Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
* These authors contributed equally
Этот протокол интегрирует публичные транскриптомические наборы данных и валидацию эпителиальных клеток толстой кишки для идентификации S100P как общего биомаркера, связанного с воспалительными заболеваниями кишечника, колоректальным раком и аденокарциномой поджелудочной железы.
Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) связано с повышенным риском колоректального рака (КРК) и аденокарциномы поджелудочной железы (ПААД), однако молекулярные особенности, общие для этих заболеваний, остаются неполностью изучены. Целью этого исследования было выявление общих генов и биологических путей, связанных с ВЗК, CRC и PAAD, посредством интегрированного транскриптомного анализа и экспериментальной валидации. Наборы данных по экспрессии генов для ВЗК, CRC и PAAD были получены из баз данных The Cancer Genome Atlas и Gene Expression Omnibus. Были проведены взвешенный анализ коэкспрессии генов и дифференциальный анализ экспрессии для выявления генов, связанных с болезнью и общих генов. Генная онтология и Киотская энциклопедия генов и геномов (анализы были использованы для изучения обогащённых биологических функций и путей). Инфильтрация иммунных клеток оценивалась с помощью идентификации типов клеток путем оценки относительных подмножеств транскриптов РНК. Для оценки диагностической эффективности распространённых генов был проведён анализ операционных характеристик приемника. Для изучения клеточного распределения S100P был проведён анализ секвенирования РНК для изучения клеточного распределения. Кроме того, были оценены эффекты снижения уровня S100P в эпителиальных клетках толстой кишки, стимулираемых липополисахаридами (LPS). Всего было выявлено 162 гена, связанных с болезнями, и четыре общих гена. Анализ функционального обогащения показал значительное обогащение иммунных и воспаленных путей, включая сигнальный путь интерлейкина-17. Анализ иммунной инфильтрации выявил схожие тенденции в нескольких популяциях иммунных клеток среди ВЗК, CRC и PAAD. Одноклеточный анализ показал повышенную экспрессию S100P в эпителиальных клетках при всех трёх заболеваниях. Снижение уровня S100P восстановило пролиферативную способность эпителиальных клеток толстой кишки, стимулируемых LPS, и снизило экспрессию воспалительных цитокинов. Интегрированный транскриптомический анализ выявил S100P как биомаркер, связанный с ВЗК, CRC и PAAD, и выделил общие иммунно-связанные признаки этих заболеваний.
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) представляют собой спектр иммунных заболеваний, поражающих желудочно-кишечный тракт, включая язвенный колит и болезньКрона 1. Этиология ВЗК крайне сложна и включает нарушения иммунной слизистой слизистой системы, дисбиоз и генетическуювосприимчивость 2. ВЗК является глобальной проблемой в области здравоохранения с растущим уровнем заболеваемости и значительными экономическими нагрузками, и его растущая распространённость привлекла значительноевнимание 1. Важно, что у пациентов с ВЗК значительно повышен риск развития колоректального рака (CRC)3 и аденокарциномы поджелудочной железы (PAAD)4. Хотя эта связь хорошо задокументирована, генетический перекрестный диалог между ВЗК, CRC и PAAD остаётся неполностью изученным.
Предыдущие исследования настоятельно свидетельствуют о том, что ВЗК, CRC и PAAD имеют общие патогенные процессы; Однако специфические и чувствительные диагностические биомаркеры по-прежнему отсутствуют, а общие патогенные механизмы до конца не прояснены. К счастью, с быстрым развитием и широкой доступностью высокопроизводительных технологий секвенирования многочисленные транскриптомные наборы данных от пациентов с ВЗК, КРК и PAAD стали доступны для широкой доступности, что позволило систематически исследовать молекулярные взаимосвязи между этими заболеваниями 2,5,6.
В этом исследовании использовались данные высокопроизводительного секвенирования пациентов с ВЗК, КРК и PAAD для выявления связанных с болезнью и общих генов с помощью взвешенного анализа коэкспрессии генов (WGCNA) и анализа дифференциальной экспрессии. Эти гены были дополнительно изучены для выявления возможных общих сигнальных путей между ВЗК, CRC и PAAD. Кроме того, мы оценили диагностическую ценность этих распространённых генов. Анализ секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) показал, что ключевой ген S100P преимущественно экспрессируется в эпителиальных клетках. Наконец, мы исследовали биологическую роль S100P в ВЗК.
