Методическая статья

Люмбальная ламинэктомия на уровне L5 у старых мышей линии C57BL/6J для моделирования послеоперационной когнитивной дисфункции

43 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71733

⸱

22 сентября 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Pharmacology, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описывается стандартизированная ламинэктомия в поясничном отделе L5 у старых мышей линии C57BL/6J для создания модели послеоперационной когнитивной дисфункции при минимизации двигательных нарушений, что позволяет проводить поведенческие, гистологические и механистические исследования периоперационных нейрокогнитивных расстройств.

Аннотация

Послеоперационная когнитивная дисфункция (ПОКД) является распространенным неврологическим осложнением после хирургического вмешательства и анестезии, особенно у пожилых людей, и сопровождается замедленным восстановлением, длительной госпитализацией и снижением качества жизни. Ортопедические и спинальные операции связаны с относительно высоким риском развития ПОКД; однако доклинические модели, точно отражающие периоперационные особенности хирургии позвоночника, остаются ограниченными. Часто используемые модели, включая лапаротомию и перелом большеберцовой кости, могут вызывать стойкие нарушения локомоции и длительное периферическое воспаление, что может затруднить интерпретацию когнитивно-поведенческих результатов. В данном протоколе описывается стандартизированный и недорогой метод моделирования ПОКД с использованием люмбальной ламинэктомии на уровне L5 под севофлурановой анестезией у 18-месячных самцов мышей линии C57BL/6J. Процедура выполняется с помощью стандартных хирургических инструментов и вызывает контролируемое хирургическое повреждение при минимизации стойкого моторного дефицита. Когнитивная функция оценивается с помощью теста распознавания нового объекта, Y-образного лабиринта с новым рукавом и лабиринта Барнса, в то время как повреждение нейронов гиппокампа и нейровоспалительные изменения оцениваются с помощью окрашивания по Нисслю и иммунофлуоресцентного окрашивания на Iba1 соответственно. Репрезентативные результаты демонстрируют сохраненную локомоторную активность, нарушение когнитивных функций, снижение целостности нейронов гиппокампа и усиление нейровоспаления в гиппокампе после операции. Эта стандартизированная и доступная модель представляет собой клинически значимую платформу для исследования механизмов когнитивной дисфункции, связанной с операциями на позвоночнике, и для оценки потенциальных периоперационных нейропротекторных вмешательств.

Введение

Послеоперационная когнитивная дисфункция (ПОКД) определяется как снижение способности к обучению и памяти, внимания, скорости обработки информации и исполнительных функций после применения анестезии и проведения хирургического вмешательства1; она преимущественно поражает пожилых пациентов, а сообщаемая частота ее возникновения, по всей видимости, варьируется в зависимости от хирургического контекста и популяции пациентов2,3. Было отмечено, что ПОКД часто встречается у пожилых людей, перенесших плановые ортопедические операции4. Клинически ПОКД может сохраняться в течение недель или месяцев после операции и ассоциируется с длительной госпитализацией и повышенной смертностью5,6,7. В условиях продолжающегося старения населения и роста объема хирургических вмешательств во всем мире ПОКД стала важной проблемой общественного здравоохранения и периоперационного ухода.

С точки зрения патофизиологии, POCD (периоперационная когнитивная дисфункция) рассматривается как многофакторный синдром, запускаемый хирургической травмой и воздействием анестетиков; при этом нейровоспаление, окислительный стресс, нарушение аутофагии и синаптическая дисфункция входят в число предполагаемых механизмов, лежащих в основе нейрональной дисфункции в областях, значимых для когнитивных функций, таких как гиппокамп8. Для детального изучения этих механизмов и оценки потенциальных методов терапевтического вмешательства был разработан ряд доклинических парадигм POCD. Доклинические парадигмы включают модели с применением только анестезии, модели на основе абдоминальных операций и модели ортопедических повреждений, такие как перелом большеберцовой кости9. Хотя эти модели способствовали развитию данной области знаний, они могут не в полной мере воспроизводить периоперационные особенности, характерные для операций на позвоночнике, а некоторые из них могут приводить к появлению сопутствующих факторов, таких как стойкий двигательный дефицит и длительное воспаление тканей, что затрудняет оценку когнитивных функций и интерпретацию механизмов.

Из доступных хирургических стратегий мы выбрали модель ламинэктомии поясничного отдела позвоночника на уровне L5 для изучения ранних послеоперационных когнитивных нарушений в стандартизированном и релевантном для хирургии позвоночника контексте. Данная процедура обеспечивает контролируемое локальное хирургическое воздействие под ингаляционной анестезией, что позволяет исследовать послеоперационные нейровоспалительные реакции и когнитивную дисфункцию, не вызывая выраженных нарушений локомоции. Благодаря оптимизации ключевых этапов операции, данный протокол представляет собой стандартизированный, практичный и экономически эффективный метод исследования когнитивных нарушений, связанных с операциями на позвоночнике, и оценки периоперационных нейропротекторных стратегий.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Чжэцзянского университета (номер этического одобрения: ZJU20260153).

