Модель перегрузки железа на основе феррик-аммония цитрат с показаниями, ассоциированными с ферроптозом, в миобластах C2C12

Краткое содержание

Здесь мы представляем модель быстрого перегруза железа на основе цитрата железа в миобластах C2C12, которая вызывает нагрузку железом, молекулярные изменения, связанные с ферроптозом, и раннюю потерю жизнеспособности, чувствительную к ферростатину.

Аннотация

Ферроптоз — это железо-зависимая форма регулируемой клеточной гибели, связанная со старением и дегенеративными заболеваниями. Ранее мы обнаружили, что стареющие мышечные стволовые клетки накапливают внутриклеточное железо и при активации подвергаются ферроптотической гибели. Здесь мы описываем простую модель in vitro, использующую цитрат железа аммония для создания перегрузки железом в мышиных миобластах C2C12. Лечение цитратом феррита аммония увеличивало внутриклеточную нагрузку железом, что подтверждается повышенным уровнем тяжело- и легкоцепочечного транскрипта ферритина, увеличением белка ферритина и усиленным сигналом от живоклеточного лабильного железного красителя. Воздействие цитрата железного аммония (FAC) также вызвало молекулярные изменения, связанные с ферроптозом, включая повышение экспрессии Slc40a1 и Hmox1, а также снижение белка глутатион пероксидазы 4. Снижение уровня глутатион пероксидазы 4, связанное с FAC, было частично устранено дефероксамином. Через 12 часов цитотоксический цитрат железного аммония снизил жизнеспособность клеток, и этот эффект был спасён ферростатином-1, что соответствует чувствительному к ферроптозу компоненту клеточной гибели. В более поздние моменты возрастная вариабельность и уменьшенный динамический диапазон анализов ограничивают интерпретируемость измерений жизнеспособности. Таким образом, этот протокол предоставляет быструю и масштабируемую модель нагрузки железа, опосредованной цитратом железа, которую можно использовать для изучения реакций, связанных с ферроптозом, и тестирования вмешательств, модифицирующих железо или ферроптоз, в мышечных клетках.

Введение

Ферроптоз — это форма регулируемой клеточной гибели (ОУЗ), молекулярно отличающаяся от других УЗД. Впервые он был обнаружен с помощью эрастина — смертельного маломолекула, селективного для РАС (саркомы крыс), который вызывает неапоптотическую^{клеточную гибель 1}. В своей фундаментальной работе Диксон и др. впервые описали его механизм как железозависимый и ввели термин ферроптоз, означающий «падение (смерть) от^{железа 1}». Молекулярно ферроптоз проявляется как чрезмерное накопление железа, усиление перекисления липидов и накопление реактивных форм кислорода, приводящие к гибели^{клеток 2}. Он уникально отличается от окислительного стресса и других форм RCD своей независимостью от активации каспаз, что является отличительной чертой апоптоза, а также отсутствием фосфорилированной протеинкиназы, взаимодействующей с рецепторами 3 (RIPK3) и смешанной псевдокиназы, похожой на домен родословной киназы (MLKL), которые наблюдаются только при^{некроптозе 3}. Кроме того, ферроптоз можно облегчить с помощью липидных антиоксидантов ферростатин-1 и липрокстатина-1, а также железного хелатора дефероксамина⁴. Хотя ферроптоз похож на другие типы РЗК тем, что все они в конечном итоге приводят к гибели клеток, его проявление механистически отличает его от других форм РЗЗ.

Изучение ферроптоза набрало популярность за последнее десятилетие, главным образом благодаря постоянным усилиям в области по выявлению новых признаков и разработке новых инструментов для изучения его основных механизмов и вклада в развитие заболеваний^{человека 5}. Недавние данные свидетельствуют, что перегрузка железом и ферроптоз являются недостаточно изученными факторами, способствующими возрастной слабости и^{саркопении 6,7,8}. Недавно мы показали, что устаревшие мышечные стволовые клетки (MuSC) уникально восприимчивы к ферроптотической гибели, возникшей из-за хронического воспаления, подавляющего антиоксидантную генетическую программу посредством эпигенетического^{заглушания 9}. Мы обнаружили, что стареющие MuSC накапливают аномальный уровень внутриклеточного элементального железа, примерно в 30 раз выше, чем у их взрослых аналогов. Хотя ферроптоз связывают с заболеваниями множества органов и тканей — преимущественно связанных со старением — его физиологическая роль остаётся неясной и требует дальнейших исследований.

Хотя наше предыдущее исследование показало, что старые MuSC чувствительны к ферроптотической смерти при активации, конкретный вклад нагрузки железа в этот фенотип остаётся проясненным. Здесь мы устанавливаем простую модель перегрузки железом в миобластах C2C12, обработанных цитратом железа аммония (FAC), и задаёмся вопросом, достаточно ли избыток железа для вызвания молекулярных изменений, связанных с ферроптозом, и потери жизнеспособности, чувствительной к ферростатину. Клетки C2C12 обеспечивают малозатратную, масштабируемую и легко доступную мышиную мышечную систему-прародителя¹⁰. Мы ожидаем, что этот подход предоставит практическую платформу для изучения стрессовых реакций, вызванных железом, в мышечных клетках, а также для тестирования вмешательств, модифицирующих фенотипы, связанные с ферроптозом.

