Этот протокол интегрирует публичные транскриптомические наборы данных и валидацию эпителиальных клеток толстой кишки для идентификации S100P как общего биомаркера, связанного с воспалительными заболеваниями кишечника, колоректальным раком и аденокарциномой поджелудочной железы.
Исследовательская статья
S100P как общий биомаркер при воспалительном заболевании кишечника, колоректальном раке и аденокарциноме поджелудочной железы: интегрированный транскриптомический анализ
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) связано с повышенным риском колоректального рака (КРК) и аденокарциномы поджелудочной железы (ПААД), однако молекулярные особенности, общие для этих заболеваний, остаются неполностью изучены. Целью этого исследования было выявление общих генов и биологических путей, связанных с ВЗК, CRC и PAAD, посредством интегрированного транскриптомного анализа и экспериментальной валидации. Наборы данных по экспрессии генов для ВЗК, CRC и PAAD были получены из баз данных The Cancer Genome Atlas и Gene Expression Omnibus. Были проведены взвешенный анализ коэкспрессии генов и дифференциальный анализ экспрессии для выявления генов, связанных с болезнью и общих генов. Генная онтология и Киотская энциклопедия генов и геномов (анализы были использованы для изучения обогащённых биологических функций и путей). Инфильтрация иммунных клеток оценивалась с помощью идентификации типов клеток путем оценки относительных подмножеств транскриптов РНК. Для оценки диагностической эффективности распространённых генов был проведён анализ операционных характеристик приемника. Для изучения клеточного распределения S100P был проведён анализ секвенирования РНК для изучения клеточного распределения. Кроме того, были оценены эффекты снижения уровня S100P в эпителиальных клетках толстой кишки, стимулираемых липополисахаридами (LPS). Всего было выявлено 162 гена, связанных с болезнями, и четыре общих гена. Анализ функционального обогащения показал значительное обогащение иммунных и воспаленных путей, включая сигнальный путь интерлейкина-17. Анализ иммунной инфильтрации выявил схожие тенденции в нескольких популяциях иммунных клеток среди ВЗК, CRC и PAAD. Одноклеточный анализ показал повышенную экспрессию S100P в эпителиальных клетках при всех трёх заболеваниях. Снижение уровня S100P восстановило пролиферативную способность эпителиальных клеток толстой кишки, стимулируемых LPS, и снизило экспрессию воспалительных цитокинов. Интегрированный транскриптомический анализ выявил S100P как биомаркер, связанный с ВЗК, CRC и PAAD, и выделил общие иммунно-связанные признаки этих заболеваний.
Введение
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) представляют собой спектр иммунных заболеваний, поражающих желудочно-кишечный тракт, включая язвенный колит и болезньКрона 1. Этиология ВЗК крайне сложна и включает нарушения иммунной слизистой слизистой системы, дисбиоз и генетическуювосприимчивость 2. ВЗК является глобальной проблемой в области здравоохранения с растущим уровнем заболеваемости и значительными экономическими нагрузками, и его растущая распространённость привлекла значительноевнимание 1. Важно, что у пациентов с ВЗК значительно повышен риск развития колоректального рака (CRC)3 и аденокарциномы поджелудочной железы (PAAD)4. Хотя эта связь хорошо задокументирована, генетический перекрестный диалог между ВЗК, CRC и PAAD остаётся неполностью изученным.
Предыдущие исследования настоятельно свидетельствуют о том, что ВЗК, CRC и PAAD имеют общие патогенные процессы; Однако специфические и чувствительные диагностические биомаркеры по-прежнему отсутствуют, а общие патогенные механизмы до конца не прояснены. К счастью, с быстрым развитием и широкой доступностью высокопроизводительных технологий секвенирования многочисленные транскриптомные наборы данных от пациентов с ВЗК, КРК и PAAD стали доступны для широкой доступности, что позволило систематически исследовать молекулярные взаимосвязи между этими заболеваниями 2,5,6.
В этом исследовании использовались данные высокопроизводительного секвенирования пациентов с ВЗК, КРК и PAAD для выявления связанных с болезнью и общих генов с помощью взвешенного анализа коэкспрессии генов (WGCNA) и анализа дифференциальной экспрессии. Эти гены были дополнительно изучены для выявления возможных общих сигнальных путей между ВЗК, CRC и PAAD. Кроме того, мы оценили диагностическую ценность этих распространённых генов. Анализ секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) показал, что ключевой ген S100P преимущественно экспрессируется в эпителиальных клетках. Наконец, мы исследовали биологическую роль S100P в ВЗК.
В заключение, целью данного исследования было выявление общих диагностических биомаркеров и биологических путей, связанных с ВЗК, CRC и PAAD, тем самым предоставляя ценные клинические знания по совместной профилактике и лечению этих заболеваний.
Протокол
В этом исследовании использованы общедоступные, деидентифицированные наборы данных из Атласа генома рака (TCGA) и Omnibus по экспрессии генов (GEO), а также установленные коммерческие клеточные линии. Не было задействовано новых человеческих участников, идентифицируемой информации о пациентах или образцов, полученных от пациентов. Все анализы проводились в соответствии с соответствующими институциональными рекомендациями и условиями использования публичных баз данных. Поэтому для этого исследования не требовалось дополнительное институциональное этическое одобрение и информированное согласие.