1. Предоперационная подготовка

  1. Экспериментальные животные, распределение по группам, анальгезия и ослепление
    1. Используйте самцов мышей линии C57BL/6J в возрасте 18 месяцев с массой тела 30–34 g. Содержите мышей при 12-часовом цикле свет/темнота со свободным доступом к корму и воде.
    2. Дайте мышам акклиматизироваться к условиям содержания в течение не менее 7 дней перед операцией. После акклиматизации случайным образом распределите мышей в группу ламинэктомии L5 или контрольную группу.
    3. Перед началом экспериментальных процедур присвойте каждой мыши кодированный идентификационный номер. Сохраняйте код распределения по группам, чтобы поведенческие тесты могли проводиться в слепом методе.
    4. Мышам группы ламинэктомии L5 проведите общую анестезию севофлураном с последующей поясничной ламинэктомией L5. Мышей контрольной группы не подвергайте воздействию севофлурана, подготовке операционного поля или хирургическому вмешательству.
    5. Вводите мелоксикам подкожно в дозе 2 mg/kg мышам обеих групп. Первую дозу вводите после индукции анестезии в группе ламинэктомии L5 и в момент времени, соответствующий завершению операции, в контрольной группе.
    6. Последующие дозы мелоксикама вводите подкожно в дозе 2 mg/kg каждые 24 h в течение 48 h мышам обеих групп. Содержите, перемещайте и мониторьте обе группы в одинаковых условиях на протяжении всего экспериментального периода.
    7. Проводите все поведенческие тесты согласно одному и тому же графику для обеих групп. Убедитесь, что исследователь, проводящий поведенческие тесты, не знает о распределении животных по группам.
  2. Стерилизуйте все хирургические инструменты и продезинфицируйте рабочую зону. Предварительно разогрейте грелку для поддержания температуры тела во время анестезии. Подготовьте мелоксикам для периоперационного введения.
  3. Включите аппарат для газовой анестезии и поместите мышь в индукционную камеру. Проведите индукцию общего наркоза 3–5% севофлураном в течение 3–5 min при скорости потока кислорода 1 L/min.
  4. Переместите анестезированную мышь на операционную платформу. Поддерживайте анестезию 1.5–3% севофлураном через анестезиологическую маску при скорости потока кислорода 0.5–0.8 L/min. Введите мелоксикам подкожно в дозе 2 mg/kg. Общая продолжительность анестезии, измеренная от начала индукции севофлураном, составляет примерно 4 h. При необходимости регулируйте концентрацию севофлурана для поддержания стабильного хирургического уровня анестезии.
  5. Положите мышь на живот, чтобы поясничный отдел позвоночника был обращен вверх. Аккуратно зафиксируйте передние конечности лентой, чтобы стабилизировать животное и обеспечить беспрепятственный доступ к операционному полю в области L5.
  6. Подтвердите достаточную глубину анестезии, убедившись в отсутствии рефлекса отдергивания лапы. Нанесите офтальмологическую мазь для предотвращения пересыхания роговицы.
  7. Удалите шерсть с кожного покрова по срединной линии в поясничной области (примерно от L3 до S1), используя триммер для мелких животных. Продезинфицируйте открытую кожу 75% этанолом, затем повидон-йодом, повторив процедуру 2–3 раза для обеспечения асептики.

2. Хирургическая операция по ламинэктомии поясничного отдела позвоночника на уровне L5

ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе все хирургические этапы выполнялись при прямом визуальном контроле без использования стереомикроскопа или увеличительных луп.

  1. Поместите анестезированную мышь в положении на животе на предварительно подогретую хирургическую платформу. Зафиксируйте передние конечности лентой для стабилизации тела и полного обнажения поясничной области (Рисунок 1).
  2. Определите уровень позвонка L5 по поверхностным ориентирам. Пальпируйте двусторонние гребни подвздошных костей и проведите воображаемую поперечную линию, соединяющую их высшие точки.
  3. Используйте эту поперечную линию в качестве приблизительного ориентира для межпозвоночного пространства L5–L6. Расположите центр планируемого разреза кожи чуть краниально от этой линии, чтобы воздействовать на дугу позвонка L5.
  4. Продезинфицируйте операционное поле. Выполните продольный разрез кожи по срединной линии длиной примерно 1,5–2,0 cm над заранее определенным уровнем L5, чтобы обнажить область L4–L6.
  5. Раздвиньте края кожи стерильным пинцетом. Обнажите дорсальную фасцию и определите срединный шов фасции.
  6. После обнажения позвоночника подтвердите уровень позвонков. Определите пояснично-крестцовый переход и самый каудальный поясничный позвонок.
  7. Определите L5 как позвонок, расположенный непосредственно краниально по отношению к L6, так как мыши C57BL/6 обычно имеют шесть поясничных позвонков. Подтвердите уровень, отсчитав два позвонка краниально от пояснично-крестцового перехода.
  8. Сделайте небольшое отверстие вдоль срединного шва фасции. Разведите параспинальные мышцы в обе стороны под прямым визуальным контролем.
  9. Рассеките мышцы, прилегающие к остистому отростку L5, чтобы обнажить подлежащую дугу позвонка. Расширьте область обзора краниально до остистого отростка L4 и каудально до остистого отростка L6, пока все три остистых отростка не станут четко видны.
  10. Проводите преимущественно тупую диссекцию вблизи кости с помощью ватных тампонов или тонкого пинцета. Используйте острую диссекцию только при необходимости для отделения фасциальных спаек и минимизации кровотечения.
  11. Поддерживайте латеральную ретракцию с помощью ватных тампонов, чтобы полностью обнажить дугу L5 и межламинарное пространство L5–L6. Повторно подтвердите уровень позвонков перед продолжением.
  12. Осторожно захватите остистый отросток L5 пинцетом и приподнимите его вместе с прилежащим отделом поясничного отдела позвоночника под углом примерно 30° относительно хирургической платформы, чтобы расширить межламинарное пространство L5–L6.
  13. Под прямым визуальным контролем введите закрытые кончики офтальмологических ножниц в межламинарное пространство L5–L6. Проведите ножницы по неглубокой плоскости непосредственно под каудальным краем дуги L5.
  14. Слегка раскройте ножницы, чтобы создать начальное костное отверстие. Расширьте окно ламинэктомии, последовательно удаляя небольшие фрагменты кости вдоль краев дуги. Ограничьте удаление кости дорсальной частью дуги L5 и избегайте расширения костного окна латерально в область двусторонних фасеточных суставов.
  15. Избегайте чрезмерной глубины введения и избыточного давления при разрезе, чтобы предотвратить повреждение твердой мозговой оболочки.
  16. Продолжайте поэтапно удалять дугу позвонка до тех пор, пока твердая мозговая оболочка не станет четко видна через костное окно.
  17. Тщательно осмотрите операционное поле. Подтвердите отсутствие активного кровотечения и убедитесь, что твердая мозговая оболочка не повреждена.
  18. Промойте операционное поле теплым стерильным физраствором. Добейтесь гемостаза с помощью осторожной компрессии.
  19. Зашейте рану послойно. Зашейте кожу нейлоновыми нитями 6-0 и продезинфицируйте место разреза.
  20. После закрытия раны продолжайте анестезию севофлураном до достижения общей продолжительности примерно 4 h. Затем прекратите подачу севофлурана и перейдите к послеоперационному уходу.

3. Послеоперационный уход

  1. В момент времени, соответствующий завершению операции в группе ламинэктомии, введите мелоксикам подкожно в дозе 2 mg/kg мышам контрольной группы. Поместите каждую мышь из группы ламинэктомии на терморегулируемую грелку и поддерживайте температуру тела до тех пор, пока животное не придет в сознание и у него не восстановится стабильное спонтанное дыхание и двигательная активность.
  2. После полного восстановления после анестезии верните каждую мышь из группы ламинэктомии в домашнюю клетку. В дальнейшем наблюдайте за животным до восстановления нормальной локомоции. Вводите последующие дозы мелоксикама подкожно в дозе 2 mg/kg каждые 24 h в течение 48 h мышам обеих групп.
  3. Ежедневно до 3-го послеоперационного дня проверяйте состояние хирургического разреза и целостность швов. При необходимости повторно проведите анестезию и замените ослабленные или разорвавшиеся швы.
  4. Ежедневно осматривайте разрез на предмет наличия отека, кровотечения, выделений или признаков местного воспаления.
  5. В течение всего послеоперационного периода контролируйте массу тела, уходовое поведение, спонтанную активность, а также потребление корма и воды.
  6. Гуманно эвтаназируйте любую мышь до запланированного завершения эксперимента, если будет соблюдено любое из следующих предопределенных критериев гуманной конечной точки: потеря ≥20% массы тела по сравнению с предоперационной; полная анорексия в течение 24 h или потребление корма ниже 50% от нормы в течение 3 последовательных дней; невозможность или выраженное нежелание стоять или добираться до корма и воды, сохраняющееся в течение 24 h после восстановления после анестезии; или терминальное состояние, характеризующееся выраженной депрессией в сочетании с температурой тела ниже 37 °C.

4. Поведенческая оценка ПОГ

  1. Тест «Открытое поле» (Локомоторный контроль; 3-й день после операции)
    1. Проведите тест «открытое поле» в арене размером 45 cm × 45 cm со стенками высотой 40 cm при уровне освещенности 20 lux. Расположите видеокамеру непосредственно над центром арены так, чтобы вся область тестирования находилась в поле зрения.
    2. Поместите мышь в центр арены и немедленно после этого запустите видеотрекинг. Позвольте мыши свободно исследовать пространство в течение 5 min. Проанализируйте всю 5-минутную сессию и с помощью системы видеотрекинга рассчитайте общее пройденное расстояние и среднюю скорость перемещения.
  2. Анализ походки
    1. Проведите анализ походки на 3-й день после операции с использованием автоматизированной системы анализа походки.
    2. Поместите каждую мышь в один конец дорожки и позвольте ей свободно пройти по ней. Зафиксируйте отпечатки лап во время локомоции с помощью высокоскоростной камеры, интегрированной в систему анализа походки.
    3. Запишите результаты проб походки для каждой мыши и соберите три валидных прогона с непрерывным движением вперед по дорожке для последующего анализа.
    4. Проанализируйте записанные данные об отпечатках лап с помощью программного обеспечения для анализа походки. Просмотрите автоматически идентифицированные отпечатки лап и при необходимости вручную скорректируйте классификацию правой передней лапы, левой передней лапы, правой задней лапы и левой задней лапы перед извлечением параметров походки.
    5. Количественно определите длину шага, время опоры, скорость переноса лапы и площадь отпечатка, и рассчитайте среднее значение по трем валидным прогонам для каждой мыши для статистического анализа.
  3. Лабиринт Барнса (Пространственное обучение и память; 4–6-е дни после операции)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите тестирование в лабиринте Барнса один раз в день в течение трех последовательных дней, начиная с 4-го дня после операции. Проводите тестирование в одно и то же временное окно ежедневно, чтобы минимизировать циркадную вариабельность.
    1. Расположите коробку для побега под назначенным целевым отверстием. Сохраняйте одно и то же расположение цели на протяжении всего эксперимента.
    2. Для начала каждой пробы поместите мышь в центр лабиринта. Позвольте мыши искать коробку для побега в течение максимум 3 min. Завершите пробу, когда мышь войдет в коробку для побега.
    3. Осторожно направьте мышь к целевому отверстию, если она не найдет коробку для побега в течение 3 min. Позвольте мыши ненадолго остаться в коробке для побега, чтобы закрепить навык выполнения задачи.
    4. Зафиксируйте латентный период побега и пройденное расстояние с помощью системы видеотрекинга. Для проб, в которых мышь не вошла в коробку для побега в течение 3 min, назначьте латентный период побега 180 s. В статистический анализ включите только латентный период побега и пройденное расстояние, зафиксированные во время финальной сессии на 3-й день.
  4. Распознавание нового объекта (Рекогнитивная память; 3–4-е дни после операции)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ту же арену и систему видеотрекинга, что и для теста «открытое поле». Используйте сессию «открытого поля» на 3-й день после операции для привыкания мышей к арене тестирования перед обучением распознаванию нового объекта.
    1. Во время тренировочной сессии поместите два идентичных цилиндрических объекта в симметричные позиции в арене. Позвольте мыши свободно исследовать их в течение 5 min.
    2. После интервала удержания 1 h замените один знакомый цилиндрический объект на новый объект кубической формы. Рандомизируйте положение нового объекта для разных мышей, чтобы минимизировать возможные предпочтения в сторону определенной стороны. Позвольте мыши исследовать объекты в течение 5 min.
    3. Зафиксируйте время исследования знакомого и нового объектов с помощью системы видеотрекинга. В анализ включайте только тех мышей, общее время исследования объектов которых составило не менее 3 s.
    4. Рассчитайте индекс предпочтения (PI) по формуле:
      Формула индекса предпочтения: PI = T_novel / (T_novel + T_familiar) × 100%.
      Примите Tnovel и Tfamiliar как время, затраченное на исследование нового и знакомого объектов соответственно во время тестовой сессии.
  5. Y-образный лабиринт с новым плечом (Пространственная рекогнитивная память; 5-й день после операции)
    1. Проведите тест в Y-образном лабиринте, состоящем из трех идентичных плеч, разделенных углом 120°. Случайным образом заблокируйте одно плечо непрозрачной дверцей и обозначьте это плечо как новое плечо.
    2. Случайным образом выберите одно из двух открытых плеч в качестве стартового плеча. Обозначьте оставшееся открытое плечо как знакомое плечо. Поместите мышь в конец стартового плеча и позвольте ей свободно исследовать два доступных плеча в течение 5 min.
    3. После межпробного интервала 1 h уберите непрозрачную дверцу и верните мышь в конец того же стартового плеча.
    4. Позвольте мыши свободно исследовать все три плеча в течение 5 min.
    5. Определите вход в плечо как перемещение отслеживаемого центра тела из центральной зоны в предопределенную зону плеча. Зафиксируйте количество входов и время, проведенное в каждом плече, с помощью системы видеотрекинга.
    6. Рассчитайте временной индекс предпочтения нового плеча по формуле:
      Формула расчета времени для поведенческого исследования; уравнение, показывающее процент времени в новом плече.
      Примите Tnovel, Tstart и Tfamiliar как время, проведенное в новом, стартовом и знакомом плечах соответственно.
    7. Рассчитайте индекс предпочтения на основе количества входов по формуле:
      Формула входов в новое плечо, E_novel/E_total, уравнение анализа поведенческого эксперимента.
      Примите Enovel как количество входов в новое плечо, а Etotal как общее количество входов во все три плеча во время тестовой пробы.

5. Обработка тканей, окрашивание по Нисслю и иммунофлуоресцентное окрашивание

  1. Обработка тканей
    1. В установленной конечной точке эксперимента глубоко анестезируйте мышь 3% севофлураном при скорости потока кислорода 2 L/min.
    2. Подтвердите достаточную глубину анестезии по отсутствию педального рефлекса. Сохраняя глубокую анестезию и до наступления остановки сердца, проведите транскардиальную перфузию 20 mL фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) для удаления внутрисосудистой крови.
    3. Немедленно проведите перфузию мыши 20 mL 4% параформальдегида (PFA).
    4. Осторожно извлеките весь головной мозг. Погрузите мозг в 4% PFA на 24 h при 4 °C для постфиксации.
    5. Перенесите мозг в 30% раствор сахарозы до полного погружения ткани на дно.
    6. Залейте мозг компаундом для оптимального криорезания (OCT).
    7. Быстро заморозьте залитую ткань и храните ее при −80 °C до момента криосекционирования.
  2. Окрашивание по Нисслю
    1. Доведите криосрезы толщиной 16 µm до комнатной температуры. Высушите стекла на воздухе в течение 20 min.
    2. Промойте стекла в PBS в течение 2 min.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед окрашиванием убедитесь, что срезы тканей плотно прилегают к стеклам.
    3. Полностью покройте срезы раствором для окрашивания толуидиновым синим. Инкубируйте в течение 30 min при 55 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмпирически оптимизируйте время окрашивания для срезов 16 µm, чтобы избежать избыточного окрашивания.
    4. Кратковременно промойте стекла в дистиллированной воде в течение 10–30 s.
    5. Последовательно проведите дифференцировку срезов в 95%, 85% и 75% этаноле по 2 min в каждом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отрегулируйте время дифференцировки для оптимизации интенсивности окрашивания.
    6. Дважды осветлите стекла в свежем ксилоле по 5 min за раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы работы с ксилолом проводите в вытяжном шкафу.
    7. Заклейте срезы нейтральным бальзамом. Осторожно накройте каждый срез покровным стеклом.
    8. Визуализируйте окрашенные срезы с помощью светового микроскопа с объективом 20×. Идентифицируйте область CA1 по характерному компактному слою пирамидных клеток в корональном срезе гиппокампа. Для каждой мыши проанализируйте один корональный срез и получите два неперекрывающихся поля из области CA1 каждого полушария гиппокампа.
    9. Вручную подсчитайте морфологически сохранные Nissl-положительные нейроны и тельца Ниссля, используя плагин для подсчета клеток в программном обеспечении для анализа изображений. Сохранные нейроны определяются по целостности сомы, округлому ядру с видимым ядрышком и обильному цитоплазматическому веществу Ниссля; тельца Ниссля определяются как интенсивно базофильные гранулярные или комковатые структуры внутри цитоплазмы нейронов.
    10. Вычислите среднее значение, полученное по всем проанализированным полям, чтобы получить одно значение на животное. Убедитесь, что наблюдатель, выполняющий подсчет, не знает о распределении животных по группам (метод «слепого» анализа).
  3. Иммунофлуоресцентное окрашивание на Iba1
    1. Дайте срезам мозга equilibrated до комнатной температуры перед окрашиванием.
    2. Погрузите стекла в раствор для демаскировки антигенов с цитратом натрия и проведите демаскировку в водяной бане при 80 °C в течение 25 min. После демаскировки дайте стеклам и раствору остыть до комнатной температуры естественным путем.
    3. Промойте срезы трижды фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) по 3 min каждый раз.
    4. Пермеабилизируйте срезы 0.2% раствором Triton X-100 в PBS в течение 30 min при комнатной температуре, после чего трижды промойте срезы PBS по 3 min.
    5. Блокируйте неспецифическое связывание, инкубируя срезы в 3% растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS в течение 1 h при комнатной температуре в увлажненной камере.
    6. Промойте срезы трижды PBS по 3 min каждый раз.
    7. Разведите первичные антитела к ионизированной кальций-связывающей адапторной молекуле 1 (Iba1; 1:100) в блокирующем растворе (3% BSA в PBS) и инкубируйте срезы с разведенными первичными антителами в течение ночи при 4 °C в увлажненной камере.
    8. Промойте срезы трижды PBS по 3 min каждый раз.
    9. Инкубируйте срезы с козьими антителами против IgG кролика (H+L), конъюгированными с 488 (1:1000), в течение 90 min при комнатной температуре в темноте.
    10. Промойте срезы трижды PBS по 3 min каждый раз в темноте.
    11. Проведите контрастное окрашивание ядер DAPI (1:8000) в течение 5 min в темноте.
    12. Промойте срезы трижды PBS по 3 min каждый раз в темноте.
    13. Заклейте срезы с использованием антифейдингового средства, накройте покровными стеклами и храните в защищенном от света месте до момента визуализации.
    14. Получите флуоресцентные изображения области CA1 гиппокампа с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа с объективом 20×. Используйте идентичные настройки получения изображений для всех срезов, включенных в количественное сравнение. Для каждой мыши проанализируйте один корональный срез и получите два неперекрывающихся поля из области CA1 каждого полушария гиппокампа.
    15. Количественно определите среднюю интенсивность флуоресценции Iba1 в области CA1 гиппокампа, используя идентичные настройки порога для всех изображений. Вычислите среднее значение по всем полям, чтобы получить одно значение на животное.

6. Статистический анализ

  1. Выполните все статистический анализы с использованием программного обеспечения для статистического анализа. Представьте данные в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD).
  2. Оцените нормальность распределения данных с помощью теста Шапиро–Уилка. Оцените равенство дисперсий с помощью F-теста.
  3. Сравните контрольную группу и группу с ламинэктомией L5, используя непарный двухсторонний t-критерий Стьюдента при соблюдении условия равенства дисперсий. Используйте t-критерий Уэлча, если условие равенства дисперсий не соблюдено.
  4. Обозначьте n как количество животных, включенных в каждый анализ. Считайте значение P < 0.05 статистически значимым.

