Исследовательская статья

Оценка комбинированного лечения с применением сорафениба и гемцитабина на клетках HepG2 и ксенотрансплантационной модели на мышах NOD/SCID: пилотное исследование

46 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71790

⸱

28 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, the Fourth Affiliated Hospital of School of Medicine, and International School of Medicine, International Institutes of Medicine, Zhejiang University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Сорафениб в сочетании с гемцитабином демонстрирует предварительные признаки аддитивного ингибирования пролиферации клеток HepG2, вызывает корреляционные изменения в экспрессии p-ERK и VEGF, а также подавляет рост опухоли печени у мышей NOD/SCID.

Аннотация

Рак печени остается одной из ведущих причин смертности от онкологических заболеваний из-за лекарственной устойчивости и ограниченного выбора методов лечения. Существует острая необходимость в поиске терапевтических стратегий для улучшения исходов заболевания. В данном пилотном исследовании представлен протокол оценки потенциального действия и лежащих в его основе механизмов комбинированного применения сорафениба и гемцитабина при раке печени. Использовалась клеточная линия рака печени HepG2, а также была создана ксенографтная модель на мышах с неполным сахарным диабетом и тяжелым комбинированным иммунодефицитом (NOD/SCID). Продемонстрированы основные этапы процедуры, включая: (1) культивирование клеток HepG2 и воздействие препаратами; (2) постановку МТТ-теста, инкубацию и измерение оптической плотности; (3) экстракцию белков, SDS-PAGE, перенос и иммуноблоттинг для определения ERK и p-ERK; (4) создание подкожных ксенографтов у мышей NOD/SCID; (5) измерение опухоли и расчет ее объема; и (6) иммуногистохимический анализ VEGF в срезах опухоли. Приведены критические этапы, советы по устранению неисправностей и технические характеристики оборудования. Комбинация сорафениба (3 µmol/L) и гемцитабина (10 µmol/L) обеспечила уровень ингибирования 71.23% ± 6.76% через 72 h при значении q равном 1.35, что указывает на  синергетический эффект при данной паре доз в протестированных условиях. По сравнению с контрольной группой, комбинированная терапия сопровождалась снижением экспрессии p-ERK, уменьшением объема опухоли и качественно более слабым иммуноокрашиванием VEGF. Эти данные демонстрируют корреляционную связь между снижением экспрессии p-ERK и наблюдаемым антипролиферативным эффектом, не устанавливая при этом причинно-следственной связи. В клетках HepG2 и на ксенографтной модели мышей NOD/SCID комбинация сорафениба и гемцитабина демонстрирует предварительные признаки антипролиферативного потенциала и связана со снижением экспрессии VEGF; однако этот результат не является прямым доказательством антиангиогенной активности, так как анализ плотности микрососудов или функциональный анализ сосудов не проводились. Данный воспроизводимый протокол представляет собой полезную основу для оценки комбинаций препаратов в моделях ГЦК и может быть адаптирован для других схем таргетной и химиотерапии, хотя перед формулированием каких-либо клинических выводов требуются дальнейшие исследования механизмов и валидация доз.

Введение

Рак печени является одним из самых распространенных и смертоносных видов рака, а также одной из самых быстрорастущих злокачественных опухолей1,2. Несмотря на снижение заболеваемости раком печени, общее бремя этого заболевания продолжает расти. Глобальные эпидемиологические данные за 2022 год, представленные в онлайн-базе данных Global Cancer Observatory (GLOBOCAN) 2022, показали, что стандартизированный по возрасту показатель заболеваемости раком печени составил 15,0 на 100 000 населения, в то время как стандартизированный по возрасту показатель смертности составил 26,7 на 100 000 населения, что делает его второй ведущей причиной смертности от рака3. В настоящее время из-за отсутствия эффективного лечения рака печени в сочетании с его скрытым началом большинство пациентов умирают в течение одного года после постановки диагноза. Сорафениб — первый мультитаргетный ингибитор киназ, одобренный для клинического применения, который воздействует на рецепторные тирозинкиназы, такие как рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR), а также на серин/треонинкиназы4,5. Сорафениб, пероральный мультикиназный ингибитор, оказывает антипролиферативное и антиангиогенное действие при раке печени, воздействуя на несколько путей факторов роста. Исторически сорафениб был первой одобренной FDA системной терапией первой линии для пациентов с распространенным или нерезектабельным раком печени6. Однако современный ландшафт терапии первой линии при распространенной гепатоцеллюлярной карциноме (ГЦК) значительно расширился. Рекомендуемые варианты теперь включают комбинацию ингибитора контрольных точек иммунитета атезолизумаб плюс бевацизумаб, ленватиниб и комбинацию двойной иммунотерапии дурвалумаб плюс тремелимумаб, среди прочих. Несмотря на эти достижения, сорафениб остается важным вариантом первой линии, особенно в регионах, где комбинации иммунотерапии недоступны или противопоказаны. В связи с его широким применением при раке печени серьезную обеспокоенность вызывают нежелательные лекарственные реакции7. Согласно анализу базы данных Системы отчетности о нежелательных явлениях FDA (FAERS) за период с 2006 по 2023 год, нежелательные явления при приеме сорафениба в основном затрагивали пищеварительную систему, кожу и подкожные ткани, а также проявлялись неспецифическим физическим недомоганием, таким как инфекции и травмы7. Хотя некоторые пациенты с распространенным раком печени могут извлечь пользу из лечения сорафенибом, у большинства пациентов со временем развивается резистентность или наступает неудача в лечении, что приводит к неблагоприятному прогнозу8,9,10. Несмотря на его применение, сорафениб приносит пользу лишь около 30% пациентов с ГЦК; более того, у респондентов резистентность часто развивается в течение 6 месяцев11. Молекулярные пути, участвующие в резистентности к сорафенибу, включают пути внеклеточной сигнал-регулируемой киназы (ERK)/фосфорилированной ERK (p-ERK), протеинкиназы B (Akt), фосфоинозитид-3-киназы (PI3K)/AKT/мишени рапамицина у млекопитающих (mTOR), индуцируемого гипоксией фактора 1α (HIF-1α)/HIF-2α и пути, связанные с аутофагией, при этом в данном исследовании особое внимание было уделено пути ERK/p-ERK11. Гемцитабин представляет собой аналог цитидина, который после попадания в организм образует дифторцитидиндифосфат и дифторцитидинтрифосфат, оказывающие различное ингибирующее действие на синтез ДНК12. При гепатобилиарных злокачественных новообразованиях гемцитабин оценивался в качестве компонента комбинированной химиотерапии. Однако в клинических отчетах также отмечалось развитие выраженной лекарственной устойчивости к гемцитабину, что ограничивает его эффективность12,13. Следовательно, эффективный и оперативный подбор оптимального режима дозирования препаратов представляет собой крайне сложную задачу. Недавние исследования показали, что комбинация гемцитабина с сорафенибом может обладать повышенной терапевтической эффективностью на основе нового прогноза биомаркера стемности опухоли14. Однако, насколько нам известно, ни в одном исследовании не изучалась данная комбинация специально при раке печени с использованием клеток HepG2 и ксенографтной модели гепатоцеллюлярной карциномы на мышах NOD/SCID (необезенные диабетики с тяжелым комбинированным иммунодефицитом). Таким образом, до сих пор отсутствуют экспериментальные данные, напрямую подтверждающие аддитивный эффект сорафениба и гемцитабина при раке печени.

