Методическая статья

Приготовление и оценка качества липосом, нагруженных противотуберкулезным препаратом рифампицином

8 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71858

⸱

1 октября 2026 г.

 ,  ,  , 
1School of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Resources Biorefinery, Guangdong University of Technology

В этой статье

Краткое содержание

Данный протокол направлен на оптимизацию процесса приготовления липосом, нагруженных противотуберкулезными препаратами, и создание стандартизированной системы оценки качества полученных липосомальных форм.

Аннотация

Туберкулез (ТБ), вызываемый Mycobacterium tuberculosis (MTB), остается одним из ведущих инфекционных заболеваний с высокой летальностью в мире и значительным бременем болезни в Китае, что усугубляется распространением мультирезистентного и рифампицин-резистентного ТБ, а также критическими ограничениями традиционной химиотерапии, включая плохое проникновение препаратов, тяжелую системную токсичность и низкую приверженность пациентов к лечению. Липосомальные системы доставки обладают уникальными преимуществами для противотуберкулезной терапии, однако их разработка затруднена непостоянством процессов приготовления, низкой эффективностью включения лекарственного вещества и отсутствием стандартизированной системы оценки качества. В данном исследовании метод гидратации тонкой пленки в сочетании с ультразвуковой обработкой и фильтрацией использовался для приготовления нанолипосом с рифампицином при различных соотношениях фосфолипидов и холестерина. Для определения эффективности инкапсуляции и степени загрузки препарата был разработан валидированный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Динамическое рассеяние света и просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) применялись для характеристики размера частиц, дзета-потенциала и микроскопической морфологии, а профили высвобождения препарата in vitro анализировались с помощью теста на растворение. Оптимизированные липосомы продемонстрировали высокую эффективность инкапсуляции, оптимальную загрузку препарата, однородный наноразмер частиц, хорошую стабильность при хранении и пролонгированное высвобождение препарата in vitro. Данная работа предлагает стандартизированные экспериментальные методы и комплексную систему оценки качества для разработки противотуберкулезных липосом, что способствует клиническому внедрению липосомальных систем доставки для лечения ТБ.

Введение

Туберкулез (ТБ) — хроническое инфекционное заболевание, вызываемое Mycobacterium tuberculosis (MTB), остается ведущей причиной смертности среди инфекционных заболеваний, вызванных одним патогеном, представляя собой постоянную и серьезную угрозу как для здоровья людей, так и для глобальной безопасности общественного здравоохранения. Согласно Глобальному отчету Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по туберкулезу за 2025 год, в 2024 году в мире было зарегистрировано примерно 10,7 миллиона новых случаев ТБ и около 1,23 миллиона смертей, связанных с ТБ1. Среди них было зафиксировано около 390 000 новых случаев туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью или устойчивостью к рифампицину (МЛУ/УР-ТБ), при этом only 42% пострадавших начали лечение. Продолжающаяся передача лекарственно-устойчиких форм ТБ стала основным препятствием для реализации глобальной стратегии ВОЗ по ликвидации туберкулеза (End TB Strategy).

В настоящее время химиотерапия остается основным методом клинического лечения туберкулеза (ТБ). Стандартный режим первой линии включает комбинацию из изониазида, рифампицина, пиразинамида и этамбутола с продолжительным курсом лечения от 6 до 9 месяцев2. При МЛУ/РР-ТБ схема лечения требует включения противотуберкулезных препаратов второго ряда, что продлевает курс терапии до 18–24 месяцев3, что сопровождается существенным увеличением затрат и заметным ростом побочных реакций на лекарственные средства4. Несмотря на то, что в последние годы были одобрены новые противотуберкулезные средства, такие как бедаквилин, деламанид и претоманид, предлагающие новые терапевтические возможности для лечения лекарственно-устойчивого ТБ5, они пока не смогли устранить основные недостатки, присущие существующей противотуберкулезной терапии6,7.

Во-первых, M. tuberculosis является типичным внутриклеточным патогеном, который преимущественно локализуется в альвеолярных макрофагах хозяина. Свободные препараты плохо проникают через мембрану макрофагов, в результате чего внутриклеточные концентрации лекарственных средств оказываются значительно ниже минимальной ингибирующей концентрации (MIC)8. Последующая невозможность элиминации внутриклеточных персистеров служит ключевым фактором рецидивов туберкулеза и возникновения лекарственной устойчивости9. Во-вторых, очаги туберкулеза характеризуются наличием множественных биологических барьеров, включая казеозно-некротическую ткань и фиброзные капсулы, которые препятствуют проникновению свободных препаратов в ядро очага, что приводит к субоптимальным локальным концентрациям лекарств и снижению бактерицидной эффективности10,11. В-третьих, длительное системное введение высоких доз препаратов склонно вызывать тяжелые побочные реакции, такие как индуцированная рифампицином гепатотоксичность, ототоксичность и нефротоксичность, связанные с аминогликозидами, а также тендинопатия и кардиотоксичность, ассоциированные с фторхинолонами, которые являются основными причинами прерывания лечения и низкой приверженности пациентов терапии12,13. В-четвертых, монотерапия или последовательное введение препаратов способствует отбору мутаций лекарственной устойчивости у M. tuberculosis, в то время как режимы комбинированной многопрепаратной терапии дополнительно увеличивают риск кумулятивной токсичности, создавая стойкую клиническую дилемму14.

Разработка систем доставки наномедикаментов предлагает перспективную стратегию преодоления вышеупомянутых трудностей в терапии туберкулеза. Среди них липосомы — наноразмерные закрытые везикулярные носители, самособирающиеся из фосфолипидных бислоев, — стали одной из наиболее клинически применимых платформ наноносителей для противоинфекционной терапии благодаря своей отличной биосовместимости, биоразлагаемости, способности к адресной доставке и свойствам контролируемого пролонгированного высвобождения15,16. По сравнению со свободными противотуберкулезными препаратами, липосомальные системы доставки обладают рядом незаменимых преимуществ для лечения туберкулеза.

Во-первых, они обеспечивают направленное обогащение в макрофагах. Липосомы преимущественно поглощаются фагоцитами ретикулоэндотелиальной системы (РЭС), что приводит к их специфическому накоплению в основных органах, в которых локализуется MTB, таких как легкие, печень и селезенка. Более того, они эффективно проникают через мембрану макрофагов17, существенно повышая внутриклеточную концентрацию препарата, что позволяет уничтожать персистирующие внутриклеточные бактерии и тем самым фундаментально снижать частоту рецидивов туберкулеза и развитие лекарственной устойчивости. Во-вторых, они демонстрируют улучшенное проникновение в очаги туберкулезного поражения. Путем модуляции размера частиц, поверхностного заряда и модификации поверхности липосомы могут эффективно преодолевать фиброзную капсулу и казеозный некротический барьер очагов туберкулеза, значительно увеличивая локальные концентрации препарата и повышая бактерицидную эффективность18. В-третьих, они заметно снижают токсичность препаратов. Липосомы изменяют биораспределение лекарственных средств in vivo, ограничивая воздействие на здоровые ткани и органы, и тем самым значительно снижая системную токсичность противотуберкулезных агентов. Например, липосомы, нагруженные аминогликозидами, существенно уменьшают накопление препарата в улитке уха и почках, практически исключая риск ототоксичности и нефротоксичности19. В-четвертых, они обеспечивают длительное пролонгированное высвобождение. Структура фосфолипидного бислоя обеспечивает контролируемое медленное высвобождение препарата, продлевая время полувыведения при циркуляции in vivo и длительность действия, что снижает частоту дозирования и существенно улучшает приверженность пациентов к лечению20. В-пятых, они позволяют осуществлять совместную доставку нескольких препаратов. Липосомы могут одновременно инкапсулировать несколько противотуберкулезных препаратов с различными физико-химическими свойствами, обеспечивая синхронную доставку и синергетический бактерицидный эффект, что эффективно подавляет появление резистентных мутантов MTB21.

Значительный прогресс был достигнут в области клинического внедрения липосомальных систем доставки лекарств для противотуберкулезной терапии. Ингаляционная суспензия амикацина в липосомах (ALIS) получила одобрение Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) для лечения заболеваний легких, вызванных комплексом Mycobacterium avium (MAC)22, и с тех пор была включена в схемы лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ) в нескольких странах, что подчеркивает клиническую ценность и широкие перспективы применения липосомальных платформ в терапии туберкулеза23. Тем не менее, разработка и промышленное производство противотуберкулезных липосом по-прежнему сталкиваются с рядом критических технических проблем, включая низкую воспроизводимость процессов приготовления, малую емкость загрузки и эффективность инкапсуляции лекарственного средства, неоднородное распределение частиц по размеру, агрегацию и утечку препарата при хранении, а также недостаточно изученную корреляцию между поведением растворения/высвобождения in vitro и эффективностью in vivo. Эти трудности серьезно препятствуют процессу исследования, разработки и клинического внедрения новых липосомальных противотуберкулезных препаратов24,25.

В данном исследовании разработан метод гидратации тонкой пленки с последующим ультразвуковым воздействием и фильтрацией, подходящий для инкапсуляции гидрофобных или слабо липофильных низкомолекулярных лекарственных средств (например, рифампицина) в фосфолипидный бислой. Для высокогидрофильных препаратов традиционный метод тонкой пленки обеспечивает низкую эффективность инкапсуляции, если не применяются дополнительные методы оптимизации (например, загрузка с использованием градиента сульфата аммония). В процедуре используется стандартное оборудование (роторный испаритель, ультразвуковая очистительная ванна, ВЭЖХ, DLS, ПЭМ), что гарантирует простоту воспроизведения без использования специализированных приборов. Текущая лабораторная установка объемом 10 mL обеспечивает стабильное качество и хорошую воспроизводимость между сериями. Масштабирование до промышленного уровня потребует оптимизации вакуума при испарении, скорости вращения, мощности ультразвука и характеристик мембраны. Примечательно, что липосомы остаются стабильными в течение 30 дней при 4 °C, однако через 60 дней наблюдаются окисление, агрегация и стратификация, что делает необходимым применение лиофилизации или модификацию состава для длительного хранения. Мы систематически оптимизировали соотношение фосфолипидов и холестерина, стандартизировали рабочий процесс приготовления и создали комплексную систему оценки качества, включающую эффективность инкапсуляции, степень загрузки лекарственного вещества, размер частиц, дзета-потенциал, морфологию, высвобождение in vitro и стабильность при хранении. Данный протокол предоставляет исследователям четкие рекомендации по оценке применимости метода для доставки гидрофобных препаратов и служит ориентиром для адаптации состава, планирования экспериментов и предварительного изучения возможности масштабирования.

Протокол

Данное исследование не предусматривало участия людей или животных, и получение этического одобрения не требовалось.

1. Приготовление нанолипосом, нагруженных рифампицином

ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте все составы в трех повторностях.

  1. Взвесьте компоненты липосом с помощью аналитических весов с точностью до 0,1 мг. Массовые соотношения фосфолипида к холестерину были установлены как 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25 и 70:30 соответственно (Таблица 1).
  2. Поместите три компонента в колбу объемом 100 mL грушевидной формы, подходящую для роторного испарителя. Растворите все липидные компоненты в 6 mL хлороформа. Обработайте смесь ультразвуком в водяной бане (40 kHz, 100 W) в течение 1 min до получения прозрачного раствора.
    ​ОСТОРОЖНО: Хлороформ является летучим органическим растворителем, вредным при вдыхании или попадании на кожу. Все этапы, включающие работу с хлороформом (1.3–1.5), следует проводить внутри сертифицированного вытяжного шкафа. Используйте нитриловые перчатки, лабораторный халат и защитные химические очки.
  3. Удалите хлороформ с помощью роторного испарителя со следующими параметрами:
    1. Установите температуру конденсатора не выше -5 °C.
    2. Установите температуру водяной бани на 37 °C
    3. Установите скорость вращения на 60 rpm
    4. Отрегулируйте вакуум до 330 mbar, чтобы снизить температуру кипения хлороформа
      ОСТОРОЖНО: Роторный испаритель должен эксплуатироваться внутри вытяжного шкафа. Убедитесь, что холодная ловушка подключена правильно, чтобы предотвратить попадание паров растворителя в вакуумный насос.
  4. Проводите испарение при 330 mbar в течение 20 min, затем увеличьте вакуум до 80 mbar и продолжайте еще 10 min для полного удаления остатков растворителя и формирования тонкой липидной пленки26.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Собранный в конденсаторе испаренный растворитель утилизируйте как органические галогенсодержащие отходы. Все отходы хлороформа помещайте в соответствующий промаркированный контейнер для галогенированных органических растворителей. Не сливайте в раковину.
  5. Высушите липидную пленку под вакуумом (≤ 80 mbar) при 25 °C в течение 12 h.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этап сушки проводится в вакуумном эксикаторе внутри вытяжного шкафа, чтобы предотвратить выброс остатков растворителя.
  6. Гидратируйте высушенную пленку 10 mL фосфат-солевого буфера (PBS). Поместите колбу в роторный испаритель (без вакуума) при 100 rpm и 37 °C на 1 h до полного отсоединения липидной пленки. Конечная концентрация рифампицина составляет 1 mg/mL.
  7. Обработайте ультразвуком в водяной бане (40 kHz, 100 W) при 37 °C в течение 10 min. Следите за тем, чтобы температура водяной бани оставалась на уровне 37 °C. Общий объем обрабатываемого образца составляет 10 mL.
  8. Последовательно отфильтруйте полученную суспензию. Предварительно смочите шприцевой фильтр из PES с размером пор 0,45 µm (диаметром 13 mm) с помощью 1 mL PBS. С помощью шприца объемом 10 mL один раз пропустите весь образец объемом 10 mL через фильтр 0,45 µm. Затем предварительно смочите шприцевой фильтр из PES с размером пор 0,22 µm (диаметром 13 mm) и один раз пропустите через него фильтрат. Не используйте экструдер для липосом (Рисунок 1).

2. Эффективность инкапсуляции

ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность инкапсуляции (EE) определяли методом ультрафильтрационного центрифугирования, который позволяет быстро отделить свободный препарат от препарата, встроенного в липосомы, на основе физического удержания. Затем измеряют содержание препарата в обеих фракциях и рассчитывают эффективность инкапсуляции27.

  1. Добавьте ровно 200 µL суспензии липосом в резервуар для образца ультрафильтрационной пробирки объемом 0,5 mL (ППП 3 kDa), затем центрифугируйте для отделения свободного лекарственного вещества от липосом.
  2. Центрифугируйте при 7 000 x g (ротор с фиксированным углом) при 25 °C в течение 15 min. Соберите фильтрат в приемную пробирку; повторите процедуру 4–5 раз.
  3. Объедините весь фильтрат и доведите объем до 10 mL метанолом в мерной колбе. Перед вводом в ВЭЖХ профильтруйте раствор через шприцевой фильтр из Nylon66 с размером пор 0,22 µm.
  4. Установите следующие условия ВЭЖХ: Колонка: C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 µm); Подвижная фаза: ацетонитрил : водный раствор фосфорной кислоты = 45 : 55 (V/V); Длина волны детектирования: 475 nm; Скорость потока: 1,0 mL/min; Температура колонки: 40 °C; Объем инъекции: 20 µL; Время анализа: 20 min
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Ацетонитрил легковоспламеняем и токсичен. Приготовление и работа с подвижной фазой должны проводиться в вытяжном шкафу. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).
  5. Рассчитайте эффективность инкапсуляции (EE) по следующей формуле: Эффективность инкапсуляции (EE, %) = [(Wrfb − Wfree) / Wrfb] × 100%
  6. Рассчитайте степень загрузки лекарственного вещества (DL) по следующей формуле: Степень загрузки (DL, %) = [(Wrfb − Wfree) / Wtotal] × 100%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Wtotal — общее содержание добавленных фосфолипидов, холестерина и рифампицина; Wrfb — содержание добавленного рифампицина; Wfree — содержание свободного лекарственного вещества в липосомах.

3. Валидация метода ВЭЖХ

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните валидацию метода ВЭЖХ на предмет линейности, точности, воспроизводимости, стабильности, степени извлечения и специфичности следующим образом.

  1. Приготовьте стандартные растворы рифампицина в подвижной фазе со следующими концентрациями: 1,15, 2,3, 4,6, 9,2, 13,8, 18,4 и 23,0 µg/mL. Проанализируйте каждый раствор методом ВЭЖХ, запишите площади пиков, рассчитайте уравнение регрессии и коэффициент детерминации R2.
  2. Измерьте площади пиков растворов рифампицина с концентрациями 9,2, 13,8 и 18,4 µg/mL. Проведите пять параллельных определений в течение одного дня и рассчитайте относительное стандартное отклонение (RSD).
  3. Приготовьте четыре параллельных раствора рифампицина с концентрацией 9,2 µg/mL. Измерьте площади пиков методом ВЭЖХ и рассчитайте RSD повторяемости метода.
  4. Выдержите стандартный раствор с концентрацией 9,2 µg/mL при комнатной температуре. Проанализируйте раствор через 0, 2, 4, 6, 12 и 24 ч, запишите площади пиков и рассчитайте RSD для оценки стабильности.
  5. Добавьте известное количество стандарта рифампицина в холостые матрицы липосом. Обработайте образцы методом ультрафильтрации, проанализируйте их с помощью ВЭЖХ, затем рассчитайте процент восстановления и RSD.
  6. Изучите хроматограммы на наличие интерференционных пиков во время удерживания рифампицина.

4. Размер частиц и дзета-потенциал

  1. Перенесите пипеткой 20 µL суспензии липосом в 980 µL ультрачистой воды (предварительно отфильтрованной через мембрану 0,22 µm). Перемешайте на вортексе в течение 10 s, затем обработайте ультразвуком в водяной бане в течение 30 s.
  2. Перенесите разбавленный образец в универсальную кювету для измерения размера и в складную капиллярную кювету для измерения дзета-потенциала.
  3. Установите следующие параметры: дисперсант = вода, температура = 25 °C.
  4. Выполните не менее 3 технических повторов, каждый из которых состоит из 10–15 измерений. Запишите Z-среднее (средний гидродинамический диаметр, взвешенный по интенсивности) и индекс полидисперсности (PDI).
  5. Вставьте палладиевый электрод в кювету для измерения дзета-потенциала при тех же параметрах28.
  6. Извлеките кювету и выключите прибор.

5. Морфологическая характеристика (ПЭМ)

  1. Разбавьте суспензию липосом с рифампицином в 50–100 раз ультрачистой водой для достижения концентрации, подходящей для ПЭМ-наблюдения.
  2. Подвергните разбавленный образец ультразвуковой обработке в водяной бане с использованием ультразвуковой бани (40 kHz, 100 W) в течение 30 s.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Избегайте чрезмерной соникации, чтобы предотвратить разрыв липосом.
  3. Поместите медную сетку с углеродным покрытием (300 mesh) на фильтровальную бумагу углеродной стороной вверх.
  4. Нанесите пипеткой 10 µL разбавленной суспензии липосом в центр сетки. Оставьте для адсорбции на 1 min.
  5. Удалите избыток суспензии с края сетки чистой фильтровальной бумагой, не касаясь центральной области наблюдения.
  6. Негативное окрашивание: Немедленно нанесите на сетку 10 µL 2% (w/v) раствора фосфорвольфрамовой кислоты (pH 7.0). Через 1 min удалите избыток красителя с края.
  7. Высушите сетку на воздухе при комнатной температуре в течение 3 h. Поместите высушенную сетку в держатель образцов ПЭМ.
  8. Проведите наблюдение при ускоряющем напряжении 80–120 kV. Используйте режим визуализации с низкой дозой облучения29 и получите изображения с помощью ПЗС-камеры (например, Gatan OneView) при номинальных увеличениях 10 000x, 25 000x и 40 000x.
  9. Выберите репрезентативные поля зрения, избегая участков с агрегацией или артефактами окрашивания.

6. Высвобождение препарата in vitro

  1. Отрежьте диализную мембрану (MWCO 7 kDa) на отрезки подходящей длины. Приготовьте раствор большого объема, содержащий 2% (w/v) бикарбоната натрия и 1 mmol/L EDTA, доведенный до pH 8.0.
  2. Кипятите диализную мембрану в этом растворе в течение 10 min. Тщательно промойте мембрану дистиллированной водой.
  3. Выдержите промытую мембрану в среде высвобождения (0.01 M PBS) в течение 30 min. Перенесите 1 mL суспензии липосом в предварительно обработанный диализный мешок; зафиксируйте оба конца диализными зажимами.
  4. Поместите диализный мешок в стакан объемом 100 mL, содержащий 80 mL предварительно нагретой до 37 °C среды высвобождения с добавлением 0.1% аскорбиновой кислоты (w/v) и 0.1 mL Tween 80. Накройте стакан алюминиевой фольгой для защиты от света.
  5. Перемешивайте в темноте при 37 °C и 200 rpm с помощью магнитной мешалки. Отбирайте по 1 mL среды высвобождения в установленные моменты времени: 0.5, 1.5, 3, 5, 7, 9, 12, 24 и 48 h.
  6. С помощью пипетки добавьте в стакан 1 mL свежей, предварительно нагретой среды высвобождения (37 °C), осторожно направляя струю на стенку стакана30 (Система закрытая; коррекция на испарение не требуется).
  7. Отфильтруйте образцы через фильтр с размером пор 0.22 µm и проанализируйте методом ВЭЖХ. Анализ образцов проводите в соответствии с условиями ВЭЖХ, описанными в разделе 2.4.
  8. Рассчитайте кумулятивное высвобождение (%) = (Общее количество обнаруженного препарата в каждый момент времени / Начальная загрузка препарата) × 100%

7. Оценка стабильности при хранении

  1. Храните подготовленную суспензию липосом с рифампицином в герметичном стеклянном флаконе при 4 °C в защищенном от света месте.
  2. Соберите образцы на 1-й, 4-й и 30-й дни хранения. Отработанный образец утилизируйте (не возвращайте его в исходный флакон).
  3. В каждой временной точке определяйте размер частиц, индекс полидисперсности и дзета-потенциал липосом31.
  4. Зафиксируйте внешний вид и отметьте наличие любого осадка или расслоения суспензии липосом.
  5. Соберите дополнительные образцы на 60-й день для визуального наблюдения окисления, выпадения осадка и расслоения суспензии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все измерения проводились в трех параллельных экспериментах. Экспериментальные данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Результаты

Для количественного определения рифампицина был разработан и валидирован метод ВЭЖХ. Репрезентативные хроматограммы стандартных растворов рифампицина представлены на рисунке 2A. Основной пик рифампицина наблюдался при времени удерживания 14,13 мин, при этом пик имел правильную форму и не подвергался существенному влиянию других пиков. Калибровочная кривая продемонстрировала хорошую линейность в диапазоне концентраций 1,15–23 µg/mL, при этом уравнение регрессии имело вид Y = 12729,5X-4778,6, а коэффициент детерминации R2 составлял 0,9995. Значение R2 ≥ 0,999 обычно считается приемлемым для количественного анализа в фармацевтических лабораториях; следовательно, полученное значение 0,9995 подтверждает высокую линейность метода в исследуемом диапазоне. Черные квадраты обозначают измеренные точки данных, а сплошная линия — аппроксимацию линейной регрессии (рисунок 2B).

Тесты на прецизионность проводились при трех концентрациях рифампицина (9,2, 13,8 и 18,4 µg/mL). Значения относительного стандартного отклонения (RSD) площадей пиков составили менее 1%, что подтверждает высокую прецизионность прибора (Таблица 2). Тест на повторяемость (n = 4) показал RSD 0,32%, что свидетельствует о надежной повторяемости (Таблица 3). Тест на стабильность, проведенный в течение 24 ч при комнатной температуре, показал RSD 0,59%, демонстрируя, что раствор рифампицина оставался стабильным в этих условиях (Таблица 4). Средний процент извлечения составил 98,12%, что подтверждает точность метода анализа рифампицина в образцах липосом. Совокупность этих результатов подтвердила, что метод ВЭЖХ подходит для количественного определения рифампицина в данном исследовании. Такая тщательная валидация гарантирует, что последующие измерения эффективности инкапсуляции, загрузки лекарственного вещества и профилей высвобождения будут надежными и воспроизводимыми для различных экспериментальных партий.

Свободный препарат и препарат, инкапсулированный в липосомы, разделяли методом ультрафильтрационного центрифугирования. Количественный анализ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) показал, что при содержании холестерина 20% эффективность инкапсуляции липосом, нагруженных рифампицином, достигала максимума 68.54 ± 2.19, а степень загрузки препарата составляла 11.42 ± 0.37 (Рисунок 3). При избытке холестерина эффективность инкапсуляции и степень загрузки липосом значительно снижаются (Таблица 5). Эти результаты демонстрируют, что соотношение холестерина к фосфолипидам 20% является оптимальным для баланса жесткости и текучести мембраны, а также для удержания рифампицина внутри бислоя. Малые стандартные отклонения (для всех трех параллельных препаратов EE <2.2% и DL <0.4%) подтверждают, что протокол приготовления обеспечивает стабильное качество формуляции с хорошей воспроизводимостью от серии к серии.

Липосомы, приготовленные с использованием оптимизированного метода, продемонстрировали узкое распределение по размеру (Рисунок 4) со средним размером 185 nm. Значение PDI <0,3 общепринято считать показателем монодисперсности популяции; следовательно, полученное значение PDI 0,153 подтверждает высокую однородность липосом по размеру. Абсолютное значение дзета-потенциала >30 mV обычно обеспечивает достаточное электростатическое отталкивание для предотвращения агрегации. Измеренное значение −38 mV таким образом указывает на хорошую коллоидную стабильность32. Низкие стандартные отклонения в трех повторностях образцов (например, размер 185,41 ± 0,72 nm при 20% холестерина) дополнительно подтверждают высокую воспроизводимость процедуры приготовления. Эти результаты показывают, что протокол гидратации тонкой пленки с последующим ультразвуковым воздействием и фильтрацией позволяет надежно получать наноразмерные липосомы с узким распределением по размеру и достаточным поверхностным зарядом, обеспечивая тем самым долгосрочную стабильность.

Приготовленные липосомы демонстрировали выраженный эффект Тиндаля. На рисунке 5A показан эффект Тиндаля для липосом33. Морфологические характеристики нанолипосом с рифампицином оценивали с помощью ПЭМ и метода динамического рассеяния света (ДРС). Как показано на рисунке 4, кривые распределения размеров липосом по интенсивности (ДРС) имели один узкий пик без видимых крупных частиц или агрегатов, что свидетельствует о хорошей однородности и монодисперсности приготовленного состава (рисунок 5B). При малом увеличении наблюдались сферические липосомальные везикулы, однако была отмечена некоторая локальная агрегация (рисунок 5C), что может быть связано с неполным диспергированием при подготовке образца, а также возможным слиянием везикул в процессе высушивания. При большом увеличении (50,000×, рисунок 5D) были видны четкие различия в контрасте: темная центральная область соответствует водному ядру, содержащему лекарственное вещество, а более светлое внешнее кольцо представляет собой липидный бислой, что является типичным признаком липосом при негативном контрастировании34.

Размер частиц, определенный с помощью ПЭМ, оказался меньше гидродинамического диаметра, измеренного методом ДРС. Это расхождение обусловлено различными принципами работы двух методов: ПЭМ измеряет диаметр дегидратированного ядра в вакууме, тогда как ДРС определяет гидратированный диаметр, включая поверхностный гидрационный слой, что является широко известной характеристикой липосомальных наночастиц35.

В первых трех группах липосом не наблюдалось выраженного начального выброса (кумулятивная скорость высвобождения через 0,5 ч составила <40% во всех группах). Начальный выброс <40% в течение первого часа обычно считается безопасным для препаратов для длительного лечения туберкулеза, так как это сводит к минимуму риск развития острой системной токсичности. Конкретные этапы высвобождения можно разделить следующим образом:

Период быстрого высвобождения (0,5–12 ч): препарат медленно диффундировал из поверхностного слоя или примембранной области липосом, и скорость высвобождения была относительно высокой. Кумулятивная скорость высвобождения в первых трех группах к 12 ч приближалась к 90% (Рисунок 6).

Предполагалось, что через 24 ч рифампицин подвергся окислительной и гидролитической деградации, что привело к аномальному снижению скорости кумулятивного высвобождения36. При содержании холестерина 30% скорость кумулятивного высвобождения через 0,5 ч составила >40%, что не соответствует стандарту пролонгированного высвобождения.

Таким образом, составы, содержащие 5–15% холестерина, являются приемлемыми, а 20% также соответствует критерию быстрого высвобождения. Незначительная межсерийная вариабельность (Рисунок 6) подтверждает воспроизводимость метода тестирования высвобождения.

