Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация ГАМКергических нейронов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток с использованием экспрессии доксициклин-индуцируемого ASCL1/DLX2 на AAVS1

86 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71804

⸱

31 июля 2026 г.

 , 
1Centre de recherche Azrieli du CHU Sainte-Justine, 2Department of Neurosciences, Universite de Montreal

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает метод генерации ГАМКергических нейронов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток путём интеграции доксициклин-индуцируемых трансгенов в AAVS1. Безопасный гавань. Стабильная, однородная экспрессия трансгенов обеспечивает эффективный подход к прямой дифференцировке в ГАМКергические нейроны, одновременно ограничивая заглушание трансгенов — распространённую проблему лентивирусных методов.

Аннотация

Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) предоставляют беспрецедентную возможность моделировать неврологические заболевания человека in vitro. Надёжная генерация определённых нейронных популяций, таких как гамма-аминомасляная кислота (ГАМКергические) нейроны, крайне важна для этих исследований. Этот протокол подробно описывает надёжный метод дифференцировки hiPSC в ГАМКергические нейроны с помощью доксициклин-индуцируемой системы. Подход основан на стабильной интеграции трансгенов, кодирующих транскрипционные факторы ASCL1 и DLX2 , в безопасный локус интеграции адено-ассоциированных вирусов 1 (AAVS1) через CRISPR/Cas9-опосредованное knock-in. Эта целевая интеграция позволяет избежать заглушания трансгена, часто наблюдаемого при случайной лентивирусной интеграции. Протокол охватывает поддержание hiPSC, процесс нуклеофекции для интеграции трансгенов, отбор пуромицинов для обогащения успешно спроектированных клеток и пошаговую процедуру дифференцировки. После индукции доксициклином инженерные хиПСК быстро выходят из клеточного цикла, приобретают морфологию нейронов и экспрессируют маркеры ГАМКергической линии в течение 21 дня. Ключевые этапы включают нейроиндукцию и последующее созревание с использованием специфических факторов роста, а также возможные подходы для улучшения клеточной адгезии во время созревания. Этот стандартизированный метод даёт обогащённые популяции индуцированных нейронов, экспрессирующих маркеры ГАМКергической линии, предоставляя ценный инструмент для нейронаучных исследований и клеточного моделирования.

Введение

Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) предоставляют уникальную платформу для моделирования неврологических заболеваний человека in vitro и для изучения сложных молекулярных механизмов, определяющих развитие идегенерацию 1. Эта технология позволяет создавать специфические для пациента клеточные модели для изучения широкого спектра состояний — от ранних нейроразвивающихся аномалий при синдромных цилиопатиях2 до тонких эпигеномных изменений, наблюдаемых при спорадической болезни Альцгеймера3. В результате направленная дифференцировка hiPSC стала краеугольным камнем современной молекулярной нейронауки.

Для эффективного отражания нюансов человеческих неврологических процессов необходимо генерировать высокоспецифические и чистые нейронные подтипы. Например, для выяснения специфических транскрипционных ролей белков, таких как MECP2, в человеческихнейронах 4 или для оценки целевых уязвимостей периферических сенсорных нейронов к вирусным инфекциям, таким как SARS-CoV-2-5. Кроме того, построение сложных, физиологически значимых микроокружений, таких как включение функциональной микроглии в трёхмерные органоиды мозга, в основном опирается на устойчивое, предсказуемое формирование отдельных нейронных и глиальныхлиний 6. Среди этих подтипов ГАМКергические нейроны представляют особый интерес из-за их ключевой тормозной роли в центральной нервной системе и их влияния на различные неврологические и психиатрическиерасстройства 7. Общая цель этого метода — предоставить надёжный, эффективный и воспроизводимый протокол направленной дифференцировки hiPSC в индуцированные нейроны, экспрессирующие маркеры ГАМКергической линии. Традиционные направленные протоколы дифференцировки для ГАМКергических нейронов, основанные на внешних сигнальных молекулах, могут быть трудоёмкими, сильно варьируемыми и приводить к гетерогенным популяциямклеток 8.

