УФ-метод ChIRP для проверяемой идентификации белков, непосредственно взаимодействующих с LncRNA: от культивированных клеток до мышиных яичек

Краткое содержание

Метод ChIRP на основе УФ-излучения для выявления прямых взаимодействий lncRNA с белком.

Аннотация

Длинные некодируемые РНК (lncRNAs) стали важными регуляторами различных биологических процессов. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе функций большинства lncRNA, остаются плохо изученными. Идентификация взаимодействующих белков, особенно РНК-связывающих белков (RBP), является ключевой стратегией для прояснения функции lncRNA. Среди доступных подходов широко используется комплексная идентификация РНК-связывающих белков (ChIRP) в сочетании с масс-спектрометрией благодаря простой конструкции зонда и простому рабочему процессу. Традиционный ChIRP основан на параформальдегидном сшивании (PFA), которое захватывает как прямые контакты РНК-белка, так и косвенные взаимодействия, опосредованные мостовыми факторами. В отличие от этого, УФ-сшивание в сочетании с строгими условиями промывания преимущественно сохраняет прямые взаимодействия РНК и белка. Используя lncRNA Tug1 в качестве модели, УФ-сшивание и PFA-кроссшипинг были сравнины в рамках ChIRP в культивируемых клетках, что показало, что УФ-основанный ChIRP обогащается для прямых взаимодействий lncRNA с белком. Этот процесс, основанный на УФ-излучениях, впоследствии был расширен на мышиные яички, где ткани диссоциировались в одноклеточные суспензии перед УФ-сшипингом, что позволило идентифицировать белки, связывающие Tug1, в нативном тканевом контексте. Сравнение с интерактомами, полученными от клеточных линий, выявило как общих, так и тканевых интеракторов. Два общих прямых взаимодействия были независимо валидированы с помощью усиленной иммунопреципитации с перекрёстным сшиванием (eCLIP). Этот подход ChIRP на основе УФ-излучения называется cPDiRT (захват белков, непосредственно взаимодействующих с РНК-мишенью). Вместе cPDiRT позволяет идентифицировать белки, связывающие lncRNA, как в культивируемых клетках, так и в нативных тканях. Сочетание диссоциации тканей и ультрафиолетового сшивания предоставляет широко применимую стратегию для изучения прямых взаимодействий lncRNA с белком в различных органных системах.

Введение

Недавние высокопроизводительные транскриптомические исследования выявили тысячи длинных некодирующих РНК (lncRNA), участвующих в различных биологических процессах — от организации хроматина до клеточной^{сигнализации 1,2}. Несмотря на их широкую экспрессию и функциональную значимость, молекулярные механизмы большинства lncRNA остаются плохо определенными. Основным препятствием является идентификация их физических белковых партнёров, особенно РНК-связывающих белков (РБП)^3,4,5.

Современные методы, ориентированные на РНК, в основном опираются на химическое перекрёстное сшивание, которое захватывает как прямые, так и косвенные взаимодействия РНК с белками. В результате эти подходы более подходят для глобального картирования интерактом, чем для идентификации подлинных прямых^{контактов 6}. Комплексная идентификация белков, связывающих РНК, а затем масс-спектрометрия (ChIRP-MS) широко используется для картирования взаимодействий lncRNA-RBP благодаря простому проектированию зонда и эффективному рабочему^{процессу 7,8}. Обычный ChIRP-MS использует параформальдегидную (PFA) перекрестную связь, которая захватывает как прямые контакты РНК-белка, так и косвенные ассоциации, опосредованные мостовыми^{факторами 9,10}.

В отличие от этого, УФ-сшивка на 254 нм имеет критическое преимущество. Она ковалентно связывает РНК и белки только тогда, когда они находятся в контакте почти на нулевом расстоянии (обычно <1 Å)¹¹. Этот процесс преобразует водородные связи в стабильные ковалентные связи и обеспечивает строгие условия промывания с высоким содержанием соли, удаляя нековалентно связанные косвенные взаимодействия. В результате подходы, основанные на УФ-излучениях, обеспечивают большую специфичность прямых взаимодействий РНК и белка, чем методы химического^{сшивания 12,13}. Тем не менее, УФ-методы по-прежнему недостаточно используются в исследованиях интерактомных LNCRNA на тканях, главным образом из-за опасений по поводу эффективности сшивания и ограниченного проникновения УФ-излучения.

Для изучения прямых взаимодействий lncRNA с белком в физиологически значимом контексте была выбрана lncRNA Tug1 в качестве модельной системы. Tug1 является идеальным ориентиром для валидации совместимого с тканями рабочего процесса прямого взаимодействия благодаря своему сильному фенотипу нокаута и высокому обогащению яичка. Генетическая абляция Tug1 приводит к полной мужской стерильности, нарушению сперматогенеза и аномалию морфологии^{сперматозоидов 14}. Кроме того, Tug1 поддерживает функцию клеток Сертоли и целостность барьера крови яичек у диетических мышей с высоким содержанием^{жира 15}. Несмотря на эти хорошо устоявшиеся фенотипы, прямые белковые партнёры, опосредующие функцию Tug1 в яичке — органе, экспрессирующем большое количество RBP, недавно экспериментально^{профилированных 16} — остаются неизвестными. Этот пробел в знаниях во многом объясняет тот факт, что большинство методов картирования взаимодействия lncRNA и белка были разработаны для культивируемых клеточных систем.

Для устранения этого ограничения фреймворк ChIRP был модифицирован путём замены перекрёстного склейки PFA на УФ-кросслинкинг для захвата белков, непосредственно взаимодействующих с Tug1. Кандидатские взаимодействия были независимо валидированы с помощью усиленной иммунопреципитации с перекрёстным сшиванием с последующим глубоким секвенированием (eCLIP-seq)¹⁷. Рабочий процесс был дополнительно расширен на тканевые применения путём диссоциации свежей мышиной ткани яичек на отдельные клетки перед УФ-сшиванием. Этот оптимизированный подход получил обозначение cPDiRT (захват белков, непосредственно взаимодействующих с РНК-мишенью).

Применение cPDiRT к Tug1 в мышином яичке позволило осуществлять прямое взаимодействие в нативном тканевом контексте. Параллельные эксперименты в культивированных клетках позволили сравнивать профили взаимодействия на основе PFA и УФ-излучения. В сочетании с независимой валидацией eCLIP этот подход сформировал высокоуверенный набор молекулярных партнёров, которые могут способствовать функции Tug1 во время сперматогенеза. Представленный здесь протокол позволяет захватывать белки, которые непосредственно взаимодействуют с целевой LNCRNA как в культивируемых клетках, так и в нативных тканях. Определяя прямую интерактому Tug1 в яичке, этот метод способствует механистическим исследованиям жизненно важной для фертильности lncRNA и предоставляет обобщённую платформу для изучения взаимодействий lncRNA и белка в репродуктивных и других сложных тканях.

Протокол

Все растворы были приготовлены с использованием ультрачистой воды и реагентов без нуклеаз, протеаз. Все реагенты и оборудование перечислены в таблице материалов.

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике животных Нанкинского медицинского университета (номер одобрения: IACUC-1812003-4) и проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (Национальный исследовательский совет, 8-е издание). Поддерживайте самцов мышей C57BL/6 (4 недели) в цикле 12 часов света и 12 часов темноты с импровированным доступом к еде и воде. Минимизировать страдания животных, используя минимальное количество животных для достижения статистической значимости. Эвтаназия мышей путём вдыхания CO₂ с последующим вывихом шейки матки согласно утверждённым институциональным протоколам.

1. Подготовьте буферы

1. Подготовьте буфер для лизиса клеток
   1. Подготовьте буфер для лизиса клеток, содержащий 50 мМ Tris-HCl (pH 7,0), 10 мМ EDTA и 1% SDS.
   2. Непосредственно перед применением добавьте 1 мМ ПМСФ, коктейль с ингибиторами протеазы и специализированный ингибитор РНаз.
      ВНИМАНИЕ: SDS — это раздражитель кожи и глаз. Избегайте вдыхания пыли или аэрозолей. ПМСФ очень токсичен, действует как ингибитор холинэстеразы и нестабилен в водном растворе. Готовьте PMSF непосредственно перед использованием. При обращении с этими реагентами надевайте перчатки и защитные очки. Работайте с ПМСФ в вытяжке с химическим паром.
2. Подготовьте буфер гибридизации
   1. Приготовьте буфер для гибридизации, содержащий 750 мМ NaCl, 1% SDS, 50 мМ Tris-HCl (pH 7,0), 1 мМ EDTA и 15% формамида.
   2. Непосредственно перед применением добавьте 1 мМ ПМСФ, коктейль с ингибиторами протеазы и специализированный ингибитор РНаз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните формамид при 4 °C, защищённый от света.
      ВНИМАНИЕ: Формамид представляет собой тератоген и репродуктивную угрозу. Используйте формамид в капюшоне с химическими парами, надевая перчатки, лабораторный халат и защитные очки. Избегайте вдыхания и контакта с кожей.
3. Подготовьте буфер для стирки
   1. Подготовьте промывочный буфер, содержащий 50 мМ Tris-HCl (pH 7,0), 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS и 0,5% натрия дезоксихолата.
   2. Защитите буфер для мытья от света во время хранения.
4. Подготовьте буфер протеиназы K (PK)
   1. Подготовьте буфер PK, содержащий 100 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl (pH 7,0), 1 мМ EDTA и 0,5% SDS.
   2. Добавьте протеиназу K к окончательной концентрации 5% непосредственно перед использованием.

2. Проектирование и подготовка зондов

1. Проектные антисмысловые зонды
   1. Проектируйте антисенсовые олигонуклеотидные зонды с помощью онлайн-дизайнера зондов, доступного в^{singlemoleculefish.com 18}.
2. Получение биотинилированных зондов
   1. Закажите антисенсовые ДНК-зонды, содержащие модификацию 3'-BiotinTEG.
3. Подготовьте зондовый пул
   1. Разведите каждый зонд отдельно до 100 мкм.
   2. Смешивать равные объёмы всех зондов, чтобы создать пул зондов. Поддерживать конечную комбинированную концентрацию олигонуклеотида 100 мкм.
   3. Храните зондовый пул при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые параметры конструкции зонда следующие: (i) один зонд на 100 п.п. мишени РНК, (ii) содержание целевой ГК 45%, (iii) длина зонда 20 нт, и (iv) расстояние между зондами 60–80 нт.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если РНК превышает установленный проектировщиком размера, перед проектированием разделите последовательность на более мелкие сегменты. Исключать повторяющиеся области и области с обширной гомологией последовательностей.

3. Проведение забора клеток, диссоциации тканей и УФ-перекрёстного склинка

1. Подготовьте системы управления без ультрафиолета
   1. Подготовьте контрольные образцы параллельно с экспериментальными.
   2. Опустите шаг УФ-кроссшипа из контрольных образцов.
   3. Выполнять все последующие процедуры, включая соникацию, вытягивание РНК-белка, экстракцию РНК и экстракцию белка, одинаково для обеих групп.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте контроль без УФ, чтобы отличить УФ-зависимые взаимодействия РНК и белка от неспецифического фонового связывания.
2. Собирайте ячейки и выполняйте ультрафиолетовое перекрёстное соединение
   1. Клетки, культивируемые в промывке
      1. Промыйте клетки три раза PBS, чтобы удалить остаточную культурную среду.
   2. Ячейки перекрёстного звена
      1. Равномерно распределите 3 мл PBS на 15-сантиметровую чашу для культуры.
      2. Облучить клетки в УФ-сшивателе с интервалом 254 нм при дозе 4000 мДж/^см².
   3. Собирайте перекрёстные ячейки
      1. Собирайте ячейки в PBS после перекрёстной связки.
      2. Центрифугуйте подвеску и уберите супернатант.
      3. Взвесьте пеллеты и подтвердите минимальную массу гранулы в 500 мг на образец.
3. Диссоциировать ткань яичек и выполнять ультрафиолетовое сшищение
   1. Подготовьте яички
      1. Декапсулируйте яички.
      2. Промой салфетку дважды с помощью DMEM.
   2. Проведите переваривание коллагеназы
      1. Инкубировать ткань в DMEM с 1 мг/мл коллагеназу IV при 37 °C в течение 5–15 минут.
      2. Продолжайте пищеварение до тех пор, пока не высвободятся семеноцветные канальцы.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 15 минут пищеварения.
   3. Промыть семенные трубочки
      1. Центрифугуйте подвеску при 1000 × г на 1 минуту при 4 °C.
      2. Удалите супернатант.
      3. Промывайте пеллет с 5–10 мл DMEM.
      4. Центрифуга снова при тех же условиях.
   4. Проведите пищеварение трипсина
      1. Ресуспензировать гранулу в виде 0,25% трипсина, содержащего 1 мг/мл ДНКазы I.
      2. Инкубировать при 37 °C в течение 5–15 минут.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 15 минут пищеварения.
   5. Остановите ферментативное пищеварение
      1. Добавьте такой же объём DMEM, дополненный 10% FBS.
   6. Сгенерировать подвеску с одной ячейкой
      1. Фильтруйте подвеску через сито с элементами 70 мкм.
   7. Промывочные ячейки
      1. Центрифугные ячейки при 2000 × г в течение 5 минут при 4 °C.
      2. Отбросьте супернатант.
      3. Промывайте гранулы 5–10 мл PBS.
      4. Центрифуга снова при тех же условиях.
   8. Клетки яичек с перекрёстной связью
      1. Повторно подвесьте подвеску с одной ячейкой в PBS.
      2. Равномерно распределите подвеску на 15-сантиметровую культурную чашу.
      3. Облучить клетки в УФ-сшивателе с интервалом 254 нм при дозе 4000 мДж/^см².
   9. Собирайте перекрёстные ячейки
      1. Для контроля без ультрафиолета исключите облучение.
      2. Собирайте ячейки в PBS.
      3. Центрифугуйте подвеску и уберите супернатант.
      4. Взвесьте пеллеты и подтвердите минимальную массу гранулы в 500 мг на образец.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Количество мышей, необходимых для получения примерно 500 мг клеточной гранулы, зависит от возраста и выхода тканей. В этом исследовании использовалось примерно 10–12 четырёхнедельных мышей.

