Методическая статья

Люмбальная ламинэктомия на уровне L5 у старых мышей линии C57BL/6J для моделирования послеоперационной когнитивной дисфункции

4 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71733

⸱

22 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Pharmacology, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описывается стандартизированная ламинэктомия в поясничном отделе L5 у старых мышей линии C57BL/6J для создания модели послеоперационной когнитивной дисфункции при минимизации двигательных нарушений, что позволяет проводить поведенческие, гистологические и механистические исследования периоперационных нейрокогнитивных расстройств.

Аннотация

Послеоперационная когнитивная дисфункция (ПОКД) является распространенным неврологическим осложнением после хирургического вмешательства и анестезии, особенно у пожилых людей, и сопровождается замедленным восстановлением, длительной госпитализацией и снижением качества жизни. Ортопедические и спинальные операции связаны с относительно высоким риском развития ПОКД; однако доклинические модели, точно отражающие периоперационные особенности хирургии позвоночника, остаются ограниченными. Часто используемые модели, включая лапаротомию и перелом большеберцовой кости, могут вызывать стойкие нарушения локомоции и длительное периферическое воспаление, что может затруднить интерпретацию когнитивно-поведенческих результатов. В данном протоколе описывается стандартизированный и недорогой метод моделирования ПОКД с использованием люмбальной ламинэктомии на уровне L5 под севофлурановой анестезией у 18-месячных самцов мышей линии C57BL/6J. Процедура выполняется с помощью стандартных хирургических инструментов и вызывает контролируемое хирургическое повреждение при минимизации стойкого моторного дефицита. Когнитивная функция оценивается с помощью теста распознавания нового объекта, Y-образного лабиринта с новым рукавом и лабиринта Барнса, в то время как повреждение нейронов гиппокампа и нейровоспалительные изменения оцениваются с помощью окрашивания по Нисслю и иммунофлуоресцентного окрашивания на Iba1 соответственно. Репрезентативные результаты демонстрируют сохраненную локомоторную активность, нарушение когнитивных функций, снижение целостности нейронов гиппокампа и усиление нейровоспаления в гиппокампе после операции. Эта стандартизированная и доступная модель представляет собой клинически значимую платформу для исследования механизмов когнитивной дисфункции, связанной с операциями на позвоночнике, и для оценки потенциальных периоперационных нейропротекторных вмешательств.

Введение

Послеоперационная когнитивная дисфункция (ПОКД) определяется как снижение способности к обучению и памяти, внимания, скорости обработки информации и исполнительных функций после применения анестезии и проведения хирургического вмешательства1; она преимущественно поражает пожилых пациентов, а сообщаемая частота ее возникновения, по всей видимости, варьируется в зависимости от хирургического контекста и популяции пациентов2,3. Было отмечено, что ПОКД часто встречается у пожилых людей, перенесших плановые ортопедические операции4. Клинически ПОКД может сохраняться в течение недель или месяцев после операции и ассоциируется с длительной госпитализацией и повышенной смертностью5,6,7. В условиях продолжающегося старения населения и роста объема хирургических вмешательств во всем мире ПОКД стала важной проблемой общественного здравоохранения и периоперационного ухода.

С точки зрения патофизиологии, POCD (периоперационная когнитивная дисфункция) рассматривается как многофакторный синдром, запускаемый хирургической травмой и воздействием анестетиков; при этом нейровоспаление, окислительный стресс, нарушение аутофагии и синаптическая дисфункция входят в число предполагаемых механизмов, лежащих в основе нейрональной дисфункции в областях, значимых для когнитивных функций, таких как гиппокамп8. Для детального изучения этих механизмов и оценки потенциальных методов терапевтического вмешательства был разработан ряд доклинических парадигм POCD. Доклинические парадигмы включают модели с применением только анестезии, модели на основе абдоминальных операций и модели ортопедических повреждений, такие как перелом большеберцовой кости9. Хотя эти модели способствовали развитию данной области знаний, они могут не в полной мере воспроизводить периоперационные особенности, характерные для операций на позвоночнике, а некоторые из них могут приводить к появлению сопутствующих факторов, таких как стойкий двигательный дефицит и длительное воспаление тканей, что затрудняет оценку когнитивных функций и интерпретацию механизмов.

Из доступных хирургических стратегий мы выбрали модель ламинэктомии поясничного отдела позвоночника на уровне L5 для изучения ранних послеоперационных когнитивных нарушений в стандартизированном и релевантном для хирургии позвоночника контексте. Данная процедура обеспечивает контролируемое локальное хирургическое воздействие под ингаляционной анестезией, что позволяет исследовать послеоперационные нейровоспалительные реакции и когнитивную дисфункцию, не вызывая выраженных нарушений локомоции. Благодаря оптимизации ключевых этапов операции, данный протокол представляет собой стандартизированный, практичный и экономически эффективный метод исследования когнитивных нарушений, связанных с операциями на позвоночнике, и оценки периоперационных нейропротекторных стратегий.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и использованием их в научных целях и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Чжэцзянского университета (номер этического одобрения: ZJU20260153).

