Стандартизированный протокол цитометрии с многоцветным потоком для измеряемой остаточной оценки заболевания при острой лейкемии

Краткое содержание

Этот протокол описывает стандартизированный рабочий процесс многоцветной проточной цитометрии для измеряемой оценки остаточных заболеваний при остром лейкозе, интегрируя контролируемую обработку образцов, гармонизированные параметры сбора, последовательные стратегии гейтинга и интерпретацию с учётом знаменателя для повышения аналитической воспроизводимости в рутинных клинических лабораториях.

Аннотация

Измеримое остаточное заболевание (МРД) является важным прогностическим индикатором в лечении острой лейкемии. Однако рутинная многоцветная цитометрическая оценка потока (MFC) остаётся уязвимой к преданалитической и аналитической вариативности, включая гемодилюцию, несогласованную глубину приобретения и субъективную интерпретацию. В этой статье представлен стандартизированный операционный рабочий процесс для рутинной оценки МРД при острой лимфобластной лейкозе В-клеток (B-ALL) и острой миелоидной лейкемии (ОМЛ). Протокол включает строгие критерии принятия образцов с интегрированной оценкой гемодилюции и применяется метод лизисирования эритроцитов для костного мозга и периферических образцов крови. Аналитическая стандартизация достигается с помощью специфических для заболевания двухтрубочных восьмицветных панелей антител, гармонизированных мишеней для приобретения, требующих не менее 500 000 положительных событий CD45, и фиксированных последовательных стратегий гейтинга. Кроме того, рабочий процесс применяет лимиты обнаружения (LOD) и количественной оценки (LOQ) с учетом знаменателя для поддержки объективной трёхуровневой системы отчетности. Валидация по 197 клиническим образцам показала высокую повторяемость, надёжную линейность разбавления и высокую согласованность с парными ортогональными молекулярными анализами. В совокупности этот протокол предоставляет практическую основу для стандартизированного мониторинга MRD. для стандартизированного мониторинга МРД в рутинных клинических лабораториях путём интеграции контролируемого преданалитического обработки и гармонизированных аналитических параметров.

Введение

Даже после достижения морфологической ремиссии пациентам с острым лейкемией требуется постоянное наблюдение на предмет измеримого остаточного заболевания (МРД) для точной оценки риска рецидива. Традиционные морфологические и цитопатологические исследования не обладают чувствительностью, необходимой для обнаружения низкоуровневых остаточных лейкемических популяций. В результате оценка МРД стала неотъемлемой частью мониторинга заболеваний как при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ), так и при острой лимфобластной лейкозе B-клеток (B-ALL). Недавние рекомендации European LeukemiaNet подчёркивают, что надёжная оценка MRD при ОМЛ зависит от технической стандартизации и воспроизводимости между наблюдателями, а не от доступности простого^{теста 1,2}. При B-ALL многоцветная проточная цитометрия (MFC) остаётся особенно важной для пациентов без стабильных молекулярных мишеней. Предыдущие исследования показали, что стандартизированные многоцветные потоковые цитометрические подходы с использованием структурированных панелей антител могут обеспечить воспроизводимое и чувствительное обнаружение остаточных заболеваний³. Проточная цитометрия широко используется благодаря широкой применимости, быстрому сроку выполнения и экономической эффективности. Результаты анализов сильно зависят от стандартизированной подготовки образцов, параметров сбора и интерпретации^{данных 4}.

Одной из основных технических задач в оценке потоковой цитометрической MRD является обнаружение редких событий, которое сильно зависит от глубины набора и общего количества событий. Идентичные панели антител могут вызвать разную аналитическую чувствительность, если образцы собраны с непостоянными размерами^{знаменателей 5}. Стандартизация, таким образом, выходит за рамки отбора антител и требует гармонизированной обработки образцов, объёмного лизиса эритроцитов, компенсации инструментов, приобретения мишень и стратегий гейтинга. В образцах костного мозга гемодилюция также представляет собой значительную преданалитическую переменную, поскольку периферическое загрязнение крови может искусственно снижать кажущуюся остаточную лейкемическую^{нагрузку 6,7}. Кроме того, интерпретация низкочастотных событий требует чётко определённых порогов отчёта на основе специфической глубины сбора образца. Недавние исследования подчёркивали важность пределов обнаружения (LOD) и количественной оценки (LOQ) для повышения согласованности интерпретации цитометрического потока^{MRD 8}.

