Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В данной работе мы представляем протокол стандартизированной высокопроизводительной визуализации и обработки данных клеток, окрашенных пропидийиодидом (PI) и Hoechst 33342, для проведения воспроизводимого анализа жизнеспособности клеток с использованием автоматизированных рабочих процессов получения и анализа изображений.
Чтобы решить проблему низкой воспроизводимости, вызванную вариативностью операционных действий при получении изображений в научных исследованиях, а также сложностью анализа большого количества образцов традиционными методами, мы представляем протокол окрашивания клеток HT22 с помощью PI и Hoechst 33342 с последующей визуализацией и анализом данных с использованием системы высокопроизводительного имиджинга (High-Content Imaging System). Данный рабочий процесс направлен на установление надежных параметров настроек визуализации и строгих стандартов контроля качества. В работе демонстрируются настройки прибора и алгоритм действий для трех различных методов обработки изображений, реализованных в системе: многоволновой подсчет клеток (Multi-Wavelength Cell Scoring, Multi), определение живых и мертвых клеток (Live-Dead, Live) и редактор пользовательских модулей (Custom Module Editor, CME). Для подтверждения эффективности эти методы обработки изображений сравниваются с традиционным методом в программе ImageJ. В итоге в исследовании обобщается рабочий процесс использования системы высокопроизводительного имиджинга для определения жизнеспособности клеток методом двойного окрашивания PI и Hoechst. Благодаря стандартизации всего процесса визуализации и обработки данных данное исследование значительно повышает воспроизводимость и достоверность получения изображений в научных работах, обеспечивая тем самым надежную методологическую поддержку для сравнения данных между различными лабораториями и способствуя развитию научных исследований.
Система высокопроизводительной визуализации является важнейшим инструментом в современных научных исследованиях, обеспечивая высокоскоростную съемку и многопараметрическую оценку поврежденных или неповрежденных клеток1,2,3. Она играет незаменимую роль в различных дисциплинах. В области наук о жизни она помогает исследователям изучать микроскопический мир клеток и тканей4,5. Например, точное детектирование флуоресцентно меченных молекул и структур внутри клеток позволяет четко визуализировать тонкие клеточные структуры....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В данном протоколе используется коммерческая клеточная линия (HT22, ATCC); участие людей или использование первичных тканей человека не предполагалось. В этом исследовании животные не использовались.
1. Стандартизированная подготовка образцов
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Влияние стандартизированной подготовки на качество визуализации
Параметры планшета были настроены таким образом, чтобы прибор мог надежно определить слой с изображениями клеток. Образцы, подготовленные в виде монослоя клеток с умеренной конфлюэнтностью, облегчали фокусировку изображения при различных увеличениях объектива, а также улучшали распознавание изображений и количественный анализ. Стандартизированная подготовка образцов и оптимизированные параметры планшета эффективно.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
При использовании метода двойного окрашивания PI и Hoechst для определения жизнеспособности клеток, например, прибор для высокопроизводительного анализа может быстро и в высокопроизводительном режиме рассчитать жизнеспособность клеток в одной партии с помощью встроенных программных модулей. Данный метод обладает рядом преимуществ, включая малый объем образца, низкую стоимость, минимальное повреждение клеток, слабое выгорание флуоресценции, устойчивость к тушению и возможность получения нескольких изображений. Кроме того,.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. При переводе рукописи Zhipu AI использовался исключительно для перевода, а не для генерации исследовательских данных, результатов экспериментов или основного академического содержания. Авторы несут полную ответственность за содержание рукописи.
Авторы выражают благодарность за поддержку, оказанную Фондом школы Чэндуского университета традиционной китайской медицины. Авторы благодарят за поддержку в рамках гранта MPRC2022034. Данное финансирование используется для разработки метода трехмерной динамической визуализации кишечных бактерий при применении отвара Эрчен (Erchen Decoction) для лечения мышей с простым ожирением. Авторы признательны за предоставление исследовательской платформы Инновационному институту китайской медицины и фармации Чэндуского университета традиционной китайской медицины и Институту междисциплинарных исследований.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Центрифужная пробирка 1,5 mL | Labigic Technology Co., Ltd. | MCT-001-150 | |
| Наконечники для пипеток 1000 µL | Labigic Technology Co., Ltd. | 35423003E | |
| Центрифужная пробирка 15 mL | Labigic Technology Co., Ltd. | CT-002-15A | |
| Наконечники для пипеток 2,5 µL | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | B10T | |
| Наконечники для пипеток 200 µL | Labigic Technology Co., Ltd. | T-001-200 | |
| Центрифужная пробирка 50 mL | Labigic Technology Co., Ltd. | CT-002-50A | |
| 96-луночный планшет для культивирования клеток | Corning Incorporated | 3599 | |
| Одноканальный дозатор с регулируемым объемом, 0,1–2,5 μL | Eppendorf SE | 3120000216 | |
| Одноканальный дозатор с регулируемым объемом, 100–1000 μL | Eppendorf SE | 3120000267 | |
| Одноканальный дозатор с регулируемым объемом, 20–200 μL | Eppendorf SE | 3120000259 | |
| Одноканальный дозатор с регулируемым объемом, 2–20 μL | Eppendorf SE | 3120000232 | |
| Чашка для культивирования клеток | Corning Incorporated | 430167 | |
| Криопробирки | Labigic Technology Co., Ltd. | BS-20-ST | |
| Диметилсульфоксид (DMSO) | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | D8371 | |
| Модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM) | Life Technologies Limited | 11966-025 | В данном исследовании полная среда DMEM была приготовлена с использованием 10% FBS, 1% раствора пенициллина-стрептомицина и 89% DMEM. |
| Инкубатор CO2 ESCO CelCulture | Esco Micro Pte. Ltd. | CCL-170B-8 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS, сверхчистая) | Procell Life Science & Technology Co.,Ltd. | 164210-50 | |
| Флуоресцентный краситель Hoechst 33342 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | B8040 | |
| Клетки HT22 | Procell Life Science & Technology Co.,Ltd. | CL-0697 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ — одно из программных обеспечений для обработки изображений, использованных в данной работе. | |
| Конфокальная система высокопроизводительного анализа изображений ImageXpress Micro | Molecular Devices, LLC | ImageXpress Micro Confocal | В тексте работы название прибора заменено на «Система высокопроизводительного анализа изображений». |
| Низкоскоростная центрифуга для замораживания | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd. | L530R | |
| Программное обеспечение для сбора и анализа высокопроизводительных изображений MetaXpress | Molecular Devices, LLC | Данное ПО является дополнением к конфокальной системе высокопроизводительного анализа изображений ImageXpress® Micro. В тексте работы под фразой «Программное обеспечение для анализа, поставляемое с устройством» подразумевается данное ПО. | |
| Вертикальный ламинарный шкаф OptiMair | Esco Micro Pte. Ltd. | ACB-4E1 | |
| Parafilm M | Pechiney Plastic Packaging Inc. | PM996 | |
| PBS | Shanghai Yuchun biology science and technology co., ltd | YC-5013 | |
| Раствор пенициллина-стрептомицина | Procell Life Science & Technology Co.,Ltd. | PB180120 | |
| Раствор пропидия иодида (PI) | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | C0080 | |
| Раствор трипсин-ЭДТА | BasalMedia Technology Co.,Ltd. | S310KJ |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно