В данном протоколе описывается создание модели аллергической астмы (АА) у мышей, индуцированной овальбумином (OVA), для оценки терапевтических механизмов воздействия метода приклеивания пластырей на акупунктурные точки Kechuanting (KAST) на воспаление дыхательных путей 2-го типа путем модуляции легочных врожденных лимфоидных клеток 2-го типа (ILC2s) через путь кальцитонин-ген-родственного пептида (CGRP)/белка 1, модифицирующего активность рецептора (RAMP1).
Исследовательская статья
Терапия приклеиванием к акупунктурной точке Кэчуаньтин облегчает воспаление дыхательных путей 2-го типа у мышей с аллергической астмой посредством модуляции количества ILC2
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Было показано, что терапия наклеиванием на акупунктурную точку Kechuanting (KAST) эффективно уменьшает воспаление дыхательных путей у пациентов с аллергической астмой (АА), однако лежащие в основе этого механизмы остаются неясными. Данное исследование было направлено на изучение терапевтических механизмов KAST на модели мышей с АА с точки зрения нейроиммунного взаимодействия. Была создана модель аллергической астмы у мышей, индуцированная овальбумином (OVA), после чего мышам проводили лечение методом KAST. Эффекты KAST на легочные врожденные лимфоидные клетки 2-й группы (ILC2s) и воспаление дыхательных путей 2-го типа оценивали с помощью проточной цитометрии, окрашивания гематоксилином и эозином (HE) и иммуногистохимии. Вестерн-блоттинг (WB) и ИФА (ELISA) использовались для определения уровней белка кальцитонин-ген-родственного пептида (CGRP) в тканях легких. Для изучения регуляторной роли пути CGRP/белок 1, модифицирующий активность рецептора (RAMP1), в отношении ILC2s и воспаления дыхательных путей 2-го типа мышам с аллергической астмой вводили интраназально CGRP или ингибитор рецептора CGRP BIBN-4096. KAST снизила количество ILC2s и уменьшила воспаление дыхательных путей 2-го типа, что сопровождалось снижением экспрессии CGRP в тканях легких. Интраназальное введение CGRP увеличило количество RAMP1+ILC2s и общую популяцию ILC2s в легких, а также усилило воспаление дыхательных путей 2-го типа. Напротив, интраназальное введение BIBN-4096 снизило количество легочных ILC2s и смягчило воспаление дыхательных путей 2-го типа. KAST уменьшает воспаление дыхательных путей при аллергической астме, что тесно связано с подавлением пути CGRP/RAMP1 и последующим угнетением легочных ILC2s, что подтверждается данными фармакологического ингибирования.
Введение
Аллергическая астма (АА) является наиболее распространенным фенотипом астмы, на который приходится 60–80% всех случаев заболевания в Китае1. Она характеризуется высокой распространенностью и субоптимальным контролем заболевания, что серьезно ухудшает качество жизни пациентов и создает значительное экономическое бремя2,3,4,5. Хотя ингаляционные кортикостероиды (ИКС) остаются основным методом клинического лечения6, некоторые пациенты демонстрируют ограниченный ответ на терапию, а длительное применение часто сопровождается побочными эффектами и невозможностью остановить прогрессирование заболевания7. Таким образом, разработка безопасных и эффективных новых терапевтических стратегий остается приоритетной задачей как в клинической, так и в исследовательской практике. Терапия наложением пластырей на акупунктурные точки Kechuanting (KAST), метод наружного применения в традиционной китайской медицине, обеспечивает трансдермальную доставку активных соединений, что потенциально позволяет избежать эффекта первого прохождения через печень и минимизировать системные побочные реакции8,9. Клинические исследования показали, что KAST может облегчать симптомы астмы, частично восстанавливать функцию легких и улучшать качество жизни пациентов10,11,12. В то же время данные метаболомики сыворотки крови, сетевой фармакологии и исследования на животных моделях астмы позволяют предположить, что KAST ослабляет воспаление дыхательных путей, снижая уровни медиаторов воспаления в сыворотке и бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ), включая подавление экспрессии IgE, IL-4 и IL-139,13,14. В совокупности эти данные служат доказательством терапевтической эффективности KAST при астме. Однако точные механизмы ее действия остаются неясными.
Одним из основных патологических механизмов, вызывающих рецидив AA, является воспаление дыхательных путей 2-го типа, в котором ключевую роль играют врожденные лимфоидные клетки 2-й группы (ILC2s)15. При стимуляции аллергеном ILC2s секретируют такие цитокины, как IL-5 и IL-13, тем самым стимулируя воспаление дыхательных путей16,17. Исследования показали, что истощение ILC2s значительно облегчает воспаление дыхательных путей у мышей с астмой, что подчеркивает их центральную роль в прогрессировании заболевания18. Примечательно, что активация и функция ILC2s строго регулируются множеством механизмов, при этом в последние годы растущее внимание привлекают нейроиммунные взаимодействия. Новые данные свидетельствуют о том, что кальцитонин-ген-родственный пептид (CGRP) может связываться с белком, модифицирующим активность рецептора 1 (RAMP1), на поверхности ILC2s, индуцируя их активацию и последующий выброс цитокинов 2-го типа, что усиливает воспаление дыхательных путей при AA19,20,21. В настоящем исследовании в ходе высокопроизводительного скрининга с помощью секвенирования РНК (RNA-seq) CGRP был идентифицирован как критически значимый нейропептид, который подвергается сильной модуляции при вмешательстве с помощью KAST. Следовательно, сосредоточившись на пути CGRP/RAMP1, мы использовали KAST в качестве метода терапии у мышей с AA, чтобы изучить его потенциальные механизмы модуляции активности ILC2s и облегчения воспаления дыхательных путей 2-го типа.
Протокол
Все процедуры с животными проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованным Национальными академиями наук. Протокол был одобрен Комитетом по этике работы с животными при аффилированной больнице Нанкинского университета китайской медицины (номер одобрения 2023DW-059-01). Полный список всех материалов, реагентов, инструментов и программного обеспечения, использованных в данном исследовании, подробно приведен в Таблице материалов.
Экспериментальные животные и группировка
Здоровых самок мышей линии BALB/c (класс SPF, возраст 8–10 недель) получили из Центра экспериментальных животных Нанкинского университета китайской медицины (лицензия № SYXK (Su) 2018-0049). Животные содержались в стандартных условиях с 12-часовым световым циклом при температуре 24–26 °C. Стерильный корм и вода предоставлялись в свободном доступе, подстилка регулярно менялась, клетки подвергались систематической чистке. После 7 дней адаптации мышей случайным образом разделили на шесть групп (n = 7 в группе): контрольную группу (Normal), группу модели, группу CGRP, группу BIBN-4096, группу KAST и группу KAST + CGRP. Животных распределяли по группам с помощью компьютерной таблицы случайных чисел. Распределение по группам было скрыто от исследователей до начала проведения вмешательств. Для оптимизации использования тканей образцы легких из рандомизированной когорты (n = 7 на группу) систематически распределялись по различным путям обработки, при этом точное количество проанализированных образцов (n = 5, 4 или 3) для конкретных гистологических и молекулярных анализов эксплицитно указано в соответствующих подписях к рисункам. Данные из анализа не исключались.
Приготовление состава KAST
Препарат был изготовлен в отделении фармации при аффилированной больнице Нанкинского университета китайской медицины22. Были использованы девять традиционных китайских лекарственных трав: Semen Brassicae (2 части), Rhizoma Corydalis (2 части), Radix Kansui, обработанный уксусом (1 часть), Asarum (1 часть), Ephedra (1 часть), Semen Lepidii (1 часть), гвоздика (1 часть), корица (1 часть) и Gleditsia sinensis (1 часть). Каждая трава была измельчена в тонкий порошок и просеяна через сито с размером ячеек 80 меш. На каждые 100 g смешанного порошка добавляли 70 mL свежего сока имбиря и 30 mL жидкого парафина, после чего смесь тщательно перемешивали и формировали пластыри массой 0.3 g ± 5% и диаметром 0.5 cm. В частности, все растительные ингредиенты и свежий имбирь были сертифицированы главным фармацевтом Линь-ган Чжао и хранились перед использованием при 4 °C в темном сухом месте9. Для обеспечения воспроизводимости вмешательства и стабильности от партии к партии был внедрен строгий стандарт контроля качества на основе установленных нашей группой методов UPLC-Q-TOF-MS и HPLC, что подтверждало постоянное присутствие основных активных маркеров, таких как синапинтиоцианат23. На практике пластыри размером 0.5 cm закрепляли с помощью медицинского дышащего гипоаллергенного адгезивного пластыря размером 2.5 cm × 5.5 cm для обеспечения оптимального трансдермального доставки.