Общая цель этого протокола — обеспечить стандартизированный рабочий процесс для рутинной оценки MRD на основе MFC в B-ALL и AML. Протокол интегрирует критерии принятия образцов, оценку гемодилюции, проектирование панелей антител, специфических к болезнью, подготовку образцов с объёмом лиза, гармонизированные мишени для забора, фиксированные последовательные стратегии гейтинга и критерии отчётности, скорректированные с учётом знаменателя, в единую операционную^{структуру 9,10}. Объединяя стандартизированные преданалитические и аналитические процедуры, этот метод обеспечивает практический и воспроизводимый подход к рутинному внедрению мониторинга МРД в клинических лабораториях. Рисунок 1 иллюстрирует общий стандартизированный преданалитический и аналитический рабочий процесс, реализованный в данном исследовании. Таблица 1 суммирует характеристики когорты и образцов пациентов с острой B-клеточной лимфобластной лейкозом (B-ALL) и острым миелоидным лейкозом (ОМЛ), зарегистрированных в период валидации в заранее определённых окнах мониторинга (конец индукции, консолидации и пред-ГСКТ).

Рисунок 1: Стандартизированный рабочий процесс для рутинной многоцветной цитометрической оценки потоковой MRD. (A) Преданалитический рабочий процесс, показывающий скрининг образцов и оценку качества на заранее определённых интервалах мониторинга. (B) Аналитический рабочий процесс — от объёмного лизиса эритроцитов и окрашивания антител через последовательное ограничение, интерпретацию с учётом знаменателя и итоговую отчетность по MRD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: Объединённая демография пациентов, характеристики клинических образцов и показатели рутинного отбора. Эта единственная пересмотренная таблица суммирует исходные клинические особенности зарегистрированной когорты, включающей случаи острого лимфобластного лейкоза B-клеток (B-ALL) и острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), и сочетает демографические характеристики на уровне пациента с характеристиками на уровне образца, интервалами мониторинга лечения, жизнеспособностью, баллами гемодилюции, глубиной набора и измеримыми остаточными классификациями заболеваний, скорректированными по знаменателям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Протокол

Все процедуры, связанные с человеческими образцами, проводились в соответствии с институциональными рекомендациями и утверждён Этическим комитетом Второй народной больницы Нэйцзяна (Утверждение No PXTS887192). В исследовании использовались деидентифицированные остаточные клинические образцы, полученные после планового диагностического тестирования. Информированное согласие было отказано, поскольку исследование не повлияло на уход за пациентом, распределение лечения или процедуры сбора образцов. Химикаты, реагенты и оборудование, используемые в протоколе, перечислены в Таблице материалов.

1. Сбор образцов и преданалитическая оценка

1. Собирайте аспираты костного мозга как предпочтителенный тип образца для измеримого остаточного заболевания (MRD). Периферические образцы крови используют только тогда, когда аспирация костного мозга клинически противопоказана или во время выбранных анализов наблюдения и компаратора.
2. Собирайте образец костного мозга во время первого аспираторного извлечения, когда это возможно. Избегайте последующих аспираторных растяжек, чтобы минимизировать периферическое загрязнение крови и недооценку низкоуровневого остаточного заболевания.
3. Сразу после сбора образцы переносят образцы в антикоагулянтные трубки с дикалием этилендиаминететрауксусной кислотой (K2-EDTA) или натрие-гепаринового антикоагулянта. Храните и транспортируйте образцы при комнатной температуре (18–25 °C) и защищайте их от прямого солнечного света.
   ВНИМАНИЕ: Не ставьте образцы в холодильник.
4. Обрабатывайте все образцы в течение 24 часов после сбора. Для исследований устойчивости сохраняйте аликвоты для повторного анализа в течение 24 и 48 часов при сохранении условий хранения при комнатной температуре.
5. Проверьте идентификатор пациента, тип антикоагулянта, целостность образца и время сбора при получении образца. Отклонять образцы с выраженным свертываемостью, тяжёлым гемолизом или выраженной клеточной дегенерацией
6. Оценить образцы костного мозга на предмет гемодилюции перед окончательной интерпретацией. Рассчитайте полуколичественный балл гемодилюции в диапазоне от 0,00 до 1,00 для оценки периферического загрязнения крови.
7. Определите это значение, разделив долю зрелых лимфоцитов на сумму CD34-положительных предшественников, незрелых гранулоцитов и зрелых лимфоцитов, где более высокий коэффициент указывает на более сильный разбавляющий эффект.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вычислите счёт по следующей формуле:
    
   где более высокий балл указывает на более сильное периферическое загрязнение крови.
8. Классифицируем результаты гемодилюции следующим образом: <0,20, приемлемо; 0,20–0,39, слегка гемодилированная; и ≥0,40, существенно гемодилированные.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не присваивайте окончательные MRD-отрицательные интерпретации заметно разбавленных образцам, если не подтверждены адекватный размер знаменателя и архитектура сохранившегося предшественника костного мозга.

2. Подготовка панели антител, специфичных к болезнью

1. Подготовьте стандартизированные специализированные для заболевания двухтрубочные панели с восемью цветами антител для анализа B-ALL и AML. Достичь стандартизации панелей путём строгого соблюдения фиксированных маркеров магистрали на всех трубках для стабильного контроля популяции.
2. Используйте последовательные флюорохромные конъюгаты для соответствующих линейных антигенов и строго соблюдайте рекомендованные производителем объемы титрации для минимизации вариабельности флуоресценции от партии к партии.
3. См. дополнительную таблицу 1 для получения комбинаций маркеров, назначения фторхромов, клонов антител, объёмов окрашивания и параметров получения.
4. Для оценки B-ALL используйте CD19, CD45, CD34, CD10 и CD20 в качестве основных маркеров в обеих трубках для определения популяций прекурсоров и паттернов созревания. Добавьте CD38, CD58 и CD81 в трубку 1.
5. Добавьте CD66c, CD123 и либо CD73, либо CD304 в трубку 2 согласно диагностическому иммунофенотипу, связанному с лейкемией, установленному при начальной оценке.
6. Для оценки ОМЛ используйте CD45, CD34, CD117, CD13, CD33 и HLA-DR в качестве основных маркеров в обеих трубах для определения популяций бластных и незрелых миелоидных групп.
7. Добавьте CD7 и CD56 в пробирку 1 для оценки экспрессии антигена между линиями. Добавьте CD11b и CD15 в трубку 2 для оценки аномалий созревания миелоидов.

3. Подготовка и окрашивание объемного лизиса

1. Перенесите 2,0 мл хорошо смешанного образца костного мозга или периферической крови в полипропиленовую трубку объемом 15 мл. Если объём образца ограничен, используйте минимальный входной объём 1,0 мл.
2. Добавьте 10 мл предварительно подогретого буфера лизиса хлорида аммония. Инкубировать суспензию в течение 10 минут при комнатной температуре для лиза эритроцитов.
3. Центрифугуйте образец при 500 × г в течение 5 минут. Аккуратно избавляйте супернатант, не нарушая гранулу с ядром.
4. Суспензировать гранулу в 2 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 2 мМ этилендиаминетрауксусной кислоты (EDTA). Повторите этап промывки один раз, если остатки гемоглобина остаются заметны.
5. Определить концентрацию ядочных клеток с помощью автоматического гематологического анализатора или ручного гемоцитометра с исключением трипана синего. Рассмотрим минимальную концентрацию ядерных клеток в 5 × 10⁶ клеток/мл как оптимальную для стандартного завоевания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если клеточный выход опускается ниже этого порога, сконцентрируйте образец дополнительной центрифугой при 500 × г в течение 5 минут и аккуратно уменьшите объем буфера ресуспензии для максимизации клеточной плотности.
6. Aliquot 5 × 10^{6 нуклеированных} клеток в пробирке для рутинного окрашивания. Увеличить вход до максимума 1 × 10⁷ клеток на пробирку для высокочувствительного анализа, когда получение образца^{позволит 6,7}.
7. Добавьте индивидуально титрированный коктейль антител и фиксируемый краситель жизнеспособности, указанный в Таблице материалов, в каждую тюбик согласно валидированной конфигурации панели окрашивания. Рутинная валидированная панель использует 5 мкл на антитело, конъюгированное с фторхромом, если только титрование, рекомендованное производителем, не указывает на другой объём, специфичный для антител.
8. Убедитесь, что объём конечной реакции окрашивания строго поддерживается на уровне 100 мкл на тест, чтобы сохранить оптимальную стехиометрию антитела к антигену. Инкубировать образцы в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте.
9. Промыйте окрашенные клетки один раз с помощью буфера для промывания и заново суспензируйте конечную гранулу в 500 мкл буфера для накопления.
10. Подготовьте одноокрашенные контроли компенсации с использованием компенсационных шариков в тот же день, когда собираются образцы.

4. Настройка приборов и сбор данных

1. Проводите ежедневный стартовый контроль качества потокового цитометра перед взятием образцов пациентов. Проверьте гидродинамику, выравнивание лазеров, работу детектора и значения флуоресцентных целей с помощью калибровочных шариков, следуя инструкциям производителя.
2. Подготовьте одноокрашенные контроли компенсации с использованием тех же фторохромов, которые входят в панели антител. Корректируйте компенсирующую матрицу перед получением пациента и убедитесь, что маркеры магистрали остаются в пределах заранее определённых целевых диапазонов флуоресценции.
3. Используйте один и тот же шаблон сбора, настройки детектора, стратегию компенсации и иерархию гейтинга для всех анализируемых образцов в период валидации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечить правильную гармонизацию между приборами, устанавливая стандартизированные значения интенсивности медианной флуоресценции для всех детекторов с помощью специализированных калибровочных шариков и подтверждая, что идентичные образцы дают сопоставимые флуоресцентные профили на разных платформах до получения клинических данных.
4. Собирайте данные с низким или умеренным расходом, чтобы снизить совпадающие события и сохранить точность обнаружения редких событий. Постоянно отслеживайте частоту событий во время приобретения.
5. Получите не менее 500 000 CD45-положительных нуклеированных событий для каждого отчетного результата MRD. Когда качество образцов и стабильность событий позволяют, увеличивайте количество общих событий до 1,0–1,5 миллиона, особенно при подозрении на низкоуровневую остаточную болезнь.
6. Приостановка или прекращение захвата при возникновении нестабильности жидкости, закупорок образца, резких изменений частоты событий или заметного ухудшения качества рассеяния. При необходимости перефильтруйте или перемешайте образец и забирайте образец только после восстановления стабильного потока.

5. Последовательное ограничение и интерпретация, скорректированная с учётом знаменателя

1. Анализируйте данные потоковой цитометрии с помощью проверенного программного обеспечения для анализа потоковой цитометрии. Используйте одну и ту же последовательную стратегию гейтинга для всех образцов, чтобы снизить изменчивость между операторами.
2. Устанавливать нормальные и регенерирующие паттерны созревания, независимо приобретая и проанализируя эталонный банк из не менее 20 нормальных или регенерирующих образцов костного мозга, которые служат базовыми шаблонами экспрессии.
3. Исключайте мусор с помощью параметров прямого и бокового рассеяния. Изолировать отдельные ячейки, применяя гейтинг с областью рассеяния вперёд и высоту рассеяния.
4. Исключить нежизнеспособные клетки с помощью окраски жизнеспособности, указанного в таблице материалов. Регулярно исключайте эти нежизнеспособные клетки, поскольку они демонстрируют неспецифическое связывание антител и могут искусственно повышать фоновый шум или имитировать редкие аномальные популяции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального дальнейшего анализа требуется минимальный порог жизнеспособности в 75%, учитывая, что образцы ниже этого значения требуют осторожной интерпретации относительно возможных редких артефактов. Определите знаменатель лейкоцитов, отслеживая жизнеспособные события с положительным CD45 с соответствующими характеристиками бокового рассеяния.
5. Для образцов B-ALL ограничьте анализ CD19-положительным прекурсором. Внедрить альтернативную систему гейтинга для пациентов, получающих таргетную терапию против CD19.
6. Переместить первичную оценку на CD22, CD24 или CD34-положительные компартменты, чтобы охватить лейкемическую популяцию независимо от экспрессии CD19. Оценить паттерны созревания CD34, CD10 и CD20 и выявить аномальные популяции с помощью паттернов экспрессии CD38, CD58, CD81, CD66c, CD123 и CD73 или CD304.
7. Для образцов ОМЛ определите область бласта или прекурсора с помощью CD45, бокового рассеяния, CD34 и экспрессии CD117.
8. Оценить аномрантную или асинхронную экспрессию миелоидных и кросс-линейных маркеров, включая CD13, CD33, HLA-DR, CD7, CD56, CD11b и CD15.
9. Рассчитайте предел обнаружения (LOD) и предел количественной оценки (LOQ) по образцу, используя общее количество жизнеспособных CD45-положительных событий в качестве знаменателя:
    
    
10. Классифицировать окончательную интерпретацию MRD в одну из трёх категорий: MRD-положительную, ниже LOD или аналитически ограниченную.
    1. Присвоить результат как MRD-положительный, если ясный, непрерывный кластер аномальных событий превышает специфичный для образца LOD и демонстрирует внутренне согласованный иммунофенотип, отличающийся от нормальных или регенерирующих гемопоэтических популяций.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Не классифицируйте рассеянные, некластерные события как MRD-положительные. Использование интегрированного подхода анализа, объединяющего как иммунофенотип, ассоциированный лейкемией (LAIP), отслеживаемый из исходной диагностической выборки, так и стратегии распознавания образов, отличающихся от нормы (DfN).
    2. Присваивать результат как ниже LOD, если встречаются редкие подозрительные события, но не достигают специфического для образца порогового значения.
    3. Назначайте результат как аналитически ограниченный, когда размер знаменателя недостаточен, значительная гемодилюция, низкое качество образца или преданалитические ограничения мешают уверенной отрицательной интерпретации.
11. Независимо проверяйте все случаи с положительными по MRD и погранично низкоуровневые случаи под руководством второго квалифицированного аналитика.
12. Завершить интерпретацию потоковой цитометрии перед просмотром парных данных молекулярного компаратора, включая количественную полимеразную цепную реакцию или результаты секвенирования следующего поколения.

6. Методология аналитической валидации

1. Оценивайте аналитическую повторяемость, подготовив дублирующиеся аликвоты из той же суспензии после лиза. Приобрести и проанализировать как минимум 30 парных образцов независимо друг от друга.
2. Оценить линейность разбавления путём подготовки последовательных разбавлений на шести уровнях в ожидаемом диапазоне низкой нагрузки. Сравните наблюдаемые значения MRD с ожидаемыми значениями MRD по рядам разбавления.
3. Оценивать воспроизводимость между операторами и между приборами, анализируя эталонные образцы у нескольких квалифицированных операторов и гармонизированных потоковых цитометров.
4. Преобразованные цитометрические и парные молекулярные проценты MRD с использованием преобразования log10 перед статистическим сравнением. Оценить количественное согласование с помощью корреляционного анализа и анализа Бланда-Альтмана.

Результаты

Характеристики набора данных для рутинной реализации

В течение периода исследования 197 последовательных образцов прошли скрининг на соответствие и преданалитическую оценку качества и вошли в подлежащий отчетности рабочий процесс. В когорту исследования вошли 98 пациентов: 62 (63,3%) с острой B-клеточной лимфобластной лейкемией (B-ALL) и 36 (36,7%) с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ). Когорта состояла из 64 мужчин (65,3%) и 34 женщин (34,7%), медианный возраст 32 года (межквартильный диапазон [IQR], 13–49 лет; диапазон 2–73 года). Медианный базовый процент взрывов составлял 67,2% (IQR, 56,9% – 80,2%).

Большинство анализируемых образцов были аспираты костного мозга (174/197, 88,3%), тогда как периферические образцы крови составили 23 из 197 (11,7%). Согласно заранее установленным интервалам мониторинга, было собрано 86 образцов (43,7%) в конце индукционной терапии, 65 (33,0%) — во время консолидирующей терапии, и 46 (23,4%) — до трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) (Таблица 1).

Медианная жизнеспособность образца составила 88,3% (IQR, 84,4% – 92,6%). Рабочий процесс приобретения дал медиану в 1 116 901 общее событие (IQR, 908 521–1 258 946) до очистки данных. После последовательного аналитического исключения обломков, совпадающих дублетов и нежизнеспособных клеток, стратегия гейтинга достигла медианы в 907 325 жизнеспособных одиночных целевых событий с положительным CD45 (IQR, 690 112–1 095 836), с медианным временем набора 11,9 минуты. Медианный балл гемодилюции составлял 0,20 (IQR, 0,14–0,28). После интерпретации с учётом знаменателя 41 экземпляр (20,8%) был классифицирован как MRD-положительный, а 156 образцов (79,2%) — ниже специфического предела обнаружения (LOD) (Таблица 1).

Аналитическая валидация: повторяемость, линейность и стабильность

Аналитическая эффективность стандартизированного рабочего процесса оценивалась с помощью повторяемости, разбавляющей линейности и краткосрочных исследований устойчивости (рисунок 2). Дублирующие аликвоты, полученные из тех же объёмных образцов, демонстрировали высокую повторяемость: медианный коэффициент вариации (CV) составляет 0,101%, а 95-й перцентиль — 0,222%.