В заключение, целью данного исследования было выявление общих диагностических биомаркеров и биологических путей, связанных с ВЗК, CRC и PAAD, тем самым предоставляя ценные клинические знания по совместной профилактике и лечению этих заболеваний.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В этом исследовании использованы общедоступные, деидентифицированные наборы данных из Атласа генома рака (TCGA) и Omnibus по экспрессии генов (GEO), а также установленные коммерческие клеточные линии. Не было задействовано новых человеческих участников, идентифицируемой информации о пациентах или образцов, полученных от пациентов. Все анализы проводились в соответствии с соответствующими институциональными рекомендациями и условиями использования публичных баз данных. Поэтому для этого исследования не требовалось дополнительное институциональное этическое одобрение и информированное согласие.
Источник данных
Данные RNA-seq для когорт IBD (GSE179285; платформа: GPL6480 и GSE24287; платформа: GPL6480), когорт CRC (TCGA-CRC; платформа: Illumina HiSeq 2000 и GSE87211; платформа: GPL13497), а также когорты PAAD (GSE128735; платформа: GPL20301 и GSE62452; платформа: GPL6244) были скачаны из TCGA и GEO. Все наборы данных были доступны 5 декабря 2025 года.
Для каждого набора данных образцы строго делились на две подгруппы: ткани поражения заболевания/опухоли служили группой случаев, а соответствующие нормальные ткани без поражения — контрольной группой. В частности, когорта с ВЗК содержала 297 образцов слизистой кишечной слизистой у пациентов с ВЗК и 56 образцов нормальной кишечной слизистой от здоровых людей; когорта CRC включала 841 первичную ткань колоректальных опухолей и 211 совпадающих смежных нормальных колоректальных эпителиальных тканей; а когорта PAAD включала 114 опухолевых тканей PAAD и 106 нормальных паренхимальных тканей поджелудочной железы.
Все наборы данных в одной категории заболеваний интегрировались равномерно. Функция normalizeBetweenArrays в лимма-пакете была применена для выполнения квантильной нормализации между выборками, эффективно устранив межплатформенные пакетные эффекты и стандартизируя значения экспрессии генов между различными наборами данных для последующего анализа дифференциальной экспрессии.
Скрининг генов, связанных с ВЗК, CRC и PAAD, а также распространённых генов
Во-первых, дифференциально экспрессированные гены (DEG) были скринингированы из когорт IBD, CRC и PAAD с использованием лимма-пакета, а исходные значения P корректировались с помощью метода частоты ложного обнаружения Бенджамини-Хохберга (FDR). В когортах IBD, CRC и PAAD критерии скрининга были установлены на уровне |logFC| > 0,4, а P < 0,05. Кроме того, WGCNA проводился на всех генах, при этом минимальный порог генного модуля составлял 100 (мягкий порог мощности = 0,90; тип сети = подписанный). В результате в трех когортах были выявлены общие ДЭГ-и и модульные гены. Гены, последовательно идентифицированные обоими методами, определялись как общие, тогда как оставшиеся гены классифицировались как родственные гены.
ИПП и анализ функционального обогащения
Эти анализы проводились на генах, связанных с заболеванием. Анализ взаимодействия белков и белков (PPI) проводился с использованием базы данных STRING (балл взаимодействия > 0,40). Функциональный анализ обогащения включал анализы генной онтологии (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG), которые проводились с использованием clusterProfiler, enrichplot и org. Hs.eg.db упаковки (P < 0,05 и скорректированное по FDR значение q [метод Бенджамини–Хохберга] < 0,05).
Профилирование иммунной микросреды
CIBERSORT — это надёжный алгоритм для оценки уровней инфильтрации иммунных клеток по данным экспрессии генов с использованием стандартной матрицы сигнатурыLM22 7. В этом исследовании алгоритм CIBERSORT использовался для оценки степени инфильтрации иммунных клеток в образцах когорт IBD, CRC и PAAD, чтобы изучить общие характеристики иммунной микросреды между тремя заболеваниями. Анализ проводился с 1000 перестановками для вычисления P значений для каждого образца, а квантильная нормализация (QN = TRUE) применялась к файлу выражения смеси. Для последующих анализов сохранялись только образцы с CIBERSORT P < 0,05, что обеспечивало надёжность результатов деконволюции.