Создание мышиной модели AA
Модель АА была индуцирована в соответствии с общепринятым протоколом из литературы с использованием сенсибилизации OVA и интраназального воздействия24. За исключением группы Normal, все мыши были сенсибилизированы путем внутрибрюшинного введения 200 µL физиологического раствора, содержащего 100 µg OVA и 2 mg гидроксида алюминия, в дни 0 и 12. С 18-го по 23-й день мышам ежедневно проводили интраназальный вызов с помощью 50 µg OVA в 50 µL физиологического раствора. С 24-го по 53-й день OVA вводили интраназально через день. На 54-й день, после взвешивания мышей, проводили эвтаназию путем делегитимации шеи и осуществляли сбор тканей. Впоследствии определяли коэффициент легких, разделив общую массу легких на массу тела.
Методы вмешательства
С 40-го по 53-й день мышам в группах KAST и KAST + CGRP выбривали участок на спине размером 3 см × 6 см. Пластыри накладывали на билатеральные акупунктурные точки Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) и Shenshu (BL23), фиксируя их адгезивной лентой на 1,5 ч один раз в день в течение 14 дней подряд. Мыши в группах CGRP и KAST + CGRP получали интраназально 10 µL раствора кальцитонина/CALCA (1 pg/µL) через день с 40-го по 53-й день. Мыши в группе BIBN-4096 получали интраназально 10 µL раствора BIBN-4096 (0,3 mg/mL, антагонист рецептора CGRP) через день. Группы контроля и модели получали стандартный корм без какого-либо вмешательства. KAST применяли с 40-го по 53-й день, после развития аллергического воспаления дыхательных путей (начиная с 40-го дня, что соответствует 22 дням после первого введения OVA на 18-й день). Таким образом, KAST в данном исследовании служил терапевтическим, а не профилактическим вмешательством.
Для подготовки кожи волосы на выбранном участке спины удаляли с помощью электрического триммера. Локализация акупунктурных точек строго соответствовала стандарту «Номенклатура и локализация акупунктурных точек для лабораторных животных — Часть 3: Мыши» (T/CAAM 0002-2020), изданному Китайским обществом иглоукалывания и прижигания. Четыре пары билатеральных точек на спине были точно отмечены и определены следующим образом: Feishu (BL13: между ребрами под остистым отростком 3-го грудного позвонка, на 3 mm латеральнее задней срединной линии), Geshu (BL17: под остистым отростком 7-го грудного позвонка, на 3 mm латеральнее срединной линии), Pishu (BL20: под остистым отростком 12-го грудного позвонка, на 3 mm латеральнее срединной линии) и Shenshu (BL23: под остистым отростком 2-го поясничного позвонка, на 3 mm латеральнее срединной линии). Лента 3M плотно приклеивалась для обеспечения стабильной адгезии, чтобы исключить смещение пластыря или вторичную эрозию кожи в течение периода выдержки 1.5 h.
Дозы CGRP/CALCA (1 pg/µL, 10 µL на мышь) и BIBN-4096 (0,3 mg/mL, 10 µL на мышь) были выбраны на основании опубликованных исследований25. В частности, для введения CGRP готовили 0,1% раствор BSA, растворяя 1 mg BSA в 1 mL ddH2O с последующим перемешиванием на вортексе до достижения конечной концентрации 1 mg/mL. Перед восстановлением лиофилизированный порошок белка Calcitonin/CALCA центрифугировали при 12 000 × g в течение 30 s при 4 °C. Затем добавляли 20 µL приготовленного 0,1% раствора BSA для получения стокового раствора с концентрацией 1 µg/µL. Флакон осторожно переворачивали несколько раз (без вортексирования), центрифугировали в течение нескольких секунд и выдерживали при комнатной температуре в течение нескольких минут для обеспечения полного восстановления белка. Для приготовления рабочего раствора с концентрацией 1 pg/µL без получения избыточного объема за один этап использовали стандартное двухэтапное серийное разведение: 1 µL стокового раствора 1 µg/µL сначала разбавляли в 999 µL стерильного физиологического раствора для получения промежуточного раствора 1 ng/µL, а затем 1 µL этого промежуточного раствора смешивали с еще 999 µL стерильного физиологического раствора для получения конечного рабочего раствора 1 pg/µL. Рабочий раствор хранили при 4 °C, а остальные аликвоты — при -20 °C в течение 2–3 месяцев. Для группы BIBN-4096 1 mg порошка BIBN-4096 растворяли в 333 µL ddH2O для получения стокового раствора 3 mg/mL, который разделяли на аликвоты по 50 µL во флаконы и хранили при -80 °C. Для приготовления рабочего раствора 0,3 mg/mL каждую аликвоту стокового раствора объемом 50 µL тщательно смешивали с 450 µL стерильного физиологического раствора. С 40-го по 53-й день каждой мыши через нос через день вводили по 10 µL либо раствора CGRP (1 pg/µL), либо раствора BIBN-4096 (0,3 mg/mL) при легкой фиксации без применения анестезии.
Показатели исхода и методы детекции
Поведенческое тестирование
На 53-й день, после последнего интраназального воздействия, частота эпизодов растирания носа и чихания регистрировалась с помощью системы цифрового видеозаписи в течение 10 min. Частота проявлений поведения на видеозаписях подсчитывалась двумя исследователями независимо друг от друга слепым методом. В случае значительного расхождения в подсчетах видеозапись пересматривал третий исследователь, после чего для статистического анализа выбирались данные с наибольшей степенью согласованности.
Бронхиальный провокационный тест
В течение 24 ч после последнего воздействия оценивали реактивность дыхательных путей с помощью небулизированного ацетилхолина (ACh) в концентрациях 0, 5, 10, 20 и 40 mg/mL (по 300 µL на каждую концентрацию, небулизация в течение 1 мин). Значения усиленного пауза-индекса (Penh), безразмерного показателя, используемого для эмпирического определения сужения дыхательных путей и оценки гиперреактивности дыхательных путей (AHR), регистрировали в течение 5 мин после каждой небулизации с помощью неинвазивной плетизмографии всего тела. Перед началом записи мышей акклиматизировали в камере в течение 10 мин. Penh рассчитывался автоматически с помощью программного обеспечения интегрированной системы ручного хранения/потоковой передачи данных по эмпирической формуле, балансирующей время выдоха/вдоха и пиковые потоки.