Результаты

Все мыши дожили до запланированного завершения эксперимента, ни одна из них не достигла заранее определенных критериев гуманного завершения, и все животные были включены в финальный анализ. Моторная функция оценивалась на 3-й послеоперационный день с помощью анализа поведения в открытом поле и анализа походки. Общая пройденная дистанция и средняя скорость в тесте с открытым полем не различались между группами, что указывает на сопоставимую спонтанную локомоторную активность (Рисунок 2A). Анализ походки также не выявил значимых межгрупповых различий в длине шага, времени опоры, скорости переноса конечности или площади отпечатка лапы (Рисунок 2B). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что процедура ламинэктомии L5 не вызвала явных моторных нарушений, которые могли бы объяснить последующие различия в когнитивно-поведенческих показателях.

Когнитивные функции оценивали с помощью теста распознавания нового объекта (NOR), Y-образного лабиринта с новым рукавом и лабиринта Барнса. В тесте NOR в группе после ламинэктомии L5 индекс предпочтения нового объекта (PI) был значительно ниже, чем в контрольной группе (Рисунок 3A). В Y-образном лабиринте с новым рукавом в группе после ламинэктомии L5 наблюдались значительно более низкие показатели PI как по времени пребывания, так и по количеству заходов в новый рукав (Рисунок 3B). В лабиринте Барнса в группе после ламинэктомии L5 на 3-й день тестирования наблюдались более длительная латентность выхода и большее пройденное расстояние (Рисунок 3C). В совокупности эти поведенческие результаты указывают на нарушение послеоперационных когнитивных функций после ламинэктомии L5.

В области CA1 гиппокампа в группе с ламинэктомией L5 наблюдалось значительно меньшее количество Nissl-положительных нейронов и существенно меньшее число телец Ниссля по сравнению с контрольной группой, что указывает на структурное повреждение нейронов (Рисунок 4A, B). Кроме того, в группе с ламинэктомией L5 была значительно повышена средняя интенсивность флуоресценции Iba1, что соответствует усилению активации микроглии (Рисунок 4C, D).

Схема и процесс диссекции поясничного отдела позвоночника мыши с идентификацией позвонков L4, L5, L6.
Рисунок 1: Процедура поясничной ламинэктомии L5 для моделирования послеоперационной когнитивной дисфункции (ПОКД) у мышей. (A) Иллюстрация области хирургического вмешательства на уровне дужки L5 и диапазона экспозиции, охватывающего прилегающие уровни позвонков (L4–L6). (B) Интраоперационные изображения, иллюстрирующие основные этапы процедуры поясничной ламинэктомии L5. (a) Поясничная область после выбривания с определением срединной линии позвоночника; стрелки указывают направление планируемого разреза кожи. (b) Срединный разрез кожи над поясничным отделом позвоночника. (c) Разрез фасции с пошаговым раздвиганием параспинальных мышц для обнажения остистых отростков и дальнейшего очищения тканей вокруг остистого отростка и дужки L5 для полного обнажения дужки L5. (d) Ламинэктомия L5 после удаления дужки L5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Сравнение ламинэктомии и контрольной группы; траектория движения, столбчатая диаграмма, сравнение данных походки, результаты эксперимента.
Рисунок 2: Оценка локомоторной активности и походки после поясничной ламинэктомии на уровне L5. (A) Тест в открытом поле, демонстрирующий общее пройденное расстояние и среднюю скорость (n = 10). (B) Анализ походки, демонстрирующий длину шага, время опоры, скорость переноса конечности и площадь отпечатка (n = 6). Данные представлены как среднее значение ± SD. Статистическая значимость указана как ns — недостоверно. Сокращения: Control = контрольная группа; Laminectomy = группа с ламинэктомией L5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Схемы лабиринтов и столбчатые диаграммы, анализирующие эффекты контроля в сравнении с ламинэктомией при выполнении когнитивных задач.
Рисунок 3: Когнитивно-поведенческие тесты после поясничной ламинэктомии L5. (A) Тест распознавания нового объекта (n = 10). (B) Тест Y-образного лабиринта с новым плечом (n = 10). (C) Тест в лабиринте Барнса (n = 10). Данные представлены как среднее значение ± SD. Статистическая значимость указана как *P < 0.05, **P < 0.01 и ***P < 0.001. Сокращения: Control = контрольная группа; Laminectomy = группа с ламинэктомией L5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты ламинэктомии; гистологические изображения и столбчатые диаграммы интенсивности IBA1 в контрольной группе и после ламинэктомии.
Рисунок 4: Гистологическая оценка области CA1 гиппокампа после поясничной ламинэктомии L5. (A) Репрезентативные изображения окрашивания по Нисслю в области CA1 гиппокампа. (B) Количественная оценка Нисль-положительных нейронов (слева) и телец Ниссля (справа) (n = 5). (C) Репрезентативные изображения иммунофлуоресценции Iba1 в области CA1 гиппокампа. Масштабная линейка = 100 µm. (D) Количественная оценка средней интенсивности флуоресценции Iba1 (n = 6). Данные представлены как среднее значение ± SD. Статистическая значимость указана как **P < 0.01 и ***P < 0.001. Сокращения: Control = контрольная группа; Laminectomy = группа с ламинэктомией L5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Послеоперационная когнитивная дисфункция была отмечена у пожилых людей, перенесших операции на позвоночнике10. Экспериментальные данные дополнительно указывают на то, что старение повышает восприимчивость к когнитивным нарушениям и нейровоспалительным реакциям, связанным с хирургическим вмешательством1,12. Настоящий протокол сочетает примерно 4 ч анестезии севофлураном с ламинэктомией L5 у старых мышей для моделирования ранних послеоперационных когнитивных нарушений. Его основная методологическая ценность заключается в предоставлении практичной и доступной процедуры для исследования поведенческих и гистологических изменений в гиппокампе после операции на позвоночнике.

