Методическая статья

Липосомы, активируемые светом и рентгеновским излучением, для контролируемого редактирования генов и доставки лекарственных средств

92 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71788

⸱

14 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1EosGene Therapeutics Pty Ltd, 2School of Biomedical Engineering, University of New South Wales, 3Biomedical AI Centre, Centenary Institute and Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 4Centre for Vision Research, Department of Ophthalmology, and Westmead Institute for Medical Research, The University of Sydney, 5Department of Ophthalmology, Westmead Hospital, 6School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering and Information Technology (FEIT), University of Technology Sydney

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описаны методы изготовления липидных наночастиц с интегрированным вертепорфином, которые активируются видимым светом или рентгеновским излучением для пространственно-временного контролируемого доставки рибонуклеопротеинов CRISPR-Cas9 и химиотерапевтических агентов, что имеет потенциальное трансляционное значение для применения в офтальмологии и онкологии.

Аннотация

Фотодинамическая терапия (ФДТ) использует активацию фотосенсибилизаторов для генерации активных форм кислорода (АФК), главным образом синглетного кислорода. Помимо прямой цитотоксичности, эту фотохимическую реакцию можно использовать для высвобождения содержимого из липидных наносистем по запросу, что обеспечивает пространственно-временной контроль доставки терапевтических агентов, недоступный при использовании обычных липидных наночастиц. В данном протоколе представлены методы изготовления и характеристики двух различных составов липидных наночастиц с интегрированным вертепорфином (VP): (1) светочувствительных липосом, состоящих из DOTAP, DOPE, холестерина и VP, для доставки рибонуклеопротеиновых (RNP) комплексов CRISPR-Cas9; и (2) рентгеночувствительных липосом, состоящих из DOTAP, DOPC, VP и наночастиц золота, для контролируемого высвобождения химиотерапевтического препарата. При активации на длине волны 690 nm (видимый свет) или клиническим рентгеновским излучением (6 MeV), VP генерирует синглетный кислород, который окисляет ненасыщенные липидные компоненты, дестабилизируя мембрану наночастиц и высвобождая инкапсулированное содержимое. Приведены протоколы приготовления липосом методом гидратации тонкой пленки и экструзии мембран, физико-химического анализа, оценки высвобождения содержимого под воздействием света и рентгеновского излучения, нокаута генов in vitro в клетках человека, а также валидации in vivo с использованием количественной визуальной репортерной системы у zebrafish и модели ксенографтной опухоли у мышей. Репрезентативные результаты демонстрируют нокаут до приблизительно 326 волокон медленных мышц на один эмбрион zebrafish посредством световой активации и значительное подавление роста опухоли за счет рентгено-индуцированного высвобождения доксорубицина. Клинический прецедент активации вертепорфина на длине волны 689–690 nm в глазу обосновывает оценку данной платформы для офтальмологической доставки, хотя биораспределение в сетчатке, фармакокинетика и безопасность на крупных животных еще должны быть установлены. Эти методы представляют собой экспериментальный подход с трансляционным потенциалом для внешне контролируемого высвобождения терапевтического содержимого. 

Введение

Липидные наночастицы (ЛНЧ) стали наиболее клинически подтвержденной невирусной платформой доставки терапевтических нуклеиновых кислот, что было продемонстрировано при их использовании в мРНК-вакцинах против COVID-191. Однако традиционные ЛНЧ высвобождают свой груз после захвата клеткой посредством эндосомального выхода, что не обеспечивает внешнего контроля над временем, местом или объемом доставки полезной нагрузки2. Отсутствие пространственно-временного контроля ограничивает их применение в тех случаях, когда точное высвобождение по требованию дает терапевтическое преимущество, включая сайт-специфическое редактирование генов, таргетную химиотерапию гетерогенных опухолей и титрованный сайленсинг генов в анатомически доступных органах, таких как глаза3,4.

Фотодинамическая терапия (ФДТ) представляет собой хорошо изученный механизм для внешнего запуска биологических эффектов. При активации на определенных длинах волн фотосенсибилизаторы генерируют синглетный кислород (1O2) и другие активные формы кислорода (АФК), которые могут окислять близлежащие биомолекулы5. Вертепорфин (VP), производное бензопорфирина, одобренное для клинического применения под торговым названием Visudyne для фотодинамического лечения субфовеальной хориоидальной неоваскуляризации при возрастной макулярной дегенерации (ВМД), особенно подходит в качестве компонента фотосенсибилизатора для наночастиц6. В клинической практике VP активируется при 689 nm для офтальмологической фотодинамической терапии, что создает основу для established-методов доставки света в глаз6,7,8. VP примерно в четыре раза более фотодинамически активен, чем производные гематопорфирина первого поколения, на проникающих в ткани длинах волн6.

Эта двойная функциональность, при которой VP одновременно выступает в качестве клинически одобренного фотосенсибилизатора и светочувствительного триггера для высвобождения содержимого наночастиц, формирует механистическую основу описанных здесь протоколов. При интеграции в липидный бислой в низких молярных соотношениях VP при освещении генерирует 1O2, который, согласно имеющимся литературным данным, окисляет ненасыщенные ацильные цепи фосфолипидов, дестабилизируя мембрану и высвобождая инкапсулированное содержимое9. Короткий радиус диффузии 1O2 (~20 nm в биологических средах) ограничивает дестабилизацию мембраны непосредственной близостью к фотосенсибилизатору, что сводит к минимуму повреждение содержимого при эффективном разрушении бислоя9,10. Кроме того, модальность рентгеновской активации преодолевает ограничение глубины проникновения видимого света в ткани. При совместном встраивании золотых наночастиц (3–5 nm) в липидный бислой клиническое рентгеновское облучение (6 MeV) усиливает активацию VP посредством переноса энергии, опосредованного Оже-электронами, что расширяет возможность применения метода для глубоко расположенных опухолей11,12. Прямые измерения синглетного кислорода с использованием Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) подтверждают, что генерация 1O2 увеличивается с дозой рентгеновского излучения и возрастает примерно в 1,4 раза при совместной загрузке золотых наночастиц по сравнению с использованием только VP11.

Данная платформа имеет особое трансляционное значение для офтальмологической генной терапии. Современные методы лечения неоваскулярной ВМД с использованием анти-VEGF препаратов требуют частых интравитреальных инъекций, при этом в реальной клинической практике результаты ухудшаются из-за хронического недостаточного лечения13,14. В то же время появляющиеся методы генной терапии на основе AAV снижают эту нагрузку, но обеспечивают конститутивную экспрессию анти-VEGF15,16, вследствие чего их невозможно титровать или отменить, что вызывает опасения ввиду связи между длительным подавлением VEGF и развитием географической атрофии, ишемией сетчатки и фиброзом17,18. Подход на основе CRISPR с использованием VP-липосом, активируемый светом, может вместо этого обеспечить контролируемый врачом, пространственно ограниченный нокаут VEGF-A, предоставляя возможность пространственного и временного регулирования первичного события редактирования при сохранении долговечности генного редактирования. Тот же принцип высвобождения по триггеру применим к дистрофиям сетчатки, вызванным мутациями в крупных генах, таким как болезнь Штаргардта (ABCA4)19,20, а также к увеальной меланоме, где конвергентные механизмы VP хорошо соответствуют биологии опухоли21,22.