Гистопатология (окрашивание гематоксилином и эозином)
Ткани легких, фиксированные в 4% параформальдегиде, подвергали дегидратации в серии спиртов возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заливали в парафиновые блоки с использованием автоматического процессора. Блоки нарезали на срезы толщиной 4 µm, выдерживали в водяной бане при 42 °C и переносили на предметные стекла. Стеккала высушивали при 80 °C в течение 2 h и оставляли до полного высыхания на ночь, после чего охлаждали до комнатной температуры. Для окрашивания срезы депарафинизировали в ксилоле (I и II, по 20 min каждый), регидратировали в серии этанола возрастающей концентрации (100% I/II и 75%, по 5 min каждый) и промывали водопроводной водой. Стеккала окрашивали гематоксилином в течение 3–5 min, дифференцировали 1% кислым спиртом и обрабатывали подкрашивающим раствором. После промывки срезы дегидратировали в 85% и 95% этаноле (по 5 min каждый) и докрашивали эозином в течение 5 min. В завершение стекла дегидратировали в абсолютном этаноле (I, II и III, по 5 min каждый), просветляли в ксилоле (I и II, по 5 min каждый), заключали в нейтральный бальзам и высушивали на воздухе. Изображения случайных полей зрения получали при 200× увеличении с помощью светового микроскопа и системы CaseViewer. Степень воспаления легких и утолщения эпителия оценивали слепым методом по шкале от 0 до 4: 0 — отсутствие воспаления; 1 — единичные воспалительные клетки; 2 — немного (<3) воспалительных очагов; 3 — множественные (≥3) воспалительные очаги; 4 — диффузная инфильтрация по всей ткани легкого. Утолщение эпителия оценивали следующим образом: 0 — норма; 1 — видимое утолщение; 2 — частичное утолщение дыхательных путей; 3 — почти полное перекрытие просвета; 4 — отсутствие нормальной структуры. Для каждой экспериментальной группы было сфотографировано и оценено в общей сложности 20 случайных микроскопических полей для получения исходных гистопатологических баллов. Данные по каждым четырем полям усредняли для получения одной независимой единицы данных, в результате чего итоговый размер выборки для статистического анализа составил n = 5 повторностей на группу. Оценка проводилась слепым методом.
Секвенирование РНК (RNA-seq)
Общую РНК экстрагировали из тканей легких мышей с использованием реагента TRIzol в соответствии с протоколом производителя. Чистоту, концентрацию и целостность РНК оценивали с помощью спектрофотометра и микрофлюидной платформы. Библиотеки транскриптома конструировали с использованием коммерческого набора для подготовки библиотек и секвенировали на платформе высокопроизводительного секвенирования для получения парноконцевых чтений длиной 150 bp. Контроль качества необработанных данных проводили с помощью соответствующего программного обеспечения для фильтрации с целью получения «чистых» чтений, которые затем картировали на референсный геном с помощью инструмента выравнивания с учетом сплайсинга. Уровни экспрессии генов рассчитывали как FPKM, а количество чтений подсчитывали с помощью специализированной утилиты для подсчета чтений. Анализ дифференциальной экспрессии выполняли с использованием специализированного статистического пакета; пороговыми значениями были установлены |log2 Fold Change| ≥ 1 и скорректированный p < 0,05.
ИФА (иммуноферментный анализ)
Свежую ткань легкого мыши точно взвешивали и гомогенизировали в PBS-буфере в строгом соотношении 20 mg ткани на 200 µL буфера. Гомогенаты центрифугировали при примерно 13,400 × g в течение 10 min при 4 °C для получения супернатантов, содержащих белок. Для нормализации общее содержание белка в супернатантах определяли методом BCA. Процедуру ELISA проводили в трех технических повторностях с использованием коммерческих наборов согласно протоколу производителя. Вкратце, в 96-луночные планшеты, покрытые антителами, добавляли 50 µL разведений стандарта или 50 µL предварительно разведенных образцов (10 µL белкового образца, смешанного с 40 µL разбавителя образца для достижения конечного 5-кратного разведения). Планшеты герметично закрывали и инкубировали при 37 °C в течение 30 min. После пятикратного промывания разведенным в соотношении 1:30 промывочным буфером в каждую лунку (кроме холостых) добавляли 50 µL реагента конъюгата, связанного с ферментом, и инкубировали смесь при 37 °C в течение 30 min. После еще пяти промывок в каждую лунку добавляли 50 µL раствора хромогена A и 50 µL раствора хромогена B, после чего планшет инкубировали в темноте при 37 °C в течение 10 min. Реакцию останавливали добавлением 50 µL стоп-реагента, что приводило к изменению цвета с синего на желтый. Оптическую плотность (значение OD) каждой лунки измеряли при 450 nm с помощью микропланшетного ридера в течение 15 min. Стандартные кривые строили с использованием четырехпараметрической логистической или линейной регрессионной модели (обеспечивая R2 > 0.99), на основании которых рассчитывали концентрации целевого белка в гомогенатах ткани легкого.
Проточная цитометрия
Ткани легких извлекали, измельчали и подвергали перевариванию в 5 mL среды RPMI-1640, содержащей 10% FBS, 50 µL Liberase TM и 5 µL DNase I, при 37 °C в течение 45 мин с перемешиванием при 80 rpm. Полученную суспензию пропускали через клеточный фильтр с размером ячеек 400 mesh и центрифугировали при 300 × g в течение 10 мин при 4 °C. Осадок ресуспендировали в 2 mL буфера для лизиса эритроцитов и выдерживали в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте. После промывки клетки ресуспендировали и окрашивали красителем Ghost Dye Red 780 (1,25 µL на образец) в течение 20 мин при 4 °C в темноте для исключения мертвых клеток. После промывки клетки блокировали с помощью 10 µL FcR Blocking Reagent в течение 10 мин при 4 °C. Затем проводили окрашивание поверхности клеток следующими антителами, конъюгированными с флуорохромами, в течение 30 мин при 4 °C: FITC анти-мышиные CD45 (0,5 µL), PE анти-мышиные/человеческие KLRG1 (1,25 µL), BB700 крысиные анти-мышиные CD90.2 (0,5 µL) и биотинилированная смесь антител к линиям, содержащая анти-мышиные CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) (по 0,5 µL каждого) и анти-мышиные CD19 (2 µL). После промывки клетки инкубировали с Brilliant Violet 605 Streptavidin (2 µL) в течение 30 мин при 4 °C. Данные собирали на платформе проточного цитометра BD и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo. Матрицы компенсации перекрытия флуоресценции автоматически контролировались и корректировались калиброванным программным обеспечением прибора. Стратегия иерархического гейтирования для идентификации легочных ILC2 была реализована последовательно следующим образом: сначала общая популяция лимфоцитов выделялась по морфологии прямого и бокового светорассеяния (FSC-A/SSC-A), затем проводили дискриминацию дуплетов путем выделения синглетов (FSC-H/FSC-A). Затем жизнеспособные клетки определяли путем исключения мертвых клеток (Ghost Dye-), после чего последовательно применяли стандартные гейты для выбора популяций CD45+ и Lineage-. В окне гейтирования жизнеспособных клеток CD45+ Lineage- легочные ILC2 были четко определены и количественно оценены на основе последующих последовательных каскадных гейтов положительных кластеров CD90.2+ и KLRG1+.
Иммунофлуоресценция (ИФ)
Замороженные срезы легких размораживали при комнатной температуре в течение 15–30 min и трижды промывали PBST (PBS, содержащий 0,05% Tween-20) по 6 min каждый раз для удаления соединения OCT. После удаления излишков жидкости с помощью фильтровальной бумаги вокруг ткани с помощью маркера для иммуногистохимии наносили гидрофобный барьер. Срезы инкубировали в буфере для блокировки и пермеабилизации, содержащем 0,3% Triton X-100 и 5% сыворотки козы, при 37 °C в течение 100 min, после чего следовала инкубация с первичными антителами в течение ночи (16–20 h) при 4 °C. На следующий день срезы выдерживали при комнатной температуре в течение 30 min для достижения равновесия, трижды промывали PBST и инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с флуорофором и соответствующими виду первичных антител, при 37 °C в темноте в течение 60–90 min. После трех дополнительных промывок PBST ядра докрашивали DAPI (разведенным в PBS в соотношении 1:1 или 2:1) в течение 8 min при комнатной температуре в темноте. После финального этапа промывок PBST (3 × 6 min) срезы заключали в антифейдинговый mounting medium, герметизировали для предотвращения образования пузырьков и хранили в темноте. Изображения получали с помощью конфокального микроскопа при увеличении 400×. Количество положительных клеток в каждом поле зрения подсчитывали вручную с использованием программного обеспечения Leica LAS X. Для каждой экспериментальной группы было получено изображение 15 случайных микроскопических полей для получения исходных данных о количестве клеток. Данные из каждых трех полей усредняли для получения одной независимой точки данных, в результате чего размер итоговой выборки составил n = 5 повторностей на группу для статистического анализа. Подсчет проводили слепым методом.