Источник данных
Данные RNA-seq для когорт IBD (GSE179285; платформа: GPL6480 и GSE24287; платформа: GPL6480), когорт CRC (TCGA-CRC; платформа: Illumina HiSeq 2000 и GSE87211; платформа: GPL13497), а также когорты PAAD (GSE128735; платформа: GPL20301 и GSE62452; платформа: GPL6244) были скачаны из TCGA и GEO. Все наборы данных были доступны 5 декабря 2025 года.
Для каждого набора данных образцы строго делились на две подгруппы: ткани поражения заболевания/опухоли служили группой случаев, а соответствующие нормальные ткани без поражения — контрольной группой. В частности, когорта с ВЗК содержала 297 образцов слизистой кишечной слизистой у пациентов с ВЗК и 56 образцов нормальной кишечной слизистой от здоровых людей; когорта CRC включала 841 первичную ткань колоректальных опухолей и 211 совпадающих смежных нормальных колоректальных эпителиальных тканей; а когорта PAAD включала 114 опухолевых тканей PAAD и 106 нормальных паренхимальных тканей поджелудочной железы.
Все наборы данных в одной категории заболеваний интегрировались равномерно. Функция normalizeBetweenArrays в лимма-пакете была применена для выполнения квантильной нормализации между выборками, эффективно устранив межплатформенные пакетные эффекты и стандартизируя значения экспрессии генов между различными наборами данных для последующего анализа дифференциальной экспрессии.
Скрининг генов, связанных с ВЗК, CRC и PAAD, а также распространённых генов
Во-первых, дифференциально экспрессированные гены (DEG) были скринингированы из когорт IBD, CRC и PAAD с использованием лимма-пакета, а исходные значения P корректировались с помощью метода частоты ложного обнаружения Бенджамини-Хохберга (FDR). В когортах IBD, CRC и PAAD критерии скрининга были установлены на уровне |logFC| > 0,4, а P < 0,05. Кроме того, WGCNA проводился на всех генах, при этом минимальный порог генного модуля составлял 100 (мягкий порог мощности = 0,90; тип сети = подписанный). В результате в трех когортах были выявлены общие ДЭГ-и и модульные гены. Гены, последовательно идентифицированные обоими методами, определялись как общие, тогда как оставшиеся гены классифицировались как родственные гены.
ИПП и анализ функционального обогащения
Эти анализы проводились на генах, связанных с заболеванием. Анализ взаимодействия белков и белков (PPI) проводился с использованием базы данных STRING (балл взаимодействия > 0,40). Функциональный анализ обогащения включал анализы генной онтологии (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG), которые проводились с использованием clusterProfiler, enrichplot и org. Hs.eg.db упаковки (P < 0,05 и скорректированное по FDR значение q [метод Бенджамини–Хохберга] < 0,05).
Профилирование иммунной микросреды
CIBERSORT — это надёжный алгоритм для оценки уровней инфильтрации иммунных клеток по данным экспрессии генов с использованием стандартной матрицы сигнатурыLM22 7. В этом исследовании алгоритм CIBERSORT использовался для оценки степени инфильтрации иммунных клеток в образцах когорт IBD, CRC и PAAD, чтобы изучить общие характеристики иммунной микросреды между тремя заболеваниями. Анализ проводился с 1000 перестановками для вычисления P значений для каждого образца, а квантильная нормализация (QN = TRUE) применялась к файлу выражения смеси. Для последующих анализов сохранялись только образцы с CIBERSORT P < 0,05, что обеспечивало надёжность результатов деконволюции.
Оценка диагностической ценности распространённых генов
Диагностическая ценность общих генов в когортах ВЗК, CRC и PAAD была оценена с помощью анализа операционных характеристик приёмника (ROC) с пакетом pROC в R. Оптимальный компромисс между чувствительностью и специфичностью визуализировался с помощью кривых ROC.
qRT-PCR, анализ трансфекции клеток и формирования колоний
qRT-ПЦР и трансфекция клеток проводились согласно предыдущимисследованиям 8,9,10. Транзиентная трансфекция выполнялась с использованием трансфекционного реагента jetPRIME (Polyplus, Китай) согласно инструкциям производителя. Клетки инкубировали с трансфекционной смесью в течение 6 часов, после чего среда заменялась полным DMEM. Последующие эксперименты проводились через 48 часов после трансфекции.
Кратко, полная клеточная РНК была извлечена с помощью реагента TRIzol. РНК была обратно транскрипирована в кДНК с помощью PrimeScript RT Master Mix. Количественная ПЦР проводилась с использованием TB Green qPCR. β-актин использовался как внутренний эталонный ген для нормализации экспрессии. Биологические эксперименты проводились в трёх экземплярах. Праймерные последовательности и siS100P можно найти в предыдущем исследовании 11.
Ячейки NCM460, FHC, HCT116, SW116, PANC1 и BXPC2 были получены согласно таблице материалов. Все клеточные линии прошли идентификацию клеток и тестирование на микоплазму.