4. Выполнить соникацию

1. Приготовьте лизаты
   1. Ресуспензировать клеточные гранулы в буфере лизиса клеток с соотношением 100 мг гранул на 1 мл буфера.
   2. Тщательно перемешайте для получения однородной суспензии.
2. Сэмплы сониката
   1. Соникат лизирует с помощью водяного соникатора или сфокусированного ультразвукового аппарата.
   2. Продолжайте звуковую обработку, пока лизат не станет визуально чётким.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте фрагментацию ДНК с помощью агарозного гелевого электрофореза. Продолжайте соникацию, пока большинство фрагментов ДНК не достигнут от 1 до 2 кб.

5. Выполнить РНК-белковое вытягивание вниз

1. Сбор входных образцов
   1. Удалите аликвоты лизата для входных контролей.
   2. Резервируйте примерно 10 мкл для анализа РНК и 10 мкл для анализа белков.
   3. Поддерживайте входные образцы при температуре 37 °C во время процедур гибридизации и промывки.
2. Преклир лизаты
   1. Добавьте 30 мкл заранее вымытых магнитных шариков в каждый образец.
   2. Инкубировать образцы при 37 °C в течение 30 минут с аккуратным смешиванием в гибридизационной печи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием мойте магнитные шарики. Поместите шариковые аликвоты на магнитную подставку на 1 минуту или пока раствор не станет прозрачным. Полностью уберите решение для хранения. Промывайте шарики дважды с 500 мкл буфера для лизиса клеток.
3. Удалите предварительные бусины
   1. Размещайте образцы на магнитной подставке.
   2. Перенесите супернатант в новую трубку.
   3. Повторите перенос один раз, чтобы полностью удалить остаточные бусины.
4. Гибридизация зондов
   1. Добавьте два тома буфера гибридизации к каждому образцу.
   2. Добавьте зонды с соотношением 1 мкл 100 мкм запаса зонда на 1 мл лизата (Дополнительная таблица 1).
5. Реакции гибридизации инкубации
   1. Инкубировать образцы при 37 °C с вращением конца за концом в течение 12–16 часов в печи для гибридизации.
6. Приготовьте бусины для захвата
   1. Промыйте 100 мкл магнитных шариков три раза с буфером лизиса клеток непосредственно перед завершением гибридизации.
   2. Удалите весь остаточный буфер после окончательной промывки.
7. Захват комплексов, связанных с зондом
   1. Кратковременные реакции центрифугной гибридизации.
   2. Промытые шарики снова суспензируйте в 1 мл гибридного образца.
8. Связывающие комплексы с бусинами
   1. Верните подвеску с шариком в оригинальную трубку.
   2. Инкубировать при 37 °C с перемешиванием в течение 30–40 минут.
9. Извлечение бусин
   1. Кратко — центрифугные образцы.
   2. Поставьте трубки на магнитную подставку на 1–2 минуты или пока раствор не станет прозрачным.
   3. Отбросьте супернатант.
   4. Удалите остаточную жидкость с помощью наконечника пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте беспокойства магнитной гранулы при удалении жидкости.
10. Комплексы захваченных Wash
    1. Добавьте 1 мл буфера для стирки.
    2. Мойте бусины при 37 °C с непрерывным перемешиванием в течение 5 минут.
    3. Повторите процедуру мытья пять раз.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для промывки содержит 1 M NaCl, который нарушает нековалентные взаимодействия белка-белок и белок-РНК, сохраняя ковалентные УФ-индуцированные перекрёстные связи. Эти строгие условия устраняют косвенные взаимодействия и неспецифический фон, тем самым обогащая прямых белковых^{партнёров 19}.
11. Резервный материал для анализа РНК
    1. Перенесите 1%–10% промытых шариков в новую трубку для анализа РНК.
    2. Оставшиеся шарики используйте сразу для извлечения белка или храните их при -80 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости приостановить протокол. Храните образцы бусинок при -80 °C до экстракции белка.
12. Элютные белки
    1. Добавьте буфер для образцов SDS в бусины.
    2. Прокипятить образцы при 95 °C в течение 30 минут для элюирования белков и обратного перекрёстного соединения.
    3. Переходите к масс-спектрометрическому анализу.