1. Предоперационная подготовка

  1. Экспериментальные животные, распределение по группам, анальгезия и ослепление
    1. Используйте самцов мышей линии C57BL/6J в возрасте 18 месяцев с массой тела 30–34 g. Содержите мышей при 12-часовом цикле свет/темнота со свободным доступом к корму и воде.
    2. Дайте мышам акклиматизироваться к условиям содержания в течение не менее 7 дней перед операцией. После акклиматизации случайным образом распределите мышей в группу ламинэктомии L5 или в контрольную группу.
    3. Перед проведением экспериментальных процедур присвойте каждой мыши кодированный идентификационный номер. Сохраняйте код распределения по группам, чтобы поведенческие тесты могли проводиться вслепую по отношению к назначенному лечению.
    4. Мышам в группе ламинэктомии L5 проведите общую анестезию севофлураном с последующей поясничной ламинэктомией на уровне L5. Мышей контрольной группы не подвергайте воздействию севофлурана, подготовке операционного поля или хирургическому вмешательству.
    5. Вводите мелоксикам подкожно в дозе 2 mg/kg мышам обеих групп. Первую дозу вводите после индукции анестезии в группе ламинэктомии L5 и в момент времени, соответствующий окончанию операции, в контрольной группе.
    6. Последующие дозы мелоксикама вводите подкожно в дозе 2 mg/kg каждые 24 h в течение 48 h мышам обеих групп. Содержите, перемещайте и наблюдайте за обеими группами в одинаковых условиях на протяжении всего экспериментального периода.
    7. Проводите все поведенческие тесты согласно одному и тому же экспериментальному графику для обеих групп. Убедитесь, что исследователь, проводящий поведенческие тесты, не знает о распределении животных по группам.
  2. Стерилизуйте все хирургические инструменты и продезинфицируйте рабочую зону. Предварительно разогрейте грелку для поддержания температуры тела во время анестезии. Подготовьте мелоксикам для периоперационного введения.
  3. Включите аппарат для газового наркоза и поместите мышь в индукционную камеру. Индуцируйте общую анестезию 3–5% севофлураном в течение 3–5 min при скорости потока кислорода 1 L/min.
  4. Перенесите анестезированную мышь на операционную платформу. Поддерживайте анестезию 1,5–3% севофлураном через анестезиологическую маску при скорости потока кислорода 0,5–0,8 L/min. Введите мелоксикам подкожно в дозе 2 mg/kg. Общая продолжительность анестезии, измеренная от начала индукции севофлураном, составляет примерно 4 h. Регулируйте концентрацию севофлурана по мере необходимости для поддержания стабильного хирургического уровня анестезии.
  5. Поместите мышь в положение на животе поясничным отделом позвоночника вверх. Осторожно зафиксируйте передние конечности лентой, чтобы стабилизировать животное и обеспечить беспрепятственный доступ к операционному полю L5.
  6. Подтвердите достаточную глубину анестезии, убедившись в отсутствии подошвенного рефлекса. Нанесите офтальмологическую мазь для предотвращения пересыхания роговицы.
  7. Удалите шерсть по срединной линии поясничной области (примерно L3–S1) с помощью триммера для мелких животных. Продезинфицируйте открытый участок кожи 75% этанолом, затем повидон-йодом, повторив процедуру 2–3 раза для обеспечения асептических условий.

2. Хирургическая операция по ламинэктомии поясничного позвонка L5

ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе все хирургические этапы выполнялись при прямом визуальном контроле без использования стереомикроскопа или увеличительных луп.