Общая цель данного протокола — предоставить комплексные, воспроизводимые методы изготовления липидных наночастиц с интегрированным VP, используя два различных состава: один, активируемый видимым светом (690 nm), и другой — рентгеновским излучением, а также для оценки эффективности доставки в модельных системах in vitro и in vivo. Поскольку эти составы различаются по липидному составу, стратегии загрузки полезного груза и способу активации, они представлены в виде отдельных протоколов. Данный протокол предназначен для исследователей, изучающих платформы наночастиц с управляемым высвобождением, стратегии доставки на основе PDT, пространственно-временной контролируемый редактив genes, а также светоактивируемую доставку лекарственных препаратов при офтальмологических и онкологических заболеваниях.

Протокол

Все эксперименты на животных с использованием zebrafish проводились в стандартных условиях в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по этике исследований животных Университета Маккуори (ARA: 2015-034). Эксперименты по созданию ксенотрансплантатов у мышей проводились в соответствии с требованиями Комитета по этике работы с животными Университета Маккуори (одобрение № 2017/001). Все процедуры были выполнены в соответствии с Законом о исследованиях животных 1985 года и Положением об исследованиях животных 2010 года.

Часть А: Светоактивируемые VP-липосомы для доставки CRISPR-Cas9 (на основе работы Aksoy et al.9)

1. Приготовление светочувствительных VP-липосом, инкапсулирующих CRISPR-Cas9 РНП

  1. Растворите DOTAP, DOPE, холестерин (Chol) и VP в 500 µL хлороформа в молярном соотношении 1:0,94:1:0,06 в стеклянной круглодонной колбе9.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Хлороформ токсичен и летуч. Выполняйте все этапы работы с хлороформом в вытяжном шкафу, используя соответствующие средства индивидуальной защиты, включая нитриловые перчатки и защитные очки.
  2. Испарите хлороформ в потоке аргона до образования тонкой липидной пленки на стенках колбы.
  3. Поместите колбу в вакуум (например, в лиофилизатор или эксикатор, подключенный к вакуумному насосу) на ночь (≥12 ч) для полного удаления остатков растворителя.
  4. Приготовьте раствор для гидратации, смешав sgRNA (конечная концентрация 0,01 µM) и белок Cas9 (конечная концентрация 0,1 mg/mL) в 500 µL воды, свободной от нуклеаз. Перед гидратацией предварительно инкубируйте sgRNA и Cas9 при комнатной температуре в течение 5 мин для формирования комплекса рибонуклеопротеина (RNP).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Комплекс RNP загружается на этапе гидратации, а не добавляется после формирования липосом. Это обеспечивает его инкапсуляцию в водном ядре липосомы.
  5. Гидратируйте высушенную липидную пленку, добавив 500 µL раствора RNP непосредственно на пленку, и перемешивайте до гомогенизации суспензии. Оставьте гидратированную липидную суспензию на 2 ч при комнатной температуре для полной гидратации липидов.
  6. Пропустите полученную мультиламеллярную суспензию через поликарбонатную мембрану с размером пор 200 nm 11 раз с помощью мини-экструдера для получения одноламеллярных липосом однородного размера9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данной рецептуре для уменьшения размера используется экструзия, а не соникация. Пропускайте суспензию через мембрану нечетное количество раз (11), чтобы конечный продукт находился с противоположной стороны мембраны по отношению к исходному материалу, что снижает загрязнение неэкструдированными везикулами.
  7. Храните VP-липосомы при 4°C в защищенном от света месте. Для достижения оптимальной активности используйте их в течение 48 ч после приготовления. Этот 48-часовой срок службы является консервативной оценкой: высвобождение VP в 10% FBS остается ниже 3% в течение 96 ч9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для применения in vitro и in vivo готовьте и обрабатывайте липосомы, используя стандартные методы асептики, и стерилизуйте конечную суспензию путем пропускания через фильтр с размером пор 0,22 µm перед использованием.

2. Физико-химическая характеристика VP-липосом

  1. Разбавьте суспензию липосом 1:100 в воде, свободной от нуклеаз. Измерьте гидродинамический диаметр, индекс полидисперсности (PDI) и дзета-потенциал методом динамического рассеяния света (DLS). Выполните все измерения DLS в трех повторностях (n = 3 технического повтора) для каждого образца и представьте значения как среднее значение ± стандартное отклонение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемые характеристики успешной рецептуры части А: гидродинамический диаметр 167.5 ± 1.9 nm, PDI < 0.3, дзета-потенциал +28 ± 1.1 mV и эффективность инкапсуляции Cas9 примерно 75.09%. Типичные физико-химические характеристики успешных рецептур обобщены в Таблице 1.9
  2. Для просвечивающей электронной микроскопии (TEM) нанесите 10 µL разбавленной суспензии липосом на медную сетку с углеродным покрытием. Окрасьте 2% раствором ацетата уранила в течение 20 s. Снимите изображения при 100 kV9, получив не менее 10 репрезентативных снимков для каждой партии.
ПараметрЧасть A: VP-липосома
(активируемая светом)		Часть B: VP/AuNP-липосома
(активируемая рентгеновским излучением)
Гидродинамический диаметр167.5 ± 1.9 nm~100–150 nm
Индекс полидисперсности (PDI)<0.3< 0.3 (типичное значение)
Зета-потенциал+28 ± 1.1 mVПоложительный (на основе DOTAP)
Эффективность инкапсуляцииCas9 RNP: 75.09%Доксорубицин: дистанционная загрузка с использованием сульфата аммония; количественное определение после лизиса с 0.1% Triton X-100
Загрузка наночастиц золотаНеприменимо156 ± 24 AuNPs на липосому (ИСП-МС)
Стабильность высвобождения груза<3% высвобождения VP в течение 96 h в 10% FBSСтабильно в течение 48 h при концентрациях 0%, 10%, 25% и 50% FBS и при pH 7.4, 6.0 и 5.0
Условие активацииОблучение светодиодом (LED) 690 nm, 0.15 mW/cm²Клиническое рентгеновское облучение 6 MeV
Основной грузКомплекс CRISPR-Cas9 RNPДоксорубицин
Метод активацииВидимый светРентгеновское излучение
Предполагаемое применениеСтимулированное редактирование геновСтимулированное высвобождение химиотерапевтического препарата

Таблица 1: Физико-химические характеристики и профили стабильности двух составов липосом с вертепорфином (VP). Репрезентативные характеристики состава, параметры загрузки, профили стабильности и условия активации для состава VP-липосом с воздействием света (Часть А) и состава VP/AuNP-липосом с воздействием рентгеновского излучения (Часть Б). Эти значения представляют собой ожидаемые контрольные показатели качества для успешного приготовления и характеристики состава и могут использоваться в качестве эталонных критериев при воспроизведении описанных здесь протоколов.

3. Светоиндуцированное высвобождение груза и измерение содержания синглетного кислорода

  1. Для проведения анализов высвобождения, инициируемого светом, приготовьте VP-липосомы, используя тот же липидный состав и протокол гидратации/экструзии. Перенесите 100 µL суспензии липосом в PBS в диализное устройство, помещенное в 12 mL PBS при перемешивании со скоростью 80 rpm.
  2. Облучайте образцы светодиодным источником света с длиной волны 690 nm при интенсивности 0,15 mW/cm2 в течение заданных интервалов (2, 4 и 6 мин)9.
  3. Отбирайте пробы внешнего диализата через 0, 1, 3, 6 и 24 ч, и количественно определяйте высвобожденный VP методом флуоресценции; определите общее количество VP, лизировав эквивалентную аликвоту 0,1% Triton X-100.
  4. Рассчитайте высвобождение VP по формуле Rvp (%) = (Ft − F0)/(Fmax − F0) × 100, где Ft, F0 и Fmax — значения флуоресценции в момент времени t, на базовом уровне и после лизиса Triton соответственно (n = 3).
  5. Подтвердите дестабилизацию мембраны, измерив изменение гидродинамического диаметра методом DLS до и после облучения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение всего процесса приготовления и хранения защищайте все образцы, содержащие VP, от воздействия окружающего света. Используйте янтарные пробирки или обертывание алюминиевой фольгой.