Процедуры, описанные в данной рукописи, широко используются, но редко представлены в детальном визуальном пошаговом формате, подходящем для воспроизведения исследователями в начале карьеры. Мы выдвинули гипотезу о том, что комбинация сорафениба и гемцитабина будет аддитивно подавлять пролиферацию клеток рака печени и рост опухоли, и что этот эффект будет связан с подавлением сигнального пути ERK/p-ERK и снижением ангиогенеза, опосредованного фактором роста эндотелия сосудов (VEGF). Данное исследование направлено на предварительное изучение ингибирующего эффекта комбинации сорафениба и гемцитабина на пролиферацию клеточной линии рака печени HepG2 in vitro и in vivo, а также механизмов этого действия (Supplementary Figure 1). Новизна данного исследования заключается в трех аспектах: (1) это первая проверка комбинации сорафениба и гемцитабина специально при раке печени с использованием широко применяемой клеточной линии HepG2 и соответствующей мышиной модели NOD/SCID; (2) в работе исследуется недостаточно изученный путь ERK/p-ERK в качестве потенциального механизма; и (3) приводятся прямые экспериментальные доказательства, а не компьютерные прогнозы, аддитивного эффекта данной комбинации при раке печени. Эти особенности отличают данную работу от предыдущих отчетов о комбинированной терапии, проведенных на других типах опухолей или с использованием иных экспериментальных моделей, особенно в контексте режимов лечения на основе сорафениба.

Протокол

Этическое одобрение было предоставлено Комитетом по благополучию и этике использования лабораторных животных Чжэцзянского университета (номер одобрения ZJU20250049).

Животные и группировка

В общей сложности 40 самок мышей NOD/SCID в возрасте 4–5 недель с массой тела 18–20 g были приобретены у лицензированного коммерческого поставщика (лицензия № SCXK (Shanghai) 2013-0006) и размещены в виварии с условиями содержания SPF (specific pathogen-free). Все протоколы работы с животными соответствовали стандартным рекомендациям. В ходе эксперимента животным обеспечивался свободный доступ к корму и воде; они содержались группами (5 мышей на клетку) в контролируемом SPF-помещении при температуре 22 ± 2 °C, влажности 50%–60% и цикле свет/темнота 12/12 h. Корм и вода предоставлялись ad libitum, контроль массы тела проводился каждые 2 недели. В случаях, когда у мышей наблюдались стойкий болевой синдром, кахексия, изъязвление опухоли, достижение опухолью максимального размера 2 cm или иные необратимые проблемы со здоровьем, проводилась эвтаназия путем внутрибрюшинного введения 0,45% пентобарбитала натрия в дозе ≥150 mg/kg массы тела с последующим подтверждением прекращения дыхания и сердцебиения, отсутствием корнеального рефлекса или применением дополнительного физического метода, если это было необходимо в соответствии с критериями гуманного прекращения эксперимента, утвержденными Комитетом по этике работы с животными. Размер выборки (n = 10 в группе) был определен на основе анализа статистической мощности при допущении величины эффекта 1.2 (полученной в ходе пилотных экспериментов), α = 0.05 и β = 0.20 (мощность 80%), с учетом 20% запаса на возможный отсев. Процедуры имплантации опухоли проводились до распределения животных по группам лечения (см. ниже раздел «Создание ксенографтов»).

После имплантации опухоли и подтверждения ее приживаемости мыши были случайным образом разделены на 4 группы методом таблицы случайных чисел для создания модели трансплантата опухоли у мышей NOD/SCID: контрольная группа, группа сорафениба, группа гемцитабина и группа комбинированного применения сорафениба и гемцитабина, по 10 мышей (5 мышей в клетке) в каждой группе. Поскольку опухолевые ткани в процессе моделирования могут вызвать ухудшение общего состояния или даже смерть мышей NOD/SCID, и учитывая, что для статистического анализа обычно требуется достаточный размер выборки, в каждую группу было включено не менее 10 мышей. Случайное распределение по группам проводилось независимыми техниками, клетки были промаркированы; при введении препаратов или измерении опухоли метод ослепления не применялся, что является существенным ограничением. Остальной отбор тканей, биохимические и патологические оценки проводились лабораторным персоналом в слепом режиме. Данные также анализировались вслепую статистиками, которые имели доступ только к закодированным файлам до завершения статистической обработки и раскрытия данных. Все животные были включены в окончательный анализ. Для обоих препаратов был выбран внутрибрюшинный путь введения для обеспечения системной абсорбции и стабильной биодоступности; дозирование один раз в день основывалось на предыдущих фармакокинетических исследованиях, показавших устойчивые концентрации в плазме при таком режиме. В контрольную группу внутрибрюшинно вводили 0.2 mL стерильного физиологического раствора. В группе сорафениба внутрибрюшинно вводили 0.2 mL сорафениба в дозе 40 mg/kg. В группе гемцитабина внутрибрюшинно вводили 0.2 mL гемцитабина в дозе 100 mg/kg. Группа комбинированного лечения: внутрибрюшинно вводили по 0.2 mL сорафениба в дозе 40 mg/kg и гемцитабина в дозе 100 mg/kg. Препараты вводились каждой группе один раз в день в течение 20 дней подряд. Все животные были включены в окончательный анализ, ни одна мышь не была исключена из исследования. За 20-дневный период лечения летальных исходов ни в одной из групп не наблюдалось. График и дозы были выбраны на основе опубликованных исследований на моделях гепатобилиарного рака. Следует отметить, что ежедневное внутрибрюшинное введение гемцитабина может вызвать токсичность. Длина и ширина трансплантированных опухолей измерялись ежедневно, и рассчитывался объем трансплантированных опухолей. Через 20 дней животные были подвергнуты эвтаназии путем вывиха шейного позвонка под глубокой анестезией, а ткани трансплантированных опухолей фиксировали в формалине. Масса тела измерялась каждые 2 дня на протяжении всего исследования. Мыши ежедневно наблюдались на предмет клинических признаков токсичности, включая пилоэрекцию, сгорбленную позу, снижение подвижности, диарею и вялость. Однако биохимический анализ сыворотки крови (например, определение аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и креатинина) и гистопатологическое исследование основных органов не проводились. Следовательно, субклиническую токсичность нельзя исключить.

Препараты и реагенты

Сорафениб растворяли в 10% диметилсульфоксиде (DMSO) и хранили при -20 °C. Перед использованием раствор размораживали и разбавляли до конечной концентрации DMSO менее 0.5%, что не оказывало влияния на рост клеток. Гемцитабин был получен из коммерческого источника. Буфер для лизиса RIPA (радиоиммунопреципитационный анализ), тиазолил синий, первичные антитела к glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), ERK, p-ERK и VEGF, вторичные антитела, среда DMEM (модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко) с высоким содержанием глюкозы, фетальная бычья сыворотка и клеточная линия HepG2 были приобретены у коммерческих поставщиков.

Сорафениб и гемцитабин являются цитотоксическими агентами. Все процедуры по приготовлению и использованию препаратов должны проводиться в специализированном боксе биологической безопасности с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторного халата, нитриловых перчаток и защитных очков). DMSO, метанол, ксилол и другие органические растворители, используемые в данном протоколе, опасны, и работа с ними должна проводиться в вытяжном шкафу во избежание вдыхания паров или контакта с кожей. Перед использованием следует ознакомиться с паспортами безопасности (MSDS) всех используемых реагентов.

Культивирование клеток

Клеточную линию HepG2 разморозили и переселили в флаконы для культивирования, содержащие 10 mL среды DMEM с высоким содержанием глюкозы (с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 U/mL пенициллина-стрептомицина и 4 mmol/L глутамина). Клетки инкубировали при 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержанием 5% CO₂. Питательную среду заменяли каждые 2 дня, а пассирование клеток проводили каждые 4 дня для поддержания логарифмической фазы роста. Клеточная линия HepG2 была получена из коммерческого источника; однако в данном исследовании независимая аутентификация клеточной линии (например, профилирование коротких тандемных повторов) и тестирование на наличие микоплазмы не проводились.

Метод МТТ для определения степени ингибирования пролиферации

Для определения степени ингибирования пролиферации клеток линии HepG2 под воздействием сорафениба и гемцитабина использовали метод с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромидом (MTT). Клетки в логарифмической фазе роста подвергали трипсинизации с использованием 0,25% трипсина в течение 2 мин, после чего реакцию останавливали добавлением равного объема полной среды. После центрифугирования при 1000 × g в течение 10 мин клетки ресуспендировали в полной среде. Плотность клеток доводили до 1 × 105 клеток/мл, и по 200 µL клеточной суспензии высевали в каждую лунку 96-луночного планшета. Данная плотность посева была выбрана на основании предварительных оптимизационных экспериментов, в которых тестировали плотность клеток в диапазоне от 5 × 103 до 5 × 104 клеток/лунку. Плотность 2 × 104 клеток/лунку обеспечивала линейный рост оптической плотности в течение 96 ч и поддерживала конфлюэнтность ниже 80% в конечной точке, что подтверждалось визуальным осмотром под инвертированным микроскопом. Чтобы измерения MTT оставались в линейном диапазоне, в каждой временной точке проводились пилотные эксперименты с контрольными лунками, обработанными растворителем. Среду заменяли каждые 48 ч для предотвращения истощения питательных веществ и накопления метаболитов. Конфлюэнтность контролировали ежедневно с помощью инвертированного микроскопа. Через 96 ч в контрольных лунках конфлюэнтность достигала примерно 75%–80%, явных признаков истощения питательной среды не наблюдалось. После прикрепления клеток среду удаляли и добавляли среду, содержащую препараты. В необработанную контрольную группу (контроль растворителя для экспериментов in vivo) добавляли среду без препаратов. Эксперимент был разделен на контрольную группу без обработки, группу сорафениба, группу гемцитабина и группу комбинированной терапии. Дозы сорафениба составляли 1,5 µmol/L, 3 µmol/L, 4,5 µmol/L и 6 µmol/L, а дозы гемцитабина — 5 µmol/L, 10 µmol/L, 15 µmol/L и 20 µmol/L. Дозы сорафениба в сочетании с гемцитабином составляли 1,5 µmol/L + 5 µmol/L, 3 µmol/L + 10 µmol/L, 4,5 µmol/L + 15 µmol/L и 6 µmol/L + 20 µmol/L. Клетки в каждой группе культивировали в течение 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч. После культивирования в каждую лунку добавляли 20 µL раствора MTT (5 mg/mL) и инкубировали клетки в инкубаторе в течение 4 ч. Супернатант осторожно удаляли, затем в каждую лунку добавляли 150 µL DMSO и встряхивали планшет в течение 10 мин для полного растворения формазана, после чего измеряли значение оптической плотности (OD) каждой лунки при 490 нм с помощью многофункционального микропланшетного ридера. Эксперимент повторяли трижды, в каждой группе было по пять повторностей. Данные представлены как среднее значение ± SD трех биологических повторов. Степень ингибирования роста клеток (%) = (1 - OD экспериментальной группы / OD контрольной группы) × 100%. Взаимодействие двух препаратов оценивали по значению q, которое рассчитывали по формуле: q = EAB / (EA + EB - EA × EB). Здесь EA и EB — степени ингибирования препаратов A и B при их самостоятельном использовании, а EAB — степень ингибирования при совместном использовании двух препаратов. Значение q более 1,15 указывает на синергический эффект между двумя препаратами; 0,85–1,15 указывает на аддитивный эффект; q менее 0,85 указывает на антагонистический эффект. Метод расчета q-значения является простым инструментом скрининга и не заменяет более строгий анализ синергии. Было протестировано лишь несколько пар доз с фиксированным соотношением, что ограничивает достоверность утверждения о синергии. Таким образом, термин «синергия» в данном исследовании относится к q > 1,15 при конкретных парах доз и временных точках, а не к подтвержденному аддитивному взаимодействию во всей матрице «доза-ответ».

Вестерн-блот анализ экспрессии белков ERK и p-ERK

Культивирование клеток и распределение по экспериментальным группам проводили по описанному выше протоколу. Для детекции ERK и p-ERK методом вестерн-блоттинга использовали сорафениб в дозе 3 µmol/L, гемцитабин в дозе 10 µmol/L и их комбинацию в дозах 3 µmol/L + 10 µmol/L. После 72 ч обработки клетки лизировали буфером для лизиса RIPA и экстрагировали общий белок из каждой экспериментальной группы. Концентрацию белка определяли бицинкининовым методом (BCA). Равные количества белка (30 µg на лунку) наносили на 10% полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и разделяли электрофорезом при 120 V в течение 90 мин. Белки переносили на мембраны из поливинилиденфторида (PVDF) (размер пор 0,45 µm) при 300 mA в течение 90 мин при 4 °C. После блокирования 5% раствором обезжиренного молока в трис-солевом буфере с 0,1% Tween-20 (TBST) в течение 1 ч при комнатной температуре мембраны инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 °C при осторожном встряхивании. После трех промывок буфером TBST (по 10 мин каждая) мембраны инкубировали со вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре. Полосы белков визуализировали с помощью субстрата для усиленной хемолюминесценции (ECL) и фиксировали с помощью цифровой системы визуализации гелей. Время экспозиции оптимизировали для каждого антитела во избежание насыщения сигнала. Денситометрический количественный анализ проводили с помощью программного обеспечения ImageJ, используя инструмент анализа гелей. Интенсивность полос всех целевых белков нормировали по GAPDH в качестве контроля загрузки, а экспрессию p-ERK дополнительно нормировали по экспрессии общего ERK. Дополнительных этапов блокирования, помимо использования 5% обезжиренного молока, не проводили. Результаты количественного анализа представляли как кратность изменения относительно контрольной группы, значение которой приняли за 1,0. Каждый эксперимент повторяли трижды независимо. Представлены репрезентативные иммуноблотты.