Во время экспериментов все клетки проходили через 3–5 поколений. Все клетки культивировались в полном DMEM, содержащем 10% плодовой бычий сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина.
Анализ формирования колоний проводился как описано в предыдущемисследовании 12. Кратко, в каждую скважину пластины с шестью лунками было засеяно по 1000 клеток и культивировано в течение 10 дней, прежде чем эксперимент был завершан. Клетки фиксировались 4% параформальдегида, окрашены 0,1% кристаллическим фиолетом, а колонии подсчитывались с помощью ImageJ.
Анализ распространённых генов на основе данных scRNA-seq
Данные scRNA-seq из набора данных IBD (GSE214695), CRC (GSE166555) и PAAD (GSE154778) были предварительно обработаны, как описано в предыдущихисследованиях 8,13. Матрицы сырого счёта были сведены к экспрессии среднего для дублирующихся генных символов с помощью limma::avereps. Начальная фильтрация сохранила гены, обнаруженные как минимум в трёх клетках и клетках, содержащих не менее 50 уникальных транскриптов. Клетки с фракцией митохондриального транскрипта >5% или менее 50 обнаруженных генов были удалены. Нормализация логарифма проводилась с коэффициентом масштабирования 10 000, после чего последовала стабилизация дисперсии для выявления 1 500 наиболее переменных генов, которые были стандартизированы по Z-шкале до анализа основных компонентов (PCA). Гены, определяющие кластерные маркеры, были отфильтрованы с использованиемлогарифма 2 (изменение fold) > 0,5, доли обнаружения ≥0,25 в целевых кластерах и скорректированного значения P <0,05.
Кратко, предобработка данных проводилась с помощью пакета Seurat, а аннотация типов ячеек — с помощью пакета SingleR (версия 2.6.0). Кластеризация ячеек проводилась в Seurat с использованием построения графа k-ближайших соседей и t-SNE на основе размерностей PCA 1–20. Затем были изучены уровни распространения и экспрессии общих генов между разными типами клеток.
Создание модели IBD
Согласно предыдущимисследованиям 14, липополисахарид (LPS) использовался для индуцирования воспаления в нормальных эпителиальных клетках кишечной кишки человека (FHC и NCM460), создавая модель ВЗК, имитирующая воспаление. Биологические эксперименты проводились в трёх экземплярах. Клетки регулярно культивировались в увлажнённом инкубаторе при 37°C с 5%CO2. Когда слияние клеток достигало примерно 50%–70%, культурная среда заменялась свежей полной средой, а клетки обрабатывались 10 нг/мл LPS в течение 12 часов. В качестве управления автомобиля использовался такой же объем стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Объём посева составлял 2 мл на одну скважину в пластинах с 6 колодцами. После обработки среда была удалена, клетки дважды промывались предварительно охлаждённым стерильным ПБС, после чего клетки собирали для последующих анализов.
Статистический анализ
Все биоинформатические анализы проводились с использованием программного обеспечения R (версия 4.1.2). Сравнения между двумя группами проводились с помощью t-теста Стьюдента, тогда как сравнение между несколькими группами — с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA). Корреляционный анализ проводился с использованием метода Спирмена. Все клеточные эксперименты повторялись как минимум три раза, а данные представлены как среднее ± стандартного отклонения (SD). Значение P или FDR < 0,05 считалось статистически значимым. NS — не значительный; P < 0,05 (*), P < 0,01 (**), и P < 0,001 (***).
Результаты
DEGs в IBD, CRC и PAAD
Сначала были интегрированы когорты с ВЗК (GSE179285 и GSE24287), когорты CRC (TCGA-CRC и GSE87211), а также когорты PAAD (GSE128735 и GSE62452), а интеграция оценивалась с использованием графиков плотности экспрессии PCA и генов. Результаты показали, что пакетные эффекты между различными наборами данных были эффективно устранены после интеграции (рисунок 1A–F).
Рисунок 1. Нормализация когорт воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), колоректального рака (КРК) и аденокарциномы поджелудочной железы (ПААД). (A) Графики анализа основных компонентов (PCA) до и после нормализации когорт ВЗК (GSE179285 и GSE24287). (B) Графики распределения экспрессии генов до и после нормализации когорт ВЗК. (C) Графики PCA до и после нормализации когорт CRC (TCGA-CRC и GSE87211). (D) Графики распределения экспрессии генов до и после нормализации когорт CRC. (E) Графики PCA до и после нормализации когорт PAAD (GSE62452 и GSE128735). (F) Графики распределения экспрессии генов до и после нормализации когорт PAAD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
После интеграции наборов данных и коррекции эффекта пакетного эффекта был проведён дифференциальный анализ экспрессии на когортах IBD, CRC и PAAD. В каждой когорте ткани поражения заболевания или опухоли сравнивались с соответствующими нормальными тканями для выявления DEG. В когорте ВЗК было выявлено 183 ДЭГ, включая 64 пониженных и 119 повышенных генов (рисунок 2A). В когорте CRC было выявлено 5 064 DEG, включая 2 477 пониженных и 2 587 повышенных (рисунок 2B). В когорте PAAD было выявлено 2 293 ДЭГ, включая 901 пониженный и 1 392 повышенных гена (рисунок 2C). В итоге было выявлено 40 пересекающихся ДЭГГ среди когорт IBD, CRC и PAAD (рисунок 2D).