Рисунок 2: Аналитическая валидация стандартизированного рабочего процесса многоцветной потоковой цитометрии MRD. (A) Распределение жизнеспособности образца по анализируемым образцам. (B) Корреляция между ожидаемыми и наблюдаемыми значениями MRD в экспериментах по серийному разбавлению в логарифмическом анализе. (C) Согласование между независимыми реплицированными анализами во время оценки повторяемости. (D) Стабильность измерений MRD после хранения при комнатной температуре за 0, 24 и 48 час. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Для оценки поведения низкоуровневого обнаружения были проанализированы 12 экспериментов по серийному разбавлению, включающие 72 наблюдений в ожидаемом нижнем диапазоне MRD. Наблюдаемые значения MRD показали сильное совпадение с ожидаемыми значениями в логарифмическом анализе (r = 0,999, скорректированный R² = 0,998, наклон = 1,009, пересечение = 0,018), что указывает на сохранение линейности в низкочастотных диапазонах событий.

Краткосрочные тесты на устойчивость показали постепенное снижение жизнеспособности образца со временем: медианная жизнеспособность снизилась с 89,1% через 0 часов до 84,9% через 24 часа и 80,6% через 48 часов. В отличие от этого, медианное абсолютное относительное изменение нагрузки MRD оставалось ограниченным на уровне 24 часа (6,2%) и 48 часов (12,0%), что поддерживало рутинную обработку в течение 24 часов после сбора данных.

Воспроизводимость между операторами и между инструментами

Воспроизводимость между операторами и приборами была оценена с использованием 24 эталонных образцов, проанализированных между несколькими операторами, и гармонизированных потоковых цитометров, что дало всего 96 оценок. Медианное абсолютное относительное отклонение от эталонных значений составило 13,7%. Эти результаты демонстрируют последовательные аналитические результаты после стандартизации подготовки образцов, условий забора и последовательных стратегий гейтинга (Таблица 2).

Таблица 2: Аналитическая валидация и показатели эффективности методов для стандартизированного измеримого рабочего процесса по остаточным заболеваниям. Эта таблица ограничена результатами валидации, включая повторяемость внутри анализа, линейность разбавления, кратковременную стабильность, воспроизводимость между операторами и инструментами, а также метрики сравнения ортогональных молекулярных методов; он не дублирует демографические характеристики пациентов или характеристики образцов, указанных в Таблице 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Клиническое применение и сравнение ортогональных методов

Ортогональное сравнение было проведено с использованием 117 парных образцов, включая 75 проанализированных количественной полимеразной цепной реакцией (qPCR) и 42 — с помощью секвенирования следующего поколения (NGS). Оценки qPCR в основном отслеживали специфические для заболевания транскрипты слияния, установленные при постановке диагноза, включая BCR::ABL1, RUNX1::RUNX1T1 и PML::RARA. Подходы NGS оценивали перестройку генов клонального иммуноглобулина или Т-клеточного рецептора при лимфобластном лейкозе и отслеживали повторяющиеся соматические мутации с помощью таргетных миелоидных панелей при остром миелоидном лейкозе. Потоковые цитометрические значения MRD показали сильную корреляцию с парными молекулярными результатами на измеримых уровнях заболевания (r = 0,893 в логарифмическом анализе).

Анализ Бланда-Альтмана показал среднюю логарифмическую разницу −0,093 с пределами согласованности от −0,848 до 0,663 (рисунок 3). Среди диссонантных случаев был выявлен один ложноотрицательный результат среди 25 молекулярно положительных образцов. Рабочий процесс показал положительный процент согласия — 78,1%, отрицательный — 97,6%, а общий уровень согласованности — 92,3%.

Рисунок 3: Клиническое применение и ортогональная валидация стандартизированной оценки MRD. (A) Распределение MRD-положительных случаев по группам заболеваний и интервалы мониторинга. (B) Корреляция между значениями потоковой цитометрической MRD и результатами парного молекулярного компаратора в логарифмическом анализе. (C) Анализ Бланда-Альтмана, сравнивающий потоковые цитометрические и парные молекулярные измерения MRD, при этом горизонтальные линии обозначают среднее смещение и 95% пределы согласования в аналитическом диапазоне. (D) Распределение MRD-положительных результатов между интервалами мониторинга лечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Эти результаты демонстрируют, что стандартизированный рабочий процесс многоцветной потоковой цитометрии достиг сильного согласия с ортогональными молекулярными МРД-анализами на рутинных клинических образцах.