6. Извлечение РНК

1. Переваривание белков
   1. Повторная суспензия образцов РНК, связанные с шариками, в 100 мкл буфера PK.
   2. Отрегулировать входные образцы РНК до конечного объёма 100 мкл с помощью PK-буфера.
2. Инкубировать с протеиназой K
   1. Инкубировать образцы при 50 °C в течение 45 минут с непрерывным смешиванием.
3. Инактивировать протеиназу K
   1. Проба тепла при 95 °C в течение 10 минут.
4. Добавить реагент TRIzol
   1. Добавьте 500 мкл реагента TRIzol в каждый образец.
   2. Вихрь тщательно.
   3. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре.
      ВНИМАНИЕ: Реагент TRIzol содержит фенол и гуанидинтиоцианат. Держите реагент в капюшоне с химическим паром, надевая перчатки, лабораторный халат и защитные очки. Избегайте вдыхания и контакта с кожей. Если возникает контакт с кожей, немедленно мойте с мылом и водой.
5. Выполните фазовое разделение
   1. Добавьте 100 мкл хлороформ в каждый образец.
   2. Вихрь тщательно.
   3. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре.
6. Восстановление водной фазы
   1. Центрифуга берёт образцы при 4 °C в течение 15 минут.
   2. Перенесите верхнюю водную фазу в новую трубку.
7. Связывание РНК с колонками очистки
   1. Добавьте равный объём 100% этанола в водную фазу.
   2. Тщательно перемешайте.
   3. Загрузить образцы на колонки очистки РНК.
8. Очищение РНК
   1. Проводите очистку РНК согласно инструкциям производителя.
   2. Элютная РНК в 30 мкл воды без нуклеаз.
9. Проверьте обогащение РНК с помощью qRT-PCR
   1. Используйте 1 мкл элюированной РНК на каждую реакцию для количественной обратной транскрипции ПЦР (qRT-PCR).
   2. Оценить обогащение целевой РНК относительно контрольных групп.