Протокол

1. Подготовка клеток C2C12

1. Оттаивающие ячейки
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы культивирования клеток должны выполняться в стерильном шкафу для биобезопасности.
   1. Подготовьте коническую трубку с 9 мл тёплой полной среды (модифицированная среда Eagle от Dulbecco с высоким содержанием глюкозы и пирувата + 10% плодовой бычьей сыворотки + 1% пен/стрептококк).
   2. Разморозьте один флакон замороженных клеток C2C12 (~1 миллион), добавив 800 мкл предварительно подогретого полного материала в флакон из основного носителя. Медленно поднимай и опускай.
   3. Когда средство, добавленное в флакон для размораивания, остынет, достаньте его и добавьте в коническую трубку. Замените на тот же объём тёплого материала из трубки. Продолжайте пипетировать вверх и вниз и менять среду, пока замороженные ячейки не будут снова суспензированы.
   4. Пипетом поместите содержимое флакона в коническую трубку носителя. Переверните, чтобы перемешать, затем добавьте содержимое в чашу, обработанную культурой клеток диаметром 10 см. Инкубировать при 37 °C в течение 4 часов.
   5. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что они прикреплены. Прикреплённые ячейки выглядят удлинёнными, а плавающие — круглыми и двигаются при движении пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если пластинчатые клетки здоровы, большинство из них должны быть прикреплены.
   6. Аспирируйте среду, чтобы удалить мёртвые клетки и мусор. Замените на 10 мл тёплого полного материала и верните в инкубатор. Дайте ей инкубировать на ночь или пока пластина не достигнет 80% слияния.
2. Посев клеток C2C12 для обработки железом
   1. Когда достигнуто желаемого слияния, аспирируете клеточные среды. Добавьте 2 мл PBS в пластину по каплю, чтобы покрыть всю поверхность; Аспирировать.
   2. Добавьте 2 мл трипсина 0,25% в клетки. Инкубировать при 37 °C в течение 5–10 минут или до отсоединения клеток. После отсоединения клетки будут выглядеть круглыми под микроскопом, а трипсин и суспензия клеток становятся мутными и утолщёнными.
   3. Нейтрализуйте трипсин, добавив 8 мл тёплого полного DMEM. Используйте серологическую пипету, чтобы тщательно перемешать раствор и промыть пластину. Перенесите подвеску ячейки в коническую трубку.
   4. Аккуратно переверните трубку 3–5 раз. Удалите соответствующий объём и подсчитайте клетки с помощью предпочтительного метода (счётчик клеток, гемоцитометр и т.д.).
   5. Сделайте суспензию из ячеек, достаточную для засевания нужного количества колодц/пластин для n = 3 для каждого состояния: пластина диаметром 10 см (для западного блота): 100 000 ячеек на пластину, пластина с 6 ячеек (для qPCR): 50 000 ячеек/ямец, пластина с 96 лунками (для окрашивания лабильным железом и люминесценцией): 1 000 ячеек/колодца. Дайте клеткам инкубироваться при 37 °C ночью.
3. Применение обработки железом к посеянным клеткам
   1. В день обработки добавьте цитрат железного аммония (FAC; формула = C₆H₁₁FeNO₇^⁺3; МВт = 265 г/моль) для завершения ДМЭМ при следующих концентрациях в стерильных условиях: Тяжёлая: 180 мкм (0,0477 мг/мл), Цитотоксичная: 1 800 мкм (0,477 мг/мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также рассмотрите возможность добавления контроля, включая, но не ограничиваясь транспортным средством, тяжелым + 150 мкм дефероксамина (железный хелатор), транспортным средством + 150 мкм дефероксамина и/или транспортным средством + RSL3 (индуктор ферроптоза; положительный контроль). Кроме того, стоит отметить, что DMEM может содержать небольшое количество нитрата железа (III) нонагидрата, источника железного железа, на исходном уровне. Читатель должен интерпретировать рекомендованные выше концентрации FAC как дополнение к существующему железному железу, уже присутствующему в среде транспортной культуры.
   2. Инвертируйте для смешивания, пока FAC не растворится в полном среде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку FAC растворим в воде, не требуется DMSO или дополнительный растворитель. Добавление FAC может изменить pH раствора, поэтому при резком изменении цвета среды рекомендуется измерять pH для обеспечения жизнеспособности клеток при добавлении обработанной среды в культуру.
   3. Аспирировать среду с клеток. Добавьте такой же объём полного материала, дополненного железом, к условиям обработки и необработанного целого материала в скважины/пластины автомобиля. Инкубировать при 37 °C в течение желаемой продолжительности лечения перед переходом к выбранному анализу: анализ на лабильное железо: 2 часа обработки FAC, qPCR и western blot: 12–24 часа FAC, люминесцентный анализ: 12 часов обработки FAC.

2. qPCR

1. Изоляция мРНК для qPCR
   ВНИМАНИЕ: Реагент для экстракции РНК и хлороформ представляют опасности для дыхательных путей. Держитесь только в вытяжке с выпарителем и в соответствующих средствах индивидуальной защиты (лабораторный халат, одноразовые перчатки, защитные к химикатами и защитные очки).
   1. На скамье аспирируйте среду из клеток. Промой клетки 2 раза стерильным PBS и тщательно аспирируй оставшуюся жидкость.
   2. В вытяжке добавьте реагент для экстракции РНК в клетки в следующих объёмах: пластина с 6 лунками: 250 мкл/скважину, чаша диаметром 10 см: 1 мл/тарелка.
   3. Работая со льдом в вытяжной вытяжке, используйте скребок для аккуратного соскреба лизированных клеток. Тщательно соскребли все части пластины, чтобы максимизировать выход РНК.
   4. Пипетировать лизат в стерильные, предварительно охлаждённые, без РНК микрофужные трубки. Оставьте их при комнатной температуре 5 минут.
   5. На каждый мл экстракционного реагента добавьте 200 мкл хлороформ ВНУТРИ ВЫТЯЖКИ С ДЫМОМ. Интенсивно встряхивайте образцы не менее 30 секунд, чтобы объединить экстракционный реагент и хлороформ. Оставьте их при комнатной температуре 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После истечения времени происходит разделение фаз, поверх которого находится прозрачная водная фаза (содержащая РНК).
   6. Анализы центрифугой в течение 15 минут при 12 000 × г при 4 °C. Тем временем маркируйте новые автоклавные трубки и добавляйте 500 мкл (на мл экстракционного реагента) изопропанола в пробирки на льду.
   7. В каждую соответствующую трубку передают только водную фазу. Аккуратно перемешайте инверсией, затем оставьте при комнатной температуре 10 минут. Если ожидается низкий выход, добавьте 2 мкл GlycoBlue, чтобы визуализировать гранулу.
   8. Центрифуга 15 минут при 12 000 × г при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осаждённая РНК может быть видна внизу трубки.
   9. Аккуратно вылейте лишний изопропанол в специально отведённый стакан для отходов. Добавьте 1 мл молекулярного этанола, 100% этанола по капле в трубку, осторожно, чтобы не сдвинуть гранулу. Центрифуга в течение 5 минут при 7 500 × г при 4 °C.
   10. Вылейте этанол. Переверните трубки и оставьте крышку открытой поверх бумажного полотенца. Дайте грануле высохнуть до отсутствия капель (~15–30 минут).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула может стать полупрозрачной, если не добавить GlycoBlue.
   11. Суспензировать гранулу в 25 мкл стерильной воды без РНК. Количественная оценка концентрации РНК с помощью ультрафиолет-видимой спектрофотометрии. Нормализуйте до равномерной концентрации по образцам, что позволит получить максимум 1 мкг РНК на 16 мкл на образец.
2. Синтез кДНК для qPCR
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все этапы на льду, чтобы максимизировать выход РНК/кДНК.
   1. Образцы отморозки. Промой рабочую зону очистителем RNAse.
   2. Добавьте 1 мкг РНК из каждого образца в соответствующую ПЦР-пробирку.
   3. Добавьте 4 мкл смеси кДНК в каждую пробирку. При необходимости добавьте стерильную воду до общего объёма 20 мкл. Пропустите смеси по следующим параметрам термоциклера: 25 °C в течение 5 минут, 42 °C 30 минут, 85 °C 5 минут, 4 °C бесконечно.
3. Запуск qPCR
   1. Разведите кДНК 1:10 в стерильной воде перед проведением дальнейших реакций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: кДНК можно замораживать при -20 °C в течение 1 месяца или при -80 °C в течение 6 месяцев.
   2. Разведите праймеры до концентрации 10 мкм стерильной водой. Включите соответствующие гены контроля и/или домашние гены (например, B2M, TBP1).
   3. Создайте мастер-миксы для каждого интересующего гена и гена хозяйственного хозяйства, чтобы было достаточно реакционного микса для запуска каждого состояния ДНК в тройном экземпляре. Рецепт мастер-смеси (для каждой реакции) следующий: 2x ПЦР-смесь: 10 мкл, прямой грунт (10 мкм): 1 мкл, обратный праймер (10 мкм): 1 мкл, стерильная вода: 8 мкл.
   4. Поместите реакционную пластину qPCR в охлаждённый металлический блок на 96 лунок. Добавьте 5 мкл разбавленной кДНК в каждую яму, и 20 мкл реакционной мастер-смеси в каждую яму. Осмотрите каждую скважину, чтобы убедиться, что все получают одинаковый объём, накройте пластину герметиком и используйте инструмент с плоским краем для выравнивания пузырьков.
   5. Центрифугуйте пластину при 1 000 × г и 4 °C в течение 1 минуты. Поместите пластину в аппарат qPCR, убедившись, что она загружена в правильном положении.
   6. В программном обеспечении qPCR обозначайте образцы и гены, представляющие интерес, для каждой скважины. Рассмотрите возможность создания шаблона, если планируете запускать несколько репликий с одной и той же конфигурацией.
   7. Запустите программу qPCR (продолжительность: ~1:36 ч), показанную в таблице 1.
   8. Экспортируйте результаты в виде . CSV или . XLSX. Если используемая машина qPCR позволяет пользователю выбирать, какие значения экспортировать, проверьте, включены ли значения CT в экспортированный файл.
   9. Используйте средние значения КТ для каждого интересующего состояния и гена — в сравнении с КТ-значениями генов Housekeeping в соответствующих условиях — чтобы рассчитать изменение сгибания каждого гена. Нормализуйте изменение сгибания в состоянии автомобиля до 1.0.