Для преодоления этих ограничений появилось мощная альтернатива 9 с использованием транскрипционных факторов вперёдпрограммирования. Этот протокол использует систему экспрессии, индуцируемую доксициклином, для стимулирования экспрессии транскрипционных факторов ASCL1 и DLX210. Нацеливая эти трансгены на безопасное место интеграции с аденоассоциированным вирусом 1 (AAVS1) с помощью CRISPR/Cas9, этот метод обходит распространённую проблему заглушания трансгенов, связанную с случайной лентивируснойинтеграцией 10. Донорская конструкция включает флуоресцентный репортёр, такой как mCherry, для мониторинга трансгенно-положительных клеток после отбора. Эта стратегия направлена на поддержку более однородной экспрессии трансгенов по сравнению с методами случайной интеграции, хотя для каждой инженерной линии следует проверять стабильность экспрессии и воспроизводимость дифференциации. Этот стандартизированный метод генерирует обогащённые популяции индуцированных нейронов, экспрессирующих ГАМКергические линейные маркеры, примерно за 21 день, что короче, чем у традиционных маломолекулярныхподходов 8,10. Этот протокол крайне подходит для исследователей, которым необходимы масштабируемые, согласованные нейронные популяции для последующих применений, таких как микроскопия с высоким содержанием, одноклеточная транскриптомика или функциональные физиологические анализы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ВНИМАНИЕ: Человеческие hiPSC культуры следует рассматривать как потенциально биологически опасный материал в рамках институциональных процедур биобезопасности. Выполнять все процедуры по культуре hiPSC человека в сертифицированном биологическом шкафу класса II с использованием стерильной техники. Все отходы, содержащие человеческие клетки, среду, подвергающиеся воздействию человеческих клеток, и материал плазмиды CRISPR/Cas9 должны быть деконтаминированы в соответствии с местными рекомендациями по биобезопасности перед утилизацией. Доксициклин, пуромицин, ДМСО и другие химические реагенты должны использоваться в перчатках и с соответствующей защитой глаз и кожи, а отходы должны утилизироваться в соответствии с институциональными процедурами по химическим отходам. Экстракт базальной мембраны (БМЭ) следует обрабатывать стерильной техникой и хранить на льду перед использованием, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию. Хранение жидкого азота и криовиальное обращение следует проводить с помощью соответствующих криогенных перчаток, защиты лица и с осторожностью, чтобы избежать ожогов или взрыва флакона во время отмораивания.

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед редактированием и дифференциацией нейронов с помощью CRISPR/Cas9 культуры hiPSC должны соответствовать заранее заданным критериям контроля качества. Клетки должны быть подтверждены отрицательными на микоплазму, иметь нормальный кариотип или приемлемый профиль целостности генома, а также поддерживать устойчивую экспрессию маркеров плюрипотентности, включая OCT4, SOX2, NANOG, TRA-1-60 и/или SSEA4. Культуры должны обладать типичной морфологией компактной hiPSC колонии, с высоким соотношением ядра к цитоплазме, чёткими границами колоний и минимальной спонтанной дифференцировкой. Следует использовать только активно размножающиеся культуры в рекомендуемом диапазоне проходов, а клетки не должны превышать лабораторно установленного максимального количества проходов, обычно ниже прохода 40, если не подтверждено иное. Культуры с аномальной морфологией, чрезмерной спонтанной дифференциацией, слабым ростом, подтверждённым загрязнением или признаками геномной нестабильности следует исключать из экспериментов по редактированию и дифференцированию. Все материалы, необходимые для этого протокола, включая рецепты носителей, перечислены в таблице материалов.

1. Подготовка реагентов и культивных пластин

  1. Подготовьте замораживающую среду, объединив 40 мл замены сыворотки с выбивающейся сывороткой (KOSR) и 10 мл диметилсульфоксида (DMSO) в конической трубке объемом 50 мл.
  2. Гомогенизируйте заморожительную среду, прокручив пипетом 10 раз. Храните раствор при 4 °C до месяца.
  3. Разведите экстракт базальной мембраны (BME) в среде Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) компании Dulbecco при конечной концентрации 80 мкг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед разбавыванием проверьте концентрацию полученного BME-раствора по номеру партии на сайте поставщика.
  4. Добавьте 1 мл разбавленной BME в одну скважину в пластину на 6 колодц. Немедленно верните стандартный BME до 4 °C на срок до 1 месяца.
  5. Наклоните пластину, чтобы раствор равномерно распределился по всей поверхности скважин. Убедитесь, что нет непокрытых участков.
  6. Инкубировать тарелку минимум 30 минут при 37 °C перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Максимального времени инкубации нет. Если инкубация длится более 1 дня, убедитесь, что DMEM/F-12 не испаряется. Раствор BME, используемый для одной скважины, может быть повторно использован только один раз для покрытия второй скважины. Манипуляция BME при комнатной температуре должна быть кратковременной из-за его быстрой полимеризации.

2. Обслуживание и передача hiPSC

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе среда обслуживания hiPSC относится к mTeSR plus. mTeSR plus является рекомендуемым средством для регулярного поддержания, пассажа, восстановления после нуклеофекции и выбора пуромицина.

  1. Проводите проход hiPSC примерно каждые 4–6 дней, когда клетки достигнут 60% слияния.
  2. Аспирируйте культурную среду из колодцев с помощью аспирационной пипетки.
  3. Добавьте 1 мл ReLeSR в скважину и инкубируем 30 секунд при комнатной температуре.
  4. Аспирировать диссоциационный реагент и инкубировать пластину в течение 8 минут при 37 °C.
  5. Аккуратно добавьте 1 мл среды для поддержания hiPSC с помощью пипетки объемом 5 мл. Соберите подвеску камеры в трубку объёмом 50 мл.
  6. Смешайте 10 мкл суспензии клетки с 10 мкл трипан-синего в микроцентрифугной трубке. Загрузите 10 мкл смеси на стекло ячейки, чтобы определить жизнеспособную концентрацию ячейки.
  7. Аспирируйте BME покрытие из предварительно подготовленной скважины. Добавьте 2 мл среды для поддержания hiPSC, дополненную ингибитором скрученной киназы (ROCK) с ассоциированной Rho (Y-27632; 10 мкм финала).
  8. Засейте 100 000 hiPSC в колодцу, стремясь к >90% жизнеспособности. Двигайте пластину в виде восьмёрки, чтобы обеспечить однородное распределение ячеек.
  9. Инкубировать клетки при 37 °C с 5%CO2.
  10. Через 24 часа замените среду на 2 мл свежего mTeSR плюс среды без ингибитора ROCK.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В присутствии ингибитора ROCK ожидается временное изменение морфологии клетки (удлинение клетки). Проверьте, что клетки восстанавливают свою характерную морфологию после удаления.

3. Нуклеофекция hiPSC

  1. Пропустите клетки, когда слияние достигнет около 60%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе примерно 60% слияния соответствуют активно растущим колониям hiPSC, покрывающим чуть более половины поверхности скважины, с видимым пространством между колониями и минимальной спонтанной дифференциацией. Колонии не должны быть переросшими, сильно слияться или иметь плотные, многослойные центры на момент нуклеофекции.
  2. Убедитесь, что устройство для нуклеофекции включено, а добавка для нуклеофекции добавлена в раствор нуклеофекции P3. Приготовьте ведро для льда.
  3. Добавьте 110 мкл нуклеофекционного раствора P3 в микроцентрифугную трубку, помещённую на лёд.
  4. Добавьте 1 мкг плазмиды CRISPR/Cas9 и 1 мкг донорской плазмиды, содержащей доксициклин-индуцируемый ASCL1-P2A-DLX2. кассета, флуоресцентный репортер и пуромицинорезистентную кассету. Аккуратно перемешивайте, не добавляя пузырей.
  5. Подготовьте целевую пластину, аспирируя BME из двух покрытых скважин. Добавьте в каждую скважину 2 мл среды для поддержания hiPSC, содержащего ингибитор ROCK, и инкубируете пластину при 37 °C.
  6. Диссоциировать hiPSC при 60% слиянии из скважины пластины с 6 лунками, как описано в шагах 2.2–2.5. Перенесите свеску в стерильную трубку и центрифугу на 5 минут при 500 г при комнатной температуре.
  7. Отбросить супернатант и снова суспензировать клеточную гранулу в 110 мкл нуклеофекционного раствора P3, содержащего плазмиды. Аккуратно выбейте пипетки, чтобы избежать образования пузырей.
  8. Перенесите 100 мкл суспензии клетки в нуклеофекционную кювету, помещённую на лёд.
  9. Вставьте кювету в нуклеофекторное устройство и запустите программу CB-150 для hiPSC.
  10. Немедленно доберите клетки с помощью пластиковой пипетки Пастера. Перенесите равные объёмы суспензии ячейки в две ранее подготовленные скважины.
  11. Распределить клетки с помощью восьмирообразного движения и инкубировать при 37 °C.
  12. Через 24 часа замените среду на mTeSR плюс среду без ингибитора ROCK. Проверьте эффективность нуклеофекции, наблюдая флуоресценцию, если применимо.