4. Анализ трансфекции in vitro и нокаута генов

  1. Рассейте клетки HEK293-GFP (или эквивалентную репортерную линию) в 96-луночные планшеты с плотностью, обеспечивающей примерно 70% конфлюэнтности к моменту обработки. Культивируйте клетки в полной среде (DMEM + 10% FBS + 1% пенициллина–стрептомицина) при 37°C и 5% CO2.
  2. Добавьте в лунки VP-липосомы, инкапсулирующие комплекс sgRNA/Cas9 RNP против GFP, в концентрации 50 ug/mL. Для анализа методом флуоресцентной микроскопии инкубируйте в течение 2 h; для анализа методом проточной цитометрии инкубируйте в течение 1 h.
  3. Замените среду на свежую полную среду. Облучайте обработанные лунки LED-светом с длиной волны 690 nm при интенсивности 0.15 mW/cm2. Для анализа методом флуоресцентной микроскопии облучайте в течение 2, 4 или 6 min; для анализа методом проточной цитометрии облучайте в течение 4 min. Включите темные контроли (липосомы без облучения) и контроли только светом (облучение без липосом).
  4. Оцените нокаут GFP через 48 h после обработки с помощью флуоресцентной микроскопии или проточной цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гидовые РНК должны быть валидированы перед использованием. В исходном исследовании кандидатные гиды eGFP были проверены на эффективность разрезания с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP), и выбранный гид (sg_eGFP_06) обеспечил эффективность разрезания 88.24%. Риск нецелевого воздействия был минимизирован in silico путем подтверждения уникальности гида (BLASTN по референсному геному с использованием Bowtie/Bowtie2, без допуска несовпадений в первых десяти основаниях с 3’-конца). Полногеномное секвенирование на предмет нецелевого воздействия не проводилось; этот этап рекомендуется для терапевтического применения9.
  5. Для измерения эффективности инкапсуляции центрифугируйте образец липосом при 15,000 rpm в течение 1 h при 4 °C, после чего профильтруйте супернатант через шприцевой фильтр Whatman Anotop 10 с размером пор 20 nm.
  6. Количественно определите свободный (неинкапсулированный) Cas9 в фильтрате с помощью BCA-анализа белков.
  7. Рассчитайте эффективность инкапсуляции по формуле EE (%) = [(Ctot − Csup) / Ctot] × 100, где Ctot — общее количество добавленного Cas9, а Csup — количество неинкапсулированного Cas9, выделенного из супернатанта. Типичные показатели эффективности состава и ожидаемые значения эффективности инкапсуляции приведены в Таблице 1.

5. Валидация in vivo: анализ визуального репортера на zebrafish

  1. Подготовьте основную смесь (MasterMix) для инъекций, объединив VP-липосомы, инкапсулирующие таргетную sgRNA для eGFP и белок Cas9, в соотношениях, указанных в оригинальном протоколе9. Итоговая смесь объемом 8 uL содержит 3.5 uL sgRNA (75 ng/uL), 1.0 uL белка Cas9 (500 ng/uL), 2.5 uL VP-липосом и 1.0 uL фенолового красного. Для контрольной смеси замените 2.5 uL липосом на воду, свободную от нуклеаз.
  2. Микроинъектируйте 2 nL основной смеси в клетку (не в желток) эмбрионов данио-рерио (zebrafish) на стадии одной клетки, используя откалиброванную систему для микроинъекций9.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Все работы с данио-рерио должны проводиться в соответствии с утвержденными протоколами по этике обращения с животными. Обращайтесь с эмбрионами осторожно, чтобы свести к минимуму механические повреждения при инъекции.
  3. Через 2 часа после оплодотворения (hpf) облучите инъектированные эмбрионы LED-светом с длиной волны 690 nm при интенсивности 0.15 mW/cm2 в течение заданного времени (например, 0, 1, 2 и 5 мин) для активации высвобождения содержимого9.
  4. Через 72 hpf анестезируйте эмбрионы в растворе трикаина и зафиксируйте их в 1% низкоплавком агарозе. Используя трансгенную репортерную линию smyhc1:eGFP, количественно оцените нокаут медленных мышечных волокон по исчезновению флуоресценции eGFP с помощью инвертированного флуоресцентного и конфокального микроскопов.
  5. Получите изображения с объединением фокуса (focus-stacked images) и подсчитайте количество eGFP-отрицательных (нокаутированных) медленных мышечных волокон на один эмбрион, анализируя обычно по 16 эмбрионов в группе (например, в программе Imaris)9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данный анализ обеспечивает количественную визуальную оценку эффективности нокаута гена. В репортерной линии smyhc1:eGFP медленные мышечные волокна в норме являются eGFP-положительными; успешный нокаут регистрируется как потеря флуоресценции eGFP в этих волокнах9.

Часть B: VP-липосомы, активируемые рентгеновским излучением, для доставки химиотерапевтических препаратов (на основе работы Deng et al.11)

6. Приготовление рентгеновски-активируемых липосом VP/AuNP, нагруженных доксорубицином

  1. Смешайте 350 µL DOTAP (100 mg/mL в хлороформе) и 370 µL DOPC (100 mg/mL в хлороформе) в стеклянной круглодонной колбе и доведите общий объем до 1.0 mL хлороформом11.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В части B используется DOPC (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин), а не DOPE. Эти две формуляции различаются по вспомогательному липиду, и данное различие критически важно для воспроизводимости.
  2. Добавьте 50 µL VP (2.3 mg/mL в DMSO) и 40 µL суспензии наночастиц золота (диаметром 3–5 nm) в липидную смесь. Это дает примерно 156 ± 24 наночастицы золота на одну липосому, согласно количественному анализу методом ICP-MS11.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наночастицы золота должны иметь диаметр 3–5 nm, чтобы встроиться в липидный бислой. Более крупные частицы (например, 50 nm) не будут встраиваться в мембрану и не обеспечат перенос энергии Оже-электронов, необходимый для рентгеновской активации11.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная здесь базовая формуляция является нетаргетной. В исходном исследовании была введена опциональная модификация для активного таргетинга путем посто insertions DSPE-PEG2000-Folate для направления липосом к опухолевым клеткам, экспрессирующим фолатные рецепторы; этот этап может быть добавлен без изменения основного механизма высвобождения VP/AuNP11.
  3. Испарите хлороформ в токе аргона и высушите под вакуумом в течение ночи, как описано в шагах 1.2–1.3.
  4. Гидратируйте липидную пленку 1.0 mL 250 mM сульфатного буфера аммония (pH 5.5). Перемешайте на вортексе, оставьте гидратированную суспензию на ночь, затем проведите экструзию 11 раз через поликарбонатную мембрану с порами 200 nm11.
  5. Удалите свободный сульфат аммония путем диализа против PBS (pH 7.4) при 4 C с четырехкратной сменой буфера для создания трансмембранного градиента сульфата аммония.
  6. Загрузите доксорубицин (Dox), инкубируя диализованные липосомы при соотношении лекарственного средства к липиду по массе 1:10 при 60°C в течение 1 ч11. Градиент сульфата аммония способствует накоплению Dox внутри липосом.
  7. Удалите неинкапсулированный Dox путем диализа против PBS при 4 C с четырехкратной сменой буфера.
  8. Охарактеризуйте загруженные липосомы методом DLS (ожидаемый размер: ~100–150 nm) и измерьте эффективность инкапсуляции,  лизируя липосомы 0.1% Triton X-100 и количественно определяя флуоресценцию Dox (возбуждение 485 nm, эмиссия 590 nm).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Успешные формуляции в части B обычно имеют гидродинамический диаметр примерно 100–150 nm, PDI < 0.3 и встраивание примерно 156 ± 24 наночастиц золота на липосому. Репрезентативные физико-химические характеристики обобщены в Таблице 1.11

7. Рентгеновское высвобождение лекарственного средства и цитотоксичность in vitro

  1. Облучите липосомы VP/AuNP, нагруженные кальцеином, с помощью клинического линейного ускорителя (фотонный пучок 6 MeV) при заданных дозах (1, 2 и 4 Gy)11. Определите количество высвобожденного содержимого путем измерения флуоресценции кальцеина (возбуждение 485 nm, эмиссия 510 nm) и установите общее высвобождение после разрушения липосом с помощью 0,1% Triton X-100."
  2. Для проведения анализов на цитотоксичность высейте клетки колоректального рака человека линии HCT116 в 96-луночные планшеты (например, 2 × 104 клеток/mL в 10% FBS).
  3. Обработайте клетки липосомами VP/AuNP, нагруженными доксорубицином (Dox), и облучите рентгеновскими лучами, как описано выше, включая контроли: только LipoDox, только рентгеновское облучение и необработанные клетки. Оцените жизнеспособность клеток с помощью МТС-теста через 0, 2, 4 и 24 ч после облучения дозой 4 Gy11.

8. Валидация in vivo: модель ксенографтов опухоли у мышей

  1. Осуществите подкожную инокуляцию в область flancs самок мышей BALB/c nude в возрасте 6–7 недель, введя 5 × 106 клеток HCT116 в 100 µL безсывороточной среды McCoy’s 5A11.
  2. Когда объем опухолей достигнет ~100 mm3, введите внутриопухолево липосомы VP/AuNP, нагруженные Dox (в эквиваленте 10 mg/kg Dox), в объеме 20 µL11.
  3. Через 24 ч после инъекции облучите опухоли рентгеновским излучением дозой 4 Gy (6 MeV) с использованием клинического линейного ускорителя при соответствующем экранировании нецелевых тканей.
  4. Контролируйте объем опухоли каждые 2 дня с помощью цифрового штангенциркуля. Рассчитывайте объем опухоли по формуле V = (π/6) × L × W2, где L — наибольший размер, а W — перпендикулярная ширина11.
  5. По завершении эксперимента удалите опухоли, зафиксируйте их в 10% нейтрально-буферном формалине и подготовьте криосрезы толщиной 6 µm для гистологического анализа (окрашивание H&E)11.

9. Статистический анализ

  1. Количественные данные представлены в виде среднего значения ± стандартного отклонения (SD), если не указано иное.
  2. Статистический анализ исследований по нокауту генов у zebrafish проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), в то время как сравнения между двумя группами анализировали с помощью двухстороннего t-критерия Стьюдента. Пожалуйста, предоставьте текст для перевода.—тест, как указано в исходных исследованиях. Статистическая значимость определялась как p < 0.05.
  3. Для исследований липосом, активируемых рентгеновским излучением, наборы данных по росту опухоли, массе тела, высвобождению груза и гистологическому анализу обрабатывали с помощью критерия Стьюдента t—тесты, описанные в оригинальной публикации.
  4. Определение н для каждого эксперимента приведено в соответствующих подписях к рисункам.
  5. Статистический анализ проводили с использованием программы GraphPad Prism версии 7.0 (GraphPad Software).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе воспроизведены экспериментальные рабочие процессы и репрезентативные наборы данных из ранее опубликованных исследований. Для получения полной информации о деталях статистического анализа читателям следует обратиться к оригинальным публикациям, где это применимо.9,11.

Результаты

Светоиндуцированное редактирование генов (Часть А):

В соответствии с протоколом части A, VP-липосомы, инкапсулирующие РНП CRISPR-Cas9, продемонстрировали светозависимое высвобождение груза. В темноте наблюдалось минимальное высвобождение, тогда как облучение при 690 nm (0.15 mW/cm2) вызывало дозозависимое высвобождение, которое увеличивалось с временем освещения (Рисунок 1A)9. Репортерный анализ eGFP на эмбрионах zebrafish обеспечил количественную визуальную оценку эффективности нокаута гена. У светоактивированных эмбрионов наблюдался нокаут 308.37 ± 40.21 eGFP-положительных волокон медленной мускулатуры на эмбрион по сравнению с 53.15 ± 35.38 волокнами в контроле в темноте (n = 80), с увеличением до 326.12 ± 36.55 волокон после 5 min облучения (n = 60) (Рисунок 1B,C)9. In vitro светоактивированные VP-липосомы обеспечили нокдаун GFP, сопоставимый с показателями Lipofectamine 2000 (снижение примерно на 53% против 50%), при этом обеспечивая уникальный светозависимый пространственно-временной контроль (Рисунок 1C)9. Эти результаты демонстрируют пространственно-временной контроль, поскольку одна и та же формуляция наночастиц обеспечивала заметно разную эффективность нокаута в зависимости от воздействия света (Рисунок 1A–C).

Метод фотохимического редактирования генов; CRISPR-Cas9, индуцированный светодиодным излучением, флуоресцентная микроскопия, экспериментальные результаты, измерение интенсивности.
Рисунок 1. Светоиндуцированная доставка CRISPR-Cas9 и пространственно-временный нокаут генов в эмбрионах данио-рерио. (A) Схематическое изображение липосом с вертепорфином (VP) (DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0.94:1:0.06), инкапсулирующих рибонуклеопротеиновые (RNP) комплексы Cas9/sgRNA. При облучении светом с длиной волны 690 nm VP генерирует активные формы кислорода, которые дестабилизируют липосомальную мембрану и инициируют внутриклеточное высвобождение груза CRISPR-Cas9. (B) Репрезентативные изображения флуоресценции эмбрионов данио-рерио smyhc1:eGFP через 72 ч после оплодотворения (hpf) после обработки VP-липосомами и воздействия света различной продолжительности (0, 1, 2 и 5 мин; 690 nm, 0.15 mW/cm2). Исчезновение флуоресценции eGFP указывает на нокаут волокон медленных мышц. На врезках показаны увеличенные изображения областей, выделенных рамками. (C) Количественная оценка интенсивности флуоресценции и количества нокаутированных волокон медленных мышц на один эмбрион, демонстрирующая светозависимую активацию CRISPR-Cas9 и нокаут генов. Данные представлены как среднее значение ± SD. Эксперименты на данио-рерио анализировались с помощью однофакторного ANOVA (n = 80 эмбрионов для измерений интенсивности флуоресценции и n = 60 эмбрионов для анализа количества волокон; p < 0.0001). Валидационные эксперименты на HEK293-GFP анализировались с помощью двухстороннего t-критерия (n = 4). Масштабные отрезки = 500 µm (общие изображения) и 100 µm (увеличенные изображения). Адаптировано с разрешения Aksoy et al.9 Copyright © 2020 American Chemical Society. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Субоптимальные результаты в анализе на zebrafish могут включать следующее: (а) менее 50 разрушенных волокон на эмбрион, что указывает на низкое качество липосом, недостаточную активность Cas9 или субоптимальную дозу света; (б) смертность эмбрионов, превышающая 20%, что свидетельствует о механическом повреждении при микроинъекции или чрезмерной фототоксичности VP; или (в) разрушение волокон в необлученных контрольных образцах, что указывает на преждевременную утечку содержимого из липосомальной формуляции.