Иммуногистохимическое определение экспрессии VEGF в ксенографтах опухолей HepG2 у мышей NOD/SCID

Для создания ксенографта: клетки HepG2 в фазе логарифмического роста собирали путем трипсинизации, дважды промывали стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS) и ресуспендировали в безсывороточной среде DMEM. Общее количество 2 × 106 клеток в 0,2 mL безсывороточной DMEM (без Matrigel) вводили подкожно в правую подмышечную область (зону с богатым кровоснабжением) каждой мыши NOD/SCID с помощью шприца объемом 1 mL для создания модели подкожного ксенографта HepG2 у мышей NOD/SCID. Приживаемость опухоли контролировали каждые 2 дня. Размер опухоли измеряли каждые два дня, и когда диаметр опухоли достигал 0,3–0,5 cm (примерно через 7–10 дней после инъекции, что определялось как точка начала лечения), мышей случайным образом разделяли на 4 группы для проведения эксперимента. Длину (L) и ширину (W) подкожного ксенографта измеряли ежедневно с помощью цифрового штангенциркуля, а объем опухоли (V) рассчитывали по формуле: V = (L × W2) / 2. Все измерения проводил исследователь, не знающий о распределении животных по группам. Через 20 дней животных подвергали эвтаназии путем перелома шейных позвонков под глубокой анестезией, а ткань ксенографта фиксировали в 10% нейтральном буферном формалине в течение 24 h при комнатной температуре, после чего заключали в парафин. Срезы тканей (толщиной 5 µm) готовили с помощью ротационного микротома и наносили на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином. Для иммуногистохимического анализа срезы депарафинизировали в ксилоле (три смены по 5 min) и регидратировали через серию спиртов decreasing концентрации (100%, 95%, 70%, 50%; по 3 min каждый). Восстановление антигенов проводили путем нагревания срезов в 10 mM цитратном натрия буфере в микроволновой печи в течение 15 min с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение 20 min. Эндогенную пероксидазную активность блокировали 3% перекисью водорода в метаноле в течение 10 min при комнатной температуре. Неспецифическое связывание блокировали 5% нормальной сывороткой козы в PBS в течение 1 h при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали с первичными антителами к VEGF (разведение 1 : 200) в течение ночи при 4 °C во влажной камере. После промывки PBS (трижды по 5 min) срезы инкубировали с козьими вторичными антителами против кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) (1 : 500), в течение 1 h при комнатной температуре. Сигнал детектировали с использованием субстрата 3,3′-диаминобензидина (DAB). Срезы докрашивали гематоксилином в течение 30 s, обезвоживали, просветляли и заключали под покровные стекла с использованием постоянного монтирующего средства. Визуализацию проводили с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа в режиме светлого поля при увеличении ×100. Для качественной иллюстрации представлены репрезентативные изображения.

Все загрязненные наконечники, пробирки и отходы культуры клеток собирали как биоопасные отходы и автоклавировали перед утилизацией. Химические отходы, включая растворы, содержащие лекарственные препараты, DMSO, ксилол и метанол, собирали в отдельные маркированные контейнеры для отходов и утилизировали в соответствии с местными правилами учреждения по обращению с опасными химическими отходами.

Статистический анализ

Для статистического анализа использовалось программное обеспечение SPSS 19.0. Экспериментальные данные для экспериментов in vitro представлены как среднее ± SD по трем независимым биологическим повторностям, а для экспериментов in vivo — как среднее ± стандартное отклонение (SD) для n = 10 мышей в группе. Для сравнения двух групп использовался двухсторонний непарный t-критерий. Для сравнения нескольких групп использовался однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Тьюки. Приводились значения p < 0.05, p < 0.01 и p < 0.001.

Результаты

Ингибирующий эффект сорафениба и гемцитабина на пролиферацию клеток HepG2

Сорафениб и гемцитабин дозозависимо подавляли пролиферацию клеток HepG2, как показано в Таблице 1. Комбинированная терапия продемонстрировала значительно более высокие показатели ингибирования во всех временных точках по сравнению с монотерапией. МТТ-тест измеряет метаболическую активность, которая коррелирует с количеством клеток, но не измеряет напрямую пролиферацию или цитотоксичность. Следовательно, термин «ингибирование пролиферации» следует интерпретировать как снижение конверсии МТ. Примечательно, что комбинация сорафениба в концентрации 3 µmol/L и гемцитабина в концентрации 10 µmol/L обеспечила наиболее выраженный ингибирующий эффект, что подчеркивает её потенциал как эффективного режима лечения рака печени. Дальнейшее исследование продемонстрировало аддитивный эффект сорафениба и гемцитабина на клетки HepG2. В Таблице 2 представлены значения q, которые указывают на потенциальные синергические взаимодействия между двумя препаратами. Примечательно, что комбинация 3 µmol/L сорафениба и 10 µmol/L гемцитабина показала значения q выше 1,15 в нескольких временных точках, что предполагает связь между снижением экспрессии p-ERK и наблюдаемым антипролиферативным эффектом, хотя данные результаты не доказывают причинно-следственную связь. Эти данные указывают на необходимость дальнейших исследований на дополнительных моделях рака печени, прежде чем можно будет сделать выводы о терапевтическом потенциале. Синергия наблюдалась не для всех пар доз, а была ограничена одной конкретной комбинацией концентраций.

Рисунок 1 показывает, что степень ингибирования пролиферации клеток в группе сорафениба и в группе комбинированной терапии достигла пика через 72 ч. Комбинированная терапия, в частности при дозировке сорафениба 3 µmol/L и гемцитабина 10 µmol/L, привела к заметно более высокому уровню ингибирования по сравнению с монотерапией.

Влияние сорафениба и гемцитабина на экспрессию ERK и p-ERK

Рисунок 2A показывает отсутствие значимых изменений в экспрессии белка ERK во всех группах. Однако экспрессия p-ERK была значительно снижена в группе сорафениба и в группе комбинированного лечения, при этом наибольшее снижение наблюдалось в группе комбинированного лечения. Эти данные демонстрируют связь между снижением уровней p-ERK и комбинированным лечением, но не доказывают, что снижение p-ERK напрямую опосредует антипролиферативный эффект. Денситометрический количественный анализ, нормализация p-ERK по общему ERK и GAPDH, информация о биологических повторностях и статистические сравнения не проводились. Следовательно, представленные иммуноблотты являются репрезентативными и носят только качественный характер.

Влияние сорафениба и гемцитабина на объем подкожных ксенографтов при трансплантированном раке печени у мышей NOD/SCID

До начала лечения значимых различий в объеме подкожных ксенографтов между группами не наблюдалось (p = 0.367). После лечения объем опухоли значительно снизился по сравнению с контрольной группой, при этом в группе комбинированной терапии объем опухолей был значительно меньше, чем в группах сорафениба и гемцитабина (p < 0.01), как показано на Рисунке 2B. Эти результаты следует интерпретировать с осторожностью, поскольку данные о токсичности или фармакокинетике не собирались для подтверждения того, что наблюдаемые различия не обусловлены лекарственной заболеваемостью или различиями в системном воздействии препаратов.