Оценка диагностической ценности распространённых генов
Диагностическая ценность общих генов в когортах ВЗК, CRC и PAAD была оценена с помощью анализа операционных характеристик приёмника (ROC) с пакетом pROC в R. Оптимальный компромисс между чувствительностью и специфичностью визуализировался с помощью кривых ROC.
qRT-PCR, анализ трансфекции клеток и формирования колоний
qRT-ПЦР и трансфекция клеток проводились согласно предыдущимисследованиям 8,9,10. Транзиентная трансфекция выполнялась с использованием трансфекционного реагента jetPRIME (Polyplus, Китай) согласно инструкциям производителя. Клетки инкубировали с трансфекционной смесью в течение 6 часов, после чего среда заменялась полным DMEM. Последующие эксперименты проводились через 48 часов после трансфекции.
Кратко, полная клеточная РНК была извлечена с помощью реагента TRIzol. РНК была обратно транскрипирована в кДНК с помощью PrimeScript RT Master Mix. Количественная ПЦР проводилась с использованием TB Green qPCR. β-актин использовался как внутренний эталонный ген для нормализации экспрессии. Биологические эксперименты проводились в трёх экземплярах. Праймерные последовательности и siS100P можно найти в предыдущем исследовании 11.
Ячейки NCM460, FHC, HCT116, SW116, PANC1 и BXPC2 были получены согласно таблице материалов. Все клеточные линии прошли идентификацию клеток и тестирование на микоплазму.
Во время экспериментов все клетки проходили через 3–5 поколений. Все клетки культивировались в полном DMEM, содержащем 10% плодовой бычий сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина.
Анализ формирования колоний проводился как описано в предыдущемисследовании 12. Кратко, в каждую скважину пластины с шестью лунками было засеяно по 1000 клеток и культивировано в течение 10 дней, прежде чем эксперимент был завершан. Клетки фиксировались 4% параформальдегида, окрашены 0,1% кристаллическим фиолетом, а колонии подсчитывались с помощью ImageJ.
Анализ распространённых генов на основе данных scRNA-seq
Данные scRNA-seq из набора данных IBD (GSE214695), CRC (GSE166555) и PAAD (GSE154778) были предварительно обработаны, как описано в предыдущихисследованиях 8,13. Матрицы сырого счёта были сведены к экспрессии среднего для дублирующихся генных символов с помощью limma::avereps. Начальная фильтрация сохранила гены, обнаруженные как минимум в трёх клетках и клетках, содержащих не менее 50 уникальных транскриптов. Клетки с фракцией митохондриального транскрипта >5% или менее 50 обнаруженных генов были удалены. Нормализация логарифма проводилась с коэффициентом масштабирования 10 000, после чего последовала стабилизация дисперсии для выявления 1 500 наиболее переменных генов, которые были стандартизированы по Z-шкале до анализа основных компонентов (PCA). Гены, определяющие кластерные маркеры, были отфильтрованы с использованиемлогарифма 2 (изменение fold) > 0,5, доли обнаружения ≥0,25 в целевых кластерах и скорректированного значения P <0,05.
Кратко, предобработка данных проводилась с помощью пакета Seurat, а аннотация типов ячеек — с помощью пакета SingleR (версия 2.6.0). Кластеризация ячеек проводилась в Seurat с использованием построения графа k-ближайших соседей и t-SNE на основе размерностей PCA 1–20. Затем были изучены уровни распространения и экспрессии общих генов между разными типами клеток.