7. Проведение анализа LC-MS/MS

1. Отдельные белки по SDS-PAGE
   1. Смешайте белки, полученные в шаге 5.12 , с 4× буфером для образцов LDS.
   2. Отдельные белки на геле Bis-Tris с 4%–12%.
   3. Окрашивайте гель с помощью серебряного набора для окрашивания.
   4. Вырезать весь белковый канал в единую полосу.
2. Акцизные гелевые изделия
   1. Урежьте белковую повязку чистым скальпелем.
   2. Минимизируйте количество избыточного геля.
   3. Нарежьте гель примерно на^{1 мм 3} части.
   4. Перенесите детали геля в трубку объёмом 0,5 мл.
3. Гелевые детали Destain
   1. Добавьте 100 мкл раствора для удаления пятен.
   2. Вихрь на 10 минут.
   3. Центрифуга при 14 000 × г в течение 1 минуты.
   4. Удалите супернатант.
   5. Повторяйте процедуру удаления пятен до тех пор, пока детали геля не станут прозрачными.
4. Редукция белков
   1. Добавьте 100 мкл раствора восстановления.
   2. Инкубировать при 56 °C в течение 30 минут.
   3. Охлаждайте образцы до комнатной температуры.
   4. Ненадолго центрифугуйте и удалите супернатант.
5. Алкилатные белки
   1. Добавьте 100 мкл раствора алкилирования.
   2. Инкубировать при комнатной температуре 20 минут в темноте.
   3. Удалите супернатант.
   4. Промыйте гелевые куски с 100 мкл буфера для пищеварения в течение 5 минут.
6. Переваривание белков
   1. Добавьте достаточно раствора трипсина, чтобы полностью покрыть кусочки геля.
   2. Инкубировать при 37 °C в течение 16–18 часов.
7. Экстрактные пептиды
   1. Добавьте 30 мкл экстракционного раствора.
   2. Соник на 15 минут или вихрь 30 минут.
   3. Центрифуга при 14 000 × г в течение 1 минуты.
   4. Перенесите супернатант в новую трубку.
   5. Повторите процедуру извлечения дважды.
   6. Объедините все экстракции.
   7. Сухие экстракты в вакуумном концентраторе примерно 1 час.
8. Очищайте пептиды с помощью StageTip
   1. Засушенные пептиды суспензируются в 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты (FA).
   2. Загрузите сэмплы на C18 StageTip.
   3. Центрифуга при 1 000 × г в течение 2 минут.
   4. Смойте StageTip с 20 мкл FA 0,1%.
   5. Элютные пептиды с 20 мкл 60% ацетонитрила/0,1% FA в флакон LC-MS.
   6. Высушите элуат.
   7. Ресуспендировать пептиды в 10 мкл с FA 0,1%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости приостановить протокол. Храните очищенные пептиды при -80 °C перед анализом LC-MS/MS.
9. Получение данных LC-MS/MS
   1. Восстановить пептиды в 0,1% муравьиной кислоты.
   2. Отдельные пептиды на аналитической колонке C18 диаметром 75 мкм × 250 мм при расходе 300 нл/мин.
   3. Примените следующий градиент растворителя B (0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле):
      2%–25% B за 0–40 минут
      25%–40% B за 40–48 мин
      40%–99% B за 50–57 мин
      Держите 99% B в течение 3 минут
   4. Работа масс-спектрометра в режиме сбора данных.
   5. Получить спектры полного сканирования MS в диапазоне m/z от 350 до 1200 с разрешением 70 000.
   6. Получите пятнадцать последовательных высокоэнергетических коллизионных диссоциационных (HCD) MS/MS с разрешением 17 500.
   7. Записывайте по одному микросканированию на каждое сканирование.
   8. Установить динамическое исключение на 30 секунд.
10. Данные масс-спектрометрии процессов
    1. Обработка необработанных данных с помощью MaxQuant (v2.1.0.0).
    2. Поиск спектров по последовательности белков мышей, загруженных с UniProt.
    3. Уточните трипсин как фермент для пищеварения.
    4. Допустим максимум два пропущенных декольте.
    5. Укажите окисление метионина как переменную модификацию.
    6. Определите цистеинкарбамидометилирование как фиксированную модификацию.
    7. Установите допуски массы прекурсора и фрагментов соответственно на 15 ppm и 20 ppm.
    8. Контролировать уровень ложного обнаружения на уровне 1% как на уровне пептидов, так и белков.
    9. Оценка количества белка с помощью iBAQ без маркировки без меток.

8. Проведение анализа обогащения генной онтологии

1. Анализ функционального обогащения
   1. Проведите анализ обогащения генной онтологии (GO) с помощью пакета clusterProfiler R (v4.6.0).
   2. Используйте базу данных GO (v2024-09-20) в качестве источника аннотаций.
   3. Примените коррекцию Бенджамини-Хохберга для множественных тестов.
   4. Определите статистическую значимость как скорректированное значение P (FDR) < 0,05.