Иммуногистохимия (ИГХ)
Парафиновые срезы подвергали депарафинизации в трех сменах ксилола (по 15 мин каждая), регидратации через серию спиртов возрастающей концентрации (100% дважды, 85% и 75%; по 5 мин каждый) и промывали дистиллированной водой. Проявление антигенов проводили в цитратном буфере (pH 6.0) с использованием скороварки (3 мин при высоком давлении после закипания) с последующим охлаждением и тремя 5-минутными промывками в PBS (pH 7.4). Эндогенную пероксидазу блокировали 3% H2O2 в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. После промывки срезы обводили гидрофобным маркером и блокировали 3% сывороткой козы в течение 30 мин. Затем срезы инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами, разведенными в PBS: анти-IL-4 (1:400), анти-IL-5 (1:300) или анти-IL-13 (1:150). На следующий день срезы промывали и инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с HRP (анти-мышиные для IL-4; анти-кроличьи для IL-5 и IL-13), в течение 50 мин при комнатной температуре. Сигналы визуализировали с помощью свежеприготовленного раствора DAB под микроскопическим контролем и останавливали реакцию проточной водой. В завершение срезы докрашивали гематоксилином, дифференцировали, подкрашивали синим, дегидратировали через серию спиртов и ксилол, и заключали в нейтральный бальзам для микроскопического исследования. Среднюю оптическую плотность (IOD/Area) количественно оценивали с помощью программного обеспечения для анализа изображений при увеличении 200×. Для каждой экспериментальной группы было получено изображение 15 случайных микроскопических полей для получения исходных значений. Данные по каждые три поля усредняли для получения одной независимой точки данных, в результате чего окончательный размер выборки составил n = 5 повторностей на группу для статистического анализа. Оценка проводилась двумя наблюдателями, не знавшими принадлежности образцов к группам.
Вестерн-блоттинг (WB)
Для подготовки образцов ткани легких мыши (приблизительно 30 mg) мелко измельчали и гомогенизировали в 300 µL предварительно охлажденного лизирующего буфера RIPA с добавлением 1% коктейля ингибиторов протеаз/фосфатаз. Гомогенизацию проводили с помощью гомогенизатора тканей при 60 Hz в течение четырех циклов (60 s на цикл). Затем лизаты центрифугировали при приблизительно 13,400 × g в течение 15 min при 4 °C для сбора супернатанта. Концентрацию общего белка определяли с помощью стандартного набора для BCA-анализа белка. Затем образцы нормировали, смешивали с 5-кратным буфером для нанесения в объемном соотношении 4:1 и денатурировали при 95 °C в течение 7 min. Для SDS-PAGE образцы белка (20 µg на дорожку) наносили вместе с предварительно окрашенным маркером молекулярной массы белков; разделение проводили при постоянном напряжении 80 V в течение 20 min, затем при 120 V в течение 70 min. Затем белки переносили методом «влажного» переноса на PVDF-мембраны 0.22 µm при постоянном токе 300 mA в течение 120 min в ледяной бане. Мембраны блокировали 5% BSA в TBST в течение 1 h при комнатной температуре и инкубировали в течение ночи (до 18 h) при 4 °C с первичными антителами к CGRP (1:500) и GAPDH (1:2000). После трехкратной промывки в TBST (по 10 min каждая) мембраны инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (1:10000), в течение 1–2 h при комнатной температуре. После еще трех промывок белковые полосы визуализировали с использованием усиленного хемилюминесцентного (ECL) субстрата в системе визуализации VILBER Fusion FX. Интенсивность полос количественно оценивали с помощью ImageJ 1.8, а экспрессию целевого белка нормировали по внутреннему контролю GAPDH.
Статистический анализ
Все экспериментальные данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Анализ данных и построение статистических графиков выполнялись с использованием специализированной статистической программной платформы. Перед проведением межгрупповых сравнений наборы данных систематически проверялись на нормальность распределения. Для данных с нормальным распределением и однородными дисперсиями применялся обычный однофакторный или двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим использованием апостериорных тестов Тьюки, Шидака, Холма-Шидака или LSD Фишера для множественных попарных сравнений. При сравнении нескольких групп с одной контрольной группой применялся тест Даннетта. Для наборов данных с неоднородными дисперсиями использовался анализ ANOVA по Брауну-Форсайту с последующим апостериорным тестом Даннетта T3. Для наборов данных, не соответствующих критерию нормальности, использовался непараметрический критерий Краскела-Уоллиса с последующим апостериорным тестом Данна для множественных сравнений. Значение P < 0.05 считалось показателем статистически значимых различий. Различные уровни значимости динамически обозначаются как *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 и ****p < 0.0001. Все оценки результатов экспериментов, включая гистологическую оценку, анализ методом проточной цитометрии и количественный анализ изображений, проводились строго в слепом режиме.
Результаты
KAST снижает количество легочных ILC2 и смягчает воспаление дыхательных путей 2-го типа
Для исследования терапевтического действия KAST была создана модель аллергического астматического (AA) воспаления у мышей, индуцированного OVA, и проведено лечение с применением пластырей на акупунктурные точки Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) и Shenshu (BL23) (Рисунок 1A). После моделирования у мышей с AA наблюдалось снижение массы тела, в то время как у мышей в группе KAST масса тела была значительно выше по сравнению с группой модели (Рисунок 1B). Коэффициент легкого, являющийся показателем легочного воспаления, был повышен у мышей с AA, но заметно снизился после применения KAST (Рисунок 1C). Поведенческая оценка выявила усиление расчесывания носа и чихания у мышей с AA, что было значительно облегчено воздействием KAST (Рисунок 1D–E). Плетизмография всего тела показала, что значения Penh, указывающие на гиперреактивность дыхательных путей, были повышены у мышей с AA, но снизились после лечения, что свидетельствует об улучшении функции легких (Рисунок 1F). Гистопатологический анализ с HE-окрашиванием выявил перибронхиальную и периальвеолярную инфильтрацию воспалительными клетками в группе модели по сравнению с нормальным контролем. Напротив, в группе KAST воспалительная инфильтрация была снижена (Рисунок 2A–B). Иммуногистохимия показала, что IL-4, IL-5 и IL-13 локализовались преимущественно в цитоплазме инфильтрирующих воспалительных клеток и некоторых эпителиальных клетках с возможным накоплением в интерстициальных пространствах. По сравнению с нормальным контролем, в группе модели наблюдалось заметное увеличение количества положительных сигналов и значений средней оптической плотности, которые были значительно снижены в группе KAST (Рисунок 2C–H). Проточная цитометрия дополнительно продемонстрировала, что количество ILC2 в легких мышей с AA было значительно выше по сравнению с нормальным контролем, в то время как KAST заметно снизил число ILC2 (Рисунок 2I–J).
KAST облегчает воспаление дыхательных путей 2-го типа путем подавления оси CGRP/RAMP1
Гиперактивация ILC2 регулируется множеством факторов. Анализ RNA-seq показал, что экспрессия CGRP была значительно повышена у мышей с AA, а KAST заметно снижал уровни CGRP в легких (Рисунок 3A). Вестерн-блоттинг и ELISA подтвердили повышенный уровень белка CGRP в модельной группе по сравнению с контролем, который снижался под действием KAST (Рисунок 3B–D). Эти результаты свидетельствуют о том, что KAST ослабляет экспрессию CGRP в легких при AA, тем самым модулируя иммунный ответ ILC2. Совокупность этих данных высокопроизводительного секвенирования и белкового скрининга указывает на сильную связь между терапевтическим воздействием KAST и снижением уровня CGRP в легких мышей с AA.