  1. Поместите анестезированную мышь в положение на животе на предварительно нагретую хирургическую платформу. Зафиксируйте передние конечности лентой для стабилизации тела и полного обнажения поясничного отдела (Рисунок 1).
  2. Определите уровень позвонка L5 по поверхностным ориентирам. Пальпируйте двусторонние гребни подвздошных костей и проведите воображаемую поперечную линию, соединяющую их высшие точки.
  3. Используйте поперечную линию как приблизительный ориентир для межпозвоночного пространства L5–L6. Расположите центр планируемого разреза кожи чуть краниальнее этой линии, чтобы воздействовать на дугу позвонка L5.
  4. Продезинфицируйте операционное поле. Выполните срединный продольный разрез кожи длиной примерно 1,5–2,0 cm над определенным уровнем L5, чтобы обнажить область L4–L6.
  5. Раздвиньте края кожи стерильным пинцетом. Обнажите дорсальную фасцию и определите срединный фасциальный шов.
  6. Подтвердите уровень позвонков после обнажения позвоночника. Определите пояснично-крестцовый переход и наиболее каудальный поясничный позвонок.
  7. Идентифицируйте L5 как позвонок, расположенный непосредственно краниальнее L6, поскольку мыши линии C57BL/6 обычно имеют шесть поясничных позвонков. Подтвердите уровень, отсчитав два позвонка краниально от пояснично-крестцового перехода.
  8. Сделайте небольшое отверстие вдоль срединного фасциального шва. Раздвиньте параспинальные мышцы с обеих сторон под прямым визуальным контролем.
  9. Отделите мышцы, прилегающие к остистому отростку L5 , чтобы обнажить подлежащую дугу позвонка. Расширьте зону обнажения краниально до остистого отростка L4 и каудально до остистого отростка L6, пока все три остистых отростка не станут четко видны.
  10. Выполняйте преимущественно тупую диссекцию, прилегающую к кости, используя ватные тампоны или тонкий пинцет. Используйте острую диссекцию только при необходимости для высвобождения фасциальных спаек и минимизации кровотечения.
  11. Поддерживайте латеральное разведение с помощью ватных тампонов, чтобы полностью обнажить дугу L5 и межламинарное пространство L5–L6. Повторно подтвердите уровень позвонков перед продолжением процедуры.
  12. Осторожно захватите остистый отросток L5 пинцетом и приподнимите его вместе с прилежащим отделом поясничного отдела позвоночника под углом примерно 30° относительно хирургической платформы, чтобы расширить межламинарное пространство L5–L6.
  13. Под прямым визуальным контролем введите закрытые кончики офтальмологических ножниц в межламинарное пространство L5–L6. Продвигайте ножницы по неглубокой плоскости непосредственно под каудальный край дуги L5.
  14. Слегка раскройте ножницы, чтобы создать первоначальное костное отверстие. Расширьте окно ламинэктомии, последовательно удаляя небольшие фрагменты кости вдоль краев дуги. Ограничьте удаление кости только дорсальной частью дуги L5 и избегайте расширения костного окна латерально в область двусторонних фасеточных суставов.
  15. Избегайте чрезмерной глубины введения и избыточной силы резания, чтобы предотвратить повреждение твердой мозговой оболочки.
  16. Продолжайте поэтапное удаление дуги до тех пор, пока твердая мозговая оболочка не станет четко видна через костное окно.
  17. Тщательно осмотрите операционное поле. Подтвердите отсутствие активного кровотечения и убедитесь в целостности твердой мозговой оболочки.
  18. Промойте операционное поле теплым стерильным физиологическим раствором. Добейтесь гемостаза с помощью легкого прижатия.
  19. Зашейте рану послойно. Ушейте кожу нейлоновым шовным материалом 6-0 и продезинфицируйте место разреза.
  20. После закрытия раны продолжайте анестезию севофлураном до тех пор, пока общая продолжительность наркоза не достигнет примерно 4 h. Затем прекратите подачу севофлурана и перейдите к послеоперационному уходу.

3. Послеоперационный уход

  1. В момент времени, соответствующий завершению операции в группе ламинэктомии, введите мелоксикам мышам контрольной группы подкожно в дозе 2 mg/kg. Поместите каждую мышь из группы ламинэктомии на терморегулируемую грелку и поддерживайте температуру тела до тех пор, пока животное не придет в сознание и у него не восстановится стабильное спонтанное дыхание и двигательная активность.
  2. После полного восстановления после наркоза верните каждую мышь из группы ламинэктомии в домашнюю клетку. В дальнейшем наблюдайте за животным до восстановления нормальной локомоции. Введите последующие дозы мелоксикама подкожно в дозе 2 mg/kg каждые 24 h в течение 48 h мышам обеих групп.
  3. Ежедневно до 3-го послеоперационного дня проверяйте состояние хирургического разреза и целостность швов. При необходимости повторно проведите анестезию и замените ослабленные или разорвавшиеся швы.
  4. Ежедневно осматривайте разрез на предмет отека, кровотечения, выделений или признаков местного воспаления.
  5. В течение всего послеоперационного периода контролируйте массу тела, поведение (уход за шерстью), спонтанную активность, а также потребление корма и воды.
  6. Гуманно эвтаназируйте любую мышь до запланированного завершения эксперимента, если будет соблюдено любое из следующих предопределенных критериев гуманной конечной точки: потеря ≥20% массы тела по сравнению с предоперационной; полная анорексия в течение 24 h или потребление корма ниже 50% от нормы в течение 3 дней подряд; невозможность или выраженное нежелание стоять или добираться до еды и воды, сохраняющееся в течение 24 h после восстановления после наркоза; или терминальное состояние, характеризующееся выраженной депрессией в сочетании с температурой тела ниже 37 °C.