3. Вестерн блот

1. Изоляция белка для вестерн-блота
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы на льду, чтобы максимизировать выход белка.
   1. В шкафе для биобезопасности аспирируйте медиа вне культуры. Промывайте клетки с достаточной колькостью холодного PBS, чтобы покрыть дно посевной пластины. Аспирировать, затем повторять.
   2. Добавьте буфер RIPA с добавлением коктейлей ингибитора протеазы и ингибитора фосфатазы, чтобы предотвратить деградацию белка. Используйте 75 мкл раствора RIPA для культивирования в пластине с 6 лунками или 200 мкл раствора RIPA в пластине диаметром 10 см.
   3. Работая со льдом, используйте скребок для аккуратного ослабления лизированных клеток с пластины. Особое внимание уделяйте удалению клеток со всех частей пластины, включая края. Раствор будет выглядеть прозрачным и несколько вязким.
   4. Пипетировать суспензию RIPA-ячейки в охлаждённые микрофужные трубки. Центрифуга отбирает образцы в течение 10 минут на максимальной скорости при 4 °C. Переложите супернатант (белковый лизат) в предварительно охлаждённую трубку. Выбросьте шарики.
   5. Измерите концентрацию белка с помощью анализа Bradford или BCA. Нормализовать образцы до 1 мкг/мкл в чистой воде, обогащённой коктейлями протеазы и фосфатазы, на льду.
   6. Разбавьте лизаты в буфере Laemmli, обеспечивая равномерную концентрацию белка по образцам. Кипячите лизаты при 95 °C в течение 10 минут для денатурации белка. Для наилучших результатов используйте вестерн-блоттинг сразу после подготовки. В противном случае храните белки в Laemmli при -20 °C краткосрочно (≤ 1 месяц) или при -80 °C в долгосрочной перспективе.
2. Подготовка акриламидных гелей для SDS-PAGE
   ВНИМАНИЕ: Акриламид — это нейротоксин, и его следует использовать только при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки, защитные к химикатами и защита глаз).
   1. Определите интересующие белки и их размер, посетив сайт компании с использованием антител/и. Используйте прогнозируемый размер интересующего белка(ов), чтобы определить, какой процент акриламида должен составлять гель(и).
      ПРИМЕЧАНИЕ: акриламид 10%-15% хорошо подходит для большинства молекулярных масс.
   2. Соберите гелевую подставку и раму в соответствии с инструкциями производителя.
   3. Для решающего геля смешайте акриламид, стерильную воду, буфер pH8.8 1,5 M Tris/HCl и 10% натрия додецилсульфата в конической трубке в соответствующих объёмах для количества и процента акриламида в гелях, которые должны быть приготовлены, согласно Таблице 2, где перечислены компоненты, необходимые для 2 гелей. Смешивайте по инверсии.
   4. Добавьте в смесь 10% раствор персульфата аммония и подвергнут TEMED. Инвертируй для смешивания.
   5. Немедленно добавьте раствор в гелевую рамку, заполняя его до тех пор, пока объём раствора в гелевой раме не окажется чуть ниже нужного для достижения дна гребня, если гребень будет вставлен.
   6. Сразу добавляйте 100–200 мкл чистого этанола по капле поверх затвердеющего геля. Если белковые лизаты нужно разморозить и/или денатурировать, завершите это в течение этого инкубационного периода. Разморозить белки на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это распределит раствор, чтобы гель не затвердел неравномерно.
   7. После затвердевания вылейте этанол. Для стекинга геля смешивают акриламид, стерильную воду, буфер pH6.8 0,5 M Tris/HCl и 10% натрия додецилсульфата в конической трубке в соответствующих объёмах для количества и процента акриламида в гелях, которые должны быть приготовлены, согласно таблице 2, где перечислены компоненты, необходимые для двух гелей. Смешивайте по инверсии.
   8. Добавьте в смесь 10% раствор персульфата аммония и TEMED в смесь. Смешивайте по инверсии.
   9. Сразу добавляйте раствор для стека в рамку гелевой литья, пока объём не достигнет верха. Добавьте гелевую гребенку сразу после заливки. Дайте отдохнуть ~1 час или пока форма колодцев не изменится, когда гель-литьё слегка покачивается.
3. Загрузочные гели
   1. Заполните камеры электрофореза буфером на соответствующую линию заполнения, чтобы определить количество гелей для запуска.
   2. Перенесите гелевую рамку с гребнями внутри в камеру электрофореза. Добавьте ещё буфер для пробежки между гелями, пока резервуар не заполнится. Аккуратно вынимите гребни из погруженных гелей.
   3. Пипета 5–10 мкл лестницы в одну яму, каждый гель.
   4. Пипета 5–20 мкл извлеченного белка и буферные образцы Laemmli в каждую яму. Добавьте 5–10 мкл 1x буфера Леммли в пустые скважины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: добавленный вами объём может потребовать оптимизации в зависимости от распространённости интересующего белка и/или эффективности антител.
4. Запуск SDS-PAGE
   1. Подключите камеру электрофореза к блоку питания. Установлен на 150 В в течение 45 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от конфигурации для полной миграции может потребоваться больше времени или повысить напряжение, поэтому корректируйте по мере необходимости.
   2. После того как белок переместится к концу геля (где гелевой кастер и гелевый корпус встречаются внизу аппарата), прекратите запуск и отключите энергоблок.
5. Завершение переноса белка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел был разработан с помощью аппарата быстрого переноса белков.
   1. Вылейте буфер для переноса в гелевый лоток. Добавьте пересадочный стек, затем нитроцеллюлозную мембрану и ещё одну пересадочную трубу в жидкость, чтобы получить сэндвич с мембраной посередине. Убедитесь, что стек сэндвича полностью погружен в буфер трансфера.
   2. Включите аппарат быстрого переноса белка и выберите правильный протокол по количеству гелей и размеру интересующих белков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1,3 A и 25 V на 10 минут работают хорошо, но может потребоваться оптимизация.
   3. Снимите верхний стек для переноса щипцами и дайте лишней жидкости стекать в гелевый лоток. Переместите стек к аппарату для переноса белков и уложите его как можно ровнее и ровнее; Используйте ролик или коническую трубку, чтобы разгладить складки. Повторите с мембраной.
   4. Используйте инструмент с тупым концом, чтобы аккуратно разделить верхнюю и нижнюю половины отливной рамки. Перенесите гель на мембрану в аппарате для переноса белков.
   5. Используйте щипцы, чтобы поднять оставшийся стек переноса из гелевого лотка. Сливайте лишнюю жидкость, затем кладите её поверх мембраны и другой трубы. Закройте гелевый бокс и запустите программу.
6. Блокировка и окрашивание антителами
   1. Откройте гелевую коробку и щипцами уберите верхнюю стопку, затем снимите гель. Убедитесь, что на мембране есть полоски от лестницы. Разрежьте мембрану так, чтобы включить только интересующий диапазон размеров.
   2. Перенесите мембрану в чистую коробку для пятен. Добавьте 5 мл блокирующего буфера, или достаточно, чтобы покрыть мембрану. Заблокируйте перемешивание при комнатной температуре на 1 час.
   3. Тем временем готовьтесь к окрашиванию антител, добавляя рекомендуемую концентрацию первичных антител в 5 мл 2% бычьей сыворотки в буфер для промывания на мембрану. Морилка также используется для белков (например, GAPDH, β-актин).
   4. Удалите от перемешивания и вылейте блокирующий буфер. Добавьте 5 мл раствора первичного антитела. Инкубируют в темноте при возбуждении при температуре 4 °C ночью (~12–16 часов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В дальнейшем все шаги должны проходить во тьме.
   5. Промывайте мембрану 3 x 5 минут при комнатной температуре с помощью буфера для промывания.
   6. Добавьте рекомендуемую концентрацию вторичного антитела до 5% BSA в буфере для промывания. Подготовьте 5 мл раствора для каждой мембраны.
   7. Слейте лишний буфер для мойки. Добавьте 5 мл вторичного раствора антител к каждому пятну. Инкубировать в темноте при комнатной температуре перемешивания в течение 1 часа.
   8. Промывайте мембрану 3 x 10 минут при комнатной температуре с буфером для стирки. Изображение немедленно.
7. Обнаружение и анализ интересующих белков
   1. Изображение белков с помощью выбранной платформы.
   2. Используйте ImageJ или другую платформу, чтобы количественно оценить интенсивность каждой интересующей полосы.

4. Анализ на лабильный железный краситель

1. Окрашивание лабильным железом
   1. Завершить весь участок 1, засев ячеек в пластине на 96 лунок под обработкой железом в течение 2 часов. Убедитесь, что для каждого состояния обработки железа имеется как минимум три скважины, а также отрицательные (носитель; культурная среда + 150 мкм хелатора железа дефероксамина) и положительные (культурные среды + 180 мкм FAC + лабильное железо-красительное сообработка) контроли.
   2. Подготовьте достаточное разбавление 1:200 раствора лабильного железа в безсывороточной среде, чтобы на каждую пробную яме оставалось 200 мкл.
   3. Аспирируйте с культурной среды. Стирайте 2 раза с PBS.
   4. Добавьте раствор для окрашивания в каждую колодцу и инкубуйте 1 час при 37 °C.
   5. Постирайте один раз PBS. Замените на PBS.
   6. Снимите клетки с помощью дальнего красного канала флуоресцентного микроскопа (646/662 нм). Сохраните и экспортируйте изображения в формате . Файлы TIF.
2. Анализ окрашивания
   1. Откройте изображения в ImageJ.
   2. Откройте окно измерений, нажав m. В окне измерения, в разделе Результаты | Задайте измерения, выберите площадь, интегрированную плотность и среднее значение серого. Выберите OK.
   3. Используйте Polygon Tool , чтобы нарисовать каждую ячейку на изображении. Нажмите m после каждой ячейки, чтобы добавить измерения в окно измерений.
   4. Когда все ячейки на изображении будут количественно оценены, скопируйте и вставьте все значения в таблицу. Используйте инструмент круга , чтобы сделать как минимум три фоновых измерения в зонах, не занятых ячейками.
   5. Используйте следующую формулу для расчёта скорректированной полной флуоресценции клеток (CTCF) для каждой клетки:
      CTCF = интегрированная плотность – (площадь выбранной ячейки x среднее серое значение фоновых показаний)
   6. Сравните значения CTCF клеток, обработанных железом, с показателями транспортных ячеек. Повышение CTCF указывает на повышение уровня лабильного железа.

5. Анализ клеточной люминесценции

1. Обработка клеток для люминесцентного анализа
   1. Заполните раздел 1, убедившись, что количество скважин соответствует n = 3 для каждого состояния, которое вы хотите включить. Добавьте как минимум три контрольных ямы без клеток (только полные носители). В каждую скважину следует добавить 100 мкл ячеек и среду.
   2. После инкубации необработанных клеток за ночь применяйте процедуры и меры контроля по желаемости. Обязательно указывайте состояние транспортного средства (не леченое), состояния только с FAC, цитотоксичный + 10 мкм ферростатина-1 (антиферроптотическое средство), транспортное средство + 1 мкм RSL3 и/или транспортное средство + 10 мкм ферростатин-1 + 1 мкм RSL3. Инкубировать в течение нужного времени (12–24 часа для максимизации эффекта лечения и предотвращения чрезмерной гибели клеток).
2. Завершение люминесцентного анализа
   1. После обработки элементов разморозите компоненты люминесцентного буфера до комнатной температуры. Комбинируйте необходимые компоненты и храните в темноте до готовности к использованию. Смотрите инструкции к набору для требований к хранению температуры.
   2. После завершения лечения клетки следуйте инструкциям из набора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это, вероятно, будет включать уравновесение при комнатной температуре, затем добавление люминесцентного буфера и финальный короткий инкубационный период при комнатной температуре. После добавления буфера люминесценции все этапы следует выполнять в темноте.
   3. Заполните и запишите светящееся изображение с помощью считывателя пластин или аналогичного прибора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола использовалось время интеграции 0,3 с.
   4. Нормализовать значения люминесценции экспериментальных скважин до средней люминесценции контрольных скважин без клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие значения люминесценции указывают на большее количество живых клеток.

Результаты

Основываясь на предыдущих наших и других исследованиях, мы выдвинули гипотезу, что увеличение увеличения внеклеточного железа вызовет внутриклеточную перегрузку железом в мышечных клетках мыши и позволит нам отслеживать реакции, связанные с ферроптозом, последующие по течению реакций. Поэтому мы разработали рабочий процесс с C2C12, описанный на рисунке 1, в котором клетки подвергались воздействию определённых концентраций цитра железного аммония в течение 2–24 часов, в зависимости от последующего анализа.

Первым шагом к валидации нашей модели было подтверждение того, что FAC может проникнуть в клетки. Используя валидированные праймеры, описанные в Таблице 3, мы провели qPCR как для тяжёлых, так и для лёгких цепей ферритина и определили, что увеличение ввода железа коррелирует с повышенным уровнем мРНК ферритина (рисунок 2A,B). На уровне белка аналогичное повышение уровня ферритина наблюдалось при увеличении концентрации FAC, хотя это, по-видимому, не зависело от дозы (см. рисунок 2C). Аналогично, окрашивание живых клеток C2C12, обработанных FAC, показало, что клетки, обработанные цитотоксичной дозой железа — а также клетки, одновременно обработанные тяжелой дозой и лабильным окрашиванием железа как положительный контроль, визуально и количественно демонстрируют повышенное накопление железа по сравнению с необработанными клетками и теми, кто подвергался воздействию только хелатора железа дефероксамина (DFO; Рисунок 2D). В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что железо, поступающее через FAC в клеточную среду, действительно поступает в клетки.

Установив, что FAC увеличивает внутриклеточную нагрузку железа, мы затем пытались определить, сопровождается ли перегрузка железом молекулярными и функциональными изменениями, связанными с ферроптозом. FAC увеличил экспрессию Slc40a1 (ферропортин) (рисунок 3A) и повысил уровень Hmox1 (рисунок 3B). FAC также снижал содержание белка GPX4, и это снижение частично было остановлено дефероксамином (рисунок 3C). Лечение RSL3 привело к аналогичному снижению уровня GPX4, поместив ответ на FAC в более широкий молекулярный контекст, ассоциированный с ферроптозом. Функционально цитотоксичная доза FAC снижала жизнеспособность на основе люминесценции через 12 часов, и эта ранняя потеря жизнеспособности была спасена ферростатином-1 (см. рисунок 3D). В отличие от этого, через 24 часа разделение между условиями становится менее выраженным и более изменчивым (рисунок 3E). Хотя образцы, обработанные ферростатином-1, остаются повышенными по сравнению с только цитотоксичным FAC, общий динамический диапазон анализов на этом позднем этапе сокращается. В совокупности эти данные показывают, что лечение FAC вызывает перегрузку железом, молекулярные изменения, связанные с ферроптозом, и временно-чувствительное снижение жизнеспособности в клетках C2C12.

Рисунок 1: Графический аннотация модели перегрузки железом. В этой модели клетки C2C12 засеиваются и дают инкубировать за ночь перед обработкой различными физиологически значимыми дозами культурной среды, насыщенной железом, и прямым молекулярным анализом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Увеличение лабильного запаса железа и синтеза ферритина после добавления цитратов железа аммония. Уровни мРНК (A) ферритина в тяжёлой цепи и (B) ферритина в легкой цепи увеличиваются с добавлением цитра железного аммония в систему. (C) Уровень белка FTH1 повышается с добавлением железного железа в систему. (D) Уровень лабильного железа повышается в клетках C2C12, обработанных железом железом до и одновременно с окрашиванием красителем лабильного железа, по сравнению с контролем транспортного средства + дефероксамина. Условие совместного лечения подразумевает одновременное лечение культурной средой + 180 мкм FAC + лабильным железным красителем. Индикаторы ошибок — +/- SD. Сокращения: FTH1 = цепь с тяжёлым ферритином; FTL1 = лёгкая цепь ферритина; DFO = дефероксамин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Молекулярные изменения, связанные с ферроптозом, и временно-зависимое снижение жизнеспособности клетки после добавления FAC. Уровни мРНК (A) ферропортина (Slc40a1) и (B) Hmox1 повышаются после обработки FAC. (C) Белок GPX4 снижается после обработки FAC и при наличии положительного контрольного RSL3; дефероксамин частично отменяет снижение GPX4, связанное с FAC. (D) Люминесценция клеток C2C12 после 12-часовой обработки FAC, RSL3 и/или ферростатином-1, нормализованная до свободных клеток (только в среде). (E) Нормализованная люминесценция обработанных клеток C2C12 после 24-часовой обработки FAC, RSL3 и/или ферростатином-1. Полоски ошибок — +/- SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Удержать этап
1	Поднимите до 50 °C при 1,6 °C/с, удержите 2 минуты
2	Поднимите до 95 °C при 1,6 °C/с, задержите 10 минут
Этап ПЦР (Run x 40)
1	Удерживать температуру при 95 °C в течение 15 секунд
2	Снизить до 60 °C при 1,6 °C/с, задержать 1 минуту
Стадия кривой плавления
1	Повышение до 95 °C при 1,6 °C/с, задержка 15 с
2	Снизить до 60 °C при 1,6 °C/с, задержать 1 минуту
3	Повышение температуры до 95 °C при 0,15 °C/s, удержание 1 с

Таблица 1: программа qPCR (продолжительность: ~1:36 ч) в разделе протокола 2.

	Разрешающий гель			Стековый гель
Компонент	10%	12.50%	15%
Акриламид (мл)	5.6	6.9	8.3	0.65
Стерильная вода (mL)	6.9	5.3	3.9	3.05
Трис/HCl, pH 1,5 М, 8,8 (мл)	4.2			-
Tris/HCl, pH 0,5 м 6,8 (мл)	-			1.25
10% додецилсульфат натрия (мкл)	166			50
0,1 г/мл персульфата аммония (мкл)	80			25
TEMED	8.3			5

Таблица 2: Сводка компонентов и объёмов, необходимых для успешной установки разрешённых и укладных гелей для western blot. Объёмов достаточно для двух гелей и их можно соответственно масштабировать. Проценты указывают на количество акриламида в смеси.  ПРИМЕЧАНИЕ: APS и TEMED следует добавлять последними и только при готовности к литью, так как они запускают процесс полимеризации геля.

Gene Target	Символ гена	Функция	Виды	Прямая последовательность	Обратная последовательность
Бета-2-микроглобулин	B2m	Ген ведения хозяйства	Мышь	TCACACTGAA TTCACCCCCA	TCACATGTCT CGATCCCAGT
Белок TATA, связывающий коробку	TBP	Ген ведения хозяйства	Мышь	CAGATGTGC GTCAGGCGTT	CCATGAAATAGT GATGCTGGGCAC
Тяжёлая ферритиновая цепь	Fth1	Субъединица белка накопления железа ферритина	Мышь	TGGCTCTGAA GAACTTTGCCA	TCATCACGGTC TGGTTTTTTTTTA
Ферритиновая лёгкая цепь	Ftl1	Субъединица белка накопления железа ферритина	Мышь	ААТГГГТАА АККАГГАГГ	AGGAAGTCACA ГАГАТГАГГГГТ
Гемоксигеназа 1	Hmox1	Превращает биливердин в билирубин в присутствии гема, CO2 и железа; При ферроптозе наблюдаются высокие уровни	Мышь	CTAGCCTGGT GCAAGATACTG	TGTCTGGGAT GAGCTAGTGC
Ферропортин 1	SLC40a1	Транспортирует избыточное железо из клеток	Мышь	GCTGCTAGAA TCGGTCTTTGG	TGGAGTTCTG CACACCATTGA

Таблица 3: Список проверенных праймеров qPCR для генов транспорта железа и ферроптоза, представляющих интерес .Праймеры специфичны для мышей из-за их использования в мРНК, происходящей из клеток C2C12.

Обсуждение

Целью этого исследования было установить практическую in vitro модель перегрузки железом у мышей-предшественников мышей и определить условия, при которых можно надежно обнаружить ответы, связанные с ферроптозом. Используя этот рабочий процесс, мы показали, что лечение цитратом железа аммония приводит к устойчивому внутриклеточному накоплению железа, сопровождаемому повышенной экспрессией ферритина и повышенным лабильным сигналом железа. Нагрузка железом также связана с молекулярными изменениями, соответствующими стрессу, связанному с ферроптозом, включая повышение экспрессии Slc40a1 и Hmox1, а также снижение белка GPX4. Функционально воздействие цитотоксичного FAC вызывает снижение жизнеспособности клеток, которое спасается ферростатином-1 на ранних этапах времени, поддерживая наличие компонента, чувствительного к ферроптозу, способствующего наблюдаемой гибели клеток.

Доза железа и продолжительность лечения — критически важные параметры, напрямую влияющие на интерпретируемость этой системы. В наших руках ранние временные точки (примерно 12 ч) обеспечивают наиболее чёткое разделение между состояниями, позволяя ферростатину-1 воспроизводить воспроизводимый способ спасать цитотоксичность, вызванную FAC. В более поздние временные моменты (например, 24 часа) общая жизнеспособность снижается, а вариабельность увеличивается в зависимости от условий, что уменьшает динамический диапазон анализа. Это соответствует накопленной потере клеток и адаптации выжившей популяции, например, повышению антиоксидантной ёмкости или изменению обработки железа.

Введение железного железа (Fe³⁺) вместо железного железа (Fe²⁺), а также концентрация введённого железа и продолжительность лечения также являются ключевыми аспектами протокола. Использование железного железа крайне важно, поскольку железо легко поглощается трансферрином — основным транспортером, ответственным за импорт^{железа 11}. Хотя железное железо может быть поглощено другими транспортерами (особенно двувалентным металлическим транспортером DMT1), в этом контексте железо, по-видимому, использовалось более эффективно, чем^{железо-железо-12}. Концентрации FAC, выбранные для этого протокола, были выбраны из-за их физиологической значимости и использования в прошлых аналогичных^{моделях 13,14}. Длительность обработки железом, составляющая 24 часа, также была основана на аналогичных моделях, сделанных нами и другими. Однако в некоторых случаях (в частности, при лабильном окрашивании железа и анализах на люминесценцию клеток) 24 часа оказались слишком долгими сроками обработки. В таких случаях 24-часовое лечение приводило к такой значительной гибели клеток, что из-за разрушения клеточного материала не было никаких выводов. Например, RSL3 — настолько мощный агент перекисления липид, что длительность обработки в 12 часов была достаточной для индуцирования перекисления липидов и одновременно обеспечивала одновременное видимое влияние перегрузки железом (рисунок 3C-E). Кроме того, для лабильного железного красителя клетки обрабатывали FAC только в течение 2 часов перед окрашиванием (после попыток окрашивания после обработок железом 2, 4 и 24 часа), чтобы зафиксировать первоначальную реакцию на перегрузку железом до чрезмерного разрушения клеток (см. рисунок 2D). В целом, похоже, что изменения на уровне генов и белков лучше всего измерять после 12–24 часов обработки железом, вероятно, потому что эти изменения занимают больше времени для развития клеток, а окрашивание лучше проводить после более короткого периода обработки.

Другие разработали похожие модели. Одна группа создала модель C2C12, обработанную железом, для изучения роли оси p53-Slc7a11 в ферроптозе. Они обнаружили, что обработка железом железом в течение 48 часов увеличивает перекисление липидов и снижает уровень Slc7a11 , что указывает на ферроптоз¹³. Другая похожая модель — на этот раз с использованием обработанных железными сульфатами C2C12 клеток для изучения связи между убиквитин-лигазой Akt-FoxO3-E3 и ферроптозом — включала лечение железом в течение 4 ч^{. 14}. Общая черта между ними заключается в том, что они включают обработку железом клеток C2C12, дифференцированных в миотрубки, а не остаются в состоянии миобластов, похожих на стволовые клетки. Это делает нашу систему особенно актуальной для ранее наблюдаемого накопления железа в MuSC.