4. Отбор антибиотиков

ВНИМАНИЕ: Пуромицин токсичен. Обращайтесь с соответствующими средствами индивидуальной защиты и утилизируйте отходы в соответствии с институциональными рекомендациями.

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед выбором отредактированных hiPSC определите оптимальную концентрацию пуромицина для каждой линии hiPSC. Посеять нередактированные hiPSC по 100 000 клеток на скважину в 6-колодцеванной пластине с покрытием BME в поддерживающей среде hiPSC, дополненной ингибитором ROCK. Через 24 часа замените среду свежей поддерживающей средой hiPSC с пуромицином при 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 и 1,5 мкг/мл. Заменить пуромицинсодержащий среднесуточный препарат и контролировать морфологию и выживаемость клеток с помощью микроскопии Brightfield в течение 5 дней. Выбранная концентрация должна устранить все неотредактированные hiPSC в течение 3–5 дней, минимизируя чрезмерную токсичность. В этом протоколе оптимальная концентрация пуромицина обычно составляет 0,4–0,6 мкг/мл.

  1. Ждите 3 прохода после нуклеофекции, обычно примерно 1–2 недели в зависимости от восстановления и скорости роста, чтобы предотвратить потерю неинтегрированных плазмид перед началом отбора.
  2. Проведите прохождение клетки и засейте по 100 000 клеток в каждую скважину.
  3. Через 24 часа добавьте пуромицин в концентрации, определяемой кривой убийства, обычно 0,4–0,6 мкг/мл.
  4. Поддерживайте отбор пуромицинов в течение заранее определённого времени, обычно около 5 дней.
  5. Валидировать выбранную популяцию с помощью флуоресцентной микроскопии или потоковой цитометрии для оценки доли репортер-положительных клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Применяйте только объединённые популяции, демонстрирующие в целом однородную экспрессию репортеров, желательно >80–90% положительных репортерных клеток. Если репортерное выражение остаётся мозаично, расширите отбор, повторите обогащение или рассмотрите клональную изоляцию перед дифференциацией.
  6. Подтвердите правильное нацеление AAVS1 с помощью соединения ПЦР перед началом дифференцировки нейронов.
  7. Когда требуется строгая валидация, проверяйте продукты ПЦР с помощью секвенирования Сэнгера и оценивайте номер трансгенной копии с помощью qPCR, ddPCR или другого соответствующего анализа с номером копии.
  8. Оценивать случайную интеграцию с помощью ПЦР-тестов для плазмидных последовательностей или более широкого анализа интеграции по всему геному, в зависимости от предполагаемого дальнейшего применения.
  9. Подтвердите, что выбранная популяция hiPSC остаётся микоплазмоотрицателной, сохраняет типичную морфологию колонии hiPSC и сохраняет устойчивый рост после отбора пуромицина.
  10. Переоценить целостность генома с помощью кариотипирования, SNP-массива или другого валидированного анализа, особенно когда редактированные клетки будут использоваться для моделирования заболеваний, функциональных тестов или долгосрочных исследований.
  11. Оценивать потенциальные нецелевые эффекты CRISPR/Cas9 с помощью целевого секвенирования прогнозируемых внецелевых участков или, при необходимости, более широких геномных подходов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте культуры для дифференцировки, если они имеют аномальную морфологию, плохое восстановление после отбора, устойчивую мозаичную экспрессию репортёров, подтверждённые геномные аномалии или неудачную интеграцию AAVS1 . В этом протоколе выбранные инженерные hiPSC используются как объединённая популяция и могут быть криоконсервированы до индукции доксициклина, после получения репортерной экспрессии AAVS1. Таргетирование, морфология и рост подтверждены. Криоконсервация после индукции доксициклина или во время созревания нейронов не входит в стандартный рабочий процесс и должна быть эмпирически проверена перед использованием.

5. Дифференциация на ГАМКергические нейроны

  1. Подготовьте необходимое количество скважин с покрытием BME. Обратите внимание, что один хорошо посеянный на 0-й день даст один источник ГАМКергических нейронов.
  2. Подготовьте 6,9 мл нейроиндукционной среды на каждую скважину, дополняя её доксициклином (1 мкг/мл). Добавьте 15% избыточный объём, чтобы учесть ошибки испарения или пипетирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Доксициклин используется в конечной концентрации 1 мкг/мл, начиная с 0-го дня, и поддерживается на протяжении всего дифференцировки и созревания. Свежая среда, содержащая доксициклин, готовится при каждом смене среды для поддержания стабильной индукции трансгенов. Эта доза была выбрана потому, что она обеспечивала устойчивую экспрессию репортеров и эффективное преобразование нейронов в наших руках. Формальный дозово-ответ доксициклина в этом протоколе не выполнялся; поэтому лаборатории, адаптирующие этот метод, могут эмпирически проверять 0,1–2 мкг/мл доксициклина, если индукция трансгенов кажется неоптимальной.
  3. В первый день диссоциировать инженерные hiPSC и засеять 200 000 клеток в подготовленные скважины с покрытием BME. Инкубировать при 37 °C.
  4. На 1, 2 и 3 дни аспирируйте среду и добавляйте 2 мл свежей нейроиндукционной среды с доксициклином.
    ПРИМЕЧАНИЕ: К третьему дню расширение клеток должно заметно уменьшиться, и могут начать появляться дендритные структуры. Если требуется экспериментальное подтверждение выхода из клеточного цикла, иммунное окрашивание Ki-67 или интеграция EdU/BrdU может быть проведено на 3–4 день.
  5. На четвёртый день подготовьте нейро-созревающую среду, содержащую нейротрофический фактор, полученный из мозга (BDNF), нейротрофический фактор, полученный по глиальным клеточным линиям (GDNF) и нейротрофин-3 (NT-3), каждый с конечной концентрацией 10 нг/мл, доксициклин при 1 мкг/мл и PluriSln при 20 мкм.
  6. Аспирировать нейроиндукционную среду. Аккуратно добавляйте 2 мл нейро-созревающей среды капель-каплю вдоль стенки колодца, чтобы не беспокоить новообразованные нейроны.
  7. На седьмой день аспирируйте среду и аккуратно добавьте 2 мл нейросозреваемой среды, содержащей нейротрофины и доксициклин, но без плюрипотентного ингибитора выживания клеток.
  8. Для длительного поддержания полностью заменяйте нейро-созревающую среду каждые 3–4 дня, адаптируя частоту в зависимости от плотности клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 21-й день — стандартная конечная точка оценки ГАМКергической нейронной идентичности. К 21-му дню клетки должны проявлять ГАМКергические нейронные особенности, включая DLX1.экспрессии и продолжают развивать свои аксональные сети. Плотность посева в 200 000 клеток/скважина была отобрана эмпирически для получения хорошо расположенных колоний при избежании перенаселённости и гибели клеток, связанных с созреванием. Плотности от 150 000 до 300 000 ячеек на яме совместимы, при этом меньшие плотности предпочитаются для морфологии и более высокие плотности для извлечения материала. Для уменьшения отслоения проводите более частые замены полусредней формы с помощью пипетки объёмом 1000 мкл при низком потоке без наклона пластины. При необходимости клетки могут быть повторно покрыты один раз после трёхдневной индукции доксициклина, до добавления среды созревания, используя усиленные покрытия, такие как поли-L-лизин/ламинин или ламинин-521. Дальнейшее спускание после начала созревания следует избегать.
  9. Культуры могут сохраняться после 21-го дня для длительного созревания, если сети останутся прикреплёнными, жизнеспособными и свободными от размножающихся колоний, похожих на hiPSC. После 21-го дня проводите замены полусредних форм каждые 3–4 дня с помощью свежей нейросозреваемой среды, содержащей доксициклин и нейротрофические факторы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте культуры для последующих анализов, когда морфология нейронов и нейритные сети стабилизируются, отслоение минимально и не видно недифференцированных колоний. В наших руках культуры обычно применяются между 21-м и 35-м днём.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешное применение этого протокола приводит к образованию обогащённой популяции индуцированных нейронов с ГАМКергическими молекулярными особенностями. Стратегия основана на целенаправленной вставке кассеты ASCL1-P2A-DLX2, индуцируемой доксициклином, в локус AAVS1 (рисунок 1A). После выбора инженерных hiPSC индукция доксициклина используется для обеспечения дифференцировки ГАМКергических нейронов, как показано в хронологии, показан...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Успешное создание ГАМКергических нейронов во многом зависит от нескольких критически важных этапов в рамках этого протокола. Поддержание высококачественных, недифференцированных hiPSC имеет первостепенное значение; Спонтанная дифференцировка перед нуклеофекцией резко снижает эффективность интеграции и чистоту нейронов на последующихэтапах 8. Кроме того, точное определение кривой уничтожения пуромицина крайне важно для полного устранения неинтегрированных клеток бе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих финансовых интересах.