Дополнительная таблица 1: Комплексные операционные параметры для стандартизированного многоцветного потокового цитометрического процесса измеримых остаточных заболеваний. Эта унифицированная таблица определяет основные методологические компоненты, разделённые на отдельные разделы. Раздел A подробно описывает конфигурацию панелей антител, специфичных к болезни, в которых выбор CD73 или CD304 основан на исходном диагностическом иммунофенипе, связанном с лейкемией. Раздел B описывает стандартизированные цели для предварительной обработки образцов и цитометрического сбора потока. Раздел C определяет пороги отчётности, скорректированные с учётом знаменателя, наряду с критериями окончательной интерпретации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Основной целью данного исследования было создание стандартизированного рабочего процесса для многоцветной цитометрической оценки измеримого остаточного заболевания (МРД) при острой лейкемии. Надёжная оценка MRD зависит не только от выбора панели антител, но и от последовательного обращения с образцами, параметров сбора и интерпретации^{данных 11}. Результаты данного исследования показывают, что гармонизированная обработка образцов, контролируемая глубина сбора и критерии отчётности, скорректированные с учётом знаменателя, могут повысить аналитическую воспроизводимость в рутинных клинических лабораторных условиях. Эти результаты согласуются с недавними усилиями по стандартизации оценки потоковой цитометрической MRD среди различных учреждений и^{операторов 12}.

Важным элементом этого процесса является процедура объёмного лизиса эритроцитов на основе хлорида аммония. Обнаружение редких событий MRD требует получения крупных клеточных знаменателей для достижения достаточной аналитической чувствительности. Стандартизированная подготовка к объемному лизису позволила стабильно восстанавливать достаточное количество ядерных клеток, часто превышающее 1,0–1,5 миллиона приобретённых событий, при сохранении приемлемой жизнеспособности образцов. Предыдущие исследования консорциума EuroFlow также подчёркивали необходимость высокого обнаружения событий для поддержки чувствительного и воспроизводимого обнаружения MRD¹³. В образцах с низкооптимальной аналитической чувствительностью устранение неполадок должно включать оценку объёма образца, клеточного восстановления и глубины собрания.

Этот протокол также включает рутинную оценку гемодилюции перед интерпретацией низкоуровневых отрицательных результатов MRD. Гемодилюция остаётся важным преданалитическим ограничением в тестах МРД на основе костного мозга, поскольку периферическое загрязнение крови может искусственно снижать кажущуюся лейкемическую нагрузку. Включение полуколичественного балла гемодилюции напрямую в рабочий процесс отчётности обеспечивает дополнительную защиту от неправильного толкования как ложноотрицательного результата. Предыдущие исследования сообщали, что гемодилюция существенно влияет на надёжность анализа потоковой цитометрической МРД при остром миелоидном^{лейкозе 7}. Образцы, демонстрирующие значительную гемодилюцию (≥0,40), следует интерпретировать с осторожностью, особенно если глубина приобретения или сохранение предшественников костного мозга недостаточны.

Ортогональное сравнение, проведённое в этом исследовании, показало сильное общее согласование между методами оценки потоковой цитометрической и молекулярной MRD оценки. Однако разногласные случаи также подчёркивают, что проточная цитометрия и молекулярные анализы оценивают различные биологические аспекты остаточных заболеваний. Предыдущие исследования показали, что фенотипические сдвиги, клональная эволюция и регенеративный гемопоэз могут способствовать расхождениям между аналитическими^{платформами 14}. В B-ALL особенно сложно отличать остаточные лейкемические прекурсоры от обычных гематогонов при низких нагрузках на болезни и требует интегрированной интерпретации многомерных иммунофенотипических паттернов, а не изолированных антигенных^{аномалий 15}. По этой причине все случаи пограничного и низкоуровневого MRD в этом рабочем процессе независимо рассматривались вторым аналитиком.