Данные о высвобождении для первых трех групп были аппроксимированы с использованием общих кинетических моделей (нулевого порядка, первого порядка, Хигучи и Ритгера-Пеппаса) (Рисунок 7). Результаты показали, что кинетическая модель первого порядка обеспечила наилучшее качество аппроксимации (R2= 0.987), что было значительно выше, чем для моделей нулевого порядка (R2= 0.246), Хигучи (R2= 0.544) и Ритгера-Пеппаса (R2 = 0.926). Это указывает на то, что характер высвобождения лекарственного вещества из липосом соответствует кинетике первого порядка. Скорость высвобождения положительно коррелирует с остаточной концентрацией лекарственного вещества в липосомах, демонстрируя типичную характеристику «начального всплеска высвобождения с последующим пролонгированным высвобождением», что дополнительно подтверждает механизм, посредством которого холестерин влияет на скорость диффузии, регулируя структуру мембраны37.

Липосомы, нагруженные рифампицином, продемонстрировали хорошую краткосрочную стабильность в течение 30 дней хранения при 4 °C. За период оценки (1, 4 и 30 дней) размер частиц незначительно увеличился, в то время как сохранялись отличная однородность размеров (PDI < 0.15) и благоприятная коллоидная стабильность (абсолютный дзета-потенциал > 24 mV) (Таблица 6). На 60-й день наблюдались явные признаки окисления и образование хлопьев, что указывает на низкую долгосрочную стабильность данной формуляции. Этот результат подчеркивает необходимость лиофилизации или модификации состава (например, добавления антиоксидантов или лиопротекторов) для длительного хранения, что является важным практическим выводом для исследователей, использующих данный протокол.

figure-results-1
Рисунок 1. Приготовление липосом, нагруженных рифампицином, методом гидратации тонкой пленки. Схематическое описание процесса приготовления липосом, нагруженных рифампицином. Липидные компоненты растворяли в органическом растворителе, после чего формировали тонкую пленку путем роторного испарения, вакуумной сушки, гидратации и соникации для получения конечного липосомального состава. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2. ВЭЖХ-идентификация и калибровка рифампицина. (A) Репрезентативная хроматограмма ВЭЖХ рифампицина, демонстрирующая характерный пик удерживания, используемый для количественного анализа. (B) Калибровочная кривая, построенная в зависимости площади пика от концентрации рифампицина (1.15–23.0 µg/mL). Уравнение регрессии и коэффициент корреляции (R2 = 0.9995) свидетельствуют об отличной линейности в исследуемом диапазоне концентраций. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3Эффективность инкапсуляции и степень загрузки рифампицина в липосомы. Эффективность инкапсуляции (EE) и степень загрузки лекарственного вещества (DL) липосом, приготовленных с различным содержанием холестерина. Наивысшие значения EE (68,5%) и DL (11,4%) наблюдались при 20% содержании холестерина, что указывает на значительное влияние содержания холестерина на инкапсуляцию и загрузку лекарственного вещества. Планки погрешностей соответствуют среднему значению. × СО (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4Распределение частиц липосом, нагруженных рифампицином, по размеру. Профили распределения частиц по размерам липосом, нагруженных рифампицином, приготовленных с различными соотношениями фосфолипидов и холестерина. Оптимизированный состав характеризовался средним гидродинамическим диаметром (Z-average diameter) 185 нм и индексом полидисперсности (PDI) 0,153, что указывает на узкое распределение частиц по размерам и хорошую гомогенность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5. Физико-химическая характеристика липосом, нагруженных рифампицином. (A) Эффект Тиндаля, наблюдаемый в суспензии липосом с рифампицином, указывает на наличие наноразмерных частиц. (B) Кривые распределения частиц по размерам для трех параллельных повторностей оптимизированного состава липосом. (C) Изображение, полученное с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), демонстрирующее многочисленные сферические липосомальные везикулы. (D) Репрезентативное ПЭМ-изображение отдельной липосомальной везикулы при большом увеличении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6
Рисунок 6. Профили высвобождения рифампицина из липосом in vitro. Профили кумулятивного высвобождения рифампицина из липосом, приготовленных с различными соотношениями фосфолипида к холестерину, на протяжении периода исследования. Характер высвобождения варьировался в зависимости от содержания холестерина, что демонстрирует его влияние на характеристики высвобождения препарата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-7
Рисунок 7. Кинетическое моделирование высвобождения рифампицина из липосом. Данные о высвобождении для оптимизированного состава (20% холестерина), аппроксимированные по моделям кинетики (A) нулевого порядка, (B) первого порядка, (C) Хигучи и (D) Ритгера-Пеппаса. Модель первого порядка продемонстрировала наилучшую сходимость (R2 = 0.987), что указывает на наибольшее соответствие экспериментальным данным высвобождения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Компоненты липосомЛецитинХолестеринРифампицин
5%47,5 мг2,5 мг10 мг
10%45 мг5 мг10 мг
15%42,5 мг7,5 мг10 мг
20%40 мг10 мг10 мг
25%37,5 мг12,5 мг10 мг
30%35 мг15 мг10 мг
Конечный объем10 мл

Таблица 1: Состав составов липосом, нагруженных рифампицином. Лецитин, холестерин и рифампицин использовались для приготовления липосом с различными соотношениями фосфолипида и холестерина при поддержании конечного объема 10 mL.

Концентрация (µg/mL)X±SОС ( % )
9.2114012.75 ± 502.420.44
13.8171412.50 ± 493.900.29
18.4232334.00 ± 1358.420.59

Таблица 2: Прецизионность количественного определения рифампицина методом ВЭЖХ при различных концентрациях. Измерения площади пиков были получены для стандартных растворов рифампицина в концентрациях 9.2, 13.8 и 18.4 µg/mL. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD), при этом значения относительного стандартного отклонения (RSD) свидетельствуют о высокой аналитической прецизионности.

НЕТ.1234ОС (%)
Площадь пика1145031141251139691145390.32

Таблица 3: Прецизионность прибора при использовании метода ВЭЖХ. Оценка прецизионности основана на четырех последовательных инъекциях одного и того же стандартного раствора рифампицина. Для оценки повторяемости прибора указаны значения площадей пиков и относительное стандартное отклонение (RSD).

Время (ч)024681224ОСН (%)
Площадь пика1145031143251145161139781138941136381125760.59%

Таблица 4: Стабильность стандартного раствора рифампицина. Оценка стабильности стандартного раствора рифампицина с концентрацией 9.2 µg/mL, хранившегося при комнатной температуре; анализ проводился через 0, 2, 4, 6, 8, 12 и 24 ч. Для оценки стабильности раствора в течение периода испытания приведены значения площади пика и относительное стандартное отклонение (RSD).

ХолестеролРазмер (нм)ПДИ (показатель полидисперсности)Дзета-потенциал (мВ)ЭЭ (%)ПП (%)
5%206.27±1.140.240±0.004-42.72±0.2664.09±1.3010.68±0.22
10%183.87±2.540.149±0.004-24.80±1.0464.70±0.3010.78±0.05
15%202.06±3.160.131±0.007-27.90±1.0465.11±1.6210.85±0.27
20%185.41±0.720.164±0.044-37.74±1.4468.54±2.1911.42±0.37
25%181.58±1.310.100±0.008-19.96±0.1649.38±2.528.23±0.42
30%178.78±0.820.074±0.014-40.25±0.3348.24±2.068.04±0.34 

Таблица 5: Физико-химические характеристики липосом, нагруженных рифампицином. Размер частиц, индекс полидисперсности (PDI), дзета-потенциал, эффективность инкапсуляции (EE) и степень загрузки лекарственного средства (DL) липосом, приготовленных с различным содержанием холестерина. Данные представлены как среднее значение ± SD (n = 3).

1 день4 дня30 дней 
Размер (нм)183.87±2.54212.42±3.12273.57±4.38
ПДИ0.149±0.0040.106±0.0020.126±0.009
Дзета-потенциал (мВ)-24.80±1.04-57.12±1.49-55.38±2.50

Таблица 6: Стабильность при хранении липосом, нагруженных рифампицином, при 4 °C. Изменения размера частиц, индекса полидисперсности (PDI) и дзета-потенциала липосом, нагруженных рифампицином, после хранения в течение 1, 4 и 30 дней при 4 °C. Результаты были использованы для оценки физической стабильности липосомальной формы при хранении.

Обсуждение

Рифампицин остается краеугольным камнем химиотерапии первой линии при туберкулезе, однако его клиническая эффективность серьезно ограничивается дозозависимой гепатотоксичностью, плохим внутриклеточным проникновением в макрофаги, содержащие Mycobacterium tuberculosis (MTB), и быстрым развитием лекарственной устойчивости при субтерапевтическом воздействии. Для решения этих неудовлетворенных клинических потребностей в данном исследовании был разработан и оптимизирован надежный протокол гидратации тонкой пленки в сочетании с ультразвуковой обработкой и фильтрацией для изготовления липосом, нагруженных рифампицином. Оптимизированная рецептура продемонстрировала однородный наноразмер частиц, сохранную везикулярную морфологию, высокую эффективность инкапсуляции препарата и профиль пролонгированного высвобождения препарата in vitro; при этом комплексная физико-химическая характеристика проводилась с помощью динамического рассеяния света (DLS), просвечивающей электронной микроскопии (TEM), высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и тестов на растворение in vitro.

Несколько этапов протокола оказывают критическое влияние на качество и воспроизводимость липосом. Во-первых, первостепенное значение имеет соотношение фосфолипидов и холестерина. Оптимальное соотношение 80:20 обеспечивает эффективность инкапсуляции (EE) = 68,5% и эффективность утечки (DL) = 11,4%; отклонения до 75:25 или 70:30 приводят к >Потеря 30% ЭЭ. Обязательно точное взвешивание на аналитических весах с точностью до 0,1 мг. Во-вторых, гидратация (раздел 1.6) требуется вращение при 100 об/мин, 37 °C для 1 на роторном испарителе без вакуума. Статическая инкубация или ручное встряхивание приводят к плохой воспроизводимости. В-третьих, ультразвуковая обработка (раздел 1.7): 40 кГц, 100 W, 10 мин при 37 °C дает значение Z-среднего, равное 185 нм и PDI < 0.2. Более короткое воздействие ультразвуком (5 мин) дает в результате >300 нм и PDI > 0,3; более длительная соникация (20 мин) влечет за собой риск деградации препарата. Поддерживайте 37 °C поскольку рифампицин чувствителен к нагреванию. В-четверетых, для последовательной фильтрации (0,45 µm затем 0,22 µm), предварительно смочите фильтры раствором PBS и фильтруйте осторожно, в один проход. Принудительное продавливание через сухие фильтры или использование шприца малого объема может привести к разрыву везикул. В-пятых, ультрафильтрация для определения эффективности инкапсуляции (разделы 2.1–2.3): ровно 200 µL, 4 цикла при 7 000 об/мин × г, 25 °C, собирая и объединяя все фильтраты после каждого цикла. Незавершенные циклы приводят к завышению эффективности извлечения (EE). Шестое, негативное контрастирование при ПЭМ (раздел 5.6): 2% фосфорвольфрамовая кислота, pH 7,0, немедленное промакивание. Задержка или неправильное значение pH приводят к коллапсу везикул. Последовательное выполнение этих шести шагов позволяет стабильно получать липосомы, соответствующие критериям приемлемости, о чем свидетельствуют низкие стандартные отклонения в трех повторностях.

Холестерин является критически важным структурным компонентом липосомальных бислоев и обладает хорошо изученным двойственным влиянием на текучесть мембраны, механическую стабильность и удержание липофильных лекарственных средств. В данном исследовании мы систематически оценили влияние молярного соотношения холестерина на эффективность состава и обнаружили, что максимальная эффективность инкапсуляции 68,5% достигалась при содержании холестерина 20% (массовая доля). Предполагается, что такое оптимальное соотношение обеспечивает баланс между сохранением упорядоченной ламеллярной структуры фосфолипидного бислоя для минимизации утечки препарата и поддержанием достаточной текучести мембраны для размещения липофильных молекул рифампицина в гидрофобном ядре бислоя. Напротив, содержание холестерина более 20% приводило к чрезмерному повышению жесткости липидного бислоя, нарушению регулярного ламеллярного расположения и последующему значительному снижению как эффективности инкапсуляции, так и емкости загрузки препарата. Эти результаты согласуются с установленным механистическим пониманием роли холестерина в инженерии липосомальных мембран. Таким образом, для достижения высокой загрузки лекарственного средства обязательны точное взвешивание липидов (с использованием аналитических весов с точностью до 0,1 мг) и строгое соблюдение 20% массовой доли холестерина.

Оптимизированные липосомы, нагруженные рифампицином, имели средний гидродинамический диаметр 185 nm с индексом полидисперсности (PDI) 0,164 ± 0,044, что указывает на высокую однородность распределения частиц по размеру. Этот наноразмер (< 200 nm) не только соответствует эффекту повышенной проницаемости и удержания (EPR) для пассивного нацеливания на воспаленные очаги легочного туберкулеза, но и является оптимальным для эффективного фагоцитоза альвеолярными макрофагами — основной внутриклеточной нишей MTB. Такой размер частиц позволяет преодолеть главное ограничение свободного рифампицина, который не достигает терапевтических концентраций внутри макрофагов, инфицированных MTB. Зета-потенциал −38 mV для оптимизированного состава обеспечивает сильное межчастичное электростатическое отталкивание, эффективно предотвращая агрегацию, слияние и седиментацию везикул при краткосрочном хранении, что гарантирует отличную коллоидную стабильность. Примечательно, что размер ядра частиц, измеренный с помощью TEM, был меньше гидродинамического диаметра, полученного методом DLS, что является хорошо документированным феноменом при характеристике липосом: DLS количественно определяет диаметр гидратированной везикулы, включая окружающий водный гидрационный слой, тогда как TEM-визуализация фиксирует дегидратированное липидное ядро в условиях высокого вакуума. Таким образом, данное расхождение является ожидаемым и физико-химически обоснованным результатом, а не несоответствием в характеристиках.