Влияние сорафениба и гемцитабина на экспрессию VEGF в трансплантированном раке печени у мышей NOD/SCID

Рисунок 2C представляет собой иммуногистохимический анализ экспрессии VEGF в тканях опухоли. В группах сорафениба и комбинированной терапии наблюдалось снижение интенсивности коричнево-желтого иммуноокрашивания и более слабая экспрессия VEGF по данным качественного иммуногистохимического анализа. Этот результат указывает на снижение ангиогенного потенциала, но не демонстрирует ангиогенез напрямую, так как анализ маркеров эндотелиальных клеток или плотности микрососудов не проводился. В группах гемцитабина и контроля качественно наблюдалась более сильная экспрессия VEGF. Эти качественные данные о VEGF носят корреляционный характер и служат лишь для выдвижения гипотез. Без количественного анализа или использования прямых сосудистых маркеров нельзя сделать вывод об ангиогенезе или синергии в процессе ангиогенеза.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ

Необработанные данные, полученные и проанализированные в ходе данного исследования, представлены в дополнительных материалах (Дополнительный файл 1).

Эффект ингибирования при воздействии на клетки; графики; показатели ингибирования в зависимости от времени; анализ сорафениба и гемцитибина.
Рисунок 1: Влияние различных вмешательств на скорость ингибирования пролиферации клеток HepG2. (A) Степень ингибирования (%) сорафенибом клеток HepG2 в разные моменты времени. (B) Степень ингибирования (%) гемцитабином клеток HepG2 в разные моменты времени. (C) Степень ингибирования (%) клеток HepG2 при комбинированном воздействии сорафениба и гемцитабина. (D) Степень ингибирования (%) сорафенибом (3 µmol/L) и гемцитабин (10 µmol/L) отдельно и в комбинации после 72 ч воздействия на клетки HepG2. *p < 0.05, **p < 0.01 в сравнении с контрольная группа. Все данные о степени ингибирования были получены с помощью МТ-теста в соответствии с описанным протоколом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Вестерн-блоттинг ERK/p-ERK, гистограмма объема опухоли, гистопатологические препараты; анализ лечения рака.
Рисунок 2Экспрессия ERK/p-ERK, объем опухоли и экспрессия VEGF в группах терапии. (A) Экспрессия ERK и p-ERK в клетках HepG2 при различных вариантах обработки; (B) Объем (мм³)3) опухолей в четырех группах до и после лечения (n = 10 в группе). **p < 0.01 в сравнении с контрольная группа после обработки. Статистические сравнения конечных объемов проводились с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). (C) Репрезентативные изображения иммуногистохимического анализа (масштабная линейка = 100 µm) экспрессии VEGF в тканях опухоли в каждой группе (n = 10 в группе). Данные изображения представлены для качественной иллюстрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Группа (μmol/L)Время воздействия (h)
24487296
Sorafenib1.512.41 ± 3.3722.74 ± 4.5729.76 ± 3.4815.7 ± 3.18
326.37 ± 6.143.10 ± 4.394.71 ± 5.4938.63 ± 5.68
4.534.42 ± 5.2658.91 ± 4.6767.85 ± 5.2054.26 ± 6.07
646.8 ± 6.6167.48 ± 5.7073.57 ± 7.0761.73 ± 6.10
Gemcitabine53.56 ± 1.416.17 ± 1.739.31 ± 1.761.35 ± 1.95
105.89 ± 2.479.62 ± 2.1514.57 ± 1.9416.58 ± 2.31
1514.57 ± 3.3819.53 ± 2.272.43 ± 2.1324.75 ± 3.25
202.36 ± 4.4628.76 ± 3.923.18 ± 3.1938.49 ± 4.28
Sorafenib + Gemcitabine1.5 + 514.13 ± 2.1626.41 ± 3.4337.75 ± 4.752.04 ± 2.84
3 + 1038.69 ± 3.9446.26 ± 4.0671.23 ± 6.7662.47 ± 7.20
4.5 + 1540.89 ± 4.2174.30 ± 6.9884.82 ± 9.176.89 ± 7.16
6 + 2064.05 ± 6.5480.67 ± 9.7992.2 ± 10.2481.05 ± 9.87

Таблица 1: Степень ингибирования (%) клеток HepG2 под воздействием сорафениба и гемцитабина. Данные представлены в виде среднего значения ± SD по результатам трех независимых экспериментов.

Группа (μmol/L）Время обработки (ч)
24487296
Сорафениб + гемцитабин1.5 + 50.910.961.040.87
3 + 101.261.171.351.28
4.5 + 150.931.111.131.02
6 + 201.091.051.121.06

Таблица 2: q-значение синергического эффекта сорафениба и гемцитобина на клетках HepG2. q > 1,15 указывает на синергизм; 0,85–1,15 указывает на аддитивность; q < 0,85 указывает на антагонизм. Данные получены в результате трех независимых экспериментов.

Дополнительная фигура 1: Исследование проводилось в два основных этапа: эксперименты in vitro с использованием клеточной линии HepG2 и эксперименты in vivo на модели ксенотрансплантата у мышей NOD/SCID. In vitro клетки HepG2 обрабатывали сорафенибом, гемцитабином или их комбинацией в различных концентрациях. Пролиферацию клеток оценивали с помощью МТ-теста, а экспрессию ERK и p-ERK анализировали методом вестерн-блоттинга. In vivo модель ксенотрансплантата создавали путем подкожного введения клеток HepG2 мышам NOD/SCID. Мышей разделили на четыре группы лечения, которым ежедневно вводили препараты внутрибрюшинно. Объем опухоли измеряли на протяжении всего периода лечения. После эвтаназии ткани опухолей извлекали и подвергали иммуногистохимическому окрашиванию на VEGF. Все данные были статистически проанализированы с использованием программного обеспечения SPSS 19.0.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: Raw data.rar.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Рак печени характеризуется высоким уровнем смертности из-за скрытого начала, быстрого прогрессирования и ограниченного количества эффективных методов лечения3,15. Распространенный рак печени часто проявляет резистентность к химиотерапии и лучевой терапии, а современные варианты лечения, включая хирургическую резекцию и трансплантацию печени, остаются недостаточными15,16. Хорошо разработана практика сочетания двух или более химиотерапевтических препаратов с различными механизмами действия, что, как считается, значительно повышает эффективность и может стать альтернативной стратегией лечения15,16. Таргетные препараты, используемые в исследованиях рака печени, включают моноклональные антитела (анти-VEGF и анти-EGFR), ингибиторы тирозинкиназы и ингибиторы mTOR; основной проблемой является оптимальная интеграция существующих препаратов для повышения общей выживаемости и качества жизни17. Поиск комбинации эффективных и малотоксичных препаратов может помочь преодолеть текущие ограничения в лечении рака печени. Недавняя клеточная модель, демонстрирующая химиорезистентность к гемцитабину, показала, что чувствительность к гемцитабину/сорафенибу (ингибиторам EGFR) может быть восстановлена14. Этот результат представляет для нас большой интерес, так как данная научная тема остается малоизученной. С помощью дробного факторного планирования была определена оптимальная комбинация трех препаратов: гемцитабина (1.4 mmol/L), сорафениба (0.03 mmol/L) и S-1 (0.185 mmol/L), которая значительно подавляет пролиферацию клеток холангиокарциномы (CCA) и рост опухоли путем подавления пути AKT/mTOR и индукции апоптоза18. Awasthi и коллеги показали, что сорафениб подавлял фосфорилирование митоген-активируемой протеинкиназы (MEK), ERK1/2, рибосомальной протеинкиназы S6 70 кДа (p70S6K) и 4E-связывающего белка 1 (4EBP-1) в клетках протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC), а также подавлял пролиферацию клеток; при сочетании с гемцитабином наблюдались аддитивные антипролиферативные и проапоптотические эффекты в различных клетках, что значительно продлевало период выживаемости животных с опухолями19. Комбинированное лечение гемцитабином и сорафенибом ингибирует процесс эпителиально-мезенхимального перехода, дополнительно подавляя пролиферацию, миграцию и инвазию клеток немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), а также вызывая остановку клеточного цикла и апоптоз20. Однако, насколько нам известно, данное исследование является первым, в котором эта комбинация тестируется специально на базе модели HepG2 in vitro и модели подкожного ксенографта гепатоцеллюлярной карциномы.