Рисунок 2. Дифференциальный анализ экспрессии когорт ВЗК, КРК и ПААД . (A) Тепловая карта и вулканический график дифференциально экспрессированных генов (DEG) в когорте с ВЗК. (B) Тепловая карта и вулканический график DEG в когорте CRC. (C) Тепловая карта и график вулканов DEG в когорте PAAD. (D) Диаграмма Венна, показывающая перекрывающиеся DEGs среди когорт IBD, CRC и PAAD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
WGCNA в IBD, CRC и PAAD
WGCNA проводилась на когортах IBD, CRC и PAAD. В когорте ВЗК были выявлены три модуля, тесно связанные с клиническими признаками, при этом MEbrown и MEturquoise показали наиболее сильные корреляции (рисунок 3A). Аналогично, в когорте CRC было выявлено восемь модулей, тесно связанных с клиническими признаками, при этом MEbrown и MEturquoise показали самые сильные корреляции (рисунок 3B). В когорте PAAD один модуль был выявлен как тесно связанный с клиническими признаками, при этом модули MEblack и MEbrown показали наиболее сильную корреляцию (рисунок 3C).
Рисунок 3. Взвешенный анализ коэкспрессии генов (WGCNA) когорт IBD, CRC и PAAD. (A) Тепловая карта, показывающая корреляции между модулями коэкспрессии генов и клиническими признаками в когорте ВЗК. (B) Тепловая карта, показывающая корреляции между модулями коэкспрессии генов и клиническими признаками в когорте CRC. (C) Тепловая карта, показывающая корреляции между модулями коэкспрессии генов и клиническими признаками в когорте PAAD. (D) Диаграмма Венна, показывающая перекрывающиеся гены, выявленные из ключевых модулей коэкспрессии в когортах IBD, CRC и PAAD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
На основе генов модулей, значительно коррелированных с клиническими признаками, были выявлены 434 модульные гена, потенциально вовлечённых в ВЗК, CRC и PAAD (рисунок 3D).
Функциональный анализ обогащения распространённых генов при ВЗК, CRC и PAAD
Объединив результаты анализа дифференциальной экспрессии и WGCNA, были выявлены 40 распространённых ДЭГов и 122 общих модульных ассоциированных гена. Для изучения общих молекулярных характеристик ВЗК, CRC и PAAD эти гены были интегрированы для дальнейшего анализа, в результате чего было получено 158 генов, связанных с заболеваниями.
Сначала 158 генов были проанализированы с помощью базы данных STRING для построения сети PPI (рисунок 4A). Впоследствии были проведены анализы обогащения GO и KEGG. Анализ GO выявил значительное обогащение биологических процессов, включая гормональный метаболический процесс (рисунок 4B,C), тогда как анализ KEGG показал обогащение путей, включая сигнальный путь интерлейкина-17 (IL-17) и сигнальный путь рецепторов, активируемых пролифератором пероксисомы (PPAR) (рисунок 4D,E).
Рисунок 4. Функциональный анализ обогащения генов, связанных с заболеваниями, выявленных при ВЗК, КРК и PAAD. (A) Сеть белок-белкового взаимодействия (PPI) генов, связанных с заболеваниями. (B) Анализ обогащения генной онтологии (GO), представленный в виде точечного графика обогащённых биологических процессов, клеточных компонентов и молекулярных функций. (C) Сеть ген–концепция GO, показывающая взаимосвязи между обогащёнными терминами GO и сопутствующими генами. (D) Анализ путей обогащения Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG), представленный в виде точечного графика. (E) Сеть ген–путей KEGG, показывающая взаимосвязи между обогащёнными путями и сопутствующими генами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Корреляционный анализ распространённых генов с инфильтрацией иммунных клеток при ВЗК, CRC и PAAD
CIBERSORT использовался для оценки уровней инфильтрации иммунных клеток в когортах ВЗК, CRC и PAAD. В когорте с ВЗК наблюдались различия в уровнях инфильтрации иммунных клеток между нормальными и образцами ВЗК (рисунок 5A), а также корреляции между общими генами и популяциями иммунных клеток (рисунок 5B). Аналогично, различия в уровнях инфильтрации иммунных клеток наблюдались между нормальными и CRC образцами в когорте CRC (рисунок 5C), а также были оценены корреляции между общими генами и популяциями иммунных клеток (рисунок 5D). В когорте PAAD также наблюдались различия в уровнях инфильтрации иммунных клеток между нормальными и PAAD образцами (рисунок 5E), а также корреляции между общими генами и популяциями иммунных клеток (рисунок 5F).