Визуализация с помощью ПЭМ дополнительно подтвердила морфологические характеристики оптимизированных липосом, которые представляли собой преимущественно однородные сферические интактные однослойные везикулы с незначительной локальной агрегацией и отсутствием явного слияния или разрыва мембран. Эти результаты подтверждают, что комбинированный процесс ультразвуковой обработки и фильтрации позволяет точно контролировать морфологию и ламеллярность везикул, сохраняя при этом структурную целостность липосомального бислоя. Структурная целостность является критическим показателем качества липосомальных формуляций, поскольку она напрямую коррелирует с удержанием лекарственного средства при хранении, стабильностью циркуляции in vivo и эффективностью адресной доставки. Кроме того, выраженный эффект Тиндаля, наблюдаемый в суспензии липосом, дополнительно подтвердил коллоидную природу дисперсии наноразмерных везикул.

Исследования высвобождения лекарственного вещества in vitro продемонстрировали, что оптимизированные липосомы с рифампицином не проявляли значимого начального резкого высвобождения (burst release) в течение первых 0.5 h, что является критически важной характеристикой, снижающей риск острой системной токсичности, связанной с быстрым достижением пиковых концентраций свободного рифампицина в плазме. Моделирование кинетики высвобождения показало, что профиль высвобождения лучше всего описывается кинетической моделью первого порядка, что указывает на то, что высвобождение рифампицина из липосомального бислоя преимущественно определялось пассивной диффузией, а не эрозией липидного матрикса. Такой паттерн пролонгированного высвобождения, контролируемый диффузией, крайне желателен для противотуберкулезной терапии, так как он обеспечивает длительное поддержание эффективных терапевтических концентраций препарата, тем самым снижая риск субтерапевтического воздействия, которое способствует возникновению лекарственной устойчивости. После 24 h наблюдалось небольшое снижение кумулятивного высвобождения лекарства, что, скорее всего, обусловлено окислительной и гидролитической деградацией неинкапсулированного рифампицина в водной среде высвобождения; этот результат согласуется с ранее опубликованными данными о стабильности рифампицина в водных средах38. Важно отметить, что липосомальный бислой создает защитную микросреду для инкапсулированного препарата, снижая его воздействие деструктивным факторам по сравнению со свободным рифампицином.

Оптимизированный состав липосом, нагруженных рифампицином, разработанный в данном исследовании, обладает рядом существенных преимуществ для терапии туберкулеза, напрямую устраняя основные недостатки традиционной химиотерапии рифампицином. Во-первых, липосомальный бислой служит защитным барьером, предотвращающим преждевременную деградацию препарата в водных и биологических средах, тем самым сохраняя антимикробную активность рифампицина. Во-вторых, профиль пролонгированного диффузионного высвобождения увеличивает период полувыведения препарата из системного кровотока, что позволяет снизить частоту дозирования и повысить приверженность пациентов к лечению — одну из главных проблем при длительной химиотерапии туберкулеза. В-третьих, оптимизированный наноразмер частиц способствует как пассивному нацеливанию на воспаленные туберкулезные очаги посредством эффекта EPR, так и эффективному поглощению макрофагами альвеол, инфицированными MTB, что позволяет достичь высоких внутриклеточных концентраций препарата, недоступных при использовании свободного рифампицина39,40. Наконец, состав препарата базируется на биосовместимых фосфолипидах и холестерине природного происхождения, что сводит к минимуму риск иммуногенности или системной токсичности, связанной с самой системой доставки.

Следует отметить, что данное исследование имеет ряд ограничений, которые необходимо устранить в будущих работах. Хотя физико-химическая характеристика и профилирование высвобождения in vitro демонстрируют перспективные показатели рецептуры, требуются дальнейшие исследования in vivo для оценки фармакокинетического поведения, распределения в тканях, противотуберкулезной эффективности и системной токсичности липосом, нагруженных рифампицином, на соответствующих моделях животных. Кроме того, масштабируемость оптимизированного протокола приготовления для промышленного производства требует дальнейшего подтверждения.

В заключение, в данном исследовании был разработан простой, высоковоспроизводимый и надежный протокол гидратации тонких пленок с последующим ультразвуковым воздействием и фильтрацией для создания липосом, нагруженных рифампицином. Систематическая оптимизация состава позволила определить определяющую роль содержания холестерина в регулировании эффективности инкапсуляции и стабильности мембраны; при этом оптимизированный состав продемонстрировал идеальные физико-химические свойства, высокую эффективность инкапсуляции препарата, отличную коллоидную стабильность и контролируемое пролонгированное высвобождение лекарственного средства in vitro. Данный стандартизированный протокол предоставляет надежную методологическую основу для разработки и характеристики липосомальных систем доставки противотуберкулезных препаратов и закладывает прочный фундамент для последующей доклинической оценки липосомального рифампицина для лечения как чувствительного, так и лекарственно-устойчивого туберкулеза.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Данное исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (№ 21977019).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
L-α-Фосфатидилхолин (соевый)RHAWNR024502≥чистота 90%, 25 г/флакон, CAS: 97281-47-5
1× Фосфатно-солевой буфер (PBS)SolarbioP1038500 мл, 0,01 моль/л, pH 6,5
1× Фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,4ThermoFisher Scientific (Gibco)C10010500BT-1500 мл, pH 7,4
ХлороформБренд ГуанчжоуGD10-AR-2.5Lч.д.а., 500 мл/флакон, CAS: 67-66-3
ХолестеринАладдинC104028-5г аналитической чистоты, ≥95% (ВЭЖХ), 5 г/флакон, CAS 57-88-5
Диализные мембраны (MD25, 7000 Да)SolarbioYA1081-5mППО с пределом отсечения молекулярной массы 7000 Да, длиной 5 м, из неметаллического материала
Система высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), LC-20AShimadzu Corporation, ЯпонияLC-20AСистема оснащена УФ-детектором SPD-20A, четвертичным насосом CBM-20A, онлайн-дегазатором LC-20AT, автосамплером SIL-20A, термостатом для колонок CTO-20A и программным обеспечением для рабочих станций LC-solution. Система использовалась для количественного определения рифампицина.
Высокоскоростная настольная центрифугаШанхайский завод научных приборов «Антин» (Shanghai Anting Scientific Instrument Factory)TGL-16BИспользуется для центрифугирования образцов
L-аскорбиновая кислотаМакклинA800296Чистота 99,99%, 100 г/флакон, CAS: 50-81-7
Анализатор размера частиц и дзета-потенциала OmniBrookhaven Instruments Corporation, США173PIИспользуется для определения размера частиц, индекса полидисперсности (PDI) и дзета-потенциала липосом
РифампицинМакклинR817237чистота 97%, 250 мг/флакон, CAS: 13292-46-1
Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ)Hitachi, Ltd., ЯпонияHT7700Используется для морфологического исследования липосом
Tween 80Энергетическая химияE0807391000-A01ч.д.а., 100 мл/флакон, CAS: 9005-65-6
Центрифужные фильтры для ультрафильтрации (0,5 мл, 3 кДа)Merck MilliporeUFC500396ППС 3 кДа, объем 0,5 мл, материал — пластик