Данное исследование было направлено на восполнение этого пробела путем изучения эффектов комбинации сорафениба, мультитаргетного ингибитора киназ, и гемцитабина, аналога цитидина, при раке печени как in vitro, так и in vivo. В этом исследовании сорафениб и гемцитабин по отдельности оказывали ингибирующее действие на пролиферацию клеток HepG2, при этом ингибирующий эффект комбинации двух препаратов был значительно сильнее, чем эффект одного препарата, что свидетельствует об аддитивном эффекте. Однако один только МТТ-тест не позволяет разграничить цитостатические (остановка роста) и цитотоксические (гибель клеток) эффекты, а также не дает прямых доказательств антипролиферативных механизмов. Среди них значение q- для группы комбинации сорафениба 3 µmol/L + гемцитабина 10 µmol/L превышало 1,15 в каждой временной точке, что указывает на синергический эффект. Сорафениб и гемцитабин по отдельности или в комбинации не вызывали значительного изменения экспрессии ERK в клетках HepG2, однако сорафениб как в монотерапии, так и в комбинации значительно подавлял экспрессию p-ERK. Комбинация двух препаратов аддитивно ингибировала фосфорилирование ERK в клетках HepG2. Эти данные указывают на связь между снижением уровня p-ERK и антипролиферативным эффектом комбинации, хотя причинно-следственная связь не была установлена. Синергия не была общим свойством комбинации при всех протестированных условиях, а наблюдалась только при одном конкретном соотношении концентраций. Результаты иммуногистохимического анализа на модели ксенографта рака печени у мышей NOD/SCID показали, что комбинация сорафениба и гемцитабина может значительно снизить экспрессию VEGF и уменьшить объем опухоли. Однако, поскольку данные о токсичности или массе тела систематически не собирались, мы не можем исключить вероятность того, что уменьшение объема опухоли частично обусловлено вызванной препаратами заболеваемостью, а не специфическими противоопухолевыми эффектами. Комбинация сорафениба и гемцитабина также была связана со снижением экспрессии VEGF в опухолевых тканях, что было показано методом иммуногистохимии. Это наблюдение предполагает потенциальный антиангиогенный эффект, но отсутствуют прямые доказательства снижения васкуляризации (например, анализ плотности микрососудов). Следовательно, вклад подавления VEGF в наблюдаемый антипролиферативный эффект остается корреляционным. Этот синергический эффект позволяет предположить, что комбинированная терапия может преодолеть ограничения монотерапии, которая часто приводит к лекарственной устойчивости и неэффективности лечения. Определение оптимальной комбинированной дозы сорафениба и гемцитабина является решающим шагом на пути к клиническому применению данной схемы лечения.

Молекулярные механизмы, лежащие в основе аддитивного эффекта сорафениба и гемцитабина, могут быть связаны с ингибированием пути ERK, о чем свидетельствует значительное снижение экспрессии p-ERK в группе комбинированной терапии. Известно, что путь ERK играет критическую роль в пролиферации, выживаемости и ангиогенезе клеток, что делает его ключевой мишенью для терапии рака. Результаты позволяют предположить, что комбинированная терапия может нарушать работу пути ERK более эффективно, чем монотерапия, что коррелирует с более выраженным снижением экспрессии p-ERK по сравнению с применением одного препарата. Исследования in vivo на мышиной модели NOD/SCID дополнительно подтверждают потенциальные терапевтические преимущества комбинированного лечения. Мы наблюдали значительное уменьшение объема опухоли и снижение экспрессии VEGF в группе комбинированной терапии. VEGF является основным драйвером ангиогенеза при ГЦК, и его ингибирование связано с замедлением роста и метастазирования опухоли. Снижение экспрессии VEGF в ответ на комбинированную терапию согласуется с гипотезой о том, что данный режим может модулировать ангиогенные процессы; однако прямые доказательства антиангиогенной активности в данном исследовании не оценивались. Наблюдаемая связь между снижением экспрессии p-ERK и антипролиферативным эффектом комбинации является многообещающей, но не устанавливает причинно-следственный механизм. Поскольку вестерн-блот-анализ проводился только в одной временной точке после длительного воздействия препаратов, он не позволяет зафиксировать ранние динамические изменения фосфорилирования ERK. Более того, интерпретация результатов ограничена отсутствием денситометрического количественного анализа, статистики на уровне повторностей, а также нормализации по общему ERK и контролю загрузки. Таким образом, хотя снижение p-ERK коррелирует с комбинированной терапией, вопрос о том, опосредует ли ингибирование пути ERK аддитивный эффект напрямую, остается неподтвержденным на основе текущих данных. Эти данные о механизме согласуются с новыми стратегиями, направленными на параллельные или компенсаторные пути для преодоления резистентности при ГЦК.