Доклинические модели POCD включают парадигмы с воздействием только анестезии, абдоминальной хирургии и ортопедических травм13. Парадигмы с применением только анестезии позволяют оценить эффекты анестетиков в отсутствие хирургической травмы14, но не воспроизводят комбинированное воздействие анестезии и повреждения тканей. Модели абдоминальной хирургии и перелома большеберцовой кости включают хирургическое повреждение и использовались для изучения когнитивных нарушений, связанных с хирургическим вмешательством15,16. Однако места проведения операций и характер повреждения тканей в этих моделях отличаются от тех, что наблюдаются при операциях на позвоночнике. Поскольку тип и интенсивность хирургической травмы могут влиять на послеоперационные когнитивные исходы и центральные воспалительные реакции9, при выборе доклинической модели следует учитывать хирургический контекст. Таким образом, настоящий протокол ламинэктомии L5 представляет собой экспериментальную парадигму, связанную с операцией на позвоночнике, для изучения ранних послеоперационных когнитивных нарушений у старых мышей.

Основная техническая сложность данного протокола заключается в удалении достаточного объема костной ткани из дуги L5 для четкого обнажения твердой мозговой оболочки при одновременном предотвращении ее повреждения. При проведении ламинэктомии под прямым визуальным контролем требуется тщательный мониторинг глубины погружения инструмента, силы резания и угла введения офтальмологических ножниц. Кость следует удалять поэтапно, выполняя небольшие контролируемые надрезы вдоль краев дуги. Захват остистого отростка L5 пинцетом и приподнимание оперируемого поясничного сегмента под углом примерно 30° относительно операционного стола расширяет междуговое пространство L5–L6. Этот маневр позволяет вводить кончики ножниц на малую глубину под костный край и снижает риск контакта с твердой мозговой оболочкой. Неполное удаление кости может ограничить хирургический доступ, в то время как чрезмерно агрессивное резание или избыточная глубина погружения могут привести к повреждению твердой мозговой оболочки. Неконтролируемое кровотечение может привести к замутнению операционного поля, нарушить послеоперационное восстановление и увеличить вариабельность поведенческих результатов. Если междуговое пространство недостаточно для безопасного введения кончиков ножниц, следует скорректировать положение и угол подъема оперируемого поясничного сегмента, а не увеличивать глубину погружения. Если кровотечение перекрывает обзор операционного поля, удаление кости следует приостановить до восстановления адекватной визуализации, после чего остатки костной ткани должны удаляться постепенно.

Отслоение параспинальных мышц и ламинэктомия на уровне L5 могут способствовать возникновению транзиторной послеоперационной боли; механическая гиперчувствительность была задокументирована после экспериментальной ламинэктомии у мышей17. Мелоксикам вводили в соответствии с заранее определенным режимом анальгезии. Сообщалось, что мимические выражения, связанные с послеоперационной болью у мышей, сохраняются примерно в течение 36–48 ч18. 48-часовой режим анальгезии был предназначен для покрытия этого раннего послеоперационного периода, а когнитивно-поведенческое тестирование начинали на 3-и сутки после операции, после завершения курса анальгезии, чтобы снизить потенциальное влияние непосредственной послеоперационной боли. Тест «открытое поле» использовался в экспериментальных исследованиях POCD для оценки спонтанной локомоторной активности и определения того, может ли снижение локомоции исказить результаты когнитивно-поведенческого тестирования19,20. Соответственно, тест «открытое поле» и анализ походки проводили на 3-и сутки после операции, перед когнитивной оценкой. Значимых межгрупповых различий в локомоторной активности в открытом поле или параметрах походки обнаружено не было, что свидетельствует о том, что последующие когнитивно-поведенческие различия вряд ли можно объяснить прежде всего явным двигательным нарушением. Однако, поскольку спонтанная послеоперационная боль и дискомфорт в области раны не оценивались напрямую, их остаточное влияние на поведенческие показатели не может быть полностью исключено. В будущих исследованиях можно использовать прямые методы оценки спонтанной послеоперационной боли.