Рисунок 5. Анализ инфильтрации иммунных клеток в когортах ВЗК, CRC и PAAD. (A) Диаграммы скрипки, показывающие оценочные доли иммунных клеток в когорте с ВЗК. (B) Корреляционный анализ между общими генами и популяциями иммунных клеток в когорте ВЗК, включая тепловую карту корреляции иммунных клеток и сеть ассоциаций ген-иммунных клеток. (C) Графики скрипки, показывающие оценочные доли иммунных клеток в когорте CRC. (D) Анализ корреляции между общими генами и популяциями иммунных клеток в когорте CRC, включая тепловую карту корреляции иммунных клеток и сеть ассоциаций ген-иммунных клеток. (E) Диаграммы скрипки, показывающие оценочную долю иммунных клеток в когорте PAAD. (F) Корреляционный анализ между общими генами и популяциями иммунных клеток в когорте PAAD, включая тепловую карту корреляции иммунных клеток и сеть ассоциаций ген-иммунных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Оценка потенциальной ценности распространённых генов при IBD, CRC и PAAD
Паттерны экспрессии общих генов были дополнительно изучены в когортах ВЗК, CRC и PAAD. S100P стабильно экспрессировался во всех трёх когортах (рисунок 6A, D, G). Кроме того, диагностическая эффективность распространённых генов оценивалась с помощью ROC-анализа.
Рисунок 6. Диагностическая эффективность распространённых генов в когортах ВЗК, CRC и PAAD. (A) Уровни экспрессии FXYD3, S100P, PLA2G2A и MUC1 в когорте с ВЗК. (B) Кривые операционных характеристик приемника (ROC), показывающие диагностическую эффективность отдельных распространённых генов в когорте ВЗК. (C) Кривая ROC, показывающая диагностическую эффективность комбинированной диагностической модели в когорте ВЗК. (D) Уровни экспрессии FXYD3, S100P, PLA2G2A и MUC1 в когорте CRC. (E) Кривые ROC, показывающие диагностическую эффективность отдельных распространённых генов в когорте CRC. (F) Кривая ROC, показывающая диагностическую эффективность комбинированной диагностической модели в когорте CRC. (G) Уровни экспрессии FXYD3, S100P, PLA2G2A и MUC1 в когорте PAAD. (H) Кривые ROC, показывающие диагностическую эффективность отдельных распространённых генов в когорте PAAD. (I) Кривая ROC, показывающая диагностическую эффективность комбинированной диагностической модели в когорте PAAD. При применимости показаны значения площади под кривой (AUC) и соответствующие 95% доверительные интервалы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
В когорте IBD значения площади под кривой (AUC) составили 0,626 для FXYD3, 0,597 для S100P, 0,670 для PLA2G2A и 0,697 для MUC1, тогда как комбинированная диагностическая модель дала AUC 0,815 (рисунок 6B,C). Аналогично, в когорте CRC значения AUC составили 0,839 для FXYD3, 0,738 для S100P, 0,716 для PLA2G2A и 0,672 для MUC1, тогда как комбинированная диагностическая модель дала AUC 0,925 (рисунок 6E,F). В когорте PAAD значения AUC были 0,852 для FXYD3, 0,896 для S100P, 0,637 для PLA2G2A и 0,733 для MUC1, тогда как комбинированная диагностическая модель дала AUC 0,901 (рисунок 6H,I).
Анализ scRNA-seq на основе распространённых генов
После предварительной обработки данных scRNA-seq из набора данных IBD было выявлено 17 кластеров клеток и 8 типов клеток. Распределение общих генов между разными популяциями клеток было оценено, и было установлено, что общие гены преимущественно экспрессируются в эпителиальных клетках (рисунок 7A). Аналогично, предварительная обработка набора данных CRC выявила 20 кластеров клеток и 8 типов клеток, при этом общие гены также преимущественно экспрессируются в эпителиальных клетках (рисунок 7B). Наконец, предварительная обработка набора данных PAAD выявила 19 кластеров клеток и 7 типов клеток, и распространённые гены также преимущественно экспрессировались в эпителиальных клетках (рисунок 7C).
Рисунок 7. Анализ секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) распространённых генов в тканях ВЗК, CRC и PAAD. (A) Однородное приближение многообразия и визуализация клеточных кластеров в наборе IBD (GSE214695), соответствующие аннотации по типам клеток и графики особенностей, показывающие экспрессию FXYD3, S100P, PLA2G2A и MUC1 в популяциях клеток. (B) визуализация кластеров клеток в наборе CRC (GSE166555), соответствующие аннотации по типам клеток и графики особенностей, показывающие экспрессию FXYD3, S100P, PLA2G2A и MUC1 в популяциях клеток. (C) визуализация кластеров клеток в наборе данных PAAD (GSE154778), соответствующие аннотации по типам клеток и графики особенностей, показывающие экспрессию FXYD3, S100P, PLA2G2A и MUC1 в популяциях клеток. Цветовые шкалы указывают на относительный уровень экспрессии генов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Биологическая функция S100P при ВЗК
Учитывая постоянное повышенное выражение S100P в когортах IBD, CRC и PAAD, а также предыдущие отчеты, описывающие его роль в CRC иPAAD 15,16, это исследование дополнительно изучало биологическую функцию S100P при IBD.
Во-первых, экспрессия S100P была значительно увеличена в модели IBD, индуцированной LPS, и была подтверждена эффективность снижения сиS100P (рисунок 8A,B). Кроме того, лечение ЛПС снизило пролиферацию клеток, тогда как ингибирование экспрессии S100P частично восстановило пролиферацию клеток (рисунок 8C). Кроме того, снижение S100P значительно снизило экспрессию IL-1β, IL-6 и TNF-α в клеточных линиях моделей IBD FHC и NCM460 (рисунок 8D,E). Наконец, снижение концентрации S100P снижало экспрессию IL17RA в эпителиальных клетках толстой кишки, клетках CRC и клетках PAAD (рисунок 8F).