9. Проведите валидацию eCLIP-seq

1. Подготовьте образцы eCLIP
   1. Выполнить усиленную иммунопреципитацию с перекрёстным ссылением (eCLIP), как было описано^{выше 17}.
   2. Подготовьте образцы клеток с УФ-связанностью для иммунопреципитации PABPC1 и CCT3.
   3. Сэмплирование лизы с использованием буфера лизиса eCLIP.
2. Иммунопреципитатные РНК-белковые комплексы
   1. Добавьте 10 мкг антител в каждый образец.
   2. Захват РНК-белковых комплексов на магнитных шариках.
   3. Собирайте входные образцы до иммунопреципитации.
3. Подготовка библиотек РНК
   1. Дефосфорилировать РНК, связанные с белком.
   2. Привязать 3' РНК-адаптер к восстановленной РНК.
   3. Промывайте иммунопреципитированные и входные образцы в строгих условиях.
   4. Комплексы элюю, варя бусины.
   5. Разрешить образцы на геле с градиентом Bis-Tris 4%–12%.
   6. Перенос отделённых комплексов в нитроцеллюлозную мембрану.
4. Восстановление РНК
   1. Вырезать мембранную область, соответствующую размеру.
   2. Переваривать белки с помощью мочевины и протеиназы K.
   3. Восстановить РНК из мембраны.
5. Генерировать библиотеки секвенирования
   1. Обратная транскрипция восстановленной РНК в кДНК.
   2. Очищайте кДНК с помощью смеси экзонуклеазы I и щелочной фосфатазы креветок.
   3. Перевязать ДНК-адаптер на 3'-конец кДНК с использованием T4-РНК-лигазы.
   4. Амплифицировать библиотеки с помощью высокоточной ДНК-полимеразы.
   5. Отдельные амплифицированные библиотеки на 3% агарозном геле с низкой температурой плавления.
   6. Очищайте библиотеки по выбранному размеру с помощью набора для экстракции геля.
   7. Библиотеки последовательностей на платформе Illumina.
6. Анализ данных eCLIP-seq
   1. Анализ данных секвенирования с помощью конвейера ENCODE eCLIP²⁰.
   2. Трим-адаптеры и 3' адаптерные димеры с помощью cutadapt (v1.14).
   3. Align считывает повторяющиеся элементы UCSC с помощью STAR (v2.7.6a).
   4. Удалите чтение, сопоставление с повторяющимися элементами.
   5. Выровнять оставшиеся считывания с эталонным геномом mm10 (GENCODE vM23).
   6. Удалите дубликаты ПЦР.
   7. Определите обогащённые сайты связывания с помощью CLIPPER.
   8. Определите значимые пики как те, с обогащением складками ≥ 8 и скорректированным P ≤ 0,001.
   9. Определить воспроизводимые пики с помощью порога невоспроизводимой скорости обнаружения (IDR) в 0,01.

Результаты

Для выявления белков, связывающих Tug1, в рабочий процесс ChIRP была включена УФ-кроссшипинг, что привело к созданию метода cPDiRT (рисунок 1). Традиционный ChIRP впервые был проведён в клетках GC2 для обогащения белков, взаимодействующих с Tug1 (рисунок 2A, B). Масс-спектрометрический анализ выявил более 190 белков, обогащённых относительно отрицательного контроля (рисунок...