Для дальнейшего изучения роли CGRP мым AA вводили экзогенный CGRP, антагонист рецептора CGRP BIBN-4096 или KAST в сочетании с CGRP. Результаты анализа ELISA показали значительное снижение уровней белка CGRP в группах KAST и BIBN-4096, повышенные уровни в группе CGRP и более высокие уровни в группе KAST + CGRP по сравнению с группой только KAST (Рисунок 4A). Проточная цитометрия выявила, что количество ILC2 было снижено в группах KAST и BIBN-4096, но увеличилось в группах CGRP и KAST + CGRP относительно группы модели (Рисунок 4B–C). Окрашивание гематоксилином и эозином (HE) показало снижение инфильтрации воспалительными клетками вокруг дыхательных путей и альвеол в группах KAST и BIBN-4096, в то время как в группах CGRP и KAST + CGRP инфильтрация усилилась (Рисунок 4D–E). Анализ ELISA дополнительно подтвердил снижение уровней IL-4, IL-5 и IL-13 в группах KAST и BIBN-4096, но их повышение в группах CGRP и KAST + CGRP (Рисунок 4F–H).
Количество легочных RAMP1+ILC2s в различных группах оценивали с помощью многоцветного иммунофлуоресцентного окрашивания. Результаты показали, что по сравнению с группой нормального контроля в легочных тканях группы модели количество общих RAMP1+ILC2s было значительно увеличено. По сравнению с группой модели, количество легочных RAMP1+ILC2s еще более значительно увеличилось в группе CGRP, тогда как в группах BIBN-4096 и KAST оно заметно снизилось. Примечательно, что по сравнению с группой KAST, в группе KAST + CGRP наблюдалось значительное повышение числа легочных RAMP1+ILC2s, что указывает на то, что экзогенное восполнение CGRP успешно нивелировало ингибирующее действие KAST на популяцию общих RAMP1+ILC2s (Рисунок 5A–B)).
ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:
Полные наборы необработанных данных, полученные и проанализированные в ходе данного исследования, были размещены в общедоступном репозитории. В частности, эти исчерпывающие материалы включают все полные оригинальные сканы мембран для вестерн-блоттинга (WB), все полные необработанные микроскопические изображения с высоким разрешением для гистологического (HE и IHC) и иммунофлуоресцентного (IF) анализа, а также наборы данных по отдельным повторам и таблицы с количественными данными в формате Excel. Все необработанные данные находятся в открытом доступе по следующему постоянному DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32979065. Порядок установки гейтов для проточной цитометрии приведен на Дополнительном рисунке 1. Два полных изображения блотов представлены на Дополнительных рисунках 2–3, а количественные данные приведены в Дополнительной таблице 1.
Рисунок 1: Влияние KAST на симптомы и функцию легких у мышей с АА. (A) Протокол индукции аллергической астмы с помощью OVA. (B) Статистика массы тела мышей в каждой группе, n = 5. (C) Коэффициент массы легких мышей в каждой группе, n = 5. (D) Количество движений лапами в области носа в течение 10 мин после последнего воздействия, n = 5. (E) Частота чихания в течение 10 мин после последнего воздействия, n = 5. (F) Значения Penh у мышей в каждой группе после стимуляции различными концентрациями ацетилхолина, n = 5. Данные представлены как среднее значение ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Статистические сравнения проводились с использованием однофакторного или двухфакторного ANOVA с последующим апостериорным тестом множественных сравнений, где это было применимо. n = биологические повторности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Регуляция количества ILC2 и воспаления дыхательных путей 2-го типа с помощью KAST у мышей с AA. (A) Морфологические изменения легких, изученные с помощью окрашивания HE. Масштабная линейка = 50 µm. Увеличение: 200×. Оценка степени воспаления проводилась слепым методом. (B) Статистический анализ показателей воспаления в различных группах, n = 5. (C–H) Репрезентативные изображения ИГХ и значения средней оптической плотности экспрессии белков IL-4 (C, D), IL-5 (E, F) и IL-13 (G, H) в тканях легких различных групп, n = 5. Масштабная линейка = 50 µm. Увеличение: 200×. (I) Репрезентативные графики проточной цитометрии, демонстрирующие окончательный гейтинг легочных ILC2 в группах Normal, Model и KAST. Синглеты жизнеспособных клеток гейтировались последовательно как CD45+ Lineage- (CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G, CD19), затем по CD90.2+, и легочные ILC2 были окончательно идентифицированы по положительной экспрессии KLRG1+. Данные были получены на высокопроизводительной платформе проточной цитометрии и проанализированы с помощью специализированного программного пакета для анализа данных проточной цитометрии. (J) Анализ ILC2, выраженный в процентах клеток CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ среди живых клеток, n = 5. Данные представлены как среднее ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Статистические сравнения проводились с использованием однофакторного ANOVA с последующими соответствующими апостериорными тестами множественных сравнений. n = биологические повторности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: KAST подавляет экспрессию CGRP в тканях легких мышей с AA. (A) Тепловая карта экспрессии генов в разных группах, n = 4. (B) Репрезентативные изображения вестерн-блоттинга (WB) экспрессии CGRP (10 kDa) и GAPDH (37 kDa) в тканях легких каждой группы. (C) Анализ экспрессии белка CGRP в тканях легких методом WB, представленный как относительная экспрессия CGRP (отношение CGRP/GAPDH), n = 3. (D) Анализ экспрессии белка CGRP в тканях легких методом ELISA, n = 4. Данные представлены как среднее значение ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Статистические сравнения проводились с использованием однофакторного ANOVA с последующим апостериорным тестом множественных сравнений. n = биологические повторности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4Влияние KAST на количество ILC2 и воспаление дыхательных путей 2-го типа через CGRP у мышей с астматическим фенотипом. (A) Анализ экспрессии белка CGRP в тканях легких из разных групп методом ИФА, n = 4. (B) Репрезентативные графики проточной цитометрии ILC2 (CD45⁺ Линия развития (линия происхождения)⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺) в каждой группе. (C) Анализ ILC2, выраженный в процентах от CD45+ клеток⁺ Линия развития⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ клеток среди живых клеток, n = 5. (D) Морфологические изменения легких, исследованные с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (HE). Масштабная линейка = 50 µmУвеличение: 200×. (Е) Статистический анализ показателей воспаления в разных группах, n = 5. (F–H) Анализ ИЛ-4 методом ИФА (F), ИЛ-5 (G), и ИЛ-13 (H) экспрессия белка в тканях легких разных групп, n = 4. Данные представлены в виде среднего значения ± СО.p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0,0001. Статистические сравнения проводились с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим применением соответствующих апостериорных тестов множественных сравнений. n = биологические повторности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Влияние KAST на количество ILC2 в тканях легких через путь CGRP/RAMP1. (A) Количество клеток RAMP1⁺ ILC2 (определяемых как тройные положительные клетки KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺) на поле зрения при 400× в тканях легких, n = 5. (B) Репрезентативное флуоресцентное окрашивание тканей легких. Ядра были окрашены DAPI (синий), иммуноокрашивание проводилось для KLRG1 (пурпурный), GATA3 (красный) и RAMP1 (зеленый). Масштабная линейка = 50 µm. Количественный анализ: ручной подсчет RAMP1⁺ ILC2 (клеток KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺) в слепом режиме с использованием специализированной платформы для анализа изображений. Данные представлены как среднее ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Статистические сравнения проводились с использованием однофакторного ANOVA с последующим апостериорным тестом множественных сравнений. n = биологические повторности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительная фигура 1: Репрезентативные графики проточной цитометрии, демонстрирующие стратегию последовательного гейтирования для изоляции легочных ILC2. Сначала общее количество событий было отобрано с помощью прямого светорассеяния (FSC-A) и бокового светорассеяния (SSC-A). Дублеты были исключены путем анализа FSC-A против FSC-H для выделения одиночных клеток. Живые клетки были идентифицированы как Ghost Dye Red 780⁻ для удаления популяций мертвых клеток. Затем лейкоциты были отобраны по маркеру CD45⁺, после чего была произведена селекция lineage-отрицательных (Lin⁻) клеток. Внутри подмножества CD45⁺ Lin⁻ клетки дополнительно гейтировали по CD90.2⁺, и легочные ILC2 в конечном итоге были определены по положительной экспрессии KLRG1 (KLRG1⁺).Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная фигура 2: Репрезентативное изображение вестерн-блота внутреннего контроля GAPDH (37 kDa) из образцов тканей легкого мыши. Интегральная оптическая плотность полос была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ для последующей нормализации.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Репрезентативное изображение вестерн-блоттинга целевого белка CGRP (10 kDa) из образцов тканей легкого мыши. Относительная экспрессия CGRP была рассчитана путем деления интегральной оптической плотности полос CGRP на соответствующие значения интегральной оптической плотности GAPDH.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица 1: Исходные значения данных. Исходные значения данных, которые использовались для построения графиков.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Обсуждение
Лечение AA сталкивается с рядом ограничений, включая побочные эффекты, связанные с длительным приемом препаратов, неполный контроль симптомов и частые рецидивы. Хотя традиционная фармакотерапия эффективна, она часто сопровождается нежелательными исходами, такими как стероидная зависимость26,27. В отличие от этого, KAST представляет собой безопасную, экономичную и удобную альтернативу для терапии AA. Клинические данные показали, что KAST может эффективно облегчать симптомы астмы путем модуляции иммунной функции легких28. В данном исследовании мы дополнительно продемонстрировали, что KAST ослабляет воспаление дыхательных путей 2-го типа у мышей с AA, подавляя путь CGRP/RAMP1 и снижая количество ILC2.