Рентгеновски-индуцированная доставка лекарств (Часть Б):

Липосомы VP/AuNP, приготовленные в соответствии с протоколом части B, продемонстрировали дозозависимое высвобождение кальцеина при облучении в диапазоне 1–4 Gy (Рисунок 2A,B)11. В модели ксенографта HCT116 у мышей, получавших нагруженные Dox липосомы VP/AuNP с последующим рентгеновским облучением в дозе 4 Gy, наблюдалось значительное подавление роста опухоли по сравнению с группами контроля, получавшими свободный Dox, только рентгеновское облучение или необлученные липосомы (Рисунок 2C)11. Гистологический анализ срезов опухоли, выполненный с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (H&E), выявил более обширные зоны некроза в группе комбинированной терапии (Рисунок 2D).

Терапия рака с использованием липосом, нацеленных рентгеновским излучением; графики высвобождения кальцеина, размера опухоли, анализ некроза.
Рисунок 2. Рентгеновское воздействие для высвобождения доксорубицина и подавления роста опухоли. (A) Схематическое изображение липосом, содержащих доксорубицин (Dox) и интегрированные вертепорфин (VP) с наночастицами золота (AuNP). Воздействие рентгеновского излучения активирует VP посредством переноса энергии, опосредованного AuNP, что приводит к генерации синглетного кислорода, который дестабилизирует липидный бислой и инициирует высвобождение содержимого. (B) Профили высвобождения кальцеина из липосом при воздействии возрастающих доз рентгеновского излучения (0–4 Gy), демонстрирующие дозозависимое высвобождение содержимого из VP/AuNP-липосом. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение по четырем измерениям. (C) Измерения объема опухоли (слева) и массы тела (справа) у мышей с ксенографтами HCT116, получавших PBS, LipoDox, только рентгеновское облучение или LipoDox с рентгеновским воздействием. Данные представлены как среднее значение ± SD (n = 4 мыши в группе). Статистическая значимость оценивалась с помощью t-критерия (P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001). (D) Репрезентативные срезы опухоли, окрашенные гематоксилином и эозином (H&E), и морфометрический анализ средней площади некроза опухоли. Стрелками указаны типичные области некроза. Диаграммы размаха («ящики с усами») показывают медиану и межквартильный размах, где усы extending до 1.5 × IQR. Данные анализировались с использованием t-критерия (n = 5). Масштабная линейка = 50 µm. Адаптировано из Deng et al.11 на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Субоптимальные результаты в модели ксенографта могут включать: (а) отсутствие различий в росте опухоли между облученными и необлученными группами липосом, что указывает на недостаточный высвобождаемый за счет VP объем или недостаточное включение золотых наночастиц; или (б) системную токсичность (потеря веса > 15%), что свидетельствует об утечке Dox из липосом до рентгеновской активации.

Обсуждение

Несколько этапов в данных протоколах имеют решающее значение для успеха. В части А необходимо точно соблюдать молярное соотношение липидов (DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0.94:1:0.06), так как концентрация VP напрямую определяет интенсивность генерации 1O2 и, следовательно, эффективность высвобождения груза9. Для инкапсуляции в водное ядро крайне важно вводить РНП Cas9/sgRNA на этапе гидратации, а не путем комплексообразования после формирования везикул. Экструзия через поликарбонатную мембрану с размером пор 200 nm (11 проходов) позволяет получить однородные униламеллярные везикулы; соникацию использовать нельзя, так как она может привести к денатурации белка Cas9. В части B критически важен размер золотых наночастиц (3–5 nm), поскольку частицы должны быть достаточно малыми, чтобы встроиться в липидный бислой для эффективного переноса энергии на VP за счет испускания электронов Оже при рентгеновском облучении11. Метод с градиентом сульфата аммония, используемый для загрузки Dox, требует полного диализа внешнего сульфата аммония перед добавлением препарата; неполный диализ приведет к снижению эффективности загрузки.

Липидный состав может быть адаптирован для различных целей применения при сохранении механизма высвобождения, опосредованного VP. Например, замена части DOTAP ПЭГилированным липидом (например, DSPE-PEG2000 в концентрации 5 mol%) может увеличить время циркуляции при системном введении, хотя это приведет к снижению положительного поверхностного заряда и может уменьшить клеточный захват in vitro2. Если измерения DLS показывают PDI > 0,3, увеличьте количество циклов экструзии или проверьте целостность мембраны. Если генерация синглетного кислорода низка, несмотря на правильное включение VP, проверьте длину волны и плотность мощности светодиодного источника света с помощью откалиброванного измерителя мощности, так как активация VP зависит от длины волны (пик возбуждения на 425 nm для полосы Соре и терапевтическая активация на 689–690 nm для Q-полосы)9. Для анализа на zebrafish, если смертность эмбрионов в обработанных группах превышает 20%, уменьшите объем инъекции или концентрацию липосом, чтобы минимизировать фототоксичность, связанную с VP. Структурированная схема поиска и устранения неисправностей, основанная на контрольных показателях из таблицы 1, выглядит следующим образом. PDI > 0,3: увеличьте количество циклов экструзии и проверьте целостность мембраны. Низкое или отсутствующее индуцированное высвобождение при правильном включении VP: подтвердите выход на 690 nm с помощью откалиброванного измерителя мощности и проверьте молярное соотношение VP. Менее ~50 нокаутированных медленных мышечных волокон на эмбрион: повторно синтезируйте липосомы, подтвердите активность RNP или увеличьте время облучения. Потеря сигнала eGFP в необлученных контрольных группах: проверьте условия хранения, используя липосомы в течение 48 h после приготовления и храня их при 4°C в темноте, а также подтвердите стабильность мембраны. В модели ксенограф отсутствие разницы между группами с облученными и необлученными липосомами указывает на необходимость подтверждения встраивания золотых наночастиц размером 3–5 nm и проверки доставленной дозы рентгеновского излучения.

Основным ограничением метода активации светом (Часть A) является глубина проникновения света с длиной волны 690 nm, что ограничивает прямую активацию поверхностно доступными тканями или теми, где возможна доставка света с помощью оптоволокна5. Метод активации рентгеновским излучением (Часть B) преодолевает это ограничение по глубине, но требует доступа к клиническому линейному ускорителю и подвергает окружающие ткани воздействию ионизирующего излучения, хотя и в терапевтических дозах11,12. Обе формуляции в настоящее время основаны на DOTAP — катионном липиде, обладающем дозозависимой цитотоксичностью, что может ограничить терапевтическое окно при системном введении2. Транзиторный характер редактирования генов с помощью RNP благоприятен с точки зрения безопасности, однако это означает, что неполный нокаут в целевой популяции клеток нельзя усилить повторным введением препарата в ту же область без повторного введения наночастиц. Кроме того, данные протоколы были валидированы на клеточных линиях и моделях мелких животных; перенос на модели более крупных животных и, в конечном счете, на клиническое применение у людей потребует оптимизации состава, фармакокинетических исследований и формальной токсикологической оценки в условиях GLP. В частности, данный протокол не включает данные по фармакокинетике, биораспределению или проникновению в сетчатку. Хотя проникновение света через ткани глаза и другие ткани хорошо описано в литературе как зависящее от длины волны, пигментации и типа ткани (и может быть усилено с помощью средств оптического просветления), количественные исследования фармакокинетики, биораспределения и доставки в сетчатку остаются важными последующими этапами, прежде чем можно будет обосновать заявления о трансляционном потенциале.