В целом, данный протокол представляет собой практический экспериментальный подход к изучению ранних послеоперационных когнитивных нарушений у старых мышей после ламинэктомии L5. Он может быть использован для исследования поведенческих исходов и лежащих в их основе механизмов когнитивных нарушений, связанных с операциями на позвоночнике, а также для оценки методов вмешательства, направленных на предотвращение или уменьшение послеоперационного когнитивного дефицита. Валидация на более крупных когортах и в независимых лабораториях позволит дополнительно подтвердить стабильность и воспроизводимость данной модели.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим Санхуа Фан из платформы центрального оборудования Медицинского факультета Чжэцзянского университета, а также Яньхун Чэнь и Сюляна Чжан из центра по работе с животными Чжэцзянского университета за техническую поддержку. Данное исследование было профинансировано за счет следующих фондов: Национальный природный научный фонд Китая (№ 82575196, 82074535 и U23A20508).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Самцы мышей C57BL/6JSuzhou Industrial Park Ai'er Maite Technology Co., Ltd.SYXK2023-05Животная модель
ANY-maze Video Tracking SoftwareStoelting Co., USA60Видеорегистрация и анализ поведения
Эритромициновая глазная мазьBeijing Twinluck Pharmaceutical Co,. Ltd.H1021270Профилактика пересыхания глаз
Прецизионный пинцетNANAЗажим кожи
ТермоковрикNANAКонтроль температуры
Iba1/AIF-1 (E4O4W) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling Technology17198Иммунофлуоресцентное окрашивание Iba1
Оборудование для ингаляционной анестезииRWD Life Science Co., Ltd.R581SАнестезия
MGT-PRAnhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd., ChinaMJY202512704Анализ походки
Микроофтальмологические ножницыNANAУдаление кости
Раствор для окрашивания по НисслюHaoke Biotechnology Co., Ltd.HK2033Окрашивание по Нисслю
НожницыShang Shou Jin Zhong Surgical Instruments Jiangsu ITD.,CorpY030Разрез кожи
СевофлуранShanghai Hengrui Pharmaceutical Co,. Ltd.2506231Анестезия
Одноразовая хирургическая простыняJiangxi Zhizheng Medical Equipment Co., Ltd.2021214021Подложка для хирургической операции
Триммер для мелких животныхYiwu Leiben Trading Co., Ltd.2504KFZB3592-0310Удаление шерсти
Хирургические иглы с нитьюShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LTD.F603Ушивание кожи
Крем для депиляции VeetRECKITT BENCKISER (India) LtdNAУдаление шерсти

Ссылки

  1. Zhao Q, Wan H, Pan H, Xu Y. Postoperative cognitive dysfunction-current research progress. Front Behav Neurosci. 2024;18:1328790.
  2. Kong H, Xu LM, Wang DX. Perioperative neurocognitive disorders: A narrative review focusing on diagnosis, prevention, and treatment. CNS Neurosci Ther. 2022;28(8):1147-1167.
  3. Monk TG, et al. Predictors of cognitive dysfunction after major noncardiac surgery. Anesthesiology. 2008;108(1):18-30.
  4. Li X, et al. Risk factors for postoperative cognitive decline after orthopedic surgery in elderly Chinese patients: A retrospective cohort study. Clin Interv Aging. 2024;19:491-502.
  5. Krenk L, et al. Cognitive dysfunction after fast-track hip and knee replacement. Anesth Analg. 2014;118(5):1034-1040.
  6. Yang X, et al. Identification of individuals at risk for postoperative cognitive dysfunction (POCD). Ther Adv Neurol Disord. 2022;15:17562864221114356.
  7. Suraarunsumrit P, et al. Outcomes associated with postoperative cognitive dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Age Ageing. 2024;53(7):afae160.
  8. Lin X, et al. The potential mechanism of postoperative cognitive dysfunction in older people. Exp Gerontol. 2020;130:110791.
  9. Lu B, et al. Effects of different types of non-cardiac surgical trauma on hippocampus-dependent memory and neuroinflammation. Front Behav Neurosci. 2022;16:950093.
  10. Park S, et al. Preoperative mild cognitive impairment as a risk factor of postoperative cognitive dysfunction in elderly patients undergoing spine surgery. Front Aging Neurosci. 2024;16:1292942.
  11. Xu Z, et al. Age-dependent postoperative cognitive impairment and Alzheimer-related neuropathology in mice. Sci Rep. 2014;4:3766.
  12. Zhang ZJ, et al. Aging alters Hv1-mediated microglial polarization and enhances neuroinflammation after peripheral surgery. CNS Neurosci Ther. 2020;26(3):374-384.
  13. Eckenhoff RG, et al. Perioperative neurocognitive disorder: State of the preclinical science. Anesthesiology. 2020;132(1):55-68.
  14. Guo LY, et al. Cognitive deficits after general anaesthesia in animal models: A scoping review. Br J Anaesth. 2023;130(2):e351-e360.
  15. Qiu LL, et al. NADPH oxidase 2-derived reactive oxygen species in the hippocampus might contribute to microglial activation in postoperative cognitive dysfunction in aged mice. Brain Behav Immun. 2016;51:109-118.
  16. Cibelli M, et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 2010;68(3):360-368.
  17. Yamamoto S, et al. Intraoperative spinal cord stimulation mitigates central sensitization after spine surgery in mice. Spine (Phila Pa 1976). 2023;48(11):E169-E176.
  18. Matsumiya LC, et al. Using the mouse grimace scale to reevaluate the efficacy of postoperative analgesics in laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2012;51(1):42-49.
  19. Sun L, et al. Activation of cannabinoid receptor type 2 attenuates surgery-induced cognitive impairment in mice through anti-inflammatory activity. J Neuroinflammation. 2017;14(1):138.
  20. Zhan G, et al. Anesthesia and surgery induce cognitive dysfunction in elderly male mice: The role of gut microbiota. Aging (Albany NY). 2019;11(6):1778-1790.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Модель операции на позвоночникеанестезия севофлураномтест когнитивных функцийповреждение нейронов гиппокампанейровоспалительные измененияокрашивание по Нисслюиммунофлуоресцентное окрашивание Iba1

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.