Врожденный иммунитет, и в частности ILC2, играет незаменимую роль в инициации, усилении и поддержании воспаления дыхательных путей 2-го типа при аллергической астме (AA)29. При воздействии аллергена ILC2 быстро реагируют на алармины, вырабатываемые эпителием, секретируя большое количество IL-5 и IL-13 в течение нескольких часов, тем самым запуская воспалительные реакции 2-го типа30,31. Кроме того, ILC2 способствуют дифференцировке Th2 и синтезу IgE, что дополнительно усиливает адаптивный иммунный ответ и усугубляет воспаление дыхательных путей32. Исследования показали, что генетическая абляция ILC2 значительно сокращает продолжительность воспаления дыхательных путей в моделях AA, что подчеркивает их центральную роль в поддержании воспаления 2-го типа18. ILC2 регулируются цитокинами (например, IL-25, IL-33, TSLP), медиаторами воспаления (например, лейкотриенами) и нейропептидами (например, CGRP, VIP, NMU)33. Среди них нейропептиды играют ключевую роль в регуляции врожденного иммунитета. Нейромедин U (NMU) напрямую усиливает активность ILC2, быстро индуцируя высвобождение IL-5 и IL-1334. Вазоактивный интестинальный пептид (VIP) способствует усвоению питательных веществ и циркадной регуляции, стимулируя выработку IL-5 клетками ILC2 и поддерживая гомеостаз эозинофилов33. CGRP заметно увеличивает высвобождение IL-5 из ILC2, тем самым способствуя воспалению дыхательных путей при AA. Примечательно, что RAMP1, субъединица рецептора CGRP, экспрессируется на ILC2 на гораздо более высоком уровне по сравнению с рецепторами к другим нейропептидам, что позволяет предположить, что CGRP является наиболее мощным лигандом для активации ILC235. В данном исследовании транскриптомный анализ позволил идентифицировать CGRP как один из наиболее дифференциально экспрессируемых нейропептидов у мышей с AA, а анализы на белковом уровне подтвердили его повышенную экспрессию в тканях легких. Экзогенное введение CGRP привело к дальнейшему увеличению количества ILC2 и высвобождению цитокинов 2-го типа, что усугубило воспаление дыхательных путей.
С точки зрения механизмов, CGRP связывается с RAMP1 на ILC2 для регуляции их последующих иммунных ответов. В то время как в некоторых публикациях CGRP характеризуется как негативный регулятор, который ограничивает экспансию ILC2 для защиты от гипервоспаления20,21, противоречивые данные указывают на то, что CGRP может взаимодействовать с аларминами для активного стимулирования врожденного иммунитета 2-го типа в специфических патологических микросредах. Наши экспериментальные конечные точки конкретно согласуются с последним каскадом, демонстрируя вызванное CGRP усиление инфильтрации ILC2 в легких в микросреде при OVA-индуцированном аллергическом процессе. Напротив, блокада пути CGRP с помощью антагониста рецептора BIBN-4096 значительно уменьшает опосредованное ILC2 воспаление дыхательных путей. Вместо предоставления прямых доказательств с помощью генетической абляции, наши результаты опираются на ассоциативные транскриптомные вариации и параллельные эксперименты с фармакологическим вмешательством (с использованием экзогенного CGRP и антагониста BIBN-4096), чтобы продемонстрировать, что терапевтическая защита KAST тесно коррелирует с подавлением сигнальных кластеров CGRP/RAMP1 на ILC2.
Несмотря на эти многообещающие результаты, необходимо признать ряд существенных ограничений. Во-первых, хотя мышиная модель, индуцированная OVA, дает ценное представление о механизмах процесса, она может не полностью воспроизводить сложный патофизиологический и иммунологический ландшафт аллергической астмы у человека из-за межвидовых различий. Во-вторых, относительно небольшой размер выборки в некоторых эксплораторных анализах указывает на необходимость привлечения более крупных когорт для достижения более широкого статистического обобщения. В-третьих, в данной работе приоритетом была сигнальная ось CGRP/RAMP1/ILC2, что означает, что другие потенциально значимые пути нейроиммунного взаимодействия и перекрывающиеся цитокиновые сети требуют более глубокого изучения в будущем. Наиболее заметным техническим ограничением является отсутствие специальной контрольной группы с имитацией воздействия на акупунктурные точки с использованием нелечебных пластырей или пластырей, наложенных вне акупунктурных точек. Следовательно, потенциальные неспецифические вмешивающиеся факторы — такие как механический стресс при бритье, воздействие в ходе эксперимента и адгезивная стимуляция самого пластыря — не могут быть полностью отделены от специфических терапевтических свойств KAST. Чтобы устранить эти недочеты, наши будущие программы исследований будут строго включать тщательно разработанные контроли с имитацией воздействия и валидацию по нескольким путям для дальнейшего подтверждения специфичности и воспроизводимости данных результатов. Относительно наблюдаемого снижения уровней белка CGRP после введения BIBN-4096 важно уточнить, что, хотя BIBN-4096 функционирует в первую очередь как конкурентный антагонист, воздействующий на рецепторный комплекс RAMP1/CRLR, а не как прямой ингибитор синтеза CGRP, его введение in vivo может привести к снижению локального накопления лиганда в тканях. Это вторичное явление, вероятно, опосредовано нарушением положительной обратной связи нейроиммунного взаимодействия. Блокируя RAMP1 на целевых иммунных клетках, таких как ILC2, BIBN-4096 подавляет последующий выброс эффекторных цитокинов, что, в свою очередь, уменьшает ретроградную воспалительную активацию окончаний сенсорных нервов и легочных нейроэндокринных клеток (PNECs), тем самым косвенно ослабляя синтез CGRP и его удерживание в тканях.