Традиционные системы LNP, включая используемые в мРНК-вакцинах, высвобождают содержимое пассивно при поглощении клеткой через эндосомальный выход и не обеспечивают временного или пространственного контроля за доставкой1,2. Вирусные векторы, такие как AAV, обеспечивают эффективную доставку генов, но ограничены емкостью упаковки (~4.7 kb), иммуногенностью при повторном введении и конститутивной экспрессией трансгена, которая не может быть модулирована после введения3. Платформа VP-липосом устраняет эти ограничения, предоставляя механизм высвобождения с внешним управлением, который не зависит от типа содержимого, совместим с большими нагрузками (белками, RNP-комплексами и малыми молекулами), является невирусным и потенциально совместимым с повторным введением, что должно быть подтверждено исследованиями иммуногенности и токсичности при повторном дозировании. В отличие от оптогенетических или термочувствительных систем, подход на основе VP использует клинически одобренный фотосенсибилизатор с установленными данными по безопасности и существующей клинической лазерной инфраструктурой, особенно в офтальмологии, где лазер Visudyne с длиной волны 689 nm уже является стандартным оборудованием6. Sang и соавт. дополнительно продемонстрировали, что гибридные липидно-полимерные наночастицы, содержащие VP, повышают эффективность радиодинамической терапии в моделях колоректального рака, подтверждая адаптивность генерации ROS с помощью VP в различных архитектурах наночастиц12.

Описанные здесь методы имеют особое значение для трех офтальмологических состояний. При неоваскулярной ВМД основным препятствием на пути к оптимальным результатам остается необходимость частых инъекций анти-VEGF препаратов. Данные реальных регистров свидетельствуют о выраженной недостаточности лечения по сравнению с протоколами клинических исследований (в среднем 7,3 против 12 инъекций в первый год, при этом 38,8% пациентов прекращают лечение, а прирост остроты зрения минимален)14, а также о долгосрочном снижении зрения, несмотря на частые дозировки23. Разрабатываемые методы генной терапии на основе AAV для снижения этой нагрузки — иксобероген соропарвовец15, ABBV-RGX-31416 и получивший статус RMAT препарат 4D-150 (снижение количества инъекций на 83%)24 — тем не менее обеспечивают конститутивную экспрессию анти-VEGF трансгенов, что делает невозможным их титрование или отмену. Это вызывает определенные опасения, учитывая данные, связывающие постоянное подавление VEGF с развитием географической атрофии (CATT17; метаанализ по 4 609 глазам18; и рост распространенности атрофии до 78,3% в течение восьми лет25). Система VP-липосом, активируемая светом и несущая CRISPR-Cas9 для таргетирования VEGF-A, могла бы вместо этого обеспечить пространственно ограниченный нокаут гена, позволяя клиницисту контролировать пространственные и временные параметры первичного редактирования при сохранении долгосрочного эффекта генного редактирования. Доклинические исследования подтверждают осуществимость данного подхода. Совместная доставка с помощью LNP мРНК Cas9 и sgРНК, таргетирующей VEGFA, привела к снижению лазерно-индуцированной хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ) у мышей26; LNP с ПЭГ-вариантом обеспечили редактирование генома в ретинальном пигментном эпителии (РПЭ)27, а LNP с пептидным наведением доставили мРНК в фоторецепторы приматов28. Однако по состоянию на начало 2026 года ни одна генная терапия сетчатки на основе LNP не перешла в стадию клинических исследований29, что подчеркивает потенциал для трансляционного применения. При болезни Штаргаута кодирующая последовательность ABCA4 длиной примерно 6,8 kb превышает емкость упаковки AAV, что требует использования стратегий с двойным вектором, характеризующихся более низкой эффективностью трансдукции19. К клиническим кандидатам относятся платформы с двойным AAV SB-007 и VG80130, а также генно-агностическая модифицирующая терапия OCU410ST31. Невирусная доставка нуклеиновых кислот позволяет обойти ограничения упаковки AAV. Наночастицы PEG-ECO, несущие плазмиду ABCA4, снижали накопление A2E у мышей Abca4-/-20, в то время как в отдельных исследованиях была продемонстрирована доставка крупных конструкций ДНК в сетчатку32 и LNP-опосредованная экспрессия мРНК в тканях глаза33. Поскольку для сохранения центрального зрения достаточно локального лечения макулы и фовеа, VP-липосомы хорошо подходят для доставки высоких концентраций препаратов для генной терапии точно в эти области. При увеальной меланоме вертепорфин действует через три взаимодополняющих механизма: цитотоксичность, опосредованную ФДТ, ингибирование пути YAP/TAZ (при этом экспрессия YAP1 коррелирует с наиболее сильными метастатическими маркерами — моносомией по 3-й хромосоме и потерей BAP1)21 и иммуногенную гибель клеток через активацию cGAS-STING. Сочетание VP-опосредованного ингибирования YAP и ФДТ с терапией анти-PD-L1 превратило иммунологически «холодные» опухоли в иммунологически активные, что значительно подавило рост опухолей и увеличило выживаемость в ортотопических моделях22. Эти результаты согласуются с сообщениями о 80%-й частоте ответа на ФДТ на основе вертепорфина в качестве основного метода лечения хориоидальной меланомы34. Оптическая доступность глаза для активации длиной волны 689 nm в сочетании с четкой локализацией большинства увеальных меланом делает VP-липосомы перспективной платформой для проведения локального лечения, потенциально снижая заболеваемость, связанную с современными методами брахитерапии и протонно-лучевой терапии.

Помимо обсуждавшихся выше офтальмологических и онкологических применений, платформа VP-липосом применима в любом терапевтическом контексте, требующем внешне управляемого высвобождения полезной нагрузки по запросу. Потенциальные области применения включают редактирование генов, инициируемое светом, при дерматологических заболеваниях, доступных для транскутанного облучения; высвобождение химиопрепаратов под действием рентгеновского излучения, синхронизированное с графиками фракционирования в клинической лучевой терапии, а также пространственно-ориентированный нокаут генов для исследований в области биологии развития. Ряд фотоактивируемых систем редактирования генов был продемонстрирован в неретинальных тканях, включая фотоактивируемый базовый редактор Mag-ABE для пространственно-временного контролируемого редактирования генома in vivo35 и систему наночастиц с апконверсией, активируемую в ближнем ИК-диапазоне (NIR), для пространственно-временного контролируемого редактирования CRISPR-Cas9 и фотодинамической терапии36. В офтальмологии растущий интерес к стратегиям длительного подавления VEGF дополнительно подчеркивает необходимость в системах доставки, которые сочетают долгосрочную терапевтическую эффективность с внешним контролем времени и места биологической активности37. Интеграция этих методов изготовления с новейшими технологиями доставки LNP в сетчатку и фотоактивируемыми системами редактирования генов представляет собой конвергенцию индивидуально валидированных компонентов, совместное применение которых в глазу остается открытым и потенциально значимым направлением исследований. Текущая работа нашей группы направлена на оптимизацию составов для субретинального и интравитреального путей введения, оценку профилей безопасности на моделях глаз крупных животных и адаптацию модальности с рентгеновским триггером для одновременного использования со стандартными протоколами лучевой терапии в клинической онкологии.

Раскрытие информации

Y.A.A. является директором и сооснователем компании EosGene Therapeutics Pty Ltd, которая владеет патентами на технологию липидных наночастиц, активируемых светом, описанную в данной работе. E.M.G. и W.D. являются сооснователями EosGene Therapeutics.