4. Поведенческая оценка POCD

  1. Тест «открытое поле» (локомоторный контроль; 3-и сутки после операции)
    1. Проведите тест в открытом поле в арене диаметром 45 см × Арена диаметром 45 см со стенками высотой 40 см при уровне освещенности 20 люкс. Разместите видеокамеру непосредственно над центром арены таким образом, чтобы вся зона тестирования находилась в поле зрения.
    2. Поместите мышь в центр арены и немедленно после этого запустите систему видеотрекинга. Позвольте мыши свободно исследовать пространство в течение 5 мин. Проанализируйте всю 5-минутную сессию и с помощью системы видеотрекинга рассчитайте общее пройденное расстояние и среднюю скорость перемещения.
  2. Анализ походки
    1. Проведите анализ походки на 3-и сутки после операции с использованием автоматизированной системы анализа походки.
    2. Поместите каждую мышь в один конец дорожки и позвольте ей свободно ее пересечь. Запишите отпечатки лап во время движения с помощью высокоскоростной камеры, интегрированной в систему анализа походки.
    3. Запишите пробы походки для каждой мыши и соберите три валидных прогона с непрерывным движением вперед по дорожке для последующего анализа.
    4. Проанализируйте зарегистрированные данные об отпечатках лап с помощью программного обеспечения для анализа походки. Просмотрите автоматически идентифицированные отпечатки лап и при необходимости вручную скорректируйте классификацию правой передней, левой передней, правой задней и левой задней лап перед извлечением параметров походки.
    5. Количественно определите длину шага, время опоры, скорость переноса конечности и площадь отпечатка, затем рассчитайте среднее значение по трем валидным прогонам для каждой мыши для последующего статистического анализа.
  3. Лабиринт Барнса (пространственное обучение и память; 4–6-е сутки после операции)
    ​ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите тестирование в лабиринте Барнса один раз в день в течение трех дней подряд, начиная с 4-го послеоперационного дня. Тестирование следует проводить в один и тот же временной интервал ежедневно для минимизации циркадных колебаний.
    1. Расположите приемный бокс под соответствующим целевым отверстием. На протяжении всего эксперимента сохраняйте единое расположение целевой зоны.
    2. Для начала каждого испытания поместите мышь в центр лабиринта. Позвольте мыши искать коробку выхода в течение периода до 3 мин. Завершите испытание, когда мышь войдет в коробку выхода.
    3. Если мышь не сможет самостоятельно найти коробку для выхода в течение 3 минут, осторожно направьте ее к целевому отверстию. Позвольте мыши ненадолго остаться в коробке для выхода, чтобы закрепить навык выполнения задачи.
    4. Зарегистрируйте латентный период поиска выхода и пройденное расстояние с помощью системы видеотрекинга. Для тех испытаний, в которых мышь не попадает в коробку выхода в течение 3 мин, установите значение латентного периода, равное 180 с. В статистический анализ включите только данные о латентном периоде поиска выхода и пройденном расстоянии, зарегистрированные во время финальной сессии на 3-й день.
  4. Распознавание нового объекта (память на распознавание; 3–4-е сутки после операции)
    ​ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ту же арену и систему видеотрекинга, которые описаны для теста «открытое поле». Проведите сессию в открытом поле на 3-й послеоперационный день, чтобы мыши привыкли к тестовой арене перед началом обучения в тесте на распознавание нового объекта.
    1. Во время тренировочной сессии поместите два идентичных цилиндрических объекта в симметричные позиции в арене. Позвольте мыши свободно исследовать пространство в течение 5 мин.
    2. После интервала удерживания продолжительностью 1 ч замените один знакомый цилиндрический объект новым объектом кубической формы. Сбалансируйте положение нового объекта между мышами, чтобы минимизировать возможные предпочтения в выборе стороны. Позвольте мыши исследовать объекты в течение 5 мин.
    3. Зарегистрируйте время исследования знакомого и нового объектов с помощью системы видеотрекинга. В анализ следует включать только тех мышей, общее время исследования объектов которых составляет не менее 3 с.
    4. Рассчитайте индекс предпочтения (PI) по следующей формуле:
      figure-protocol-1
      Определите Tновый и Tзнакомый как время, затраченное на исследование нового и знакомого объектов соответственно во время тестовой сессии.
  5. Y-образный лабиринт с новым плечом (Пространственная распознавательная память; 5-е сутки после операции)
    1. Проведите тест в Y-образном лабиринте, состоящем из трех идентичных рукавов, разделенных 120°Случайным образом перекройте один рукав непрозрачной дверцей и обозначьте этот рукав как новый.
    2. Случайным образом выберите один из двух открытых рукавов в качестве стартового. Второй открытый рукав обозначьте как знакомый. Поместите мышь в конец стартового рукава и позвольте ей свободно исследовать два доступных рукава в течение 5 мин.
    3. После межпробного интервала продолжительностью 1 ч уберите непрозрачную дверь и верните мышь в конец того же стартового плеча.
    4. Позвольте мыши свободно исследовать все три плеча в течение 5 мин.
    5. Определите вход в рукав как перемещение отслеживаемого центра тела из центральной зоны в предопределенную зону рукава. С помощью системы видеотрекинга зарегистрируйте количество входов и время, проведенное в каждом рукаве.
    6. Рассчитайте новый индекс предпочтения плеча на основе времени по формуле:
      figure-protocol-2
      Определите Tновый, TПожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода., и Tзнакомый как время, проведенное в новом, стартовом и знакомом рукавах соответственно.
    7. Рассчитайте индекс предпочтения на основе количества заходов следующим образом:
      figure-protocol-3
      Определите Eновый в качестве количества вхождений в новый плечо, и Eобщее количество как общее количество заходов во все три рукава во время тестового испытания.