Подводя итог, наши эмпирические данные демонстрируют, что KAST эффективно перестраивает микроокружение врожденного иммунитета легких, воздействуя на нейронную ось CGRP/RAMP1. Хотя мы признаем, что прямая клиническая экстраполяция требует осторожной оптимизации с учетом биологических различий между грызунами и людьми, данные конечные точки обеспечивают критически важную, ранее отсутствующую механистическую основу, которая обосновывает традиционную теорию «Fei Wai He Pi Mao» (Легкие, связанные с кожей и волосами). Предлагая уточренную нейроиммунную перспективу, данный протокол создает надежную научную базу для руководства и поддержки будущих проспективных многоцентровых клинических исследований по применению традиционной терапии приклеивания травяных составов в акупунктурные точки для лечения аллергической астмы.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Данная работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (№ 82274632), Проектом по подготовке ведущих специалистов в области традиционной китайской медицины провинции Цзянсу (№ SLJ0309), Фондом естественных наук провинции Цзянсу (№ BK20231381), Проектом плана развития науки и технологий в области традиционной китайской медицины провинции Цзянсу (№ ZT202205) и Ключевой лабораторией исследований иглоукалывания и медицины Министерства образования в Нанкинском университете китайской медицины (№ AML202304).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Дышащий медицинский пластырь 3M | 3M, USA | 1530C | Фиксация пластыря |
| Хлорид ацетилхолина | Sigma-Aldrich, USA | A6625 | Бронхиальная провокация |
| Биоанализатор Agilent 2100 | Agilent Technologies, USA | G2939BA | Оценка качества и целостности РНК |
| Alexa Fluor 488 козьи антитела против кроличьего IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, USA | (custom order) | Иммунофлуоресценция (вторичные антитела) |
| Гидроксид алюминия | Sigma-Aldrich, USA | 239186 | Адъювант |
| Антитела против CGRP (кролик) | Abcam, UK | ab81887 | Вестерн-блоттинг / ИФ |
| Мышь BALB/c (самка, SPF, 8–10 недель, 18–22 g) | Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd. | B202407260106 | Модель животного |
| BB700 крысиные антитела против мышиного CD90.2 (клон 53-2.1) | BD Biosciences, USA | 566465 | Проточная цитометрия |
| Проточный цитометр BD FACSCanto II | BD Biosciences, USA | FACSCanto II | Проточная цитометрия |
| BIBN-4096 (Ольцегапанта гидрохлорид) | MedChemExpress LLC, USA | HY-10095A | Антагонист рецепторов CGRP |
| Биотинированный коктейль для определения линий (Lineage Cocktail) | BD Biosciences, USA | (Customized, clones as described) | Проточная цитометрия |
| Brilliant Violet 605 стрептавидин | BD Biosciences, USA | 563260 | Проточная цитометрия |
| BSA, фракция альбумина V | BioFroxx (neoFroxx GmbH), Germany | 4240GR100 | Блокировка |
| Белок кальцитонин/CALCA | MedChemExpress LLC, USA | HY-P77587 | Воздействие CGRP |
| Антитела против CD11c/ITGAX (кролик) | Abmart, Shanghai, China | MU115408S | Иммунофлуоресценция |
| Цитратный буфер для демаскировки антигенов | Boster, China | AR0024 | Иммуногистохимия |
| Раствор для окрашивания DAPI | Beyotime, Shanghai, China | C1006 | Окрашивание ядер |
| ddH2O (Двукратно дистиллированная вода) | Sigma-Aldrich, USA | 10977015 | Реконституция белков и растворение порошков |
| DESeq2 | Bioconductor (R package) | Version 1.42.0 | Программное обеспечение для анализа дифференциальной экспрессии |
| ДНКаза I | Roche Diagnostics, Germany | 10104159001 | Переваривание ткани легкого |
| Ослиные антитела против мышиного IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam, UK | ab150106 | Иммунофлуоресценция (вторичные антитела) |
| ECL-субстрат (Super Femto) | Nanjing Lanken Biotech, China | – | Хемилюминесценция при вестерн-блоттинге |
| Набор для улучшенного BCA-анализа белка | Beyotime, Shanghai, China | P0010 | Количественное определение белка |
| Раствор эозина Y | Sigma-Aldrich, USA | HT110216 | Гистология (окрашивание Г&Э) |
| Этанол (абсолютный, аналитической чистоты) | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10009218 | Дегидратация тканей и гистология |
| Антитела F4/80 (мышь, клон C-7) | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-377009 | Иммунофлуоресценция |
| fastp | Open Source (GitHub) | Version 0.23.4 | ПО для контроля качества сырых данных RNA-seq |
| FITC антитела против мышиного CD45 (клон 30-F11) | BD Biosciences, USA | 553080 | Проточная цитометрия |
| FlowJo | BD Biosciences, USA | 10 | Анализ данных проточной цитометрии |
| Моноклональные антитела против GAPDH (мышь) | Proteintech, Wuhan, China | 60004-1-Ig | Вестерн-блоттинг |
| Антитела против GATA3 (мышь, клон L50-823) | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-268 | Иммунофлуоресценция |
| Ghost Dye Red 780 | Tonbo Biosciences, USA | 13-0865-T100 | Исключение мертвых клеток |
| Кросс-адсорбированные вторичные козьи антитела против кроличьего IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, USA | A11008 | Иммунофлуоресценция (вторичные антитела) |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, USA | 10.1.2 | Статистический анализ |
| Раствор гематоксилина (по Харрису) | Sigma-Aldrich, USA | HHS16 | Гистология (окрашивание Г&Э) |
| HISAT2 | Johns Hopkins University (Open Source) | Version 2.2.1 | ПО для выравнивания RNA-seq на референсный геном |
| HRP-конъюгированные козьи антитела против мышиного IgG (H+L) | Proteintech, Wuhan, China | SA00001-1 | Вестерн-блоттинг (вторичные антитела) |
| HRP-конъюгированные козьи антитела против кроличьего IgG (H+L) | Proteintech, Wuhan, China | SA00001-2 | Вестерн-блоттинг (вторичные антитела) |
| HTSeq-count | EMBL (Python utility) | Version 2.0.3 | Утилита для подсчета ридов геномных признаков RNA-seq |
| Пероксид водорода (H2O2, 3% раствор) | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | Блокировка эндогенной пероксидазы |
| Конъюгированные iFluor™ 488 козьи антитела против кроличьего IgG | Huabio, China | HA1121 | Иммунофлуоресценция (вторичные антитела) |
| Моноклональные антитела против IL-4 | Proteintech, Wuhan, China | 66142-1-Ig | Вестерн-блоттинг |
| Антитела против IL13 | Affinity Biosciences, USA | DF6813 | Вестерн-блоттинг |
| Антитела против IL5 | Affinity Biosciences, USA | AF5123 | Вестерн-блоттинг |
| Illumina Novaseq 6000 | Illumina, USA | – | Секвенирование РНК |
| ImageJ | NIH, USA | 1.8 | Количественный анализ вестерн-блоттинга |
| Image-Pro Plus | Media Cybernetics, USA | Version 6.0 | Количественное определение оптической плотности изображений |
| Травяная рецептура KAST | Pharmacy Department, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine | – | Лечебное вмешательство |
| Моноклональные антитела KLRG1 (2F1) | Thermo Fisher Scientific, USA | 58-5893-82 | Иммунофлуоресценция |
| Leica LAS X | Leica Microsystems, Germany | 4.5 | Количественный анализ иммунофлуоресценции |
| Конфокальный микроскоп Leica STELLARIS 8 DIVE | Leica Microsystems, Germany | STELLARIS 8 | Визуализация иммунофлуоресценции |
| Liberase TM | Roche Diagnostics, Germany | 5401119001 | Переваривание ткани легкого |
| Маркер (предварительно окрашенная лестница белков) | NCM Biotech, Suzhou, China | P9001 | Вестерн-блоттинг |
| Набор ИФА для CGRP мыши | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF2491-A | ИФА |
| Набор ИФА для IL-13 мыши | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-02456M1 | ИФА |
| Набор ИФА для IL-4 мыши | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-02448M1 | ИФА |
| Набор ИФА для IL-5 мыши | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-11729M1 | ИФА |
| Нейтральный бальзам, среда для заключения срезов | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10014061 | Заключение гистологических препаратов |
| Нормальная козья сыворотка (для блокировки) | Abcam, UK | ab7481 | Блокировка при ИГХ/ИФ |
| Среда для заморозки OCT | Sakura, USA | 4583 | Заморозка для криосрезов |
| Набор для быстрой подготовки PAGE-гелей в один этап | Vazyme, Nanjing, China | E303-01 | Подготовка гелей для SDS-PAGE |
| Овальбумин (OVA) | Sigma-Aldrich, USA | A5503 | Сенсибилизация/провокация |
| Параформальдегид (4% в PBS) | Biosharp, China | BL539A | Фиксация тканей |
| PE антитела против KLRG1 мыши/человека (клон 2F1) | BD Biosciences, USA | 564022 | Проточная цитометрия |
| Коктейль ингибиторов фосфатаз (50×) | Beyotime, Shanghai, China | P1092 | Экстракция белков |
| Раствор поли-L-лизина | Boster, China | AR0003 | Покрытие гистологических стекол |
| Ингибитор протеиназ и фосфатаз | NCM Biotech, Suzhou, China | P002 | Экстракция белков |
| Мембрана PVDF (0.22 μm) | Merck Millipore, USA | ISEQ00010 | Вестерн-блоттинг |
| Поликлональные антитела против RAMP1 (кролик) | Proteintech, Wuhan, China | 10327-1-AP | Иммунофлуоресценция |
| Буфер для лизиса эритроцитов (RBC lysis buffer) | Beyotime, Shanghai, China | C3702 | Подготовка образцов для проточной цитометрии |
| Буфер для лизиса RIPA (сильный) | Beyotime, Shanghai, China | P0013B | Экстракция белков |
| Среда RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11875093 | Основа для переваривания клеток ткани |
| SuperKine™ улучшенная антифейдинговая среда для заключения срезов | Wuhan Yakeyin Biotechnology Co., Ltd. | BMU104 | Заключение срезов при иммунофлуоресценции |
| Triton X-100 (детергент) | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | Пермеабилизация при иммунофлуоресценции |
| Реагент TRIzol | Thermo Fisher Scientific, USA | 15596026 | Экстракция РНК |
| Набор VAHTS Universal V10 для подготовки библиотек RNA-seq | Vazyme, Nanjing, China | NR605-01 | Создание библиотек RNA-seq |
| Система плетизмографии всего тела | Guangyuanda, Beijing, China | WBP-4 | Функция легких (Penh) |
| Ксилол (аналитической чистоты) | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10023418 | Депарафинизация и просветление |
Ссылки
- Chinese guidelines for the diagnosis and treatment of allergic asthma (2019, the first edition). Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2019;58(9):636-55.
