Определённый метод на основе гидрогеля для получения трёхмерных органоидов молочной железы человека, которые воспроизводят морфогенез молочной железы

Краткое содержание

Этот протокол описывает определённый метод на основе гидрогеля для получения органоидов молочной железы человека, которые воспроизводят ключевые особенности морфогенеза молочной железы в контролируемой трёхмерной культурной системе.

Аннотация

Разработка физиологически значимых человеческих моделей, которые воспроизводят архитектуру тканей и динамику состояния клеток, остаётся серьёзной задачей при изучении развития молочной железы и ранних событий канцерогенеза. Обычные двумерные культуры и многие трёхмерные системы не способны отражать структурную организацию и микроэкологические сигналы, которые определяют молочную железу человека. Здесь мы описываем воспроизводимый метод получения трёхмерных органоидов человеческой молочной железы из первичных эпителиальных клеток, встроенных в определённый гидрогельный матрикс, состоящий из коллагена типа I, ламинина, фибронектина и гиалуроновой кислоты. Эта система поддерживает прогрессирование отдельных клеток на ключевых этапах морфогенеза молочной железы, включая расширение предков, эпителиальное формирование, формирование конечных протоков, лобулярных структур, а также появление мезенхимоподобного компартимента, в течение 21-дневного периода культуры. Мы предоставляем пошаговый протокол подготовки гидрогеля, посева клеток и условий культуры. Метод совместим с высокосодержательной визуализацией и количественным анализом количества органоидов, распределения размеров и архитектурной сложности. Эта платформа позволяет механистически изучать пластичность эпителия и возмущения окружающей среды, обеспечивая масштабируемую и биологически значимую систему для изучения ранних изменений на уровне тканей, связанных с риском рака молочной железы.

Введение

Понимание развития человеческих молочных желез и ранних событий, предрасполагающих ткань к злокачественной трансформации, требует экспериментальных систем, которые точно воспроизводят архитектуру тканей, клеточную иерархию и микроэкологическую сигнализацию. Хотя двумерные эпителиальные культуры дали важные механистические инсайты, им не хватает структурного контекста, необходимого для моделирования эпителиальной организации и^{морфогенеза 1}. Существующие трёхмерные системы культуры, включая те, что основаны на экстрактах базальных мембран, продвинулись в этой области, но остаются ограниченными переменным составом, неполным контролем над компонентами внеклеточного матрикса и непоследовательной поддержкой архитектуры тканей высшего^{порядка 1}. Кроме того, многие органоидные системы, основанные на экстрактах базальных мембран, ограничены своей неспособностью стабильно поддерживать появление тканоподобной организации¹. В частности, многие системы полагаются на экзогенные стромальные компоненты, а не на эндогенное развитие поддерживающих микроокружений, что ограничивает их способность моделировать эпителиально-мезенхимальные взаимодействия, являющиеся центральными для развития тканей и заболеваний. Эти ограничения ограничивают воспроизводимое изучение процессов развития, эпителиальной пластичности и влияния воздействий окружающей среды или молекулярных возмущений на организацию тканей.

Для устранения этих ограничений мы разработали определённую гидрогель-трехмерную модель человеческого органоида молочной железы, которая позволяет первичным эпителиальным клеткам формировать организованные структуры внутри определённого внеклеточного^{матрикса} 2,3,4,5,8. Гидрогель состоит из коллагена первого типа, ламинина, фибронектина и гиалуроновой кислоты — компонентов, отобранных на основе их установленной роли в развитии молочных желез и морфогенезе эпителия. Эти внеклеточные матриксовые молекулы взаимодействуют с различными клетковыми рецепторами, включая интегрины, дискоидин-доменные рецепторы, CD44 и RHAMM, и известны тем, что регулируют эпителиальную полярность, ветвящееся морфогенез, поддержание стволовых клеток, механотрансдукцию и организацию тканей молочной^{железы 6,7}. Предыдущие исследования, описывавшие эту гидрогельную систему, показали, что включение этих компонентов внеклеточного матрикса значительно улучшает морфогенез протоково-лобулярного морфогенеза и созревание эпителия по сравнению с условиями, основанными только на коллагене или^{матригеле, 3,8}. Кроме того, физические свойства этой формулы гидрогеля ранее были охарактеризованы с помощью атомно-силовой микроскопии, что показало, что композитный внеклеточный матриксовый гидрогель демонстрирует меньшую жёсткость и увеличенное вздутие по сравнению с гелями, содержащими только коллаген (модуль Юнга: 256,7 ± 20,0 Па против 559,2 ± 204,0 Па соответственно), что соответствует более мягкой и гидратированной матричной^{среде 8}.

Важно, что эта модель поддерживает появление мезенхимоподобного компартмента, который возникает рядом с эпителиальными структурами, обеспечивая эндогенную структурную и сигнальную поддержку, более близкую к нативной организации^{тканей 3}. Физиологическая значимость этой гидрогелевой системы была оценена посредством прямых сравнений с традиционными органоидными культурами на основе матригеля с использованием как морфологических, так и транскриптомических анализов. Ранние исследования показали, что культуры гидрогеля поддерживают более организованное формирование тканей протоков и дольки и дифференцировку по многородной линии, чем культуры на основе матригеля, при этом сохраняя реакцию^{гормонов 8}. В последнее время интегрированные анализы секвенирования одноклеточных РНК, сравнивающие органоиды, выращенные на основе гидрогеля, органоиды, выращенные в Матригеле, и первичную ткань молочной железы человека, показали, что органоиды, выращенные на гидрогеле, более точно воспроизводят эпителиальную иерархию, клеточное разнообразие и эпителиально-мезенхимальные взаимодействия, присутствующие в нативной ткани человеческой^{груди 3}. В отличие от этого, органоиды, выращенные в Матригеле, были обогащены для пролиферативных гибридных базальных состояний и не имели стромальных популяций, что соответствует эпителиальной самосборке, а не направленному органогенезу.

Описанный здесь протокол предлагает воспроизводимый и масштабируемый метод получения органоидов из первичной человеческой ткани, с дополнительными этапами для истощения фибробластов и диссоциации в отдельные клетки. Поскольку эта платформа совместима с живой визуализацией, высококонтентной визуализацией, количественным морфометрическим анализом, отслеживанием клеток и исследованиями генетических возмущений, её можно интегрировать с последующим подходами, оценивающими количество, размер, архитектуру и динамику роста органоидов. Таким образом, эта платформа предоставляет биологически значимую систему для изучения развития человеческой груди, эпителиальной пластичности, взаимодействия эпителий и микросреды, а также реакций на уровне тканей на нарушения развития, молекулярности или окружающей среды.

Схематический обзор рабочего процесса, включая обработку тканей, приготовление гидрогеля, культуру органоидов, прогрессию развития и дальнейший анализ, приведён на рисунке 1, а репрезентативные морфологии органоидов, полученные с помощью этой платформы, показаны на рисунке 2.

Рисунок 1. Обзор процесса генерации органоидов на основе гидрогеля. (A) Блок-схема, обобщающая рабочий процесс протокола, включая сбор тканей, обработку тканей, криоконсервацию, восстановление и необязательную подготовку клеток, подготовку гидрогеля, культуру органоидов, разработку органоидов и аналитические применения в дальнейших процессах. (B) Визуальная схема, отражающая основные этапы протокола генерации органоидов на основе гидрогеля, включая обработку и подготовку тканей, восстановление и необязательную подготовку клеток, а также подготовку гидрогеля и посев органоидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Репрезентативные органоидные морфологии, возникающие в определённой гидрогелевой системе. Репрезентативные яркие изображения органоидов, полученных из различных человеческих тканей, культивируемых в определённой гидрогелевой матрице. Органоиды молочной железы, полученные из отдельных эпителиальных клеток, полученных с помощью мамопластики, были изображены на 21-й день культуры. Ксенотрансплантатные органоиды, полученные пациентами, полученные из фрагментов опухоли, были изображены на 16-й день посева. Органоиды слюнных желез, образованные из эпителиальных фрагментов, были изображены на третий день культуры. Органоиды почек, полученные из фрагментов эпителия, были изображены на 17-й день культуры. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Протокол

Первичные ткани, которые в противном случае были бы выброшены как медицинские отходы после операции, были получены в соответствии со всеми соответствующими законами с использованием протоколов, утверждённых институциональными контрольными советами Медицинского центра Мэна и Медицинского центра Тафтса. Все ткани были анонимизированы до переноса и не могли быть связаны с конкретными пациентами. По этой причине этому исследованию был предоставлен статус освобождения от Комитета по использованию человека в качестве экспериментальных субъектов при Массачусетском технологическом институте и в Университете здравоохранения Тафтса (IRB #13521). Все пациенты, участвовавшие в этом исследовании, подписали форму информированного согласия, соглашаясь участвовать в исследовании и опубликовать результаты.

1. Обработка и подготовка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнять все процедуры, связанные с человеческими тканями, в соответствии с институциональными стандартами биобезопасности и этическими нормами. Обратитесь к схемам рабочих процессов, показанных на рисунках 1A и 1B, чтобы получить визуальный обзор шагов протокола и рабочего процесса подготовки органоидов до начала процедуры.

1. Приготовьте MEGM с использованием эпителиальной базальной среды молочной железы, дополненной экстрактом бычьего гипофиза 52 мкг/мл, фактором роста эпидермиса человека 10 нг/мл, 5 мкг/мл инсулина, 500 нг/мл гидрокортизона, 1% (v/v) GlutaMAX и 1% (v/v) антибиотико-антимикотическим (100X).
2. Подготовьте диссоциационную среду, добавив 1,5 мг/мл коллагеназу A (хранящуюся при −20°C) и 100 U/mL гиалуронидазу (при 4°C) в эпителиальную среду молочной железы (MEGM).
3. Получайте человеческую грудную ткань, полученную профилактическими мастэктомиями и редукционными маммопластиками, в течение 24 часов после удаления, нефиксированную в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) и поддерживаемую при 4°C. Взвесьте ткань на точном весе, чтобы определить общий вес ткани.
4. Поместите ткань в стерильный шкаф для биобезопасности. Механически измельчите ткань на фрагменты 3–5^{мм 3} с помощью стерильных скальпелей. Перенесите примерно 2–3 г измельчённой ткани в коническую трубку объёмом 15 мл. Добавьте 10 мл диссоциационной среды в каждую трубку.
5. Инкубировать трубки при 37°C на орбитальном вращателе при 8 об/мин в течение 12–18 часов для ферментативного переваривания ткани. Считать пищеварение завершенным, когда не осталось крупных фрагментов ткани и по всему среде видна однородная суспензия равномерно фрагментированного материала.
6. Дайте эпителиальным фрагментам оседать под действием гравитации в течение 5 минут. Убедитесь, что в среде не осталось видимых фрагментов и что присутствует отдельная гранула. Аккуратно декантуйте и выбросьте супернатант, не нарушая шарик.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант содержит стромальные клетки и компоненты матрицы, и может быть промыт, использован или сохранен для других исследований.
7. Повторно суспензируйте гранулу в промывке на 10 мл, состоящую из 5% сыворотки плода бычьего скота (FBS) в PBS. Центрифугу при 250 × г в течение 5 минут в центрифуге с поворотным ведром при комнатной температуре.
8. Повторите этап промывания ещё три раза или пока супернатант не станет чистым и не будет видимого мусора.
9. Суспензировать конечную гранулу в замораживающей среде, состоящую из 10% диметилсульфоксида (DMSO) в MEGM при объёме 1 мл на грамм исходной массы ткани.
   ВНИМАНИЕ: ДМСО вреден при контакте или вдыхании. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты и работайте в химическом защитном капюшоне, если это требует институциональные правила.
10. Аликвот 1 мл подвески в каждый криовиал. Поместите криовиалы при −80°C в заморозительный контейнер перед длительным хранением в жидком азоте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг представляет собой точку паузы. Храните образцы при −80°C перед передачей в условия длительного хранения.

2. Восстановление и необязательная подготовка клеток

1. Оттаивание и первоначальное восстановление
   1. Удалить криоконсервированную ткань из хранения при температуре −80°C после заморозки не менее 24 часов или из длительного хранения в жидком азоте. Немедленно погрузите криовиальное тело до крышки в водяную ванну при температуре 37°C и быстро размораживайте в течение 1 минуты, чтобы минимизировать гибель клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно перемешивайте криовиал во время размораивания, чтобы обеспечить равномерное прогрев.
   2. После полного оттаивания немедленно переложите содержимое криовиального фильтра в коническую трубку объёмом 15 мл с 10 мл MEGM. Центрифугу при 250 × г на 5 минут.
2. Необязательное истощение фибробластов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Истощение фибробластов путём предварительного покрытия — это необязательный этап обогащения, используемый для уменьшения быстро адгерирующихся популяций стромальных или фибробластов, когда требуется более эпителиально-обогатённая стартовая популяция. Этот этап не является необходимым для формирования органоидов и может быть корректирован в зависимости от цели эксперимента.
   1. Восстановите пеллету в 10 мл MEGM.
   2. Перенесите восстановленную суспензированную ткань в контейнер для клеточной культуры диаметром 10 см. Инкубировать при 37°C в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂ в течение 90 минут для прикрепления фибробластов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не трогайте посевную чашу во время инкубации, чтобы обеспечить эффективное присоединение фибробластов.
   3. Соберите супернатант, содержащий неадгезирующие клетки, с помощью серологической пипетки объёмом 10 мл, аккуратно наклоняя посевную чашу примерно на 45°. Аккуратно промойте тарелку 5 мл PBS и комбинируйте промывание с собранным супернатантом.
   4. Центрифугуйте комбинированную подвеску при 250 × г в течение 5 минут для извлечения материала, обогащённого эпителием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, прилипшие к пластинке, обогащаются для фибробластов молочных желез и могут быть размножены отдельно, добавляя среду, состоящую из DMEM + 10% FBS и антибиотиков.
3. Опциональная диссоциация в отдельные клетки
   1. Суспензировать гранулу в 500 мкл предварительно подогреного (37°C) раствора диссоциационного фермента, состоящего из 0,25% трипсина. Альтернативные диссоциационные реагенты могут потребовать оптимизации. Перенесите подвеску в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл. Тритурируйте образец 20 раз с помощью пипетки P1000 для стимулирования диссоциации.
      ВНИМАНИЕ: Ферментативные реагенты для диссоциации могут быть вредны. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты и избегайте контакта кожи или глаз.
   2. Инкубировать трубку при 37°C в течение 3-5 минут. Механически диссоциируйте образец сразу после инкубации, тритурируя 20 раз с помощью пипетки P1000.
   3. Добавьте 1 мл жидкости с сывороткой для нейтрализации ферментативной реакции. Центрифугу при 500 × г в течение 5 минут.
   4. Ресуспензировать гранулу в растворе диспазы объемом 300 мкл (5 Ед/мл) и раствора ДНКазы с 30 мкл (1 мг/мл). Инкубировать при 37°C в течение 3–5 минут.
   5. Механически диссоциируйте образец пипетированием 15–20 раз. Добавьте в суспензию 700 мкл жидкости с сывороткой.
   6. Фильтруйте суспензию ячейки через сито 40 мкм в чистую трубку. Может использоваться либо стандартное сито с ячейки 40 мкм, либо сито с наконечником пипетки Flowmi. Flowmi-сита могут уменьшить потери образца при работе с ограниченным количеством ячеек.
   7. Определите жизнеспособное количество ячеек с помощью исключения трипана синего цвета. Смешайте 10 мкл суспензии ячейки с трипан-синим в соотношении 1:1 и загрузите 10 мкл смеси в камеру для подсчета ячеек или счётное стекло. Определите жизнеспособность клетки с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра.
   8. Центрифугуйте подвеску при 500 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
   9. Суспензировать клеточную гранулу в MEGM в нужной концентрации для засева гидрогеля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов с одноклеточным посевом типичные входы составляют примерно от 1 000 до 5 000 клеток на 200 мкл гидрогеля, в зависимости от экспериментальной цели и характеристик донорского образца. Более низкие плотности посева обычно используются для живой визуализации и морфогенеза для облегчения отслеживания развития отдельных органоидов, тогда как более высокие плотности обычно применяются для молекулярного анализа конечных точек, включая сбор РНК и белка.

3. Подготовка гидрогеля и органоидный посев

1. Подготовка запасов и расчёт объёмов
   1. Перед использованием поместите на лёд раствор ламинина (1,18 мг/мл), раствор гиалуроновой кислоты (1 мг/мл в стерильной воде), раствор фибронектина (2 мг/мл в стерильной воде) и PBS 1× на лёд. Храните ламинины и аликвоты с фибронектином при −80°C и храните раствор гиалуроновой кислоты при 4°C. Замороженные компоненты медленно размораживайте на льду при 0°C–4°C перед использованием.
   2. Приготовьте дополнительный раствор с внеклеточной матрицей на 25×. Для получения 1 мл смешайте 425 мкл ламинина, 250 мкл гиалуроновой кислоты, 250 мкл фибронектина и 75 мкл ПБС в трубке, хранящейся на льду. Аккуратно перемешайте, перевернув трубку 3–4 раза. Храните раствор при 4°C до месяца.
   3. Определите желаемый итоговый объём и состав гидрогеля перед приготовлением. Подготовьте как минимум 20% избыточного объёма, чтобы учесть потери материала во время пипетирования и переноса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состав гидрогеля состоит из коллагена I, конечной концентрации внеклеточных матрикса с концентрацией 1× (из запаса 25×), и 12,5% (v/v) 0,1 N гидроксида натрия относительно объёма коллагена I для нейтрализации и полимеризации pH.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные концентрации гидрогеля составляют 1,7 мг/мл коллагена I, 20 мкг/мл ламинина, 20 мкг/мл фибронектина и 10 мкг/мл гиалуроновой кислоты.
   4. Вычислите требуемый объём коллагена I (V_{коллагена}) по следующей формуле:
      
      Здесь C_final  = 1,7 мг/мл, _{V total} — это желаемый итоговый объём гидрогеля, а C_stock — концентрация раствора коллагена. Используйте концентрации коллагена в диапазоне от 2 до 12 мг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация коллагена может варьироваться между партиями. Более высокие концентрации увеличивают вязкость и должны быть пипетированы медленно.
   5. Вычислите объём 0,1 N гидроксида натрия (V_NaOH) по следующей формуле:
      V_NaOH = 0,125 x V_{коллаген}
      Приготовьте рабочий раствор гидроксида натрия с концентрацией 0,1 Н, разбавляя 1 Н гидроксида натрия в стерильной воде.
   6. Вычислите объём добавки внеклеточного матрица (V_ES) по следующей формуле:
      
   7. Вычислите оставшийся объём, который нужно заполнить ростовой средой, используя следующую формулу:
      _{Среда роста} V = _всего V - (V_{коллаген} + _{V NaOH} + V_ES + _{V клетки/ткань})
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите объём клеток или фрагментов ткани для каждого эксперимента отдельно. Используйте типичный диапазон от 10 до 100 мкл в пределах допустимого объёма. Точный подсчёт фрагментов не выполняется, поскольку размер и состав фрагментов существенно различаются между препаратами. Стандартизуйте посев с помощью визуальной оценки численности и распределения фрагментов.
2. Приготовление гидрогелевой мастер-смеси
   1. Поместите коллаген I, внеклеточную матриксовую добавку, гидроксид натрия (0,1 N) и среду роста на лёд при 0°C–4°C. Поддерживайте все компоненты при низкой температуре, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию.
   2. Добавьте рассчитанный объём коллагена I в охлаждённую микроцентрифугную трубку.
   3. Добавьте рассчитанный объём предварительно охлаждённой почвенной среды в раствор коллагена.
   4. Добавьте рассчитанный объём 0,1 N гидроксида натрия для нейтрализации раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущая оптимизация показала, что эти условия обеспечивают соответствующий гель pH; поэтому регулярное тестирование pH гидрогелевой смеси не требуется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все последующие шаги быстро, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию коллагена.
   5. Смешивайте раствор, энергично встряхивая трубку со скоростью примерно один раз в секунду не менее 6 встряхиваний.
   6. Добавьте рассчитанный объём добавки внеклеточного матрикса в смесь.
   7. Добавьте рассчитанный объём отдельных клеток или фрагментов ткани с помощью пипетки P1000 или ширококалиберной пипетки. Сразу перемешайте, встряхивая, как описано в шаге 3.2.5, и сразу переходите к следующему этапу.
3. Осаждение гидрогелем
   1. Пипетировать гидрогелевую смесь в культурные сосуды с нужным объёмом на каждую скважину. Используйте 200 мкл гидрогеля на скважину для 4-колодцевых камерных затворов, 100 мкл на скважину для 8-колодцевых камерных затворов и 20 мкл на скважину для плит с 96 колодцами.
   2. При использовании камерных затворов размазывайте гидрогель в тонкую подушечку по поверхности. Разместите наконечник пипетки у центрального верхнего края камеры и проведите наконечник по поверхности, раздавая гель, чтобы получить ровную подушечку. Для пластин с 96 лунками размещайте кончик пипетки в центре колодца, сохраняя контакт с поверхностью, и размещайте гель по центру, чтобы сохранить куполообразную структуру. Избегайте пипетирования воздуха в гель, так как это приведёт к образованию пузырьков.
   3. Инкубировать культурные сосуды при 37°C в увлажнённом инкубаторе с 5%_CO2 в течение 60 минут для полной полимеризации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Описанные здесь условия полимеризации были оптимизированы для форматов культур, использованных в этом исследовании. Могут потребоваться незначительные корректировки времени полимеризации в зависимости от геометрии сосуда культуры, объёма гидрогеля и условий инкубации.
4. Культура и обслуживание
   1. Добавьте в каждую скважину заранее подогреный MEGM. Регулируйте громкость в соответствии с используемым форматом культуры.
   2. Аккуратно отсоедините гидрогель от поверхности культуры с помощью наконечника пипетки, чтобы гель мог всплывать. Проведите кончик пипетки по периметру геля и аккуратно поднимите под полимеризированный гидрогель, чтобы освободить его с поверхности.
   3. Заменяйте MEGM два раза в неделю на свежую предварительно подогреную среду. Сохранять культуры в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂ примерно 3–4 недели и прекращать культуры до полного коллапса гидрогеля. Определите коллапсированные гидрогели по появлению плотных, непрозрачных, похожих на пробки структур, возникающих в результате обширного клеточного роста внутри геля (см. представительные примеры на дополнительном рисунке 1).

Результаты

Успешное выполнение этого протокола приводит к формированию трёхмерных органоидных структур, демонстрирующих организованную эпителиальную морфологию и специфические структурные особенности. Органоиды начинают формироваться в течение 3–7 дней после посева и продолжают развиваться в течение всего периода культуры. Предыдущая характеристика этой гидрогель-органоидной системы показала воспроизводимое формирование органоидов у нескольких независимых первичных доноров^{человека...}

Обсуждение

Описанный здесь протокол позволяет воспроизводить трёхмерные человеческие органоиды молочной железы в определённой гидрогелевой микросреде, поддерживающей ключевые особенности морфогенеза^{молочной железы 3}. Для успеха этого метода критически важно несколько шагов. Во-первых, обработка тканей и ферментативная диссоциация должны тщательно контролироваться для сохранения жизнеспособности эпителия при минимизации переваривания, что может снизить выход клеток и ухудшить...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
15 мл конические пробирки	VWR	89039-664	Стерильные пробирки для обработки тканей и центрифугирования
40 мкм сеточный фильтр	VWR	732-2757	Фильтрационное устройство для приготовления одноклеточной суспензии
40 мкм сеточный фильтр для малых объемов	Bel-Art	136800040	Фильтрационное устройство для приготовления одноклеточной суспензии
Автоматизированный счетчик клеток	Bio-Rad	1450102	Устройство, используемое для подсчета клеток и определения их жизнеспособности
Экстракт гипофиза крупного рогатого скота	Thermo Scientific	13028014	Добавка для среды эпителиальных клеток
Слайды для подсчета клеток	Bio-Rad	145-0011	Двухкамерные слайды, используемые для подсчета клеток
Центрифуга	N/A	N/A	Настольная центрифуга/центрифуги должны иметь возможность работать со скоростью не менее 500 x g и размещать пробирки объемом 15 мл и 1,5 мл.
Коллаген I	Millipore Sigma	08-115	Белок внеклеточной матрицы, используемый для формирования гидрогелев
Коллагеназа A	Sigma-Aldrich	11088793001	Фермент, используемый для диссоциации тканей
Криопробирки	Corning	976171	Стерильные пробирки для криогенного хранения образцов
Культуральные сосуды (например, камерные слайды, многоканальные пластинки)	Corning	354104 354108 3603	Площадки для депонирования гидрогелев и культивирования органоидов.
Диметилсульфоксид	Millipore Sigma	317275	Криопротектор, используемый в замораживающей среде
Dispase II	Roche	4942078001	Фермент, используемый для вторичной диссоциации тканей
DNase I	Roche	10104159001	Фермент, используемый во время диссоциации клеток.
Фета́льная сыворотка бычьего теля	Gibco	10437	Добавка сыворотки, используемая в среде для промывания и нейтрализации
Фибронектин	Sigma-Aldrich	F2006	Компонент внеклеточной матрицы
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061	Добавка для среды эпителиальных клеток
Человеческий эпидермальный фактор роста	Sigma-Aldrich	E9644	Добавка для среды эпителиальных клеток
Гидрокортизон	Sigma-Aldrich	H0888	Добавка для среды эпителиальных клеток
Гиалуроновая кислота	Millipore Sigma	385908	Компонент внеклеточной матрицы для формулирования гидрогелев
Гиалуронидаза	Sigma-Aldrich	H3506	Фермент, используемый для диссоциации тканей
Инкубатор	Thermo Scientific	3598	Устройство, используемое для инкубации тканей
Инсулин	Sigma-Aldrich	I9278	Добавка для среды эпителиальных клеток
Ламинин	Gibco	23017-015	Компонент внеклеточной матрицы
Молочная эпителиальная базальная среда	Thermo Scientific	M171500	Питательная среда для эпителиальных клеток
Микроцентрифужные пробирки (1,5 мл)	Thermo Scientific	3451	Пробирки, используемые для реакций с малым объемом
Орбитальный вращатель	Thermo Scientific	400110	Вращатель, используемый для диспергирования тканей во время ферментативной диссоциации
Пипетка P1000	Gilson	P1000	Устройство, используемое для смешивания и переноса объемов до 1000 мкл
Пениллин-стрептомицин	Thermo Scientific	15140122	Антибиотическая добавка для среды эпителиальных клеток
Фосфатно-буферный раствор	Gibco	20012-027	Буферный раствор, используемый для промывания и ополаскивания
Точные весы	Mettler Toledo	ML303E	Весы, используемые для взвешивания тканей
Серологическая пипетка	Nunc	170356N	Пипетка, используемая для сбора неадгезивных эпителиальных клеток
Гидроксид натрия (1 Н)	Fisher Chemical	SS261	Реагент, используемый для нейтрализации колlagen
Стерильные скальпели	Bard-Parker	372615	Инструменты, используемые для механического измельчения тканей
Раствор трипсина синего	Gibco	15250061	Краситель, используемый для оценки жизнеспособности клеток
Трипсин (0,25%)	Gibco	25200056	Ферментативный реагент, используемый для диссоциации клеток
Водяная баня (37 градусов Цельсия)	VWR	10LA	Устройство, используемое для контролируемого размораживания образцов