5. Обработка тканей, окрашивание по Нисслю и иммунофлуоресцентное окрашивание

  1. Подготовка тканей
    1. В назначенный конечный момент эксперимента глубоко анестезируйте мышь 3% севофлураном при скорости потока кислорода 2 L/min.
    2. Подтвердите достаточную глубину анестезии по отсутствию педального рефлекса. Поддерживая глубокую анестезию и до наступления остановки сердца, проведите транскардиальную перфузию 20 mL фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) для удаления внутрисосудистой крови.
    3. Немедленно проведите перфузию мыши 20 mL 4% параформальдегида (PFA).
    4. Осторожно извлеките весь мозг. Погрузите мозг в 4% PFA на 24 h при 4 °C для постфиксации.
    5. Перенесите мозг в 30% раствор сахарозы до полного погружения ткани на дно.
    6. Залейте мозг компаундом для оптимального криорезки (OCT).
    7. Быстро заморозьте подготовленную ткань и храните ее при −80 °C до момента криосекционирования.
  2. Окрашивание по Нисслю
    1. Доведите криосрезы толщиной 16 µm до комнатной температуры. Высушите предметные стекла на воздухе в течение 20 min.
    2. Промойте стекла в PBS в течение 2 min.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед окрашиванием убедитесь, что срезы ткани плотно прикреплены к стеклам.
    3. Полностью покройте срезы окрашивающим раствором толуидинового синего. Инкубируйте в течение 30 min при 5 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмпирически оптимизируйте время окрашивания для срезов 16 µm, чтобы избежать избыточного окрашивания.
    4. Кратковременно промойте стекла в дистиллированной воде в течение 10–30 s.
    5. Последовательно дифференцируйте срезы в 95%, 85% и 75% этаноле по 2 min в каждом растворе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отрегулируйте время дифференцировки для оптимизации интенсивности окрашивания.
    6. Дважды промойте стекла в свежем ксилоле по 5 min.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы с использованием ксилола проводите в вытяжном шкафу.
    7. Закрепите срезы нейтральным бальзамом. Осторожно накройте каждый срез покровным стеклом.
    8. Визуализируйте окрашенные срезы с помощью светового микроскопа с объективом 20×. Идентифицируйте область CA1 по характерному компактному слою пирамидных клеток в корональном срезе гиппокампа. Для каждой мыши проанализируйте один корональный срез и захватите два неперекрывающихся поля из области CA1 каждого полушария гиппокампа.
    9. Вручную подсчитайте морфологически неповрежденные Nissl-положительные нейроны и тельца Ниссля, используя плагин для подсчета клеток в программном обеспечении для анализа изображений. Неповрежденные нейроны определяются по целой соме, округлому ядру с видимым ядрышком и обилию цитоплазматического вещества Ниссля; тельца Ниссля определяются как интенсивно базофильные гранулярные или комковидные структуры в цитоплазме нейронов.
    10. Вычислите среднее значение, полученное из всех проанализированных полей, чтобы получить одно значение на животное. Убедитесь, что наблюдатель, выполняющий подсчет, не знает о распределении животных по группам.
  3. Иммунофлуоресцентное окрашивание на Iba1
    1. Перед окрашиванием дайте срезам мозга equilibrated до комнатной температуры.
    2. Погрузите стекла в раствор цитрата натрия для демаскировки антигена и проведите процедуру демаскировки в водяной бане при 80 °C в течение 25 min. После демаскировки дайте стеклам и раствору естественным образом остыть до комнатной температуры.
    3. Промойте срезы трижды фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) по 3 min за каждую промывку.
    4. Пермеабилизируйте срезы 0.2% Triton X-10 в PBS в течение 30 min при комнатной температуре, затем трижды промойте в PBS по 3 min.
    5. Блокируйте неспецифическое связывание, инкубируя срезы с 3% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в PBS в течение 1 h при комнатной температуре в увлажненной камере.
    6. Промойте срезы трижды в PBS по 3 min.
    7. Разведите первичные антитела к ионизированной кальций-связывающей адапторной молекуле 1 (Iba1; 1:10) в блокирующем растворе (3% BSA в PBS) и инкубируйте срезы с разведенными первичными антителами в течение ночи при 4 °C в увлажненной камере.
    8. Промойте срезы трижды в PBS по 3 min.
    9. Инкубируйте срезы с козьими антителами против кроличьего IgG (H+L), конъюгированными с 48 (1:10), в течение 90 min при комнатной температуре в темноте.
    10. Промойте срезы трижды в PBS по 3 min в темноте.
    11. Проведите контрастное окрашивание ядер DAPI (1:800) в течение 5 min в темноте.
    12. Промойте срезы трижды в PBS по 3 min в темноте.
    13. Закрепите срезы с помощью антифейдингового mounting medium, накройте покровными стеклами и храните в защищенном от света месте до момента визуализации.
    14. Получите флуоресцентные изображения области CA1 гиппокампа с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа с объективом 20×. Используйте идентичные настройки захвата изображений для всех срезов, включенных в количественные сравнения. Для каждой мыши проанализируйте один корональный срез и захватите два неперекрывающихся поля из области CA1 каждого полушария гиппокампа.
    15. Количественно определите среднюю интенсивность флуоресценции Iba1 в области CA1 гиппокампа с идентичными настройками порога для всех изображений. Вычислите среднее значение по всем полям, чтобы получить одно значение на животное.

6. Статистический анализ

  1. Выполните все статистические анализы с помощью программного обеспечения для статистического анализа. Представьте данные в виде среднего значения ± стандартного отклонения (SD).
  2. Оцените нормальность распределения данных с помощью критерия Шапиро–Уилка. Оцените равенство дисперсий с помощью F-теста.
  3. Сравните контрольную группу и группу с ламинэктомией L5 с помощью двухвыборочного двухстороннего t-критерия Стьюдента, если допущение о равенстве дисперсий соблюдено. В случае несоблюдения допущения о равенстве дисперсий используйте t-критерий Уэлча.
  4. Обозначьте n как количество животных, включенных в каждый анализ. Значение P < 0,05 считайте статистически значимым.