Несмотря на то, что данное исследование предоставляет ценные сведения о потенциальном аддитивном эффекте сорафениба и гемцитабина при раке печени, следует признать ряд его ограничений. Во-первых, размер выборки в данном исследовании относительно мал, что может ограничить возможность обобщения полученных результатов. Для подтверждения эффективности и безопасности комбинированного лечения на более разнообразной популяции пациентов потребуется исследование с более крупной когортой. Во-вторых, в работе использовалась клеточная линия HepG2, которая является общепризнанной моделью для изучения рака печени, однако она может не в полной мере отражать гетерогенность рака печени, наблюдаемую у пациентов. Различные подтипы рака печени и генетические особенности могут вызывать разный ответ на комбинированную терапию. Следовательно, полученные здесь результаты могут быть неприменимы ко всем типам рака печени, и перед формулированием более широких выводов необходима валидация с использованием дополнительных клеточных линий (например, Huh7 [клеточная линия гепатоцеллюлярной карциномы человека] и PLC/PRF/5 [клеточная линия гепатоцеллюлярной карциномы человека, также известная как клетки Александра] или ксенографтов, полученных от пациентов). В-третьих, эксперименты in vivo проводились с использованием мышиной модели NOD/SCID, у которой отсутствует иммунная система, что не позволяет полностью воспроизвести сложное опухолево-иммунное микроокружение при раке печени у человека. В будущих исследованиях следует использовать иммунокомпетентные мышиные модели или гуманизированные системы для лучшего понимания иммунологических аспектов лечения. В-четвертых, в данном исследовании не оценивались токсичность или профиль безопасности комбинации сорафениба и гемцитабина. Данные об изменении массы тела, токсичности для органов (например, тесты функции печени и почек) или нежелательных явлениях у мышей NOD/SCID не собирались. Таким образом, на основании текущих данных невозможно сделать выводы о безопасности или переносимости данной комбинации. В-пятых, утверждение об антиангиогенном действии является предварительным и не должно интерпретироваться избыточно. Хотя экспрессия VEGF была снижена качественно, мы не проводили количественного иммуногистохимического (ИГХ) анализа (например, определение H-score, процента положительной площади, интенсивности окрашивания или слепой цифровой анализ изображений в нескольких полях каждой опухоли). Более того, мы не оценивали плотность микрососудов с помощью эндотелиальных маркеров, таких как кластер дифференцировки 31 (CD31) или эндомуцин, и не проводили функциональных сосудистых тестов. Следовательно, текущие данные по VEGF не демонстрируют напрямую снижение ангиогенеза; они лишь показывают корреляционное снижение уровней белка VEGF. В-шестых, статистический анализ имеет несколько ограничений. Объем опухоли измерялся многократно у одних и тех же мышей в течение 20 дней, однако мы использовали однофакторный ANOVA только для конечных объемов, а не ANOVA с повторными измерениями или смешанную модель, учитывающую временную корреляцию. Нормальность распределения и однородность дисперсии формально не проверялись. Кроме того, хотя в данном исследовании была выявлена связь между снижением экспрессии p-ERK и аддитивным антипролиферативным эффектом сорафениба и гемцитабина, на основании этих данных нельзя сделать вывод о причинно-следственной связи. Анализ методом вестерн-блоттинга имеет ряд дополнительных ограничений: (i) исследовалась только одна поздняя временная точка (72 h), в то время как фосфорилирование ERK является ранним и транзиторным событием передачи сигнала; (ii) представлены репрезентативные блоты без денситометрического количественного анализа или статистического анализа по независимым биологическим повторностям; (iii) уровень p-ERK не был нормализован по общему ERK, а общий ERK не был последовательно и количественно нормализован по контролю нагрузки. Следовательно, эти данные носят преимущественно качественный характер и служат для генерации гипотез. Окончательная механистическая валидация потребует проведения экспериментов по восстановлению функции (например, конститутивная активация ERK с помощью мутантного MEK или использование активаторов ERK), чтобы проверить, приводит ли восстановление уровней p-ERK к ослаблению антипролиферативного эффекта комбинации. Серьезным ограничением является отсутствие глубокой молекулярной валидации. Мы не исследовали p-VEGFR, p-AKT или маркеры апоптоза. Данные по пути ERK являются качественными и не устанавливают причинно-следственную связь. Прежде чем делать какие-либо выводы о механизме действия, необходимы дополнительные исследования, специально разработанные для выяснения лежащего в основе механизма. Аналогично, нокдаун ERK с помощью siRNA или использование фармакологических ингибиторов, нацеленных на вышестоящие регуляторы (например, ингибиторов MEK), могли бы помочь установить, действительно ли наблюдаемый эффект зависит от ERK. Эти валидационные эксперименты вышли за рамки данного первичного исследования, но представляют собой критически важное направление для будущих работ. Другие ключевые пути, участвующие в пролиферации и выживании опухоли, такие как PI3K/AKT или связанные с ними нижестоящие факторы, не были изучены и также могут вносить вклад в наблюдаемые эффекты. Результаты исследования экспрессии VEGF являются предварительными и служат для генерации гипотез. Снижение интенсивности иммуноокрашивания VEGF дает важную подсказку о возможной модуляции ангиогенных путей, но не является убедительным доказательством антиангиогенного механизма. Мы особо предупреждаем читателей, что один лишь ИГХ-анализ VEGF, особенно без количественной оценки или подтверждающих сосудистых маркеров, не может установить антиангиогенный механизм. Отсутствие анализа маркеров эндотелиальных клеток и сосудистой функции является одним из основных ограничений данного исследования. Таким образом, для полного понимания механизма действия комбинированной терапии необходим более всесторонний анализ задействованных сигнальных путей, включая потенциальную роль других киназ и ангиогенных факторов.

Описанные здесь процедуры были оптимизированы для клеток HepG2 и мышей NOD/SCID. Воспроизводимость может варьироваться в зависимости от используемых клеточных линий или штаммов мышей. Ключевые факторы, влияющие на воспроизводимость, включают: (1) номер пассажа клеток (использовать пассажи до 20); (2) время инкубации с MTT (стандартизировать ровно до 4 h); (3) номера лотов антител (фиксировать для каждого эксперимента); и (4) подготовку оператора штангенциркуля (использовать одного и того же «слепого» оператора на протяжении всего исследования). Мы рекомендуем пользователям провести эксперименты с положительным контролем (например, только сорафениб в концентрации 6 µmol/L) для проверки правильности настройки системы перед тестированием комбинаций.

Данное исследование с помощью вестерн-блоттинга показало, что комбинированная терапия сорафенибом и гемцитабином значительно снижает экспрессию p-ERK в клетках HepG2, что указывает на модуляцию сигнального пути ERK; однако эти данные являются качественными и не устанавливают причинно-следственную связь. p-ERK широко используется в качестве функционального маркера активации пути ERK, и его снижение обычно интерпретируется как показатель снижения активности данного пути(11). Хотя мы не проводили дальнейшего анализа транскрипционных изменений нижележащих генов-мишеней (таких как c-Fos, c-Myc) с помощью ОТ-ПЦР, наблюдаемое снижение p-ERK обеспечивает корреляционную поддержку участия пути ERK, а не прямые механистические доказательства. Будущие исследования могут более детально раскрыть особенности регуляции нижележащей сети ERK с помощью анализа транскриптома или таргетной qPCR, что позволит улучшить понимание механизма комбинированного лечения. Кроме того, в данном исследовании основное внимание уделялось краткосрочным эффектам комбинированной терапии. Необходимы долгосрочные исследования для оценки стойкости ответа, возможного развития резистентности и отсроченной токсичности, связанной с лечением. Наконец, в данной работе не изучалась возможность сочетания сорафениба и гемцитабина с другими новыми стратегиями, такими как иммунотерапия или иные методы таргетной терапии, которые потенциально могли бы усилить терапевтический эффект. Будущие исследования должны быть направлены на изучение многокомпонентных комбинаций препаратов для разработки более эффективных схем лечения рака печени. Таким образом, несмотря на то что данное исследование указывает на многообещающий аддитивный эффект сорафениба и гемцитабина при раке печени, полученные результаты следует интерпретировать с учетом ограничений исследования. Необходимы дальнейшие исследования для валидации этих результатов и их внедрения в клиническую практику с целью улучшения исходов лечения и оценки потенциальных побочных эффектов у пациентов с раком печени.

В заключение, данное исследование предоставляет предварительные доказательства того, что комбинация сорафениба и гемцитабина проявляет антипролиферативную активность и связана со снижением экспрессии VEGF в клетках HepG2 и в ксенографтной модели на мышах NOD/SCID. Однако данные по VEGF являются качественными и не демонстрируют напрямую антиангиогенные эффекты; следовательно, любые утверждения об антиангиогенной активности на данном этапе остаются необоснованными. Несмотря на то, что данные указывают на связь между снижением экспрессии p-ERK и антипролиферативным эффектом комбинации, причинно-следственные механизмы еще предстоит установить. С учетом отмеченных здесь ограничений метода вестерн-блоттинга, механистическая роль пути ERK в данной комбинации на текущем этапе остается гипотетической. Комбинация сорафениба и гемцитабина заслуживает дальнейшего изучения, включая эксперименты по восстановлению функции сигнального пути и тестирование на дополнительных моделях рака печени, чтобы определить, является ли ингибирование пути ERK действительно ключевым медиатором наблюдаемого синергизма. Клиническая значимость применения сорафениба в сочетании с гемцитабином должна быть оценена в сравнении с современными стандартами в будущих доклинических и клинических исследованиях, особенно в контексте сорафениб-резистентных опухолей или в ситуациях, когда сорафениб остается доступным вариантом клинической терапии.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о наличии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы не имеют благодарностей.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Система цифрового гель-имиджингаBio-Rad Laboratories, Inc., USA1708280
Среда DMEM с высоким содержанием глюкозыHyClone, USASH30243.01
Кроличьи моноклональные антитела к ERKSanta Cruz, USAsc-94
Фетальная бычья сывороткаZhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd., China11011-8611/11011-8615
Инвертированный флуоресцентный микроскопOlympus, JapanIX73
Кроличьи поликлональные антитела к GAPDHSanta Cruz, USAsc-25778
ГемцитабинEli Lilly and Company95058-81-4
Козьи вторичные антитела против кроликаShanghai Shenggong Biological Engineering Co., Ltd., ChinaD111018
Программное обеспечение ImageJ National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA Version 1.8.0_112
Микропланшетный ридерThermo Fisher Scientific Inc., USAMK3
Кроличьи моноклональные антитела к p-ERKSanta Cruz, USA9106
Центрифуга с охлаждениемChangsha Xiangyi Centrifuge Co., Ltd.DL-5M
Лизирующий буфер RIPABiyuntian Biological Technology Research Institute, ChinaP0013B
Ротационный микротомLeica, GermanyCM3050
СорафенибBayer Company, Germany284461-73-0
Тиазолиловый синий (MTT)Sigma, USAM5655
Трехгазовый инкубаторThermo Fisher Scientific Inc., USA51026402
Кроличьи моноклональные антитела к VEGFBioLegend, USAB199116

Ссылки

  1. Fujii T, Kuzuya T, Kondo N, Funasaka K, Ohno E, Hirooka Y, et al. Altered intestinal Streptococcus anginosus and 5α-reductase gene levels in patients with hepatocellular carcinoma and elevated Bacteroides stercoris in atezolizumab/bevacizumab non-responders. J Med Microbiol. 2024;73(9):001878.
  2. Gay MD, Drda JC, Chen W, Huang Y, Yassin AA, Duka T, et al. Implicating the cholecystokinin B receptor in liver stem cell oncogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2024;326(3):G291-g309.
  3. Diao X, Guo C, Jin Y, Li B, Gao X, Du X, et al. Cancer situation in China: an analysis based on the global epidemiological data released in 2024. Cancer Commun (Lond). 2025;45(2):178-97.
  4. Yokota S, Yonezawa T, Momoi Y, Maeda S. Sorafenib inhibits tumor cell growth and angiogenesis in canine transitional cell carcinoma. J Vet Med Sci. 2022;84(5):666-74.
  5. Nassar-Reis JP, Umeta PF, Stefano JT, Longatto-Filho A, Carrilho FJ, Alves VAF, et al. P53 and VEGF are promising biomarkers for sorafenib efficacy in an experimental model of NASH-related HCC. J Mol Histol. 2023;54(5):473-88.
  6. Taha AM, Aboulwafa MM, Zedan H, Helmy OM. Ramucirumab combination with sorafenib enhances the inhibitory effect of sorafenib on HepG2 cancer cells. Sci Rep. 2022;12(1):17889.
  7. Ning L, Tian Y, Chen D, Han J, Xie G, Sun J. Sorafenib safety evaluation: Real-world analysis of adverse events from the FAERS database. Heliyon. 2024;10(18):e37348.
  8. Vij P, Hussain MS, Satapathy SK, Cobos E, Tripathi MK. The emerging role of long noncoding RNAs in sorafenib resistance within hepatocellular carcinoma. Cancers (Basel). 2024;16(23):3904.
  9. Lu X, Chen Z, Mi W, Zheng J, Liu Y. MARK1 suppress malignant progression of hepatocellular carcinoma and improves sorafenib resistance through negatively regulating POTEE. Open Med (Wars). 2024;19(1):20241060.
  10. Lee HJ, Lee JS, So H, Yoon JK, Choi JY, Lee HW, et al. Comparison between nivolumab and regorafenib as second-line systemic therapies after sorafenib failure in patients with hepatocellular carcinoma. Yonsei Med J. 2024;65(7):371-9.
  11. Tang W, Chen Z, Zhang W, Cheng Y, Zhang B, Wu F, et al. The mechanisms of sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma: theoretical basis and therapeutic aspects. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):87.
  12. Lin Q, Guan S, Peng M, Yu H. A mesoporous silica-based nano-drug co-delivery system with gemcitabine for targeted therapy of pancreatic cancer. J Coll Physicians Surg Pak. 2024;34(12):1456-63.
  13. Tang J, Liu Z, Xie G, Wang C, Jiang Y. POU4F1 enhances lung cancer gemcitabine resistance by regulating METTL3-dependent TWF1 mRNA N6 adenosine methylation. 3 Biotech. 2025;15(1):7.
  14. Cheng J, Zhu T, Liu S, Zhou J, Wang X, Liu G. Prediction of synergistic gemcitabine-based combination treatment through a novel tumor stemness biomarker NANOG in pancreatic cancer. RSC Med Chem. 2024;15(11):3853-61.
  15. Man S, Luo C, Yan M, Zhao G, Ma L, Gao W. Treatment for liver cancer: From sorafenib to natural products. Eur J Med Chem. 2021;224:113690.
  16. Llovet JM, Pinyol R, Kelley RK, El-Khoueiry A, Reeves HL, Wang XW, et al. Molecular pathogenesis and systemic therapies for hepatocellular carcinoma. Nat Cancer. 2022;3(4):386-401.
  17. Bronte F, Bronte G, Cusenza S, Fiorentino E, Rolfo C, Cicero G, et al. Targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Curr Med Chem. 2014;21(8):966-74.
  18. Li H, Zhang Z, Zhou Z, Ding X, Zhou G. Optimal combination of gemcitabine, sorafenib, and S-1 shows increased efficacy in treating cholangiocarcinoma in vitro and in vivo. Anticancer Drugs. 2016;27(7):600-8.
  19. Awasthi N, Zhang C, Hinz S, Schwarz MA, Schwarz RE. Enhancing sorafenib-mediated sensitization to gemcitabine in experimental pancreatic cancer through EMAP II. J Exp Clin Cancer Res. 2013;32(1):12.
  20. Jiang S, Wang R, Zhang X, Wu F, Li S, Yuan Y. Combination treatment of gemcitabine and sorafenib exerts a synergistic inhibitory effect on non-small cell lung cancer in vitro and in vivo via the epithelial-to-mesenchymal transition process. Oncol Lett. 2020;20(1):346-56.

Перепечатки и разрешения

Теги

Рак печенисорафениб гемцитабинмыши NOD SCIDМТТ-тестэкстракция белкаSDS-PAGEэкспрессия ERKиммуногистохимия VEGF
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.