Ссылки

  1. World Health Organization. Global tuberculosis report 2025. Geneva: World Health Organization; 2025.
  2. Wei X, Yue L, Zhao B, Jiang N, Lei H, Zhai X. Recent advances and challenges of revolutionizing drug-resistant tuberculosis treatment. Eur J Med Chem. 2024;277:116785.
  3. World Health Organization. Consolidated guidelines on tuberculosis: module 4: treatment and care. Geneva: World Health Organization; 2022.
  4. Singh V. Tuberculosis treatment-shortening. Drug Discov Today. 2024;29(5):103955.
  5. Li SY, et al. Next-generation diarylquinolines improve sterilizing activity of regimens with pretomanid and the novel oxazolidinone TBI-223 in a mouse tuberculosis model. Antimicrob Agents Chemother. 2023;67(4).
  6. Timm J, et al. Baseline and acquired resistance to bedaquiline, linezolid and pretomanid, and impact on treatment outcomes in four tuberculosis clinical trials containing pretomanid. PLOS Glob Public Health. 2023;3(10).
  7. Chesov E, et al. Emergence of bedaquiline resistance in a high tuberculosis burden country. Eur Respir J. 2022;59(3):2100621.
  8. Dhillon J, Mitchison DA. Activity and penetration of antituberculosis drugs in mouse peritoneal macrophages infected with Mycobacterium microti OV254. Antimicrob Agents Chemother. 1989;33(8):1255-9.
  9. Ge Z, Wang Z, Wei M. Measurement of the concentration of three antituberculosis drugs in the focus of spinal tuberculosis. Eur Spine J. 2008;17(11):1482-7.
  10. Parbhoo T, Schurz H, Mouton JM, Sampson SL. Persistence of Mycobacterium tuberculosis in response to infection burden and host-induced stressors. Front Cell Infect Microbiol. 2022;12:981827.
  11. Sarathy JP, et al. Prediction of drug penetration in tuberculosis lesions. ACS Infect Dis. 2016;2(8):552-63.
  12. Fountain FF, Tolley EA, Jacobs AR, Self TH. Rifampin hepatotoxicity associated with treatment of latent tuberculosis infection. Am J Med Sci. 2009;337(5):317-20.
  13. Chen X, et al. Acquired resistance during short-course treatment for rifampicin-resistant tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 2026;32(2):315-22.
  14. Singh V, Chibale K. Strategies to combat multi-drug resistance in tuberculosis. Acc Chem Res. 2021;54(10):2361-76.
  15. Pinto-Alphandary H, Andremont A, Couvreur P. Targeted delivery of antibiotics using liposomes and nanoparticles: research and applications. Int J Antimicrob Agents. 2000;13:155-68.
  16. Drulis-Kawa Z, Dorotkiewicz-Jach A. Liposomes as delivery systems for antibiotics. Int J Pharm. 2010;387(1-2):187-98.
  17. Singh SR, et al. Advancing tuberculosis chemotherapy: targeted nanomedicines for the mycobacterium TB granuloma. Small. 2025;21(49).
  18. Ferreira M, et al. Liposomes as antibiotic delivery systems: a promising nanotechnological strategy against antimicrobial resistance. Molecules. 2021;26(7):2047.
  19. Zweijpfenning SMH, et al. Safety and outcomes of amikacin liposome inhalation suspension for Mycobacterium abscessus pulmonary disease: a NTM-NET study. Chest. 2022;162(1):76-81.
  20. Allen TM, Cullis PR. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Adv Drug Deliv Rev. 2013;65(1):36-48.
  21. Truzzi E, et al. Drugs/lamellae interface influences the inner structure of double-loaded liposomes for inhaled anti-TB therapy: an in-depth small-angle neutron scattering investigation. J Colloid Interface Sci. 2019;541:399-406.
  22. U.S. Food and Drug Administration. ARIKAYCE (amikacin liposome inhalation suspension) [prescribing information]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2018.
  23. Yıldırım M, Düzgüneş N. Liposome-encapsulated antibiotics for the therapy of mycobacterial infections. Antibiotics (Basel). 2025;14(7):728.
  24. Yun Y, et al. Recent advances in functional lipid-based nanomedicines as drug carriers for organ-specific delivery. Nanoscale. 2025;17(13):7617-38.
  25. Farooque F, Mughees MM, Wasi M. Liposomes as drug delivery system: an updated review. J Drug Deliv Ther. 2021;11(5 Suppl):149-58.
  26. Wang Z, Liu L, Yin W, Liu Z, Shi L, Tang M. A novel drug delivery system: the encapsulation of naringenin in metal-organic frameworks into liposomes. AAPS PharmSciTech. 2021;22(2):61.
  27. Niu NK, et al. Preparation and characterization of HRZ triple anti-tuberculosis drugs/TGF-β1 siRNA nanoliposomes. Orthop J China. 2018;26(23):2177-82.
  28. Wang Y, et al. Formulation and pharmacokinetic evaluation of a paclitaxel nanosuspension for intravenous delivery. Int J Nanomedicine. 2011;6:1497-507.
  29. Mishra M, et al. Mycobacterial lipid-derived immunomodulatory drug-liposome conjugate eradicates endosome-localized mycobacteria. J Control Release. 2023;360:578-90.
  30. Yoshizawa Y, Kono Y, Ogawara KI, Kimura T, Higaki K. PEG liposomalization of paclitaxel improved its in vivo disposition and anti-tumor efficacy. Int J Pharm. 2011;412(1-2):132-41.
  31. Guo LN, et al. Liposome and exosome pre-treatment for transmission electron microscopy and morphological observation. Acta Sci Nat Univ Sunyatseni. 2025;64(4):62-68.
  32. Crommelin DJA, van Bommel EMG. Stability of liposomes on storage: freeze dried, frozen or as an aqueous dispersion. Pharm Res. 1984;1(4):159-63.
  33. Wang F, et al. Nanoliposome-encapsulated brinzolamide-hydropropyl-β-cyclodextrin inclusion complex: a potential therapeutic ocular drug-delivery system. Front Pharmacol. 2018;9:91.
  34. Ubhe AS. Imaging of liposomes by negative-stain transmission electron microscopy and cryo-transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 2023;2633:245-51.
  35. Filippov SK, et al. Dynamic light scattering and transmission electron microscopy in drug delivery: a roadmap for correct characterization of nanoparticles and interpretation of results. Mater Horiz. 2023;10:2023-42.
  36. Wallenwein CM, et al. How wound environments trigger the release from rifampicin-loaded liposomes. Int J Pharm. 2023;633:122606.
  37. Forte J, et al. Mucoadhesive rifampicin-liposomes for the treatment of pulmonary infection by Mycobacterium abscessus: chitosan or ε-poly-L-lysine decoration. Biomolecules. 2023;13(6):924.
  38. Sorokoumova GM, et al. Bacteriostatic activity and decomposition products of rifampicin in aqueous solution and liposomal composition. Pharm Chem J. 2008;42:475-8.
  39. Fenaroli F, et al. Enhanced permeability and retention-like extravasation of nanoparticles from the vasculature into tuberculosis granulomas in zebrafish and mouse models. ACS Nano. 2018;12(8):8646-61.
  40. Hamed A, Osman R, Al-Jamal KT, Holayel SM, Geneidi AS. Enhanced antitubercular activity, alveolar deposition and macrophage uptake of mannosylated stable nanoliposomes. J Drug Deliv Sci Technol. 2019;51:513-23.

Перепечатки и разрешения

Теги

Липосомы с рифампициномпротивотуберкулезная терапиялипосомальная доставка лекарственных средствметод гидратации тонкой пленкиэффективность инкапсуляциивысокоэффективная жидкостная хроматографиядинамическое рассеяние светапросвечивающая электронная микроскопиявысвобождение лекарственного средства in vitro
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.