Результаты

Все мыши дожили до запланированного завершения эксперимента, ни одна из них не достигла заранее определенных критериев гуманного завершения, и все животные были включены в окончательный анализ. Моторная функция оценивалась на 3-и сутки после операции с помощью анализа поведения в открытом поле и анализа походки. Ни общее пройденное расстояние, ни средняя скорость в тесте с открытым полем не имели межгрупповых различий, что указывает на сопоставимую спонтанную локомоторную активность (Рисунок 2A). Анализ походки также не выявил значимых межгрупповых различий в длине шага, времени опоры, скорости переноса конечности или площади отпечатка лапы (Рисунок 2B). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что процедура ламинэктомии L5 не привела к выраженному нарушению двигательных функций, которое могло бы объяснить последующие различия в когнитивно-поведенческих показателях.

Когнитивные функции оценивали с помощью теста распознавания нового объекта (NOR), Y-образного лабиринта с новым рукавом и лабиринта Барнса. В тесте NOR группа после ламинэктомии L5 продемонстрировала значительно более низкий индекс предпочтения (PI) нового объекта по сравнению с контрольной группой (Рисунок 3A). В Y-образном лабиринте с новым рукавом в группе ламинэктомии L5 наблюдались значительно более низкие значения PI как для времени пребывания, так и для количества заходов в новый рукав (Рисунок 3B). В лабиринте Барнса на 3-й день тестирования в группе ламинэктомии L5 отмечались более длительная латентность поиска выхода и большее пройденное расстояние (Рисунок 3C). В совокупности эти поведенческие результаты свидетельствуют о нарушении когнитивных функций в послеоперационном периоде после ламинэктомии L5.

В области CA1 гиппокампа в группе с ламинэктомией L5 наблюдалось значительное снижение количества Nissl-положительных нейронов и количества телец Ниссля по сравнению с контрольной группой, что указывает на структурное повреждение нейронов (Рисунок 4A, B). Кроме того, средняя интенсивность флуоресценции Iba1 была значительно повышена в группе с ламинэктомией L5, что согласуется с усилением активации микроглии (Рисунок 4C, D).

figure-results-1
Рисунок 1Процедура ламинэктомии на уровне L5 поясничного отдела позвоночника для моделирования послеоперационной когнитивной дисфункции (ПОКД) у мышей. (A) Иллюстрация хирургической мишени на уровне дужки L5 и диапазона обнажения, охватывающего прилегающие уровни позвонков (L4–L6). (B) Интраоперационные изображения, иллюстрирующие основные этапы процедуры ламинэктомии поясничного позвонка L5. (a) Поясничная область после бритья с отмеченной срединной линией позвоночника; стрелками указано направление планируемого кожного разреза. (b) Срединный разрез кожи над поясничным отделом позвоночника. (c) Разрез фасции с поэтапным разведением параспинальных мышц для обнажения остистых отростков и дальнейшего иссечения тканей вокруг остистого отростка и дужки позвонка L5 для полного обнажения дужки L5. (d) Ламинэктомия L5 после удаления дужки позвонка L5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в увеличенном размере.

figure-results-2
Рисунок 2Оценка локомоторной активности и походки после поясничной ламинэктомии на уровне L5. (A) Тест «открытое поле», демонстрирующий общее пройденное расстояние и среднюю скорость (n = 10). (B) Анализ походки, демонстрирующий длину шага, время опоры, скорость переноса конечности и площадь отпечатка (n = 6). Данные представлены в виде среднего значения ± SD. Статистическая значимость обозначается как ns — недостоверно. Сокращения: Control = контрольная группа; Laminectomy = группа с ламинэктомией L5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3Когнитивно-поведенческие оценки после ламинэктомии поясничного отдела позвоночника на уровне L5. (A) Тест распознавания нового объекта (n = 10). (B) Тест в Y-образном лабиринте с новым рукавом (n = 10). (С) Тест в лабиринте Барнса (n = 10). Данные представлены в виде среднего значения ± SD. Статистическая значимость обозначена символом *P < 0.05, **P < 0,01, и ***P < 0.01. Сокращения: Control = контрольная группа; Laminectomy = группа с ламинэктомией L5. Нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в увеличенном виде.

figure-results-4
Рисунок 4Гистологическая оценка области CA1 гиппокампа после люмбэктомии на уровне L5. (A) Репрезентативные изображения окрашивания по Нисслю в области CA1 гиппокампа. (B) Количественное определение Nissl-положительных нейронов (слева) и телец Ниссля (справа) (n = 5). (C) Репрезентативные изображения иммунофлуоресцентного окрашивания на Iba1 в области CA1 гиппокампа. Масштабная линейка = 100 µm. (D) Количественное определение средней интенсивности флуоресценции Iba1 (n = 6). Данные представлены в виде среднего значения ± SD. Статистическая значимость обозначена как **P < 0,01 и ***P < 0.01. Сокращения: Control = контрольная группа; Laminectomy = группа с ламинэктомией L5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Послеоперационная когнитивная дисфункция была отмечена у пожилых людей, перенесших операции на позвоночнике10. Экспериментальные данные дополнительно указывают на то, что старение повышает восприимчивость к когнитивным нарушениям и нейровоспалительным реакциям, связанным с хирургическим вмешательством1,12. Настоящий протокол сочетает примерно 4 ч анестезии севофлураном с ламинэктомией L5 у старых мышей для моделирования ранних послеоперационных когнитивных нарушений. Его основная методологическая ценность заключается в предоставлении практичной и доступной процедуры для исследования поведенческих и гистологических изменений в гиппокампе после операции на позвоночнике.

Доклинические модели POCD включают парадигмы с воздействием только анестезии, абдоминальной хирургии и ортопедических травм13. Парадигмы с применением только анестезии позволяют оценить эффекты анестетиков в отсутствие хирургической травмы14, но не воспроизводят комбинированное воздействие анестезии и повреждения тканей. Модели абдоминальной хирургии и перелома большеберцовой кости включают хирургическое повреждение и использовались для изучения когнитивных нарушений, связанных с хирургическим вмешательством15,16. Однако места проведения операций и характер повреждения тканей в этих моделях отличаются от тех, что наблюдаются при операциях на позвоночнике. Поскольку тип и интенсивность хирургической травмы могут влиять на послеоперационные когнитивные исходы и центральные воспалительные реакции9, при выборе доклинической модели следует учитывать хирургический контекст. Таким образом, настоящий протокол ламинэктомии L5 представляет собой экспериментальную парадигму, связанную с операцией на позвоночнике, для изучения ранних послеоперационных когнитивных нарушений у старых мышей.

Основная техническая сложность данного протокола заключается в удалении достаточного объема костной ткани из дуги L5 для четкого обнажения твердой мозговой оболочки при одновременном предотвращении ее повреждения. При проведении ламинэктомии под прямым визуальным контролем требуется тщательный мониторинг глубины погружения инструмента, силы резания и угла введения офтальмологических ножниц. Кость следует удалять поэтапно, выполняя небольшие контролируемые надрезы вдоль краев дуги. Захват остистого отростка L5 пинцетом и приподнимание оперируемого поясничного сегмента под углом примерно 30° относительно операционного стола расширяет междуговое пространство L5–L6. Этот маневр позволяет вводить кончики ножниц на малую глубину под костный край и снижает риск контакта с твердой мозговой оболочкой. Неполное удаление кости может ограничить хирургический доступ, в то время как чрезмерно агрессивное резание или избыточная глубина погружения могут привести к повреждению твердой мозговой оболочки. Неконтролируемое кровотечение может привести к замутнению операционного поля, нарушить послеоперационное восстановление и увеличить вариабельность поведенческих результатов. Если междуговое пространство недостаточно для безопасного введения кончиков ножниц, следует скорректировать положение и угол подъема оперируемого поясничного сегмента, а не увеличивать глубину погружения. Если кровотечение перекрывает обзор операционного поля, удаление кости следует приостановить до восстановления адекватной визуализации, после чего остатки костной ткани должны удаляться постепенно.

Отслоение параспинальных мышц и ламинэктомия на уровне L5 могут способствовать возникновению транзиторной послеоперационной боли; механическая гиперчувствительность была задокументирована после экспериментальной ламинэктомии у мышей17. Мелоксикам вводили в соответствии с заранее определенным режимом анальгезии. Сообщалось, что мимические выражения, связанные с послеоперационной болью у мышей, сохраняются примерно в течение 36–48 ч18. 48-часовой режим анальгезии был предназначен для покрытия этого раннего послеоперационного периода, а когнитивно-поведенческое тестирование начинали на 3-и сутки после операции, после завершения курса анальгезии, чтобы снизить потенциальное влияние непосредственной послеоперационной боли. Тест «открытое поле» использовался в экспериментальных исследованиях POCD для оценки спонтанной локомоторной активности и определения того, может ли снижение локомоции исказить результаты когнитивно-поведенческого тестирования19,20. Соответственно, тест «открытое поле» и анализ походки проводили на 3-и сутки после операции, перед когнитивной оценкой. Значимых межгрупповых различий в локомоторной активности в открытом поле или параметрах походки обнаружено не было, что свидетельствует о том, что последующие когнитивно-поведенческие различия вряд ли можно объяснить прежде всего явным двигательным нарушением. Однако, поскольку спонтанная послеоперационная боль и дискомфорт в области раны не оценивались напрямую, их остаточное влияние на поведенческие показатели не может быть полностью исключено. В будущих исследованиях можно использовать прямые методы оценки спонтанной послеоперационной боли.

