечение управления электронным микроскопом для регулировки смещения пучка
Topaz	Open source	V 2.5	Инструмент выбора частиц на основе глубокого обучения; интегрирован как плагин в CryoSmart
Образец белка TRPML1	Shuimu Biosciences Ltd.	SMPP-0053	Человеческий TRPML1 (муколипин-1); приготовлен внутренним отделом белков и кристаллографии
Устройство для витрификации	Thermo Fisher Scientific	Vitrobot Mark IV	Для подготовки образцов для крио-ЭМ
UCSF Chimera X	UCSF, США	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Программное обеспечение общего назначения для отображения, анализа и многого другого
SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology)	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Интегрированная рабочая платформа крио-ЭМ
SMARTFold	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Фреймворк глубокого обучения, лежащий в основе ModelSmart
Leginon	National Resource for Automated Molecular Microscopy (NRAMM)	RRID:SCR_016731	Автоматизированное программное обеспечение для получения данных крио-ЭМ
SerialEM	Университет Колорадо	RRID:SCR_017293	Автоматизированное программное обеспечение для получения данных ТЭМ/крио-ЭМ
EPU	Thermo Fisher Scientific	N/A	Автоматизированное программное обеспечение для сбора данных крио-ЭМ
EPU Multigrid	Thermo Fisher Scientific	N/A	Автоматизированное сбор данных крио-ЭМ с использованием нескольких сеток
Gatan Latitude	Gatan Inc.	N/A	Программное обеспечение для получения данных электронной микроскопии
JADAS	JEOL Ltd.	N/A	Автоматизированная система получения данных крио-ЭМ
Auto-EMation	Университет Цинхуа	N/A	Автоматизированное программное обеспечение для получения данных крио-ЭМ
RELION	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016274	Байесовское программное обеспечение для реконструкции крио-ЭМ
cryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	RRID:SCR_016501	Обработка и реконструкция изображений крио-ЭМ
EMAN2	Baylor College of Medicine	RRID:SCR_017270	Пакеты обработки изображений крио-ЭМ
CTFFIND4	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016732	Программное обеспечение для оценки CTF
Gctf	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016500	Расчет CTF с ускорением на GPU
MotionCor2	Howard Hughes Medical Institute / UCSF	RRID:SCR_016499	Программное обеспечение для коррекции движения
DeepEMhancer	Spanish National Center for Biotechnology (CNB-CSIC)	RRID:SCR_021214	Улучшение карт крио-ЭМ с использованием глубокого обучения
Topaz	Университет Калифорнии в Беркли	RRID:SCR_018037	Пикинг частиц на основе глубокого обучения
UCSF ChimeraX	Университет Калифорнии в Сан-Франциско	RRID:SCR_015872	Программное обеспечение для молекулярной визуализации
CTFFIND4	Grigorieff Lab	RRID:SCR_016732	Оценка CTF, используемая в рабочем процессе CryoSmart
EMDB-8840	Электронный банк данных микроскопии	Accession: EMD-8840	Справочная карта человеческого TRPML1
EMPIAR-10204	Общественный архив электронных микроскопических изображений	Accession: EMPIAR-10204	Бенчмарк-набор данных β-галактозидаз
Передающий электронный микроскоп (TEM)	Не указано	N/A	Используется для получения данных крио-ЭМ
Электронный микроскоп FEI Tecnai	FEI (теперь Thermo Fisher Scientific)	Не указано	Упоминается в цитируемом рабочем процессе
Энергетический фильтр	Не указа