Благодарности

Поддержку предоставляли программа ECR Канадской сети стволовых клеток и Фонд UdeM pour le partenariat CHU Sainte-Justine - Institut Imagine en épilepsie de l'enfant. Тео Рабин поддерживается сетью Odisé.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4D-Nucleofector™ Core UnitLonzaAAF-1002BДля электропорации/нуклефекции hiPSCs.
6-well culture platesSarstedt83.3920300Пластина для тканевой культуры, обработанная для поддержания и дифференцировки hiPSC.
BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)STEMCELL Technologies78005Рекомбинантный человеческий белок для нейрональной матурации; готовьте в соответствии с инструкциями производителя и используйте в конечной концентрации 10 нг/мл.
Cell counter (Countess)Thermo Fisher ScientificC10283Используется для подсчета клеток.
CentrifugeVWR76468-134Для центрифугирования клеток.
CO2 incubatorThermo Fisher ScientificHeracell VIOS 160i или эквивалентИнкубатор для культур клеток, поддерживающий 37 °C, влажную атмосферу и 5% CO2.
CryotubesThermo Fisher Scientific5000-0020Стерильные криогенные флаконы для замораживания hiPSC; могут быть использованы эквивалентные криовиалы с внешней резьбой объемом 1,8–2,0 мл.
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane ExtractBio-TechneBME001-05Стандартная матрица покрытия BME, используемая в протоколе. Проверьте концентрацию запаса, указанную для партии, в сертификате анализа Bio-Techne и разбавьте в DMEM/F-12 до рабочей концентрации 80 мкг/мл.
DMEM/F-12Wisent319-090-CLБазальная среда, используемая для разбавления BME.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)Sigma-AldrichD2650Криопротектор, используемый при приготовлении замораживающей среды.
Donor plasmid: inducible ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 targeting cassetteCustom plasmidAddgene accession pendingКассета с индуцируемой ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1, содержащая элементы селекции/репортера. Предоставьте карту плазмиды и полную последовательность как вспомогательный файл или по запросу.
Doxycycline hyclateSigma-AldrichD9891Используется для индукции экспрессии ASCL1-P2A-DLX2. Приготовьте стерильный резервный раствор, разделите на порции, защитите от света, храните замороженным и используйте в конечной концентрации 1 мкг/мл.
Ethanol (70%)Commercial Alcohols / Greenfield GlobalP016EAANДля стерилизации внутри кабинета биологической безопасности; используйте утвержденный институциональный 70% этанол или эквивалент.
Fluorescence microscopeECHORevolve R4Микроскоп, используемый для фазовой контрастной и флуоресцентной визуализации экспрессии репортера и морфологии нейронов.
GDNF (Glial-Derived Neurotrophic Factor)STEMCELL Technologies78058Рекомбинантный человеческий белок для нейрональной матурации; готовьте в соответствии с инструкциями производителя и используйте в конечной концентрации 10 нг/мл.
hiPSC line PGP1EditCo BioPGP1 human iPSC lineКоммерчески доступная человеческая линия iPSC с открытым согласием, используемая в этом протоколе; запишите номер пассажей и статус контроля качества перед редактированием и дифференцировкой.
Image-analysis softwareImageJ/FijiОткрытый исходный код; должна быть указана версия, использованнаяДля количественного анализа флуоресценции и обработки репрезентативных изображений.
KnockOut™ Serum Replacement (KOSR)Thermo Fisher Scientific10828028Используется при приготовлении замораживающей среды.
Laminin-521STEMCELL Technologies200-0117Опциональный реагент для устранения проблем. Не является частью стандартного протокола покрытия; может быть использован как альтернатива или матрица двойного покрытия, если сохраняется отслоение нейронов.
Liquid nitrogen dewarThermo Fisher ScientificLocator 6 Plus или эквивалентДолгосрочное хранение замороженных hiPSC в газовой фазе или жидком азоте в соответствии с институциональными процедурами криобезопасности.
Mr. Frosty™ Freezing ContainerThermo Fisher Scientific5100-0001Для контролируемого замораживания клеток при -80 °C.
mTeSR™ PlusSTEMCELL Technologies100-0276Среда для поддержания hiPSC без кормилки.
Neuro-induction mediumSTEMCELL Technologies08582Коммерческая среда для нейрональной индукции.
Neuro-maturation base medium (BrainPhys™ Neuronal Medium)STEMCELL Technologies05790Базовая среда для нейрональной матурации; добавьте BDNF, GDNF, NT-3, доксициклин и PluriSln-1, как описано в протоколе.
NT-3 (Neurotrophic Factor 3)STEMCELL Technologies78074Рекомбинантный человеческий белок для нейрональной матурации; готовьте в соответствии с инструкциями производителя и используйте в конечной концентрации 10 нг/мл.
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X KitLonzaV4XP-3024Набор, содержащий Solution P3 и куветы для нуклеофекции hiPSC.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific1514012

Ссылки

  1. Mertens J, Marchetto MC, Bardy C, Gage FH. Evaluating cell reprogramming, differentiation, and conversion technologies in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 2016 Jul;17(7):424-37.
  2. Barabino A, Flamier A, Hanna R, Héon E, Freedman BS, Bernier G. Deregulation of Neuro-Developmental Genes and Primary Cilium Cytoskeleton Anomalies in iPSC Retinal Sheets from Human Syndromic Ciliopathies. Stem Cell Reports. 2020 Mar 10;14(3):357-73.
  3. Katbe A, Hanna R, Flamier A, Serhani D, Hamam R, Barabino A, et al. Epigenomic alterations and neural development anomalies in induced pluripotent stem cells from sporadic Alzheimer’s disease. Development. 2026 Jan 1;153(1):dev204910.
  4. Liu Y, Flamier A, Bell GW, Diao AJ, Whitfield TW, Wang HC, et al. MECP2 directly interacts with RNA polymerase II to modulate transcription in human neurons. Neuron. 2024 Jun;112(12):1943-1958.e10.
  5. Flamier A, Bisht P, Richards A, Tomasello DL, Jaenisch R. Human iPS cell-derived sensory neurons can be infected by SARS-CoV-2. iScience. 2023 Sep 15;26(9).
  6. Wogram E, Sümpelmann F, Khalil A, Flamier A, Fu D, Bell GW, et al. Human iPSC-Derived Microglia Integrate Into Cerebral Organoids and Assume an In Vivo-Like Phenotype. Eur J Neurosci. 2025 Nov;62(9):e70281.
  7. Marín O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nat Rev Neurosci. 2012 Jan 18;13(2):107–20. PubMed PMID: 22251963.
  8. Yang N, Ng YH, Pang ZP, Südhof TC, Wernig M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 2011 Dec 2;9(6):517-25.
  9. Busskamp V, Lewis NE, Guye P, Ng AHM, Shipman SL, Byrne SM, et al. Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells. Mol Syst Biol. 2014 Nov 17;10(11):760.
  10. Barretto N, Zhang H, Powell SK, Fernando MB, Zhang S, Flaherty EK, et al. ASCL1- and DLX2-induced GABAergic neurons from hiPSC-derived NPCs. J Neurosci Methods. 2020 Mar 15;334:108548.
  11. Gu J, Rollo B, Liu Z, O’Brien TJ, Kwan P, Cromer B, et al. Forward programming of human pluripotent stem cells to generate glutamatergic and GABAergic neurons in a tri-culture model with astrocytes. Stem Cell Res Ther. 2026 Feb 25;17(1):125.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

НейробиологияВыпуск 233Выпуск 233Пустое значениеВыпускhESC/hiPSCдифференцировкаCRISPR/Cas9.

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.