В целом, данный протокол представляет собой практический экспериментальный подход к изучению ранних послеоперационных когнитивных нарушений у старых мышей после ламинэктомии L5. Он может быть использован для исследования поведенческих исходов и лежащих в их основе механизмов когнитивных нарушений, связанных с операциями на позвоночнике, а также для оценки методов вмешательства, направленных на предотвращение или уменьшение послеоперационного когнитивного дефицита. Валидация на более крупных когортах и в независимых лабораториях позволит дополнительно подтвердить стабильность и воспроизводимость данной модели.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим Санхуа Фан из платформы центрального оборудования Медицинского факультета Чжэцзянского университета, а также Яньхун Чэнь и Сюляна Чжан из центра по работе с животными Чжэцзянского университета за техническую поддержку. Данное исследование было профинансировано за счет следующих фондов: Национальный природный научный фонд Китая (№ 82575196, 82074535 и U23A20508).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Самцы мышей C57BL/6JSuzhou Industrial Park Ai'er Maite Technology Co., Ltd.SYXK2023-05Животная модель
ANY-maze Video Tracking SoftwareStoelting Co., USA60Видеорегистрация и анализ поведения
Эритромициновая глазная мазьBeijing Twinluck Pharmaceutical Co,. Ltd.H1021270Профилактика пересыхания глаз
Прецизионный пинцетNANAЗажим кожи
ТермоковрикNANAКонтроль температуры
Iba1/AIF-1 (E4O4W) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling Technology17198Иммунофлуоресцентное окрашивание Iba1
Оборудование для ингаляционной анестезииRWD Life Science Co., Ltd.R581SАнестезия
MGT-PRAnhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd., ChinaMJY202512704Анализ походки
Микроофтальмологические ножницыNANAУдаление кости
Раствор для окрашивания по НисслюHaoke Biotechnology Co., Ltd.HK2033Окрашивание по Нисслю
НожницыShang Shou Jin Zhong Surgical Instruments Jiangsu ITD.,CorpY030Разрез кожи
СевофлуранShanghai Hengrui Pharmaceutical Co,. Ltd.2506231Анестезия
Одноразовая хирургическая простыняJiangxi Zhizheng Medical Equipment Co., Ltd.2021214021Подложка для хирургической операции
Триммер для мелких животныхYiwu Leiben Trading Co., Ltd.2504KFZB3592-0310Удаление шерсти
Хирургические иглы с нитьюShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LTD.F603Ушивание кожи
Крем для депиляции VeetRECKITT BENCKISER (India) LtdNAУдаление шерсти

Ссылки

  1. Zhao Q, Wan H, Pan H, Xu Y. Postoperative cognitive dysfunction-current research progress. Front Behav Neurosci. 2024;18:1328790.
  2. Kong H, Xu LM, Wang DX. Perioperative neurocognitive disorders: A narrative review focusing on diagnosis, prevention, and treatment. CNS Neurosci Ther. 2022;28(8):1147-1167.
  3. Monk TG, et al. Predictors of cognitive dysfunction after major noncardiac surgery. Anesthesiology. 2008;108(1):18-30.
  4. Li X, et al. Risk factors for postoperative cognitive decline after orthopedic surgery in elderly Chinese patients: A retrospective cohort study. Clin Interv Aging. 2024;19:491-502.
  5. Krenk L, et al. Cognitive dysfunction after fast-track hip and knee replacement. Anesth Analg. 2014;118(5):1034-1040.
  6. Yang X, et al. Identification of individuals at risk for postoperative cognitive dysfunction (POCD). Ther Adv Neurol Disord. 2022;15:17562864221114356.
  7. Suraarunsumrit P, et al. Outcomes associated with postoperative cognitive dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Age Ageing. 2024;53(7):afae160.
  8. Lin X, et al. The potential mechanism of postoperative cognitive dysfunction in older people. Exp Gerontol. 2020;130:110791.
  9. Lu B, et al. Effects of different types of non-cardiac surgical trauma on hippocampus-dependent memory and neuroinflammation. Front Behav Neurosci. 2022;16:950093.
  10. Park S, et al. Preoperative mild cognitive impairment as a risk factor of postoperative cognitive dysfunction in elderly patients undergoing spine surgery. Front Aging Neurosci. 2024;16:1292942.
  11. Xu Z, et al. Age-dependent postoperative cognitive impairment and Alzheimer-related neuropathology in mice. Sci Rep. 2014;4:3766.
  12. Zhang ZJ, et al. Aging alters Hv1-mediated microglial polarization and enhances neuroinflammation after peripheral surgery. CNS Neurosci Ther. 2020;26(3):374-384.
  13. Eckenhoff RG, et al. Perioperative neurocognitive disorder: State of the preclinical science. Anesthesiology. 2020;132(1):55-68.
  14. Guo LY, et al. Cognitive deficits after general anaesthesia in animal models: A scoping review. Br J Anaesth. 2023;130(2):e351-e360.
  15. Qiu LL, et al. NADPH oxidase 2-derived reactive oxygen species in the hippocampus might contribute to microglial activation in postoperative cognitive dysfunction in aged mice. Brain Behav Immun. 2016;51:109-118.
  16. Cibelli M, et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 2010;68(3):360-368.
  17. Yamamoto S, et al. Intraoperative spinal cord stimulation mitigates central sensitization after spine surgery in mice. Spine (Phila Pa 1976). 2023;48(11):E169-E176.
  18. Matsumiya LC, et al. Using the mouse grimace scale to reevaluate the efficacy of postoperative analgesics in laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2012;51(1):42-49.
  19. Sun L, et al. Activation of cannabinoid receptor type 2 attenuates surgery-induced cognitive impairment in mice through anti-inflammatory activity. J Neuroinflammation. 2017;14(1):138.
  20. Zhan G, et al. Anesthesia and surgery induce cognitive dysfunction in elderly male mice: The role of gut microbiota. Aging (Albany NY). 2019;11(6):1778-1790.

Перепечатки и разрешения

Теги

Модель операции на позвоночникеанестезия севофлураномтест когнитивных функцийповреждение нейронов гиппокампанейровоспалительные измененияокрашивание по Нисслюиммунофлуоресцентное окрашивание Iba1

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.