Рисунок 8. Снижение уровня S100P ослабляет воспалительные реакции, вызванные липополисахаридами (LPS), в эпителиальных клетках толстой кишки. (A) Относительная экспрессия мРНК S100P в клетках FHC после стимуляции LPS и снижения S100P. (B) Относительная экспрессия мРНК S100P в клетках NCM460 после стимуляции LPS и снижения S100P. (C) Репрезентативные изображения формирования колоний и количественная оценка пролиферации клеток в клетках FHC и NCM460 после стимуляции LPS и снижения S100P. (D) Измерение уровней IL-1β, IL-6 и TNF-α по ИФА в клетках FHC после стимуляции LPS и снижения S100P. (E) Измерение уровней IL-1β, IL-6 и TNF-α в клетках NCM460 после стимуляции LPS и снижения S100P. (F) Относительная экспрессия мРНК IL-17RA после снижения S100P в клетках FHC, NCM460, HCT116, SW1116, PANC-1 и BxPC-3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Доступность данных
Анализируемые в ходе текущего исследования наборы данных публично доступны в TCGA и репозитории GEO под номерами присоединения TCGA-CRC, GSE179285, GSE24287, GSE87211, GSE128735, GSE62452, GSE214695, GSE166555 и GSE154778. В ходе этого исследования не было создано новых наборов данных секвенирования.
Обсуждение
Предыдущие исследования выявили связь ВЗК, иммунно-связанного с желудочно-кишечным расстройством, с несколькими заболеваниями, включая нейродегенеративныезаболевания 17, рассеянныйсклероз 18, амиотрофический латеральный склероз19,эндометриоз 20, ревматоидныйартрит 2, лимфомуХоджкина 21, CRC22 иPAAD 23. Обычно считается, что ВЗК повышает риск развития как CRC24 , так и PAAD23. Хотя эпидемиологические связи между этими заболеваниями были отмечены, их общие молекулярные характеристики остаются неполностью изученными. В этом исследовании мы интегрировали массовые транскриптомические наборы данных, данные scRNA-seq и клеточные функциональные эксперименты для изучения общих молекулярных признаков между ВЗК, CRC и PAAD. Наши результаты дают дополнительное понимание возможных молекулярных и иммунных характеристик, общих для этих заболеваний.
В этом исследовании мы выявили 158 генов, связанных с болезнями, с помощью анализа дифференциальной экспрессии и WGCNA, включая 40 распространённых ДЕГ и 122 гена, ассоциированных с общими модулями. Анализ функционального обогащения показал значительное обогащение путей, включая сигнальный путь IL-17. Предыдущие исследования отмечали важную роль сигнализации IL-17 в прогрессировании ВЗК, CRC иPAAD 25,26,27. Эти наблюдения свидетельствуют о том, что процессы, связанные с IL-17, могут представлять собой общую биологическую особенность для всех этих заболеваний. Однако настоящее исследование не изучало механистическую связь между сигналами S100P и IL-17, и для уточнения этой связи необходимы дополнительные функциональные исследования. В анализируемых наборах данных были выявлены четыре распространённых гена (FXYD3, S100P, PLA2G2A и MUC1). Предыдущие исследования показали, что FXYD3 регулирует рост клетокPAAD 28, S100P участвует в прогрессировании CRCи PAAD 15,16, а MUC1 участвует в прогрессировании IBD, CRC иPAAD 29,30,31. В отличие от этого, PLA2G2A исследовался менее подробно во всех трёх заболеваниях. Анализ ROC показал, что каждый из четырёх генов демонстрировал измеримую диагностическую эффективность, тогда как комбинированная диагностическая модель обеспечивала более высокие диагностические показатели, чем отдельные гены. Наши результаты расширяют предыдущие наблюдения, идентифицируя эти гены как общие молекулярные признаки для ВЗК, CRC и PAAD.
Анализ инфильтрации иммунных клеток показал схожие паттерны инфильтрации для наивных B-клеток, отдыхающих естественных киллеров (NK) и макрофагов M0 в когортах IBD, CRC и PAAD. Кроме того, анализ scRNA-seq показал, что FXYD3, S100P, PLA2G2A и MUC1 преимущественно экспрессируются в эпителиальных клетках. Эти данные дают дополнительную информацию о клеточном распределении выявленных генов и их возможной связи с иммунными характеристиками. Однако настоящие анализы не устанавливают прямых взаимодействий между эпителиальными клетками и иммунной микросредой, и требуются дальнейшие механистические исследования.
Наконец, мы исследовали биологическую роль S100P в модели ВЗК, индуцируемой LPS, имитирующей воспаление. Экспрессия S100P значительно увеличилась после стимуляции LPS, а понижение с помощью siRNA эффективно снизило её экспрессию. В изученных экспериментальных условиях S100P с нокдауном частично восстанавливался клеточная пролиферация и снижал экспрессию воспалительных цитокинов IL-1β, IL-6 и TNF-α. Кроме того, снижение концентрации S100P было связано со снижением экспрессии IL17RA. Эти результаты поддерживают дальнейшее изучение S100P в клеточных ответах, связанных с воспалением.