Благодарности

Авторы выражают благодарность за предоставление оборудования и техническую помощь сотрудникам Центра по работе с данио-рерио Университета Маккуори (работа с zebrafish) и Комитету по этике в отношении животных Университета Маккуари. Данная работа была частично поддержана Центром передового опыта ARC по наноразмерной биофотонике (CE140100003). Авторы также выражают благодарность за поддержку компании EosGene Therapeutics Pty Ltd.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фильтрационная мембрана 20 nm (Anotop 10 или эквивалент)Whatman (Cytiva)N/AИспользуется для отделения свободного Cas9 при измерении эффективности инкапсуляции
Светодиодный источник света 690 nmThorlabsM690L4Источник света для запуска высвобождения груза из липосом, опосредованного VP; регулируемая плотность мощности
Антибиотик–антимикотик (100X)Thermo Fisher Scientific15240062Добавка для культуры клеток; конечная концентрация 1%
Баллон с аргоном и регуляторN/AN/AИспользуется для испарения растворителя при подготовке липидной пленки
Мини-экструдер AvantiAvanti Polar Lipids610000Система ручной экструзии, используемая с поликарбонатными мембранами 200 nm для стандартизации размера липосом
Мыши BALB/c nude (самки, 5–6 недель)Animal Resources CentreN/AИммунодефицитные мыши, используемые для модели ксенотрансплантата опухоли HCT116
Набор для BCA-анализа белковThermo Fisher ScientificN/AИспользуется для количественного определения свободного Cas9 и измерения эффективности инкапсуляции
Система визуализации Bio-Rad ChemiDoc MPBio-Rad Laboratories12003154Система визуализации гелей и вестерн-блоттинга
КальцеинSigma-AldrichC0875Флуоресцентный краситель для тестов на высвобождение; самогашение при высоких концентрациях
Спектрофотометр Cary 5000 UV-Vis-NIRAgilent TechnologiesN/AУФ-видимая абсорбционная спектроскопия липосом и вертепорфина
Клетки CCD841 CoN (нормальный эпителий толстой кишки человека)ATCCCRL-1790Линия нормальных эпителиальных клеток толстой кишки; используется в качестве неракового контроля
ХлороформSigma-Aldrich288306Органический растворитель для подготовки липидной пленки
ХолестеринSigma-AldrichC8667Компонент мембраны липосом, используемый в составе с фотоактивацией
Клинический линейный ускоритель (фотонный пучок 6 MeV)Varian Medical SystemsN/AКлинический источник рентгеновского излучения для исследований иррадиации
Цифровой штангенциркульN/AN/AИспользуется для измерения объема ксенотрансплантированной опухоли
Диметилсульфоксид (DMSO)Sigma-Aldrich472301Растворитель для подготовки стокового раствора вертепорфина
DOPC (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин)Avanti Polar Lipids850375PЛипидный компонент, используемый в составе с рентгеновской активацией
DOPE (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин)Sigma-AldrichP1223Вспомогательный липид, используемый в составе с фотоактивацией
DOTAP (1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан)Avanti Polar Lipids890890PКатионный липид, используемый в обоих составах
Доксорубицина гидрохлоридSigma-AldrichD1515Химиотерапевтический препарат, загружаемый в липосомы с рентгеновской активацией
DSPE-PEG2000Avanti Polar Lipids880120PПЭГилированный липид, используемый в составе с рентгеновской активацией
Модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965092Среда для культивирования клеток HEK293 и PC12
Фосфатно-солевой буфер в модификации Дульбекко (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190144Промывочный буфер
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Thermo Fisher Scientific10099141Добавка для культуры клеток; конечная концентрация 10%
Спектрофлуориметр Fluorolog-Tau3HORIBA ScientificN/AФлуоресцентная спектроскопия для характеристики вертепорфина
Программное обеспечение для стекинга фокуса (например, Zerene Stacker)N/AN/AИспользуется для генерации изображений со стекингом фокуса при визуализации zebrafish
Лиофилизатор (Alpha 1-4 LDplus)Martin Christ / John Morris ScientificN/AИспользуется для вакуумной сушки и удаления растворителя
sgRNA к GFPThermo Fisher ScientificA35943Одноцепочечная гидовая РНК, нацеленная на eGFP; используется для валидации нокаута
Золотые наночастицы (3–5 nm, стабилизированные цитратом)NanoComposixN/AРадиосенсибилизатор, используемый в составе с рентгеновской активацией
GraphPad PrismGraphPad Software7.0Статистический анализ и визуализация данных
Клетки HCT116 (колоректальная карцинома человека)ATCCCCL-247Линия клеток колоректального рака, используемая для исследований in vitro и in vivo
Клетки HEK293/GFPGenTargetSC001Стабильная экспрессирующая GFP клеточная линия, используемая для валидации CRISPR-нокаута
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570Ядерный краситель; рабочая концентрация 5 µg/mL
Программное обеспечение для анализа изображений (например, Imaris)Bitplane (Oxford Instruments)N/AИспользуется для количественной оценки нокаутированных медленных мышечных волокон
ImageJ/FijiNational Institutes of Health (NIH)Open sourceПрограммное обеспечение для анализа изображений
Инвертированный флуоресцентный микроскопLeica MicrosystemsDMi3000Используется для визуализации репортеров zebrafish и оценки флуоресценции GFP
Система визуализации in vivo IVIS SpectrumCTPerkinElmer128201Система флуоресцентной визуализации in vivo
Просвечивающий электронный микроскоп JEOL JEM-1400JEOLJEM-1400ПЭМ-визуализация липосом
Конфокальный микроскоп Leica SP2Leica MicrosystemsN/AКонфокальная визуализация клеточного захвата
Низкоплавкий агарозN/AN/AИспользуется для фиксации эмбрионов zebrafish при визуализации
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Реагент для трансфекции, используемый в качестве положительного контроля
Программное обеспечение Living ImagePerkinElmerN/AПрограммное обеспечение для сбора и анализа изображений
Среда McCoy's 5AThermo Fisher Scientific16600082Среда для культивирования клеток HCT116
Система микроинъекцийN/AN/AИспользуется для микроинъекций в эмбрионы zebrafish на стадии одной клетки
МТС-тест на пролиферацию клетокPromegaG3582Тест на жизнеспособность клеток
Спектрофотометр NanoDropThermo Fisher ScientificND-2000Измерения чистоты и концентрации РНК
Вода, свободная от нуклеазThermo Fisher ScientificR0582Используется для подготовки РНП CRISPR-Cas9
Среда с пониженным содержанием сыворотки Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985070Среда для трансфекции
Параформальдегид (4%)Sigma-AldrichP6148Фиксатор для гистологического анализа
Клетки PC12 (феохромоцитома крысы)ATCCCRL-1721Нейроноподобная клеточная линия, используемая в исследованиях захвата
Поликарбонатные мембранные фильтры (200 nm)Avanti Polar Lipids610006Мембраны для экструзии для определения размера липосом
Набор RNeasy Plus MiniQIAGEN74134Набор для экстракции РНК
Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG)Thermo Fisher ScientificS36002Флуоресцентный зонд для детектирования синглетного кислорода
Диализные устройства Slide-A-Lyzer MINI (10 kDa MWCO)Thermo Fisher Scientific69570Диализные устройства для подготовки липосом и загрузки препарата
Краситель для нуклеиновых кислот SYBR GoldThermo Fisher ScientificS11494Краситель для гелей с нуклеиновыми кислотами
Zebrafish Tg(ubi:EGFP)Zebrafish International Resource CenterZDB-GENO-080606-2Трансгенные zebrafish, используемые для валидации CRISPR in vivo
TNF-α (рекомбинантный человеческий)Life TechnologiesRTNFAIЦитокин, используемый в исследованиях индукции TNFAIP3
sgRNA к TNFAIP3Thermo Fisher ScientificN/AsgRNA, нацеленная на TNFAIP3
Метансульфонат трикаина (MS-222)N/AN/AАнестетик для zebrafish, используемый перед визуализацией
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Детергент, используемый для лизиса липосом и тестов на высвобождение
Белок TrueCut Cas9 v2Thermo Fisher ScientificA36498Нуклеаза Cas9, используемая для подготовки РНП CRISPR-Cas9
Трипсин-ЭДТА (0,25%)Thermo Fisher Scientific25200056Реагент для диссоциации клеток
Ацетат уранила (2%)Electron Microscopy Sciences22400Отрицательный контраст для ПЭМ-визуализации
ВертепорфинSigma-AldrichSML0534-5MGФотосенсибилизатор, включенный в составы липосом
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalZEN3600Измерения динамического рассеяния света и дзета-потенциала