Создание модели IBD
Согласно предыдущимисследованиям 14, липополисахарид (LPS) использовался для индуцирования воспаления в нормальных эпителиальных клетках кишечной кишки человека (FHC и NCM460), создавая модель ВЗК, имитирующая воспаление. Биологические эксперименты проводились в трёх экземплярах. Клетки регулярно культивировались в увлажнённом инкубаторе при 37°C с 5%CO2. Когда слияние клеток достигало примерно 50%–70%, культурная среда заменялась свежей полной средой, а клетки обрабатывались 10 нг/мл LPS в течение 12 часов. В качестве управления автомобиля использовался такой же объем стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Объём посева составлял 2 мл на одну скважину в пластинах с 6 колодцами. После обработки среда была удалена, клетки дважды промывались предварительно охлаждённым стерильным ПБС, после чего клетки собирали для последующих анализов.
Статистический анализ
Все биоинформатические анализы проводились с использованием программного обеспечения R (версия 4.1.2). Сравнения между двумя группами проводились с помощью t-теста Стьюдента, тогда как сравнение между несколькими группами — с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA). Корреляционный анализ проводился с использованием метода Спирмена. Все клеточные эксперименты повторялись как минимум три раза, а данные представлены как среднее ± стандартного отклонения (SD). Значение P или FDR < 0,05 считалось статистически значимым. NS — не значительный; P < 0,05 (*), P < 0,01 (**), и P < 0,001 (***).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
DEGs в IBD, CRC и PAAD
Сначала были интегрированы когорты с ВЗК (GSE179285 и GSE24287), когорты CRC (TCGA-CRC и GSE87211), а также когорты PAAD (GSE128735 и GSE62452), а интеграция оценивалась с использованием графиков плотности экспрессии PCA и генов. Результаты показали, что пакетные эффекты между различными наборами данных были эффективно устранены после интеграции (рисунок 1A–F).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Предыдущие исследования выявили связь ВЗК, иммунно-связанного с желудочно-кишечным расстройством, с несколькими заболеваниями, включая нейродегенеративныезаболевания 17, рассеянныйсклероз 18, амиотрофический латеральный склероз19,эндометриоз 20, ревматоидныйартрит 2, лимфомуХоджкина 21, CRC22 иPAAD 23
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Конфликт интересов:
Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.
Авторы признают финансовую поддержку Национального ключевого плана исследований и разработок Китая (Грант No 2023YFB3210400).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| BXPC2 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| CIBERSORT | N/A | N/A | Immune cell infiltration analysis |
| clusterProfiler package | Bioconductor | v4.8.0 | Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analyses |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | A5256701 | Cell culture supplement |
| FHC cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| GEO dataset (GSE128735) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE154778) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE166555) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for colorectal cancer |
| GEO dataset (GSE179285) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE214695) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE24287) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE62452) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE87211) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for colorectal cancer |
| ggplot2 package | CRAN | v3.4.2 | Data visualization |
| HCT116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | v1.8.0 | Colony counting |
| jetPRIME Transfection Reagent | Polyplus | 101000046 | Cell transfection |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Beyotime Co., Ltd | S1735 | Induction of an inflammation-mimicking IBD cell model |
| limma package | Bioconductor | v3.54.0 | Differential expression analysis |
| NCM460 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| org.Hs.eg.db package | Bioconductor | v3.23.1 | Gene annotation for enrichment analysis |
| PANC1 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| Penicillin–streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic supplement for cell culture |
| pheatmap package | CRAN | v1.0.12 | Heatmap visualization |
| pROC package | CRAN | v1.19.0.1 | Receiver operating characteristic (ROC) analysis |
| PrimeScript RT Master Mix | Takara Bio | RR036A | Reverse transcription of RNA into cDNA |
| Primer sets for qRT-PCR | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Primer sequences reported in Reference 11 |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | v4.1.2 | Statistical and bioinformatics analyses |
| Seurat package | CRAN | v4.0 | Single-cell RNA sequencing data preprocessing and analysis |
| siS100P | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Small interfering RNA targeting S100P |
| SingleR package | Bioconductor | v2.6.0 | Cell type annotation for single-cell RNA sequencing |
| STRING database | STRING Consortium | N/A | Protein-protein interaction analysis |
| SW1116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| TB Green qPCR Mix | Takara Bio | RR430B | Quantitative real-time PCR |
| TCGA-CRC dataset | The Cancer Genome Atlas (TCGA) | N/A | Public colorectal cancer transcriptomic dataset |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA extraction |
| WGCNA package | CRAN | v1.73 | Weighted gene co-expression network analysis |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.