У этого исследования есть несколько ограничений. Во-первых, проводились только эксперименты по потере функции, а эксперименты по переэкспрессии или спасению не проводились; следовательно, нельзя установить прямую причинную роль S100P. Во-вторых, экспрессия S100P оценивалась преимущественно на уровне мРНК, а валидация на уровне белков не проводилась. В-третьих, функциональные эксперименты ограничивались моделью клеток, имитирующей воспаление, тогда как модели CRC и PAAD экспериментально не проводились. Наконец, хотя мультиомический анализ усилил идентификацию общих молекулярных признаков, необходимы дополнительные механистические исследования и валидация in vivo для дальнейшего уточнения биологической роли S100P и других общих генов.
В заключение в этом исследовании были выявлены общие молекулярные особенности, биологические пути и иммунно-связанные характеристики при ВЗК, КРК и ПААД. Четыре распространённых гена (FXYD3, S100P, PLA2G2A и MUC1) продемонстрировали диагностический потенциал в анализируемых наборах данных, а S100P был дополнительно изучен в модели, имитирующей воспаление ВЗК. Эти результаты служат основой для будущих исследований, изучающих общие молекулярные механизмы, связывающие ВЗК, CRC и PAAD.
Раскрытие информации
Конфликт интересов:
Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.
Благодарности
Авторы признают финансовую поддержку Национального ключевого плана исследований и разработок Китая (Грант No 2023YFB3210400).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| BXPC2 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| CIBERSORT | N/A | N/A | Immune cell infiltration analysis |
| clusterProfiler package | Bioconductor | v4.8.0 | Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analyses |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | A5256701 | Cell culture supplement |
| FHC cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| GEO dataset (GSE128735) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE154778) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE166555) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for colorectal cancer |
| GEO dataset (GSE179285) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE214695) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE24287) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE62452) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE87211) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for colorectal cancer |
| ggplot2 package | CRAN | v3.4.2 | Data visualization |
| HCT116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | v1.8.0 | Colony counting |
| jetPRIME Transfection Reagent | Polyplus | 101000046 | Cell transfection |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Beyotime Co., Ltd | S1735 | Induction of an inflammation-mimicking IBD cell model |
| limma package | Bioconductor | v3.54.0 | Differential expression analysis |
| NCM460 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| org.Hs.eg.db package | Bioconductor | v3.23.1 | Gene annotation for enrichment analysis |
| PANC1 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| Penicillin–streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic supplement for cell culture |
| pheatmap package | CRAN | v1.0.12 | Heatmap visualization |
| pROC package | CRAN | v1.19.0.1 | Receiver operating characteristic (ROC) analysis |
| PrimeScript RT Master Mix | Takara Bio | RR036A | Reverse transcription of RNA into cDNA |
| Primer sets for qRT-PCR | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Primer sequences reported in Reference 11 |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | v4.1.2 | Statistical and bioinformatics analyses |
| Seurat package | CRAN | v4.0 | Single-cell RNA sequencing data preprocessing and analysis |
| siS100P | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Small interfering RNA targeting S100P |
| SingleR package | Bioconductor | v2.6.0 | Cell type annotation for single-cell RNA sequencing |
| STRING database | STRING Consortium | N/A | Protein-protein interaction analysis |
| SW1116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| TB Green qPCR Mix | Takara Bio | RR430B | Quantitative real-time PCR |
| TCGA-CRC dataset | The Cancer Genome Atlas (TCGA) | N/A | Public colorectal cancer transcriptomic dataset |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA extraction |
| WGCNA package | CRAN | v1.73 | Weighted gene co-expression network analysis |
Ссылки
- Xu R, Du W, Yang Q, Du A. ITGB2 related to immune cell infiltration as a potential therapeutic target of inflammatory bowel disease using bioinformatics and functional research. Journal of cellular and molecular medicine. 2024;28(15):e18501.
- Sun HW, Zhang X, Shen CC. The shared circulating diagnostic biomarkers and molecular mechanisms of systemic lupus erythematosus and inflammatory bowel disease. Frontiers in immunology. 2024;15:1354348.
- Faye AS, Holmer AK, Axelrad JE. Cancer in inflammatory bowel disease. Gastroenterology clinics of North America. 2022;51(3):649-66.
- Yu J, et al. Risk of hepato-pancreato-biliary cancer is increased by primary sclerosing cholangitis in patients with inflammatory bowel disease: A population-based cohort study. United European gastroenterology journal. 2022;10(2):212-24.
- Xia B, et al. Identification of potential shared gene signatures between gastric cancer and type 2 diabetes: A data-driven analysis. Frontiers in medicine. 2024;11:1382004.
- Luo Y, et al. Exploring the molecular mechanism of comorbidity of type 2 diabetes mellitus and colorectal cancer: Insights from bulk omics and single-cell sequencing validation. Biomolecules. 2024;14(6).
- Newman AM, et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nature methods. 2015;12(5):453-7.