Ссылки

  1. Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. N Engl J Med. 2020;383(27):2603-15.
  2. Cullis PR, Hope MJ. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Mol Ther. 2017;25(7):1467-75.
  3. Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(5):358-78.
  4. Kim S et al. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 2014;24(6):1012-19.
  5. Wilson BC, Patterson MS. The physics, biophysics and technology of photodynamic therapy. Phys Med Biol. 2008;53(9):R61-R109.
  6. Scott LJ, Goa KL. Verteporfin. Drugs Aging. 2000;16(2):139-46.
  7. Treatment of Age-related Macular Degeneration With Photodynamic Therapy (TAP) Study Group. Photodynamic therapy of subfoveal choroidal neovascularization in age-related macular degeneration with verteporfin: one-year results of 2 randomized clinical trials—TAP Report 1. Arch Ophthalmol. 1999;117(10):1329-45. doi:10.1001/archopht.117.10.1329.
  8. Boettner EA, Wolter JR. Transmission of the ocular media. Invest Ophthalmol. 1962;1(6):776–83.
  9. Aksoy YA et al. Spatial and temporal control of CRISPR-Cas9-mediated gene editing delivered via a light-triggered liposome system. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(47):52433-44.
  10. Ogilby PR. Singlet oxygen: there is indeed something new under the sun. Chem Soc Rev. 2010;39(8):3181-209.
  11. Deng W et al. Controlled gene and drug release from a liposomal delivery platform triggered by X-ray radiation. Nat Commun. 2018;9(1):2713.
  12. Sang R et al. Unlocking the in vivo therapeutic potential of radiation-activated photodynamic therapy for locally advanced rectal cancer with lymph node involvement. EBioMedicine. 2025;116:105724.
  13. Fleckenstein M, Schmitz-Valckenberg S, Chakravarthy U. Age-related macular degeneration: a review. JAMA. 2024;331(2):147-57.
  14. Wykoff CC et al. Impact of anti-VEGF treatment and patient characteristics on vision outcomes in neovascular age-related macular degeneration: up to 6-year analysis of the AAO IRIS Registry. Ophthalmol Sci. 2024;4(2):100421.
  15. Khanani AM et al. Safety and efficacy of ixoberogene soroparvovec in neovascular age-related macular degeneration in the United States (OPTIC): a prospective, two-year, multicentre phase 1 study. EClinicalMedicine. 2024;67:102394.
  16. Campochiaro PA et al. Gene therapy for neovascular age-related macular degeneration by subretinal delivery of RGX-314: a phase 1/2a dose-escalation study. Lancet. 2024;403(10436):1563-73.
  17. Maguire MG et al. Five-year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: the Comparison of Age-related Macular Degeneration Treatments Trials. Ophthalmology. 2016;123(8):1751-61.
  18. Eshtiaghi A et al. Geographic atrophy incidence and progression after intravitreal injections of anti-vascular endothelial growth factor agents for age-related macular degeneration: a meta-analysis. Retina. 2021;41(12):2424-35.
  19. Li R et al. Split AAV8 mediated ABCA4 expression for gene therapy of mouse Stargardt disease (STGD1). Hum Gene Ther. 2023;34(13-14):616-28.
  20. Sun D et al. Effective gene therapy of Stargardt disease with PEG-ECO/pGRK1-ABCA4-S/MAR nanoparticles. Mol Ther Nucleic Acids. 2022;29:823-35.
  21. Brouwer NJ et al. Targeting the YAP/TAZ pathway in uveal and conjunctival melanoma with verteporfin. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2021;62(4):3.
  22. Zhang S et al. Combination of YAP inhibition and photodynamic therapy induces dual DNA damage and activates STING pathway to enhance immunotherapy in uveal melanoma. Redox Biol. 2026;89:103965. doi:10.1016/j.redox.2025.103965.
  23. Cheema MR, DaCosta J, Talks J. Ten-year real-world outcomes of anti-vascular endothelial growth factor therapy in neovascular age-related macular degeneration. Clin Ophthalmol. 2021;15:279-87.
  24. Kay C et al. Interim results from the phase 2b population extension cohort in the PRISM clinical trial evaluating 4D-150 in adults with neovascular (wet) age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2025;66(8):1861.
  25. Vofo BN et al. Long-term macular atrophy growth in neovascular age-related macular degeneration: influential factors and role of genetic variants. Eye (Lond). 2025;39(9):1717-23.
  26. Cao D et al. Dynamically covalent lipid nanoparticles mediate CRISPR-Cas9 genome editing against choroidal neovascularization in mice. Sci Adv. 2025;11(28):eadj0006.
  27. Gautam M et al. Lipid nanoparticles with PEG-variant surface modifications mediate genome editing in the mouse retina. Nat Commun. 2023;14(1):6468.
  28. Herrera-Barrera M et al. Peptide-guided lipid nanoparticles deliver mRNA to the neural retina of rodents and nonhuman primates. Sci Adv. 2023;9(2):eadd4623.
  29. Wu H et al. Innovative gene delivery systems for retinal disease therapy. Neural Regen Res. 2026;21(2):542-52.
  30. Riedmayr LM et al. mRNA trans-splicing dual AAV vectors for (epi)genome editing and gene therapy. Nat Commun. 2023;14(1):6578.
  31. Khanani AM et al. A novel modifier gene therapy to treat Stargardt disease: Phase 1 GARDian1 Trial Insights. Eye (Lond). 2026;40:429–30.
  32. Goddaer S et al. Overcoming size barriers in retinal gene therapy via lipid nanoparticle-mediated delivery of full-length EYS DNA. Drug Deliv Transl Res. 2026;16(8):2921–36. doi:10.1007/s13346-025-02036-y.
  33. Chambers CZ et al. Lipid nanoparticle-mediated delivery of mRNA into the mouse and human retina and other ocular tissues. Transl Vis Sci Technol. 2024;13(7):7.
  34. Yordi S, Soto H, Bowen RC, Singh AD. Photodynamic therapy for choroidal melanoma: What is the response rate? Surv Ophthalmol. 2021;66(4):552-59.
  35. Zou Q et al. Photoactivatable base editors for spatiotemporally controlled genome editing in vivo. Biomaterials. 2023;302:122328.
  36. Zeng J et al. Near-infrared optogenetic nanosystem for spatiotemporal control of CRISPR-Cas9 gene editing and synergistic photodynamic therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 2025;17(1):701-10.
  37. Campochiaro PA. Sustained suppression of VEGF for treatment of retinal and choroidal vascular diseases. Am J Ophthalmol. 2025;277:1-6.

Перепечатки и разрешения

Теги

CRISPR Cas9

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.