Несмотря на то, что метод является простым способом изучения воздействия перегрузки железом на мышцы in vitro, у него есть ограничения, поскольку он применялся только в контексте клеток C2C12. Предыдущие исследования показали, что мышечные стволовые клетки подвержены перегрузке железом при старении, что говорит о том, что аналогичный метод может быть верен в этом^{контексте 9}.

В совокупности эта модель демонстрирует, что перегрузка железом достаточна для индуцирования воспроизводимого набора молекулярных изменений, связанных с ферроптозом, и снижения чувствительности к ферростатину в клетках C2C12. Хотя дополнительные ортогональные анализы могут дополнительно уточнить классификацию гибели клеток в конкретных контекстах, наблюдаемые здесь совокупные молекулярные и фармакологические ответы соответствуют клетческому стрессу, связанному с ферроптозом. Мы ожидаем, что этот подход позволит проводить механистические исследования дисрегуляции железа при старении и заболеваниях мышц.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1 kb Protein Ladder, 500 µL size	Bio-Rad	1610374	Хранить при -20 °C. Растворять на льду.
15 mL Centrifuge Tubes CS500	Avantor/VWR	89039-664
30% Acrylamide/Bisphosphate solution, 29:1, 500 mL size	Bio-Rad	1610156	Является нейротоксином. Обращаться только с соответствующим личным средством защиты (лабораторный халат, перчатки, защита глаз).
5425 / 5425 R Microcentrifuge	Eppendorf	05-414-052
5910 Ri centrifuge	Eppendorf	05-414-459PM2
96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165305
Ammonium persulfate, 10 g	Bio-Rad	1610700	Агент полимеризации для заливки гелями на основе акриламида в виде 10% весового/объемного раствора в стерильной воде. Порошок стабилен при комнатной температуре, но раствор должен храниться в долгосрочной перспективе при -20 °C и краткосрочно при 4 °C.
Anti-GAPDH, mouse antibody, 100 µg size	Thermo Fisher Scientific	AM4300	Использовать в концентрации 1:2000 в 2% BSA + буфере для промывания. Размер 37 кДа.
BCA Protein Assay Kit with Dilution-Free BSA Protein Standards	Thermo Fisher Scientific	A55865	Следуйте инструкциям производителя. Имейте в виду, что стандарты должны храниться при 4 °C после первого использования.
Beta Actin Loading Control Monoclonal Antibody (BA3R), DyLight 800 4X PEG	Thermo Fisher Scientific	MA515739D800	Использовать в концентрации 1:1000 в 2% BSA + буфере для промывания. Размер 42 кДа.
BioLite 6 Well Multidish Cell Culture-Treated Surface	Thermo Fisher Scientific	130184
Blot Box, Black, 9x6.5 cm, 5/pk	Fisher Scientific	501870983
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	Использовать для приготовления буфера Лэмли.
BSA, solid, 100 g	Fisher Scientific	BP9703100	Хранить при 4 °C.
C2C12 cells	ATCC	CRL-1772	Хранить в газовой фазе жидкого азота.
cDNA Supermix QScript 500 reactions	Avantor/VWR	101414-108	Хранить при -20 °C. Растворять на льду.
Cell lifter, 100pk	Fisher Scientific	8100240	Поскольку они больше, используются для извлечения клеток из 10 см и больших блюд.
Cell scrapers, 10 inch handle, 100pk	Fisher Scientific	08-100-241	Поскольку у них маленькая головка, они наилучшим образом подходят для удаления клеток из многокамерных пластин.
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Kit, 10 mL	Promega	G7570
Chloroform, 99.9%	Thermo Fisher Scientific	610281000	Использовать только в вытяжном шахте и утилизировать отходы в отдельном контейнере.
COMPLETE EDTA-free protease inhibitor tabs	Sigma-Aldrich	4693132001	Растворяйте 1 таблетку в 500 µL стерильной воды для создания 100× раствора.
CO2 100-120 V Incubator	Binder	9640-0002	Модель версии CBS 170-120 V. Использовать для культивирования клеток.
Deferoxamine mesylate, 50 mg	Fisher Scientific	5764/50	DFO - это хелатор железа, поэтому его добавление в клетки уменьшает содержание железа. Растворяйте в воде для получения концентрации запаса 1 М.
Dimethyl sulfoxide, 100 mL	Fisher Scientific	D5879-100ML	Использовать для окрашивания лабильного железа и восстановления.
DMEM, high glucose, pyruvate, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	11995065
Dylight 680 conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H&L)	Thermo Fisher Scientific	35568	Добавлять в 5% BSA в буфере для промывания в соотношении 1:5000.
DyLight 800 4× PEG conjugate Goat anti-Mouse IgG (H&L) Secondary Antibody	Thermo Fisher Scientific	SA535521	Добавлять в 5% BSA в буфере для промывания в соотношении 1:5000.
Easypet 3 1-channel pipet aid	Eppendorf	4430000018
Far-red Labile Fe2+ Dye	Sigma-Aldrich	SCT037	Приготовьте запасной раствор, добавив 50 µL DMSO в аликот при комнатной температуре. Чувствителен к свету. Концентрация запаса: 1 мМ
Ferric Ammonium Citrate, 500 g	MP Biomedicals	158040
Ferrostatin 10 mg	Fisher Scientific	502259214	Захватывает побочные продукты перекисного окисления липидов, ингибируя ферроптоз in vitro. Растворяйте в DMSO для получения концентрации запаса 10 мМ.
Fetal Bovine Serum, Premium Plus, bottle, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A5669701	Использовать для дополнения DMEM для культивирования клеток C2C12. Добавляется на 10% по объему.
Flex-Tube 1.5 mL PCR clean, colorless,