- Huang K, et al. Prevalence, risk factors, and management of asthma in China: a national cross-sectional study. LANCET. 2019;394(10196):407-18.
- Zhou J, et al. Characteristics of different asthma phenotypes associated with cough: a prospective, multicenter survey in China. Respir Res. 2022;23(1):243.
- Venkatesan P. 2023 GINA report for asthma. Lancet Respir Med. 2023;11(7):589.
- Schatz M, Rosenwasser L. The allergic asthma phenotype. J Allergy Clin Immunol Pract. 2014;2(6):645-8; quiz 9.
- Reddel HK, et al. Global Initiative for Asthma Strategy 2021: executive summary and rationale for key changes. Eur Respir J. 2022;59(1).
- Smith SG, et al. Increased numbers of activated group 2 innate lymphoid cells in the airways of patients with severe asthma and persistent airway eosinophilia. J Allergy Clin Immunol. 2016;137(1):75-86.e8.
- Mu JX, et al. Effects of fermented white mustard seed plaster on airway immune balance and its inflammatory response mechanism in bronchial asthma rats. Zhen Ci Yan Jiu. 2025;50(3):287-94.
- Zhao SM, et al. Anti-asthma components and mechanism of Kechuanting acupoint application therapy: based on serum metabolomics and network pharmacology. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(24):6780-93.
- Hu J, et al. A systematic review and meta-analysis of acupoint application combined with western medicine therapy in the treatment of bronchial asthma. Ann Palliat Med. 2021;10(11):11473-81.
- Hu W, et al. Study on Raman spectroscopy evaluating the contact dermatitis produced by acupoint sticking during treating bronchial asthma. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2022;37(3):1830-3.
- Wang H, et al. Effect of Acupoint Application Induced Contact Dermatitis on Asthma Control and Serum IFN-gamma/IL-4 in Asthmatic Patients. Journal of Traditional Chinese Medicine. 2018;59(7):582-5.
- Yang Q, et al. Modulation of helper T cell 2 cytokines in asthmatic rats by acupoint application with ginger juice hydrogel. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2024;39(6):3068-72.
- Wang Y, et al. Effects of Baijiezi Powder and Its Disassembled Formula on the Ig-E,IL-4,IFN-gamma and TNF-alpha in Allergic Asthmatic Rats. Chinese Pharmaceutical Journal. 2019;54(18):1491-6.
- Guidelines for the prevention and management of bronchial asthma (2024 edition). Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2025;48(3):208-48.
- Boonpiyathad T, Sözener ZC, Satitsuksanoa P, Akdis CA. Immunologic mechanisms in asthma. Semin Immunol. 2019;46:101333.
- Klein Wolterink RG, et al. Pulmonary innate lymphoid cells are major producers of IL-5 and IL-13 in murine models of allergic asthma. Eur J Immunol. 2012;42(5):1106-16.
- Christianson CA, et al. Persistence of asthma requires multiple feedback circuits involving type 2 innate lymphoid cells and IL-33. J Allergy Clin Immunol. 2015;136(1):59-68.e14.
- Kabata H, Artis D. Neuro-immune crosstalk and allergic inflammation. J Clin Invest. 2019;129(4):1475-82.
- Wallrapp A, et al. Calcitonin Gene-Related Peptide Negatively Regulates Alarmin-Driven Type 2 Innate Lymphoid Cell Responses. Immunity. 2019;51(4):709-23.e6.
- Nagashima H, et al. Neuropeptide CGRP Limits Group 2 Innate Lymphoid Cell Responses and Constrains Type 2 Inflammation. Immunity. 2019;51(4):682-95.e6.
- Shi K, et al. Optimization of acupoint application scheme in the treatment of bronchial asthma based on the orthogonal design method. Zhongguo Zhen Jiu. 2017;37(6):571-5.
- Hu J, et al. Components of drugs in acupoint sticking therapy and its mechanism of intervention on bronchial asthma based on UPLC-Q-TOF-MS combined with network pharmacology and experimental verification. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(5):1359-69.
- Li Y, et al. Kinetics of the accumulation of group 2 innate lymphoid cells in IL-33-induced and IL-25-induced murine models of asthma: a potential role for the chemokine CXCL16. Cell Mol Immunol. 2019;16(1):75-86.
- Xu J, et al. Excess neuropeptides in lung signal through endothelial cells to impair gas exchange. Dev Cell. 2022;57(7):839-53.e6.
- Patel VH, et al. Current Limitations and Recent Advances in the Management of Asthma. Dis Mon. 2023;69(7):101483.
- Farinha I, Heaney LG. Barriers to clinical remission in severe asthma. Respir Res. 2024;25(1):178.
- Zhao SM, et al. Repeated Herbal Acupoint Sticking Relieved the Recurrence of Allergic Asthma by Regulating the Th1/Th2 Cell Balance in the Peripheral Blood. Biomed Res Int. 2020;2020:1879640.
- van Rijt L, von Richthofen H, van Ree R. Type 2 innate lymphoid cells: at the cross-roads in allergic asthma. Semin Immunopathol. 2016;38(4):483-96.
- Cortez VS, Robinette ML, Colonna M. Innate lymphoid cells: new insights into function and development. Curr Opin Immunol. 2015;32:71-7.
- Thio CL, Chang YJ. The modulation of pulmonary group 2 innate lymphoid cell function in asthma: from inflammatory mediators to environmental and metabolic factors. Exp Mol Med. 2023;55(9):1872-84.
- Kubo M. Innate and adaptive type 2 immunity in lung allergic inflammation. Immunol Rev. 2017;278(1):162-72.
- Kabata H, Moro K, Koyasu S, Asano K. Group 2 innate lymphoid cells and asthma. Allergology International. 2015;64(3):227-34.
- Cardoso V, et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 2017;549(7671):277-81.
- Xie X, et al. Mediation of the JNC/ILC2 pathway in DBP-exacerbated allergic asthma: A molecular toxicological study on neuroimmune positive feedback mechanism. J Hazard Mater. 2024;465:133360.