У этого исследования есть несколько ограничений. Во-первых, валидация проводилась в одном учреждении с использованием ограниченного количества гармонизированных инструментов. Во-вторых, образцы периферической крови включались только в отдельных клинических ситуациях, поскольку они не могут заменить костный мозг для рутинной послелечебной оценки МРД в большинстве случаев острого лейкемии. Кроме того, некоторые аналитические параметры, включая оценку гемодилюции и интерпретацию событий низкого уровня, всё ещё требуют проверки опытного оператора, несмотря на стандартизированный рабочий процесс. Тем не менее, протокол предоставляет практическую основу для рутинной клинической реализации стандартизированной многоцветной цитометрической оценки MRD^16,17. Интегрируя преданалитическую оценку качества, гармонизированные стратегии приобретения и критерии интерпретации с учётом знаменателя, этот рабочий процесс обеспечивает более воспроизводимую и клинически согласованную отчётность MRD в рутинной лабораторной практике.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Буфер для получения данных	Лабораторный раствор	ПБС с 0,5% БСА и 2 мМ ЭДТА; конечный объем взвешивания 500 µL	Конечное взвешивание перед регистрацией в потоковом цитометре
Трубка AML 1 анти-CD117-APC антитело	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Клон: 104D2; флюоресцентный краситель: APC; объем окрашивания: 5 µL/тест в рутинной проверенной панели, если специфическая титрация антитела отличается	Ранняя идентификация миелоидных/бластов
Трубка AML 1 анти-CD13-FITC антитело	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Клон: L138; флюоресцентный краситель: FITC; объем окрашивания: 5 µL/тест в рутинной проверенной панели, если специфическая титрация антитела отличается	Якорь миелоидной линии
Трубка AML 1 анти-CD33-PE антитело	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Клон: P67.6; флюоресцентный краситель: PE; объем окрашивания: 5 µL/тест в рутинной проверенной панели, если специфическая титрация антитела отличается	Якорь миелоидной линии
Трубка AML 1 анти-CD34-PerCP-Cy5.5 антитело	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Клон: 8G12; флюоресцентный краситель: PerCP-Cy5.5; объем окрашивания: 5 µL/тест в рутинной проверенной панели, если специфическая титрация антитела отличается	Маркер незрелости
Трубка AML 1 анти-CD45-APC-H7 антитело	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Клон: 2D1; флюоресцентный краситель: APC-H7; объем окрашивания: 5 µL/тест в рутинной проверенной панели, если специфическая титрация антитела отличается	Маркер лейкоцитарного каркаса и определение знаменателя
Трубка AML 1 анти-CD56-V500 антитело	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Клон: NCAM16.2; флюоресцентный краситель: V500; объем окрашивания: 5 µL/тест в рутинной проверенной панели, если специфическая титрация антитела отличается	Аберрантное фенотипирование, связанное с бластами
Трубка AML 1 анти-CD7-V450 антитело	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Клон: M-T701; флюоресцентный краситель: V450; объем окрашивания: 5 µL/тест в рутинной проверенной панели, если специфическая титрация антитела отличается	Обнаружение межлинейной аберрации
Трубка AML 1 анти-HLA-DR-PE-Cy7 антитело	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Клон: G46-6; флюоресцентный краситель: PE-Cy7; объем окрашивания: 5 µL/тест в рутинной проверенной панели, если специфическая титрация антитела отличается	Дискриминация созревания и подтипов
Трубка AML 2 анти-CD117-APC антитело	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Клон: 104D2; флюоресцентный краситель: APC; объем окрашивания: 5 µL/тест в рутинной проверенной панели, если специфическая титрация антитела отличается	Ранняя идентификация миелоидных/бластов
Трубка AML 2 анти-CD11b-V450 антитело	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Клон: ICRF44; флюоресцентный краситель: V450; объем окрашивания: 5 µL/тест в рутинной проверенной панели, если специфическая титрация антитела отличается	Оценка дискордантности созревания
Трубка AML 2 анти-CD13-FITC антитело	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Клон: L138; флюоресцентный краситель: FITC; объем окрашивания: 5 µL/тест в рутинной проверенной панели, если специфическая титрация антитела отличается	Якорь миелоидной линии
Трубка AML 2 анти-CD15-V500 антитело	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Клон: HI98; флюоресцентный краситель: V500; объем окрашивания: 5 µL/тест в рутинной проверенной панели, если специфическая титрация антитела отличается	Оценка отличного от нормального миелоидного паттерна
Трубка AML 2 анти-CD33-PE антитело	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Клон: P67.6; флюоресцентный краситель: PE; объем окрашивания: 5 µL/тест в рутинной проверенной панели, если специфическая титрация антитела отличается	Якорь миелоидной линии
Трубка AML 2 анти-CD34-PerCP-Cy5.5 антитело	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman