Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ ELISpot для количественного определения антигенспецифических и общих антителосекретирующих клеток в крови и костном мозге иммунизированных макак-резусов

59 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71836

⸱

21 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Comparative Medicine, Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, University of Texas, 2New Iberia Research Center, University of Louisiana at Lafayette, 3Department of Immunology and Microbiology, Scripps Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

Метод ELISpot для B-клеток является валидированным способом количественной оценки численности и долговечности антигенспецифических долгоживущих плазматических клеток, секретирующих IgG, IgM и IgA, а также общего количества антитело-секретирующих клеток (ASC) как в крови (отражающих короткоживущие плазмобласты после иммунизации), так и более стабильных ASC в костном мозге.

Аннотация

Оценка новых вакцинных антигенов и адъювантов традиционно основывается на измерении титров антител, разработка которых после иммунизации требует времени. Количественное определение антителопродуцирующих клеток (АПК) после первичной и бустерной иммунизации обеспечивает более ранний и более информативный с точки зрения механизмов показатель гуморального иммунитета, индуцированного вакциной, и может способствовать оптимизации составов вакцин и стратегий иммунизации. В данной работе описывается протокол подсчета АПК в мононуклеарных клетках периферической крови (МНКПК) и клетках костного мозга (КМ) макак-резусов; макаки-резусы являются важной доклинической моделью для исследований вакцин против ВИЧ. Этот метод иммуноспот-анализа с использованием ферментов (ELISpot) позволяет количественно определить как антигенспецифические, так и общие АПК, вырабатывающие IgG, IgM и IgA, путем измерения их абсолютной и относительной частоты. В периферической крови данный анализ фиксирует пик плазмобластного ответа после иммунизации, тогда как в костном мозге он выявляет накопление антигенспецифических плазматических клеток различных изотипов, позволяя таким образом оценить долговечность долгоживущих АПК. Данный протокол представляет собой надежный и воспроизводимый подход для оценки комбинаций иммуногенов и адъювантов в доклинических исследованиях вакцин и предоставляет ценные данные для поддержки перевода перспективных кандидатов в вакцины на стадию клинической разработки.

Введение

Антителопродуцирующие клетки (АПК) являются ключевыми компонентами адаптивного иммунитета и включают как короткоживущие плазмобласты, которые быстро образуются после иммунизации, так и долгоживущие плазматические клетки, отвечающие за устойчивую продукцию антител. Плазмобласты временно обнаруживаются в периферической крови и вторичных лимфоидных органах, достигая пиковых значений в определенные моменты времени после иммунизации, которые варьируются в зависимости от состава вакцины и вида организма (обычно 4–5-е сутки у макак-резусов и примерно 7-е сутки у людей). Напротив, зрелые плазматические клетки являются долгоживущими и преимущественно локализуются во вторичных лимфоидных тканях и костном мозге (КМ). Эффективная вакцина должна вызывать как выраженный гуморальный, так и клеточный иммунный ответ. Измерение вторичного иммунного ответа, который проявляется в быстрой экспансии плазмобластов в мононуклеарных клетках периферической крови (МНКПК) после бустерной иммунизации, позволяет получить ценные данные о величине индуцированного вакциной иммунного ответа. Общая цель данного протокола — предоставить надежный метод количественного определения раннего ответа плазмобластов и долгоживущих плазматических клеток после специфической иммунизации белком Env у макак-резусов.

В методе иммуноспот-анализа (ELISpot) антитело-секретирующие клетки (ASC) культивируют в 96-луночных планшетах с дном из мембраны из поливинилиденфторида (PVDF) или смешанного целлюлозного эфира (MCE), покрытой антигеном (Ag), что позволяет жизнеспособным клеткам секретировать белки, которые захватываются непосредственно на поверхности мембраны. Захваченные белки затем детектируют с помощью антител в стандартном формате сэндвич-иммуноанализа. В хромогенных ELISpot-анализах пятна образуются в результате превращения субстрата 3-амино-9-этилкарбазола (AEC) пероксидазой хрена (HRP) в нерастворимый цветной осадок, что позволяет визуализировать и подсчитать отдельные ASC. ELISpot обладает несколькими важными преимуществами, включая возможность обнаружения антигенспецифических ответов ex vivo, высокочувствительную функциональную оценку отдельных иммунных клеток и количественный мониторинг иммунного ответа T- и B-клеток как в доклинических, так и в клинических исследованиях1,2,3.

В данной работе описан протокол B-клеточного ELISpot-анализа для количественного определения общего и антигенспецифического IgG, IgM и IgA ASC в PBMC и клетках костного мозга макак-резусов. В протоколе подробно описаны все критические этапы, включая покрытие планшетов, блокировку, посев клеток, проведение анализа, подсчет пятен и анализ данных, для характеристики кинетики общего и Env-специфического ответа плазмобластов и плазматических клеток. Данный метод представляет собой воспроизводимый подход к оценке и сравнению иммуногенности различных составов антигенов и адъювантов в доклинических исследованиях вакцин и способствует оптимизации стратегий вакцинации для последующего внедрения в клиническую практику.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Макаки-резус, использованные в данном протоколе, были получены из колоний, свободных от специфических патогенов (SPF), исследовательского центра New Iberia и содержались в Центре сравнительной медицины и исследований им. Майкла Э. Килинга при Онкологическом центре имени М. Д. Андерсона Техасского университета. Уход за животными и все экспериментальные процедуры соответствовали Руководству по содержанию и использованию лабораторных животных и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Онкологического центра имени М. Д. Андерсона Техасского университета (протокол № 2616RN00).

Данный протокол представляет собой оптимизацию метода, описанного в предыдущих доклинических исследованиях по иммунизации4,5,6,7, разработанного для выявления ответов ASC. В нижеприведенном протоколе описывается процедура ELISpot с использованием свежих препаратов PBMC и клеток BM  макак-резусов, участвующих в протоколе экспериментальной вакцинации против ВИЧ.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры из разделов 1–4 следует проводить в сертифицированном боксе биологической безопасности II класса, используя асептическую технику. По возможности используйте многоканальные дозаторы.

1. Подготовка планшетов для ELISpot

  1. Покрытие планшетов для ELISpot
    1. Покройте планшеты 1 и 3 для определения общего иммуноглобулина (Ig), добавив в каждую лунку по 100 µL неконъюгированных антител козьих к IgG + IgM + IgA обезьян в концентрации 5 µg/mL, разведенных в стерильном DPBS. Инкубируйте планшеты при 4 °C не менее 8 ч, желательно в течение ночи (Рисунок 1A,C).
    2. Покройте антигенспецифические планшеты 2 и 4, добавив в каждую лунку по 100 µL лектина Galanthus nivalis (GNL) в концентрации 20 µg/mL, разведенного в DPBS. Инкубируйте планшеты при 4 °C не менее 8 ч, желательно в течение ночи (Рисунок 1B,D).
    3. Храните покрытые планшеты при 4 °C до использования.
  2. Промывка и блокировка планшетов для общего иммуноглобулина
    1. Удалите раствор для покрытия из планшетов 1 и 3, быстро перевернув каждый планшет над контейнером для отходов. Плотно прижмите перевернутый планшет к абсорбирующей бумаге, чтобы удалить остатки жидкости.
    2. Промойте каждый планшет дважды, используя по 200 µL/лунка PBS, содержащего 0,05% Tween 20. Затем промойте планшеты дважды по 200 µL/лунка DPBS для удаления остатков детергента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Tween 20 цитотоксичен. Полностью удалите его перед посевом клеток.
    3. Добавьте по 200 µL RPMI-10 в каждую лунку. Инкубируйте планшеты в течение 2 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе.
  3. Промывка и блокировка антигенспецифических планшетов
    1. Удалите раствор GNL для покрытия из планшетов 2 и 4, быстро перевернув каждый планшет над контейнером для отходов. Плотно прижмите перевернутые планшеты к абсорбирующей бумаге, чтобы удалить остатки жидкости.
    2. Промойте каждый планшет четыре раза, используя по 200 µL/лунка DPBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте PBS, содержащий Tween 20, для планшетов, покрытых GNL.
    3. Добавьте по 200 µL RPMI-10 в каждую лунку. Инкубируйте планшеты в течение 2 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе.
    4. Слейте блокирующий раствор. Промойте каждый планшет четыре раза, используя по 200 µL/лунка DPBS.
    5. Добавьте по 100 µL/лунка антигена CH505 SOSIP до конечной концентрации 5 µg/mL. Инкубируйте планшеты в течение 2 ч при 37 °C.
    6. Слейте раствор антигена и промойте каждый планшет четыре раза стерильным DPBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте DPBS в лунках после последней промывки, чтобы предотвратить высыхание мембраны MCE перед посевом клеток.

2. Подготовка образцов: выделение PBMC и мононуклеарных клеток костного мозга

  1. Выделение PBMC из цельной крови
    1. Центрифугируйте пробирки с 10 mL крови с ЭДТА при 450 x g в течение 20 мин при комнатной температуре с выключенным тормозом.
    2. Удалите плазму и добавьте 4 mL DPBS без Ca2+ и Mg2+. Аккуратно перемешайте, используя серологическую пипетку на 10 mL.
    3. Осторожно нанесите разведенную кровь слоем поверх 4 mL Ficoll в центрифужной пробирке объемом 15 mL. Центрифугируйте при 800 x g в течение 30 мин при комнатной температуре с использованием медленного ускорения и медленного торможения.
    4. Перенесите слой лейкоцитов (buffy coat), содержащий мононуклеарные клетки периферической крови, в новую пробирку объемом 15 mL. Добавьте 8–10 mL DPBS и центрифугируйте при 450 x g в течение 10 мин при комнатной температуре.
    5. Удалите супернатант и аккуратно ресуспендируйте осадок клеток.
    6. Добавьте 2 mL лизирующего буфера ACK (хлорид аммония-калия) к клеточной суспензии. Инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Не превышайте время инкубации в 5 мин, так как длительное воздействие лизирующего буфера ACK снижает жизнеспособность клеток.
    7. Остановите лизис эритроцитов, добавив 10 mL DPBS, содержащего 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 10 мин при комнатной температуре.
    8. Удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в RPMI-10.
    9. Подсчитайте количество PBMC подходящим методом подсчета клеток и убедитесь, что жизнеспособность составляет >90%, например, с помощью окрашивания трипановым синим.
    10. Доведите концентрацию в одной аликвоте до 5 × 106 клеток/mL для проведения антиген-специфических анализов ELISpot. Доведите концентрацию во второй аликвоте до 1 × 106 клеток/mL для анализов ELISpot на общий уровень иммуноглобулинов.
  2. Выделение мононуклеарных клеток костного мозга
    1. Поместите клеточный фильтр с размером пор 70 µm в центрифужную пробирку объемом 50 mL. Предварительно смочите фильтр 1 mL DPBS.
    2. Добавьте 4 mL DPBS к 1 mL аспирата костного мозга. Тщательно перемешайте с помощью серологической пипетки.
    3. Пропустите суспензию костного мозга через фильтр 70 µm. Перед утилизацией фильтра промойте его 2 mL DPBS.
    4. Нанесите отфильтрованную суспензию слоем поверх 4 mL Ficoll в центрифужной пробирке объемом 15 mL. Центрифугируйте при 800 x g в течение 30 мин при комнатной температуре с использованием медленного ускорения и медленного торможения.
    5. Перенесите слой мононуклеарных клеток в новую пробирку объемом 15 mL. Добавьте 8–10 mL DPBS и центрифугируйте при 450 x g в течение 10 мин при комнатной температуре.
    6. Удалите супернатант и аккуратно ресуспендируйте осадок клеток.
    7. Добавьте 2 mL лизирующего буфера ACK к клеточной суспензии. Инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Не превышайте рекомендуемое время лизиса для сохранения жизнеспособности клеток.
    8. Остановите лизис эритроцитов, добавив 10 mL DPBS, содержащего 2% FBS. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 10 мин при комнатной температуре.
    9. Удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в RPMI-10.
    10. Подсчитайте количество мононуклеарных клеток костного мозга подходящим методом подсчета клеток и убедитесь, что жизнеспособность составляет >90%, например, с помощью окрашивания трипановым синим.
    11. Доведите концентрацию в одной аликвоте до 5 × 106 клеток/mL для проведения антиген-специфических анализов ELISpot. Доведите концентрацию во второй аликвоте до 1 × 106 клеток/mL для анализов ELISpot на общий уровень иммуноглобулинов.

3. Посев и инкубация клеток

  1. Посев на планшеты для определения общего иммуноглобулина
    1. Удалите блокирующую среду из планшетов 1 и 3, быстро перевернув каждый планшет над контейнером для отходов. Плотно постучите перевернутыми планшетами по абсорбирующей бумаге, чтобы удалить остатки среды.
    2. Добавьте 100 µL RPMI-10 в каждую лунку первого ряда и 133 µL RPMI-10 в каждую лунку второго и третьего рядов. Эти манипуляции выполняются в технических дублетах.
    3. Добавьте 100 µL суспензии PBMC (1 × 106 клеток/mL) в первую лунку каждого столбца в планшете 1. Расположите образцы в соответствии со схемой планшета [например, лунки A1–A6 для макаки-резуса 1 (RM1) и A7–A12 для макаки-резуса 2 (RM2)].
    4. Добавьте 100 µL суспензии клеток костного мозга (1 × 106 клеток/mL) в первую лунку каждого столбца в планшете 3. Расположите образцы в соответствии со схемой планшета.
    5. Приготовьте трехкратные серийные разведения, перенося по 67 µL из одной лунки в следующую и тщательно перемешивая после каждого переноса. Продолжайте серийное разведение в назначенных лунках, затем удалите последние 67 µL, чтобы поддерживать конечный объем 133 µL на лунку.
    6. Инкубируйте планшеты в течение ночи при 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержанием 5% CO2.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте перемещения или беспокойства планшетов во время инкубации, чтобы предотвратить появление двойных пятен.
  2. Посев на антиген-специфические планшеты
    1. Удалите DPBS из планшетов 2 и 4, быстро перевернув каждый планшет над контейнером для отходов. Плотно постучите перевернутыми планшетами по абсорбирующей бумаге, чтобы удалить остатки буфера.
    2. Добавьте 100 µL RPMI-10 в каждую лунку первого ряда и 133 µL RPMI-10 в каждую лунку второго и третьего рядов.
    3. Добавьте 100 µL суспензии PBMC (5 × 106 клеток/mL) в первую лунку каждого столбца в планшете 2. Добавьте образцы в соответствии со схемой планшета.
    4. Добавьте 100 µL суспензии клеток костного мозга (5 × 106 клеток/mL) в первую лунку каждого столбца в планшете 4. Добавьте образцы в соответствии со схемой планшета.
    5. Приготовьте трехкратные серийные разведения, перенося по 67 µL из одной лунки в следующую и тщательно перемешивая после каждого переноса. Продолжайте серийное разведение в назначенных лунках, затем удалите последние 67 µL, чтобы поддерживать конечный объем 133 µL на лунку.
    6. Инкубируйте планшеты в течение ночи при 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержанием 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте воздействия на инкубатор во время инкубации, так как вибрация может привести к появлению двойных пятен или артефактов в виде «кометного хвоста».

4. Обработка планшетов ELISpot

  1. Обработка планшетов для определения общего содержания иммуноглобулинов
    1. Извлеките планшеты из инкубатора после примерно 18 ч инкубации.
    2. Удалите клетки и культуральную среду, быстро перевернув каждый планшет над контейнером с отходами, содержащим 10% раствор гипохлорита натрия. Плотно прижмите перевернутые планшеты к абсорбирующей бумаге, чтобы удалить остатки жидкости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные этапы обработки выполняйте в нестерильных условиях.
    3. Промойте каждый планшет четыре раза, используя 200 µL/лунку DPBS с 0,05% Tween 20.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте финальный промывочный буфер в лунках, чтобы предотвратить высыхание мембран.
    4. В качестве альтернативы, при обработке большого количества планшетов, используйте автоматический промыватель микропланшетов.
    5. Приготовьте раствор детектирующих антител, разведя биотинилированные антитела к IgG и IgM обезьяны в пропорции 1:1 000, а биотинилированные антитела к IgA обезьяны — в пропорции 1:500 в DPBS, содержащем 0,05% Tween 20 и 1% FBS.
    6. Удалите финальный промывочный буфер, прижав планшеты к абсорбирующей бумаге. Добавьте 100 µL/лунку разведенных антител к IgG в колонки 1 и 2, 7 и 8; антител к IgM — в колонки 3 и 4, 9 и 10; и антител к IgA — в колонки 5 и 6, 11 и 12.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте по одному планшету за раз, чтобы предотвратить высыхание мембран.
    7. Инкубируйте планшеты в течение 2 ч при комнатной температуре.
    8. Удалите раствор детектирующих антител и четыре раза промойте планшеты DPBS, содержащим 0,05% Tween 20.
    9. Приготовьте ферментный конъюгат, разведя HRP-авидин 1:1 000 в DPBS, содержащем 0,05% Tween 20 и 1% FBS.
    10. Добавьте 100 µL/лунку разведенного HRP-авидина в каждую лунку. Инкубируйте планшеты в течение 2 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте.
    11. Удалите раствор HRP-авидина и четыре раза промойте планшеты DPBS, содержащим 0,05% Tween-20.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте финальный промывочный буфер в лунках до завершения проявления субстрата.
  2. Обработка планшетов для определения антиген-специфических антител
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура аналогична той, что использовалась для планшетов общего содержания иммуноглобулинов. Однако все этапы промывки выполняйте с использованием DPBS без Tween 20, чтобы сохранить покрытие GNL.
    1. Извлеките планшеты из инкубатора после примерно 18 ч инкубации.
    2. Удалите клетки и культуральную среду, быстро перевернув каждый планшет над контейнером с отходами, содержащим 10% раствор гипохлорита натрия. Плотно прижмите перевернутые планшеты к абсорбирующей бумаге, чтобы удалить остатки жидкости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные этапы обработки выполняйте в нестерильных условиях.
    3. Промойте каждый планшет четыре раза, используя 200 µL/лунку DPBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте финальный промывочный буфер в лунках, чтобы предотвратить высыхание мембран.
    4. Приготовьте раствор детектирующих антител, разведя биотинилированные антитела к IgG и IgM обезьяны в пропорции 1:1 000, а биотинилированные антитела к IgA обезьяны — в пропорции 1:500 в DPBS, содержащем 1% FBS.
    5. Удалите финальный промывочный буфер, прижав планшеты к абсорбирующей бумаге. Добавьте 100 µL/лунку разведенных антител к IgG в колонки 1 и 2, 7 и 8; антител к IgM — в колонки 3 и 4, 9 и 10; и антител к IgA — в колонки 5 и 6, 11 и 12.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте по одному планшету за раз, чтобы предотвратить высыхание мембран.
    6. Инкубируйте планшеты в течение 2 ч при комнатной температуре.
    7. Удалите раствор детектирующих антител и четыре раза промойте планшеты, используя 200 µL/лунку DPBS.
    8. Приготовьте ферментный конъюгат, разведя HRP-авидин 1:1 000 в DPBS, содержащем 1% FBS.
    9. Добавьте 100 µL/лунку разведенного HRP-авидина в каждую лунку. Инкубируйте планшеты в течение 2 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте.
    10. Удалите раствор HRP-авидина и четыре раза промойте планшеты, используя 200 µL/лунку DPBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте финальный промывочный буфер в лунках до завершения проявления субстрата.
  3. Автоматическая промывка (опционально)
    1. Подготовьте автоматический промыватель микропланшетов, заполнив систему DPBS согласно инструкциям производителя.
    2. Выберите предустановленную программу промывки ELISpot и выполните все этапы промывки, используя DPBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте DPBS для всех автоматических промывок, чтобы избежать повторной подготовки прибора при смене различных промывочных буферов.
    3. Для промывателя микропланшетов используйте настройки, указанные в Таблице 1.

5. Детекция

  1. Приготовление раствора субстрата
    1. Приготовьте рабочий раствор субстрата AEC непосредственно перед использованием, добавив одну каплю раствора хромогена на каждые 1 mL раствора субстрата. Тщательно перемешайте с помощью вортекса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте примерно 40 mL рабочего субстрата для четырех планшетов на 96 лунок.
  2. Проявление планшетов ELISpot при комнатной температуре
    1. Обрабатывайте планшеты по одному. Слейте остатки последнего промывочного буфера и немедленно добавьте по 100 µL рабочего субстрата AEC в каждую лунку.
    2. Визуально контролируйте проявление пятен до появления четких красных точек, обычно это занимает 2–4 min.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Избегайте избыточного проявления планшетов, так как это усиливает фоновое окрашивание и ухудшает разрешение пятен.
    3. Остановите ферментативную реакцию, тщательно промыв планшет под проточной водопроводной водой.
    4. Промойте планшет водопроводной водой четыре-пять раз. Удалите излишки воды с помощью абсорбирующих бумажных полотенец.
    5. Снимите поддон планшета и оставьте его высыхать на воздухе примерно на 24 h перед подсчетом пятен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Остановите реакцию, как только пятна станут видны в лунках с наибольшей концентрацией клеток, чтобы избежать избыточного проявления.
    6. Повторите шаги 5.2.1–5.2.5 для каждого оставшегося планшета.

6. Количественный анализ пятен

  1. Получение изображений ELISpot
    1. Просканируйте каждый планшет с помощью ридера ELISpot, оснащенного программным обеспечением для захвата изображений.
    2. Выберите соответствующий шаблон планшета, определите лунки для анализа и получите изображения согласно инструкциям программного обеспечения.
    3. Сохраните необработанные данные и экспортируйте изображения планшетов в формате TIFF для архивации.
  2. Подсчет антитело-секретирующих клеток
    1. Проверьте результаты автоматического подсчета пятен для каждой лунки.
    2. Проведите ручную верификацию каждой лунки, чтобы выявить неправильно объединенные или разделенные пятна. При необходимости отмечайте отдельные пятна вручную для получения точных данных о количестве.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ручная верификация рекомендуется, так как крупные пятна могут быть засчитаны несколько раз программным обеспечением для автоматического анализа.
    3. Запишите количество пятен вместе с соответствующими коэффициентами разведения в электронную таблицу, как описано в Таблице 2.
    4. Проанализируйте дубликаты лунок отдельно для IgG, IgM и IgA перед расчетом среднего количества пятен для каждого разведения.
    5. Рассчитайте количество антитело-секретирующих клеток на миллион исходных клеток, умножив среднее количество пятен на соответствующий коэффициент разведения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте коэффициенты разведения 15×, 45× и 135× для анализов общего иммуноглобулина и 3×, 9× и 27× для антиген-специфических анализов.
    6. Выполните все расчеты в программе для работы с электронными таблицами и постройте графики с помощью статистического программного обеспечения для визуализации данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В данном анализе ELISpot для B-клеток антителопродуцирующие клетки (АПК) выявляли с помощью CH505 SOSIP — растворимого тримера гликопротеина оболочки (Env) ВИЧ-1, использованного в качестве адсорбирующего антигена в исследовании вакцины, направленном на выработку широко нейтрализующих антител (bnAbs) против ВИЧ-1. На рисунке 1 представлена схема расположения лунок на планшете ELISpot, использованная для количественного определения общего числа и специфических к антигену АПК на разных планшет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

ELISpot B-клеток представляет собой чувствительный метод обнаружения общего иммуноглобулина и ответов антител-секретирующих клеток (ASC), специфичных к антигену, в клетках крови, плазмы и костного мозга8,9,10,11. Для обеспечения воспроизводимости протокола критически важны несколько этапов. Во-первых, мембраны должны быть точно покрыты оптимальной концентрацией захватывающих антител. Блокировка...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о наличии финансового конфликта интересов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность персоналу по уходу за животными в Центре сравнительной медицины и исследований Килинга за их помощь, а также многим бывшим членам команды и коллегам за последовательное совершенствование данной процедуры. Финансирование этого проекта по созданию вакцины против ВИЧ для нечеловекообразных приматов (NHP) было предоставлено по грантам NIH 5R01AI183472 (MBZ) и R24OD010947 (FJV).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ACK LysisQuality Biological118-156-101500 ml
Сито µmFisher22363548Стерильный фильтр для клеток, подходящий для конических пробирок объемом 50 mL
Рабочий субстрат AECBD Biosciences551951Реагенты на 10 планшета(ов)
Анализ: ExcelMicrosoft officeVersion 2508 Build 16.0.19127.20678Microsoft Excel для Microsoft 365
Анализ: GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersion 10.6.1 (892) GraphPad Prism 10
Биотинированные антитела к Rhesus IgANHPRRAB-3086851лиофилизат
Биотинированные антитела к IgG обезьяныRocklandP/N 617-106-012лиофилизат
Биотинированные антитела к IgM обезьяныRocklandP/N 617-106-007лиофилизат
Блокирующая средаЛабораторные реагентыприготовлено в лабораторииRPMI-10
Буфер для разведения вторичных антител и HRPЛабораторные реагентыприготовлено в лаборатории1X DPBS с 1% FBS
Центрифуга Thermo Scientific75004521Sorvall Legend XTR, год выпуска: 2013, ротор TX-750 и 75003608 (круглый стакан
Буфер для покрытияЛабораторные реагентыприготовлено в лаборатории1X DPBS
DPBSGibco14190-1361X
Планшеты для ELISpotMillipore SigmaMSHAN4B50упаковка из 50 планшетов
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Omega ScientificFB-011X
ФиколлSTEMCELL Technologies18061500 ml
Неконъюгированный GNLVector LaboratoriesL-1240-5лиофилизат
Пероксидаза хрена (HRP) — АвидинVector LaboratoriesA-20045mg/ml, готовый к использованию
Считыватель Mabtech IRIS Fluorospot/ELISpotMabtech ABP/N: 2000Автоматизированная визуализация и анализ для тестов ELISpot и Flurospot
Пенициллин/СтрептомицинGibco15140-122100X
Мойка планшетовBioTek Instruments, Inc.REF# 405TSRSМойка микропланшетов 405 TS
RPMI-10Лабораторные реагентыприготовлено в лабораторииRPMI-1640 + 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина 
RPMI-1640Gibco22400-0711X
Tween20Sigma Life sciencesP7949500ml
Неконъюгированные поликлональные антитела козы к IgG+IgA+IgM обезьяны IgG/IgM/IgALS-BioC347340лиофилизат
Буфер для промывки (антиген-специфичные планшеты)Лабораторные реагентыприготовлено в лаборатории(только DPBS 1X)
Буфер для промывки (планшеты для общего Ig)Лабораторные реагентыприготовлено в лаборатории(DPBS 1X + 0,05% Tween 20)

Ссылки

  1. Hwai H, Chen YY, Tzeng SJ. B-Cell ELISpot Assay to Quantify Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Methods Mol Biol. 2018;1808:133-141.
  2. Haralambieva IH, Ovsyannikova IG, Kennedy RB, Poland GA. Detection and Quantification of Influenza A/H1N1 Virus-Specific Memory B Cells in Human PBMCs Using ELISpot Assay. Methods Mol Biol. 2018;1808:221-236.
  3. Sahay B, Aranyos AM, McAvoy A, Yamamoto JK. Utilization of Feline ELISpot to Evaluate the Immunogenicity of a T Cell-Based FIV MAP Vaccine. Methods Mol Biol. 2018;1808:197-219.
  4. Silveira EL, et al. Vaccine-induced plasmablast responses in rhesus macaques: Phenotypic characterization and a source for generating antigen-specific monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 2015;416:69-83.
  5. Arunachalam PS, et al. A comparative immunological assessment of multiple clinical-stage adjuvants for the R21 malaria vaccine in nonhuman primates. Sci Transl Med. 2024;16(758):eadn6605.
  6. Kasturi SP, et al. 3M-052, a synthetic TLR-7/8 agonist, induces durable HIV-1 envelope-specific plasma cells and humoral immunity in nonhuman primates. Sci Immunol. 2020;5(48):eabb1025.
  7. Kasturi SP, et al. Adjuvanting a Simian Immunodeficiency Virus Vaccine with Toll-Like Receptor Ligands Encapsulated in Nanoparticles Induces Persistent Antibody Responses and Enhanced Protection in TRIM5alpha Restrictive Macaques. J Virol. 2017;91(4):e01844-16.
  8. Shah HB, Koelsch KA. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods Mol Biol. 2015;1312:419-426.
  9. Czerkinsky CC, et al. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 1983;65(1-2):109-121.
  10. Saletti G, et al. Enzyme-linked immunospot assays for direct ex vivo measurement of vaccine-induced human humoral immune responses in blood. Nat Protoc. 2013;8(6):1073-1087.
  11. Walsh PN, et al. Optimization and qualification of a memory B-cell ELISpot for the detection of vaccine-induced memory responses in HIV vaccine trials. J Immunol Methods. 2013;394(1-2):84-93.
  12. Brunner C, et al. Cell-based ELISpot protocol to detect and quantify antigen-specific antibody-secreting cells in murine whole-organ single-cell suspensions. STAR Protoc. 2025;6(3):103797.
  13. Rouers A, Tay MZ, Ng LFP, Renia L. B-cell ELISpot assay to analyze human memory B cell and plasmablast responses specific to SARS-CoV-2 receptor-binding domain. STAR Protoc. 2023;4(1):102130.
  14. Tian C, et al. Use of ELISpot assay to study HBs-specific B cell responses in vaccinated and HBV-infected humans. Emerg Microbes Infect. 2018;7(1):16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Периферическая кровьиммуногенность вакциныплазмобластный ответплазматические клеткистратегия иммунизациидоклинические исследования вакцин

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.