- Sun W, et al. Construction and validation of a novel senescence-related risk score can help predict the prognosis and tumor microenvironment of gastric cancer patients and determine that STK40 can affect the ROS accumulation and proliferation ability of gastric cancer cells. Frontiers in immunology. 2023;14:1259231.
- Hong J, et al. A zinc metabolism-related gene signature for predicting prognosis and characteristics of breast cancer. Front Immunol. 2023;14:1276280.
- Man KF, et al. CREB1-BCL2 drives mitochondrial resilience in RAS GAP-dependent breast cancer chemoresistance. Oncogene. 2025;44(16):1093-105.
- Zhou H, et al. S100P promotes trophoblast syncytialization during early placenta development by regulating YAP1. Frontiers in endocrinology. 2022;13:860261.
- Zhou C, et al. Novel exosome-associated LncRNA model predicts colorectal cancer prognosis and drug response. Hereditas. 2025;162(1):79.
- Hong J, et al. Integrative PANoptosis-focused omics analysis uncovers GSDMC as a candidate biomarker in breast cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2026;Volume 14 - 2026.
- Qiu C, et al. Hsa_circ_0004662 accelerates the progression of ulcerative colitis via the microRNA-532/HMGB3 signalling axis. Journal of cellular and molecular medicine. 2025;29(6):e70430.
- Schmid F, et al. Calcium-binding protein S100P is a new target gene of MACC1, drives colorectal cancer metastasis and serves as a prognostic biomarker. British journal of cancer. 2022;127(4):675-85.
- Arumugam T, Simeone DM, Van Golen K, Logsdon CD. S100P promotes pancreatic cancer growth, survival, and invasion. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2005;11(15):5356-64.
- Zong J, et al. The two-directional prospective association between inflammatory bowel disease and neurodegenerative disorders: A systematic review and meta-analysis based on longitudinal studies. Frontiers in immunology. 2024;15:1325908.
- Yaqubi K, et al. Inflammatory bowel disease is associated with an increase in the incidence of multiple sclerosis: A retrospective cohort study of 24,934 patients. European journal of medical research. 2024;29(1):186.
- Li CY, et al. Genome-wide genetic links between amyotrophic lateral sclerosis and autoimmune diseases. BMC medicine. 2021;19(1):27.
- Shigesi N, et al. The association between endometriosis and autoimmune diseases: A systematic review and meta-analysis. Human reproduction update. 2019;25(4):486-503.
- Sonnenberg A, Duong HT, McCarty DJ, El-Serag HB. Concurrence of inflammatory bowel disease with multiple sclerosis or Hodgkin lymphoma. European journal of gastroenterology & hepatology. 2023;35(12):1349-53.
- Chacon-Millan P, et al. A combination of microarray-based profiling and biocomputational analysis identified miR331-3p and hsa-let-7d-5p as potential biomarkers of ulcerative colitis progression to colorectal cancer. International journal of molecular sciences. 2024;25(11).
- Everhov Å H, et al. Inflammatory bowel disease and pancreatic cancer: A Scandinavian register-based cohort study 1969-2017. Alimentary pharmacology & therapeutics. 2020;52(1):143-54.
- Contran N, et al. Colorectal cancer and inflammatory bowel diseases share common salivary proteomic pathways. Scientific reports. 2024;14(1):17711.
- Sun W, et al. Osthole pretreatment alleviates TNBS-induced colitis in mice via both cAMP/PKA-dependent and independent pathways. Acta pharmacologica Sinica. 2017;38(8):1120-8.
- Li SY, et al. Diosgenin exerts anti-tumor effects through inactivation of cAMP/PKA/CREB signaling pathway in colorectal cancer. European journal of pharmacology. 2021;908:174370.
- Castro-Pando S, et al. Pancreatic epithelial IL17/IL17RA signaling drives B7-H4 expression to promote tumorigenesis. Cancer immunology research. 2024;12(9):1170-83.
- Kayed H, et al. FXYD3 is overexpressed in pancreatic ductal adenocarcinoma and influences pancreatic cancer cell growth. International journal of cancer. 2006;118(1):43-54.
- Wang H, et al. Mesenchymal stem cells ameliorate DSS-induced experimental colitis by modulating the gut microbiota and MUC-1 pathway. Journal of inflammation research. 2023;16:2023-39.
- Li W, et al. MUC1-C drives stemness in progression of colitis to colorectal cancer. JCI insight. 2020;5(12).
- Murthy D, et al. The MUC1-HIF-1α signaling axis regulates pancreatic cancer pathogenesis through polyamine metabolism remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2024;121(14):e2315509121.
- Sun W, et al. TRIM47 regulates energy metabolism via glycolytic reprogramming to drive hepatocellular carcinoma progression and represents an efficient therapeutic target. Adv Sci (Weinh). 2026;13(17):e16996.
- Sun W, et al. METTL4 enhances GLI1 translation through m(6)Am modification to promote tumor progression as a therapeutic target for hepatocellular carcinoma. J Adv Res. 2026.
- Yuan Y, et al. RNA nanotherapeutics for hepatocellular carcinoma treatment. Theranostics. 2025;15(3):965-92.