Обсуждение

cPDiRT был разработан как модифицированный протокол на базе ChIRP, который заменяет параформальдегидную (PFA) перекрестную связь на УФ-склейку для селективного захвата прямых взаимодействий lncRNA с белком. Объединяя ферментативную диссоциацию свежей ткани яичек в отдельные клетки с помощью УФ-сшивания, прямое взаимодействие было расширено от культивированных клеточных линий к нативным тканям. Параллельные эксперименты в культивированных клетках позволили сравнить подходы на основе PFA и...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,25% раствор трипсина-ЭДТА	Gibco	25200056	для диссociации тканей и приготовления одноклеточной суспензии
100% этанол	Sigma-Aldrich	459844	для очистки РНК
AffinityScript обратная транскриптаза	Agilent	600107	для синтеза кДНК eCLIP
Анти-CCT3 антитело	Abcam	Ab225878	антитело для eCLIP
Анти-PABPC1 антитело	Abcam	Ab312314	антитело для eCLIP
Хлороформ	Sigma-Aldrich	C2432	для извлечения РНК
Коллагеназ тип IV	Sigma-Aldrich	C5138	для ферментативной диссоциации тканей яичника
Реактивы для дефосфорилирования (T4 PNK)	New England Biolabs	M0201S	для дефосфорилирования РНК eCLIP
Среда DMEM с высокой концентрацией глюкозы	Gibco	11965092	для культуры клеток и буфера для диссоциации тканей
Магнитные бусы Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Thermo Fisher Scientific	65001	для захвата стрептавидин-биотин-пробе-РНК-белок комплексов
Магнит DynaMag-15	Thermo Fisher Scientific	12301D	для разделения магнитных бус
Магнит DynaMag-2	Thermo Fisher Scientific	12321D	для разделения магнитных бус
ЭДТА	Sigma-Aldrich	E9884	для хелатирования двухвалентных катионов в буферах лизиса и мойки
Экзонуклеаза I	New England Biolabs	M0293S	для очистки кДНК eCLIP
Фета́льная сыворотка бычья (FBS)	Gibco	10099141C	для остановки дисгестии трипсином
Формамид	Thermo Fisher Scientific	AM9342	для приготовления буфера гибридизации
Гермошкаф для гибридизации	TUOHE	LF-I	для гибридизации пробе и промывки бус
Агароза с низкой температурой плавления	Sigma-Aldrich	A9414	для селекции размера библиотеки eCLIP
Комплект для гелягельной экстракции MinElute	Qiagen	28604	для селекции размера библиотеки eCLIP
Комплект miRNeasy Mini	Qiagen	217004	для очистки РНК
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	для приготовления буфера мойки с высокой концентрацией соли
Мембрана из нитроцеллюлозы	GE Healthcare / Amersham	10600002	для переноса в западный блот eCLIP
NP-40	Thermo Fisher Scientific	85125	для моющего вещества буфера мойки
Без нуклеаз и протеаз вода	Thermo Fisher Scientific	10977035	для приготовления решений без нуклеаз
NuPAGE 4-12% Bis-Tris гель	Thermo Fisher Scientific	NP0322BOX	для селекции размера eCLIP
NuPAGE предварительно изготовленные гели Bis-Tris	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX	для разделения белков SDS-PAGE
PBS (pH 7,4)	Thermo Fisher Scientific	10010023	для мойки и пересуспензирования клеток
Фенилметилсульфонилфторид (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	ингибитор сериновых протеаз для буфера лизиса клеток; добавляется свежим перед использованием
Коктейль ингибиторов протеаз	Roche	4693132001	широкоспектральные ингибиторы протеаз для буфера лизиса клеток; добавляется свежим перед использованием
Протеиназа K	Sigma-Aldrich	P4850	для ферментативного расщепления белков в извлечении РНК
qRT-PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	11704044	для количественной обратной транскрипции для подтверждения обогащения РНК
Решение RNase/Protease-Free DNase I	Thermo Fisher Scientific	EN0521	для диссоциации тканей
Комплект RNeasy Mini	Qiagen	74104	для очистки РНК
Буфер для загрузки образца SDS-PAGE	Beyotime	P0286	для приготовления образца белка
Щелочно-фосфатаза креветок	New England Biolabs	M0371S	для очистки кДНК eCLIP
Комплект окрашивания серебром	Beyotime	P00175	для визуализации белков в гелях SDS-PAGE
Дезоксихолат натрия	Sigma-Aldrich	D6750	для моющего вещества буфера мойки
Додециллсульфат натрия (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	для лизиса клеток и денатурации белков
Superase-in RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	специализированный ингибитор РНКазы; добавляется свежим перед использованием
Т4 РНК-лигаза	New England Biolabs	M0204	для лигирования адаптеров eCLIP
Tris-HCl (pH 7,0)	Sigma-Aldrich	T5941	для приготовления буферов лизиса, гибридизации и мойки
TRIzol реагент	Thermo Fisher Scientific	15596026CN	для извлечения РНК
Ультразвуковой клеточный измельчитель	ATPIO	ATPIO-65