Определённый метод на основе гидрогеля для получения трёхмерных органоидов молочной железы человека, которые воспроизводят морфогенез молочной железы

Summary

Этот протокол описывает определённый метод на основе гидрогеля для получения органоидов молочной железы человека, которые воспроизводят ключевые особенности морфогенеза молочной железы в контролируемой трёхмерной культурной системе.

Abstract

Разработка физиологически значимых человеческих моделей, которые воспроизводят архитектуру тканей и динамику состояния клеток, остаётся серьёзной задачей при изучении развития молочной железы и ранних событий канцерогенеза. Обычные двумерные культуры и многие трёхмерные системы не способны отражать структурную организацию и микроэкологические сигналы, которые определяют молочную железу человека. Здесь мы описываем воспроизводимый метод получения трёхмерных органоидов человеческой молочной железы из первичных эпителиальных клеток, встроенных в определённый гидрогельный матрикс, состоящий из коллагена типа I, ламинина, фибронектина и гиалуроновой кислоты. Эта система поддерживает прогрессирование отдельных клеток на ключевых этапах морфогенеза молочной железы, включая расширение предков, эпителиальное формирование, формирование конечных протоков, лобулярных структур, а также появление мезенхимоподобного компартимента, в течение 21-дневного периода культуры. Мы предоставляем пошаговый протокол подготовки гидрогеля, посева клеток и условий культуры. Метод совместим с высокосодержательной визуализацией и количественным анализом количества органоидов, распределения размеров и архитектурной сложности. Эта платформа позволяет механистически изучать пластичность эпителия и возмущения окружающей среды, обеспечивая масштабируемую и биологически значимую систему для изучения ранних изменений на уровне тканей, связанных с риском рака молочной железы.

Introduction

Понимание развития человеческих молочных желез и ранних событий, предрасполагающих ткань к злокачественной трансформации, требует экспериментальных систем, которые точно воспроизводят архитектуру тканей, клеточную иерархию и микроэкологическую сигнализацию. Хотя двумерные эпителиальные культуры дали важные механистические инсайты, им не хватает структурного контекста, необходимого для моделирования эпителиальной организации и^{морфогенеза 1}. Существующие трёхмерные системы культуры, включая те, что основаны на экстрактах базальных мембран, продвинулись в этой области, но остаются ограниченными переменным составом, неполным контролем над компонентами внеклеточного матрикса и непоследовательной поддержкой архитектуры тканей высшего^{порядка 1}. Кроме того, многие органоидные системы, основанные на экстрактах базальных мембран, ограничены своей неспособностью стабильно поддерживать появление тканоподобной организации¹. В частности, многие системы полагаются на экзогенные стромальные компоненты, а не на эндогенное развитие поддерживающих микроокружений, что ограничивает их способность моделировать эпителиально-мезенхимальные взаимодействия, являющиеся центральными для развития тканей и заболеваний. Эти ограничения ограничивают воспроизводимое изучение процессов развития, эпителиальной пластичности и влияния воздействий окружающей среды или молекулярных возмущений на организацию тканей.

Для устранения этих ограничений мы разработали определённую гидрогель-трехмерную модель человеческого органоида молочной железы, которая позволяет первичным эпителиальным клеткам формировать организованные структуры внутри определённого внеклеточного^{матрикса} 2,3,4,5,8. Гидрогель состоит из коллагена первого типа, ламинина, фибронектина и гиалуроновой кислоты — компонентов, отобранных на основе их установленной роли в развитии молочных желез и морфогенезе эпителия. Эти внеклеточные матриксовые молекулы взаимодействуют с различными клетковыми рецепторами, включая интегрины, дискоидин-доменные рецепторы, CD44 и RHAMM, и известны тем, что регулируют эпителиальную полярность, ветвящееся морфогенез, поддержание стволовых клеток, механотрансдукцию и организацию тканей молочной^{железы 6,7}. Предыдущие исследования, описывавшие эту гидрогельную систему, показали, что включение этих компонентов внеклеточного матрикса значительно улучшает морфогенез протоково-лобулярного морфогенеза и созревание эпителия по сравнению с условиями, основанными только на коллагене или^{матригеле, 3,8}. Кроме того, физические свойства этой формулы гидрогеля ранее были охарактеризованы с помощью атомно-силовой микроскопии, что показало, что композитный внеклеточный матриксовый гидрогель демонстрирует меньшую жёсткость и увеличенное вздутие по сравнению с гелями, содержащими только коллаген (модуль Юнга: 256,7 ± 20,0 Па против 559,2 ± 204,0 Па соответственно), что соответствует более мягкой и гидратированной матричной^{среде 8}.

Важно, что эта модель поддерживает появление мезенхимоподобного компартмента, который возникает рядом с эпителиальными структурами, обеспечивая эндогенную структурную и сигнальную поддержку, более близкую к нативной организации^{тканей 3}. Физиологическая значимость этой гидрогелевой системы была оценена посредством прямых сравнений с традиционными органоидными культурами на основе матригеля с использованием как морфологических, так и транскриптомических анализов. Ранние исследования показали, что культуры гидрогеля поддерживают более организованное формирование тканей протоков и дольки и дифференцировку по многородной линии, чем культуры на основе матригеля, при этом сохраняя реакцию^{гормонов 8}. В последнее время интегрированные анализы секвенирования одноклеточных РНК, сравнивающие органоиды, выращенные на основе гидрогеля, органоиды, выращенные в Матригеле, и первичную ткань молочной железы человека, показали, что органоиды, выращенные на гидрогеле, более точно воспроизводят эпителиальную иерархию, клеточное разнообразие и эпителиально-мезенхимальные взаимодействия, присутствующие в нативной ткани человеческой^{груди 3}. В отличие от этого, органоиды, выращенные в Матригеле, были обогащены для пролиферативных гибридных базальных состояний и не имели стромальных популяций, что соответствует эпителиальной самосборке, а не направленному органогенезу.

Описанный здесь протокол предлагает воспроизводимый и масштабируемый метод получения органоидов из первичной человеческой ткани, с дополнительными этапами для истощения фибробластов и диссоциации в отдельные клетки. Поскольку эта платформа совместима с живой визуализацией, высококонтентной визуализацией, количественным морфометрическим анализом, отслеживанием клеток и исследованиями генетических возмущений, её можно интегрировать с последующим подходами, оценивающими количество, размер, архитектуру и динамику роста органоидов. Таким образом, эта платформа предоставляет биологически значимую систему для изучения развития человеческой груди, эпителиальной пластичности, взаимодействия эпителий и микросреды, а также реакций на уровне тканей на нарушения развития, молекулярности или окружающей среды.

Схематический обзор рабочего процесса, включая обработку тканей, приготовление гидрогеля, культуру органоидов, прогрессию развития и дальнейший анализ, приведён на рисунке 1, а репрезентативные морфологии органоидов, полученные с помощью этой платформы, показаны на рисунке 2.

Рисунок 1. Обзор процесса генерации органоидов на основе гидрогеля. (A) Блок-схема, обобщающая рабочий процесс протокола, включая сбор тканей, обработку тканей, криоконсервацию, восстановление и необязательную подготовку клеток, подготовку гидрогеля, культуру органоидов, разработку органоидов и аналитические применения в дальнейших процессах. (B) Визуальная схема, отражающая основные этапы протокола генерации органоидов на основе гидрогеля, включая обработку и подготовку тканей, восстановление и необязательную подготовку клеток, а также подготовку гидрогеля и посев органоидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Репрезентативные органоидные морфологии, возникающие в определённой гидрогелевой системе. Репрезентативные яркие изображения органоидов, полученных из различных человеческих тканей, культивируемых в определённой гидрогелевой матрице. Органоиды молочной железы, полученные из отдельных эпителиальных клеток, полученных с помощью мамопластики, были изображены на 21-й день культуры. Ксенотрансплантатные органоиды, полученные пациентами, полученные из фрагментов опухоли, были изображены на 16-й день посева. Органоиды слюнных желез, образованные из эпителиальных фрагментов, были изображены на третий день культуры. Органоиды почек, полученные из фрагментов эпителия, были изображены на 17-й день культуры. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Protocol

Первичные ткани, которые в противном случае были бы выброшены как медицинские отходы после операции, были получены в соответствии со всеми соответствующими законами с использованием протоколов, утверждённых институциональными контрольными советами Медицинского центра Мэна и Медицинского центра Тафтса. Все ткани были анонимизированы до переноса и не могли быть связаны с конкретными пациентами. По этой причине этому исследованию был предоставлен статус освобождения от Комитета по использованию человека в качестве экспериментальных субъектов при Массачусетском технологическом институте и в Университете здравоохранения Тафтса (IRB #13521). Все пациенты, участвовавшие в этом исследовании, подписали форму информированного согласия, соглашаясь участвовать в исследовании и опубликовать результаты.

1. Обработка и подготовка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнять все процедуры, связанные с человеческими тканями, в соответствии с институциональными стандартами биобезопасности и этическими нормами. Обратитесь к схемам рабочих процессов, показанных на рисунках 1A и 1B, чтобы получить визуальный обзор шагов протокола и рабочего процесса подготовки органоидов до начала процедуры.

1. Приготовьте MEGM с использованием эпителиальной базальной среды молочной железы, дополненной экстрактом бычьего гипофиза 52 мкг/мл, фактором роста эпидермиса человека 10 нг/мл, 5 мкг/мл инсулина, 500 нг/мл гидрокортизона, 1% (v/v) GlutaMAX и 1% (v/v) антибиотико-антимикотическим (100X).
2. Подготовьте диссоциационную среду, добавив 1,5 мг/мл коллагеназу A (хранящуюся при −20°C) и 100 U/mL гиалуронидазу (при 4°C) в эпителиальную среду молочной железы (MEGM).
3. Получайте человеческую грудную ткань, полученную профилактическими мастэктомиями и редукционными маммопластиками, в течение 24 часов после удаления, нефиксированную в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) и поддерживаемую при 4°C. Взвесьте ткань на точном весе, чтобы определить общий вес ткани.
4. Поместите ткань в стерильный шкаф для биобезопасности. Механически измельчите ткань на фрагменты 3–5^{мм 3} с помощью стерильных скальпелей. Перенесите примерно 2–3 г измельчённой ткани в коническую трубку объёмом 15 мл. Добавьте 10 мл диссоциационной среды в каждую трубку.
5. Инкубировать трубки при 37°C на орбитальном вращателе при 8 об/мин в течение 12–18 часов для ферментативного переваривания ткани. Считать пищеварение завершенным, когда не осталось крупных фрагментов ткани и по всему среде видна однородная суспензия равномерно фрагментированного материала.
6. Дайте эпителиальным фрагментам оседать под действием гравитации в течение 5 минут. Убедитесь, что в среде не осталось видимых фрагментов и что присутствует отдельная гранула. Аккуратно декантуйте и выбросьте супернатант, не нарушая шарик.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант содержит стромальные клетки и компоненты матрицы, и может быть промыт, использован или сохранен для других исследований.
7. Повторно суспензируйте гранулу в промывке на 10 мл, состоящую из 5% сыворотки плода бычьего скота (FBS) в PBS. Центрифугу при 250 × г в течение 5 минут в центрифуге с поворотным ведром при комнатной температуре.
8. Повторите этап промывания ещё три раза или пока супернатант не станет чистым и не будет видимого мусора.
9. Суспензировать конечную гранулу в замораживающей среде, состоящую из 10% диметилсульфоксида (DMSO) в MEGM при объёме 1 мл на грамм исходной массы ткани.
   ВНИМАНИЕ: ДМСО вреден при контакте или вдыхании. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты и работайте в химическом защитном капюшоне, если это требует институциональные правила.
10. Аликвот 1 мл подвески в каждый криовиал. Поместите криовиалы при −80°C в заморозительный контейнер перед длительным хранением в жидком азоте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг представляет собой точку паузы. Храните образцы при −80°C перед передачей в условия длительного хранения.

2. Восстановление и необязательная подготовка клеток

1. Оттаивание и первоначальное восстановление
   1. Удалить криоконсервированную ткань из хранения при температуре −80°C после заморозки не менее 24 часов или из длительного хранения в жидком азоте. Немедленно погрузите криовиальное тело до крышки в водяную ванну при температуре 37°C и быстро размораживайте в течение 1 минуты, чтобы минимизировать гибель клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно перемешивайте криовиал во время размораивания, чтобы обеспечить равномерное прогрев.
   2. После полного оттаивания немедленно переложите содержимое криовиального фильтра в коническую трубку объёмом 15 мл с 10 мл MEGM. Центрифугу при 250 × г на 5 минут.
2. Необязательное истощение фибробластов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Истощение фибробластов путём предварительного покрытия — это необязательный этап обогащения, используемый для уменьшения быстро адгерирующихся популяций стромальных или фибробластов, когда требуется более эпителиально-обогатённая стартовая популяция. Этот этап не является необходимым для формирования органоидов и может быть корректирован в зависимости от цели эксперимента.
   1. Восстановите пеллету в 10 мл MEGM.
   2. Перенесите восстановленную суспензированную ткань в контейнер для клеточной культуры диаметром 10 см. Инкубировать при 37°C в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂ в течение 90 минут для прикрепления фибробластов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не трогайте посевную чашу во время инкубации, чтобы обеспечить эффективное присоединение фибробластов.
   3. Соберите супернатант, содержащий неадгезирующие клетки, с помощью серологической пипетки объёмом 10 мл, аккуратно наклоняя посевную чашу примерно на 45°. Аккуратно промойте тарелку 5 мл PBS и комбинируйте промывание с собранным супернатантом.
   4. Центрифугуйте комбинированную подвеску при 250 × г в течение 5 минут для извлечения материала, обогащённого эпителием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, прилипшие к пластинке, обогащаются для фибробластов молочных желез и могут быть размножены отдельно, добавляя среду, состоящую из DMEM + 10% FBS и антибиотиков.
3. Опциональная диссоциация в отдельные клетки
   1. Суспензировать гранулу в 500 мкл предварительно подогреного (37°C) раствора диссоциационного фермента, состоящего из 0,25% трипсина. Альтернативные диссоциационные реагенты могут потребовать оптимизации. Перенесите подвеску в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл. Тритурируйте образец 20 раз с помощью пипетки P1000 для стимулирования диссоциации.
      ВНИМАНИЕ: Ферментативные реагенты для диссоциации могут быть вредны. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты и избегайте контакта кожи или глаз.
   2. Инкубировать трубку при 37°C в течение 3-5 минут. Механически диссоциируйте образец сразу после инкубации, тритурируя 20 раз с помощью пипетки P1000.
   3. Добавьте 1 мл жидкости с сывороткой для нейтрализации ферментативной реакции. Центрифугу при 500 × г в течение 5 минут.
   4. Ресуспензировать гранулу в растворе диспазы объемом 300 мкл (5 Ед/мл) и раствора ДНКазы с 30 мкл (1 мг/мл). Инкубировать при 37°C в течение 3–5 минут.
   5. Механически диссоциируйте образец пипетированием 15–20 раз. Добавьте в суспензию 700 мкл жидкости с сывороткой.
   6. Фильтруйте суспензию ячейки через сито 40 мкм в чистую трубку. Может использоваться либо стандартное сито с ячейки 40 мкм, либо сито с наконечником пипетки Flowmi. Flowmi-сита могут уменьшить потери образца при работе с ограниченным количеством ячеек.
   7. Определите жизнеспособное количество ячеек с помощью исключения трипана синего цвета. Смешайте 10 мкл суспензии ячейки с трипан-синим в соотношении 1:1 и загрузите 10 мкл смеси в камеру для подсчета ячеек или счётное стекло. Определите жизнеспособность клетки с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра.
   8. Центрифугуйте подвеску при 500 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
   9. Суспензировать клеточную гранулу в MEGM в нужной концентрации для засева гидрогеля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов с одноклеточным посевом типичные входы составляют примерно от 1 000 до 5 000 клеток на 200 мкл гидрогеля, в зависимости от экспериментальной цели и характеристик донорского образца. Более низкие плотности посева обычно используются для живой визуализации и морфогенеза для облегчения отслеживания развития отдельных органоидов, тогда как более высокие плотности обычно применяются для молекулярного анализа конечных точек, включая сбор РНК и белка.

3. Подготовка гидрогеля и органоидный посев

1. Подготовка запасов и расчёт объёмов
   1. Перед использованием поместите на лёд раствор ламинина (1,18 мг/мл), раствор гиалуроновой кислоты (1 мг/мл в стерильной воде), раствор фибронектина (2 мг/мл в стерильной воде) и PBS 1× на лёд. Храните ламинины и аликвоты с фибронектином при −80°C и храните раствор гиалуроновой кислоты при 4°C. Замороженные компоненты медленно размораживайте на льду при 0°C–4°C перед использованием.
   2. Приготовьте дополнительный раствор с внеклеточной матрицей на 25×. Для получения 1 мл смешайте 425 мкл ламинина, 250 мкл гиалуроновой кислоты, 250 мкл фибронектина и 75 мкл ПБС в трубке, хранящейся на льду. Аккуратно перемешайте, перевернув трубку 3–4 раза. Храните раствор при 4°C до месяца.
   3. Определите желаемый итоговый объём и состав гидрогеля перед приготовлением. Подготовьте как минимум 20% избыточного объёма, чтобы учесть потери материала во время пипетирования и переноса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состав гидрогеля состоит из коллагена I, конечной концентрации внеклеточных матрикса с концентрацией 1× (из запаса 25×), и 12,5% (v/v) 0,1 N гидроксида натрия относительно объёма коллагена I для нейтрализации и полимеризации pH.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные концентрации гидрогеля составляют 1,7 мг/мл коллагена I, 20 мкг/мл ламинина, 20 мкг/мл фибронектина и 10 мкг/мл гиалуроновой кислоты.
   4. Вычислите требуемый объём коллагена I (V_{коллагена}) по следующей формуле:
      
      Здесь C_final  = 1,7 мг/мл, _{V total} — это желаемый итоговый объём гидрогеля, а C_stock — концентрация раствора коллагена. Используйте концентрации коллагена в диапазоне от 2 до 12 мг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация коллагена может варьироваться между партиями. Более высокие концентрации увеличивают вязкость и должны быть пипетированы медленно.
   5. Вычислите объём 0,1 N гидроксида натрия (V_NaOH) по следующей формуле:
      V_NaOH = 0,125 x V_{коллаген}
      Приготовьте рабочий раствор гидроксида натрия с концентрацией 0,1 Н, разбавляя 1 Н гидроксида натрия в стерильной воде.
   6. Вычислите объём добавки внеклеточного матрица (V_ES) по следующей формуле:
      
   7. Вычислите оставшийся объём, который нужно заполнить ростовой средой, используя следующую формулу:
      _{Среда роста} V = _всего V - (V_{коллаген} + _{V NaOH} + V_ES + _{V клетки/ткань})
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите объём клеток или фрагментов ткани для каждого эксперимента отдельно. Используйте типичный диапазон от 10 до 100 мкл в пределах допустимого объёма. Точный подсчёт фрагментов не выполняется, поскольку размер и состав фрагментов существенно различаются между препаратами. Стандартизуйте посев с помощью визуальной оценки численности и распределения фрагментов.
2. Приготовление гидрогелевой мастер-смеси
   1. Поместите коллаген I, внеклеточную матриксовую добавку, гидроксид натрия (0,1 N) и среду роста на лёд при 0°C–4°C. Поддерживайте все компоненты при низкой температуре, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию.
   2. Добавьте рассчитанный объём коллагена I в охлаждённую микроцентрифугную трубку.
   3. Добавьте рассчитанный объём предварительно охлаждённой почвенной среды в раствор коллагена.
   4. Добавьте рассчитанный объём 0,1 N гидроксида натрия для нейтрализации раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущая оптимизация показала, что эти условия обеспечивают соответствующий гель pH; поэтому регулярное тестирование pH гидрогелевой смеси не требуется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все последующие шаги быстро, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию коллагена.
   5. Смешивайте раствор, энергично встряхивая трубку со скоростью примерно один раз в секунду не менее 6 встряхиваний.
   6. Добавьте рассчитанный объём добавки внеклеточного матрикса в смесь.
   7. Добавьте рассчитанный объём отдельных клеток или фрагментов ткани с помощью пипетки P1000 или ширококалиберной пипетки. Сразу перемешайте, встряхивая, как описано в шаге 3.2.5, и сразу переходите к следующему этапу.
3. Осаждение гидрогелем
   1. Пипетировать гидрогелевую смесь в культурные сосуды с нужным объёмом на каждую скважину. Используйте 200 мкл гидрогеля на скважину для 4-колодцевых камерных затворов, 100 мкл на скважину для 8-колодцевых камерных затворов и 20 мкл на скважину для плит с 96 колодцами.
   2. При использовании камерных затворов размазывайте гидрогель в тонкую подушечку по поверхности. Разместите наконечник пипетки у центрального верхнего края камеры и проведите наконечник по поверхности, раздавая гель, чтобы получить ровную подушечку. Для пластин с 96 лунками размещайте кончик пипетки в центре колодца, сохраняя контакт с поверхностью, и размещайте гель по центру, чтобы сохранить куполообразную структуру. Избегайте пипетирования воздуха в гель, так как это приведёт к образованию пузырьков.
   3. Инкубировать культурные сосуды при 37°C в увлажнённом инкубаторе с 5%_CO2 в течение 60 минут для полной полимеризации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Описанные здесь условия полимеризации были оптимизированы для форматов культур, использованных в этом исследовании. Могут потребоваться незначительные корректировки времени полимеризации в зависимости от геометрии сосуда культуры, объёма гидрогеля и условий инкубации.
4. Культура и обслуживание
   1. Добавьте в каждую скважину заранее подогреный MEGM. Регулируйте громкость в соответствии с используемым форматом культуры.
   2. Аккуратно отсоедините гидрогель от поверхности культуры с помощью наконечника пипетки, чтобы гель мог всплывать. Проведите кончик пипетки по периметру геля и аккуратно поднимите под полимеризированный гидрогель, чтобы освободить его с поверхности.
   3. Заменяйте MEGM два раза в неделю на свежую предварительно подогреную среду. Сохранять культуры в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂ примерно 3–4 недели и прекращать культуры до полного коллапса гидрогеля. Определите коллапсированные гидрогели по появлению плотных, непрозрачных, похожих на пробки структур, возникающих в результате обширного клеточного роста внутри геля (см. представительные примеры на дополнительном рисунке 1).

Results

Успешное выполнение этого протокола приводит к формированию трёхмерных органоидных структур, демонстрирующих организованную эпителиальную морфологию и специфические структурные особенности. Органоиды начинают формироваться в течение 3–7 дней после посева и продолжают развиваться в течение всего периода культуры. Предыдущая характеристика этой гидрогель-органоидной системы показала воспроизводимое формирование органоидов у нескольких независимых первичных доноров^{человека 3}. В этом исследовании были оценены первичные эпителиальные клетки, выделенные от 12 доноров маммопластики, не вызывающих заболеваний, и 11 из 12 донорских образцов успешно сгенерировали органоиды в описанных условиях культуры. Среди доноров медианное количество органоидных структур, образующихся на 100 семянных клеток, составляло 1,775 (95% ДИ: 0,45–4,10). Хотя наблюдалась значительная междонорская вариабельность в эффективности формирования органоидов и динамике роста, сложные морфологии протоково-лобулярных и ацинарных формировок воспроизводились у разных доноров.

Органоиды молочной железы, полученные из отдельных эпителиальных клеток, демонстрируют прогрессивный морфогенез, формируя ветвящиеся структуры к 21-му дню культуры (рисунок 2). Эти структуры характеризуются вытянутыми выступлениями и многоклеточной организацией. Органоиды демонстрировали прогнозируемые площади от 10 000 до 90 000^{мкм 2} к 18-му дню, с круговыми значениями ниже 0,3, рассчитанными как 4π × (Площадь/^{Периметр 2})^3,9. Органоиды, полученные из фрагментов ткани, обычно к 18-му дню формировали структуры размером более 90 000 мкм^², тогда как органоиды, полученные из фрагментов опухоли, формировали более плотные и неправильные структуры с сниженной организацией и увеличенными радиальными выступлениями, что соответствует изменённому росту.

Органоиды, полученные из эпителиальных фрагментов слюнных желез и почек, также демонстрируют разные морфологии при тех же гидрогелевых условиях (см. рисунок 2). Органоиды слюнных желез формируют компактные структуры в ранние периоды времени (3-й день), тогда как органоиды почек развивают удлинённую и асимметричную морфологию к 17-му дню. Эти наблюдения включены для демонстрации более широкой адаптивности гидрогелевой органоидной системы, выходящей за рамки молочной ткани, и проиллюстрировать её способность поддерживать формирование органоидов из множества эпителиальных тканевых источников.

Ранее проведённые иммунокрашеные и молекулярные анализы ^3,5,8 показали наличие маркеров эпителиальной линии, включая люминальные маркеры KRT8, KRT18, KRT19, E-кадгерин, GATA3, JAG1, Notch1 и MUC1, а также базальные или миоэпиттелиальные маркеры KRT5, KRT14, Slug, SOX9 и TP63, что указывает на сохранение эпителиальной гетерогенности внутри органоидов. Структурные особенности, соответствующие конечной лобулярной организации, были обнаружены с помощью конфокальной микроскопии и трёхмерной реконструкции и определялись как структуры с удлинёнными протоками, соединёнными с концьными или альвеолярными почками, напоминающими организацию нативных человеческих терминальных протоковых лобулярных единиц. Эти структуры также демонстрировали слоистую эпителиальную организацию с узорами люминальных и базальных клеток, что соответствует ранее опубликованным анализам этой^{платформы 3}.

Был обнаружен мезенхимоподобный компартмент в связи с эпителиальными структурами и между ними, который характеризулся миграционным поведением и экспрессией маркеров, включая VIM, SNAI1, ZEB1, S100A, CD90 и FAPα. Вместе с анализом таймлапс-микроскопии эти наблюдения поддерживают формирование поддерживающей микросреды в^{культурной системе 3}.

Важно, что этот протокол предназначен для предоставления широко адаптируемой методологической основы, а не для установления единого фиксированного биологического ориентира. Количественные результаты, включая эффективность образования органоидов, размер, сложность ветвления и клеточный состав, могут варьироваться в зависимости от донорского источника, менопаузального состояния, исходного материала (например, фрагментов ткани против отдельных клеток) и экспериментальных условий.

К неоптимальным результатам относятся снижение эффективности формирования органоидов (<1 органоид на 500 посеянных клеток), чрезмерный клеточный мусор, нарушение полимеризации коллагена или неспособность установить организованные структуры. Эти результаты обычно связаны с низкой жизнеспособностью клеток, неполной диссоциацией тканей, неправильным составом гидрогеля или неправильной нейтрализацией pH.

Количественный анализ развития органоидов может проводиться с использованием живых и высококонтентных методов для измерения количества органоидов, распределения размеров, ветвления, структурной сложности и динамики клеток. Предыдущие исследования с использованием этой платформы проводились продольные живые визуализации, отслеживание клеток, морфометрический анализ и генетические возмущения для количественной оценки динамики роста органоидов и поведения родословной на протяжении^{времени 3,5}. Визуализация проводилась с помощью конфокальной микроскопии, а анализ изображений — с помощью программного обеспечения NIS-Elements.

Дополнительный рисунок 1. Репрезентативный пример коллапса гидрогеля во время длительной культуры органоидов на 18-й день. Коллапсированные гидрогели выглядят как плотные, непрозрачные, похожие на пробки структуры, возникающие в результате обширного клеточного роста и сжатия матрикса. Эти морфологические особенности использовались как критерий для завершения культур перед полным коллапсом гидрогеля. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

Описанный здесь протокол позволяет воспроизводить трёхмерные человеческие органоиды молочной железы в определённой гидрогелевой микросреде, поддерживающей ключевые особенности морфогенеза^{молочной железы 3}. Для успеха этого метода критически важно несколько шагов. Во-первых, обработка тканей и ферментативная диссоциация должны тщательно контролироваться для сохранения жизнеспособности эпителия при минимизации переваривания, что может снизить выход клеток и ухудшить последующий^{морфогенез 10}. В частности, кратковременные и последовательные ферментативные процедуры в сочетании с мягкой механической диссоциацией необходимы для поддержания функциональных эпителиальных популяций. Во-вторых, подготовка гидрогеля требует точного контроля концентрации коллагена, pH и^{тайминга 11}. Нейтрализация коллагена инициирует полимеризацию; Поэтому все этапы после добавления гидроксида натрия должны выполняться быстро и на льду, чтобы обеспечить равномерное образование геля. Неполная или отложенная полимеризация может привести к плохо структурированным или коллапсированным гидрогелям, которые не поддерживают развитие органоидов. Наконец, плотность посева должна быть эмпирически оптимизирована для каждого донорского образца, так как чрезмерная нагрузка на ткани или клетки может привести к быстрому сокращению геля и потере структурной^{целостности 12}.

Несколько аспектов устранения неполадок могут повысить воспроизводимость. Плохое образование органоидов может быть связано с низкой жизнеспособностью клеток, неоптимальным составом гидрогеля или неправильным обращением с гелем во время^{осаждения 13}. Поддержание запасов коллагена при 4°C и отсутствие преждевременной полимеризации крайне важно для стабильного качества^геля. Кроме того, успешное отделение гидрогелей от поверхности культуры после полимеризации служит индикатором правильного образования геля; Отсутствие отслоения обычно связано с неполной полимеризацией или неправильными^{поверхностными условиями 14}. Вариабельность размера и морфологии органоидов ожидается между донорскими образцами и отражает биологическую гетерогенность, а не техническую неудачность. Предыдущие исследования с использованием этой платформы показали воспроизводимое формирование органоидов у широкого круга независимых первичных доноров человека, несмотря на значительную междонорскую вариабельность эффективности формирования органоидов и^{морфогенеза 3}.

У этого метода есть несколько ограничений. Хотя модель поддерживает появление мезенхимоподобного компартмента наряду с эпителиальными структурами, она не полностью отражает сложность in vivo стромальной, иммунной и сосудистой микросреды. Состав гидрогеля, хотя и определен, представляет собой упрощённый внеклеточный матрикс и может не охватывать все биомеханические или биохимические сигналы, присутствующие в нативной^{ткани 15,16}. Кроме того, вариабельность между донорами может влиять на динамику и морфологию роста органоидов, что требует эмпирической оптимизации для конкретных применений. Несмотря на эти ограничения, способность этой системы поддерживать самоорганизацию и эндогенные эпителиально-мезенхимальные взаимодействия представляет собой значительный прогресс по сравнению со многими существующими моделями^{культуры 3}.

По сравнению с широко используемыми системами на основе экстракта базальных мембран, этот подход обеспечивает лучший контроль над составом внеклеточной матрицы и снижает изменчивость, связанную с неопределёнными^{материалами 17}. Предыдущие исследования, напрямую сравнивавшие эту гидрогель-платформу с органоидными системами на основе Матригеля, показали значительные различия в организации тканей и^{клеточном составе 3,8}. Органоиды, выращенные на гидрогеле, больше напоминали родную человеческую грудную ткань как на морфологическом, так и на транскриптомическом уровне, сохраняя многолинейные эпителиальные популяции, включая люминальные, базальные, прогениторные и мезенхимоподобные компартменты, тогда как органоиды, выращенные в Матригеле, были доминированы пролиферативными гибридными базальными состояниями и не имели стромальных популяций. Кроме того, в отличие от систем ко-культуры, основанных на добавлении экзогенных стромальных клеток, эта модель обеспечивает внутреннее появление поддерживающего мезенхимоподобного компартмента, что позволяет изучать взаимодействия эпителий и микросреды в более физиологически значимом и менее искусственно спроектированном контексте. Возникающие популяции, похожие на мезенхимы, внутри гидрогелей ранее верифицировались с помощью комплементарной живой визуализации, иммунокрашивки и одноклеточных транскриптомических^{анализов 3}. Эти исследования продемонстрировали появление высокоподвижных стромоподобных клеток, экспрессирующих мезенхимальные и эпителиально-мезенхимальные переходные маркеры, включая Vimentin, THY1/CD90, FAP, S100A4, ZEB1 и Snail, а также взаимное взаимодействие эпителиально-мезенхимальной сигнализации, выявленных с помощью анализа лиганд–рецепторов. Эти особенности делают систему особенно подходящей для изучения процессов, зависящих от архитектуры тканей и коммуникации между клетками, включая морфогенез, эпителиальную пластичность и раннее ремоделирование^{тканей 4,5}.

Описанная платформа имеет широкое применение в фундаментальных и трансляционных исследованиях. Он может использоваться для изучения развития человеческой груди, моделирования ранних событий в начале заболевания и оценки влияния молекулярных или экологических воздействий на организацию тканей. Предыдущие исследования с использованием этой платформы показали, что функциональные возмущения развивающихся регуляторов, таких как DDR1 и RUNX1, изменяют дифференцировку по линии, организацию эпителий и морфогенез протоко-лобулярных элементов в трёхмерной^{культуре 5,18}. Совместимость с количественной визуализацией и анализом с высоким содержанием дополнительно позволяет систематически анализировать фенотипические исходы, включая изменения размера, структуры и сложности органоидов. Таким образом, этот метод предоставляет масштабируемую и биологически значимую платформу для изучения организации человеческих тканей и её нарушений в контекстах, связанных с заболеваниями.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Конические трубки объёмом 15 мл	VWR	89039-664	Стерильные трубки для обработки тканей и центрифугирования
40 μ Сито M-ячейки	VWR	732-2757	Фильтрационное устройство для подготовки суспензии с одной ячейкой
40 μ Сито M-ячейки для малых объёмов	Bel-Art	136800040	Фильтрационное устройство для подготовки суспензии с одной ячейкой
Автоматический счётчик ячеек	Био-Рад	1450102	Устройство, используемое для подсчёта ячеек и определения жизнеспособности
Экстракт гипофиза крупного рогатого скота	Thermo Scientific	13028014	Добавка для среды эпителиальных клеток
Слайды для подсчёта клеток	Био-Рад	145-0011	Двухкамерные затворы, используемые для подсчёта ячеек
Центрифуга	Н/Д	Н/Д	Настольные центрифуги должны иметь скорость не менее 500 x g и вместимость труб на 15 мл и 1,5 мл.
Коллаген I	Миллипор Сигма	08-115	Внеклеточный матриксный белок, используемый для образования гидрогелей
Коллагеназа A	Сигма-Олдрич	11088793001	Фермент, используемый для диссоциации тканей
Криовиалы	Корнинг	976171	Стерильные флаконы для криогенного хранения образцов
Сосуды для культивирования (например, камерные слайды, многоколодочные пластины)	Корнинг	354104 354108 3603	Платформы для осаждения гидрогелей и органоидной культуры.
Диметилсульфоксид	Миллипор Сигма	317275	Криопротектор, используемый в замораживающей среде
Dispase II	Рош	4942078001	Фермент, используемый для вторичной тканевой диссоциации
DNase I	Рош	10104159001	Фермент, используемый при диссоциации клеток.
Сыворотка плода крупного рогатого скота	Gibco	10437	Сывороточная добавка, используемая в промывках и нейтрализационных средствах
Фибронектин	Сигма-Олдрич	F2006	Компонент белка внеклеточного матрикса
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061	Добавка для среды эпителиальных клеток
Эпидермальный фактор роста человека	Сигма-Олдрич	E9644	Добавка для среды эпителиальных клеток
Гидрокортизон	Сигма-Олдрич	H0888	Добавка для среды эпителиальных клеток
Гиалуроновая кислота	Миллипор Сигма	385908	Компонент внеклеточного матрикса для формулы гидрогеля
Гиалуронидаза	Сигма-Олдрич	H3506	Фермент, используемый для диссоциации тканей
Инкубатор	Thermo Scientific	3598	Устройство, используемое для инкубации тканевой культуры
Инсулин	Сигма-Олдрич	I9278	Добавка для среды эпителиальных клеток
Ламинин	Gibco	23017-015	Компонент белка внеклеточного матрикса
Грудная эпителиальная базальная среда	Thermo Scientific	M171500	Среда роста для эпителиальных клеток
Микроцентрифугные трубки (1,5 мл)	Thermo Scientific	3451	Трубки, используемые для реакций малого объёма
Орбитальный ротатор	Thermo Scientific	400110	Ротатор, используемый для дисперсии тканей во время ферментативной диссоциации
Пипетка P1000	Гилсон	P1000	Устройство для смешивания и передачи объёмов до 1 000 и млн; L
Пенициллин-стрептомицин	Thermo Scientific	15140122	Антибиотик для эпителиальных клеточных сред
Фосфатно-буферный физиологический раствор	Gibco	20012-027	Буферный раствор, используемый для стирки и ополаскивания
Точная балансировка	Меттлер Толедо	ML303E	Весы, используемые для взвешивания тканей
Серологическая пипетка	Нунк	170356N	Пипетт, используемый для извлечения неадгезирующих эпителиальных клеток
Гидроксид натрия (1 N)	Фишер Кемикал	SS261	Реагент, используемый для нейтрализации коллагена
Стерильные скальпели	Бард-Паркер	372615	Инструменты, используемые для механического измельчения тканей
Раствор Trypan Blue	Gibco	15250061	Краситель, используемый для оценки жизнеспособности клеток
Трипсин (0,25%)	Gibco	25200056	Ферментный реагент, используемый для диссоциации клеток
Водяная баня (37 градусов; C)	VWR	10LA	Устройство, используемое для контролируемого оттаивания образцов