Методическая статья

Стандартизированный рабочий процесс для высококонтентного имиджинга и обработки данных

35 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71863

⸱

21 августа 2026 г.

 ,  , 
1College of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Institute of Interdisciplinary Studies, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Life Science and Technology, Southeast University

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы представляем протокол стандартизированной высокопроизводительной визуализации и обработки данных клеток, окрашенных пропидийиодидом (PI) и Hoechst 33342, для проведения воспроизводимого анализа жизнеспособности клеток с использованием автоматизированных рабочих процессов получения и анализа изображений.

Аннотация

Чтобы решить проблему низкой воспроизводимости, вызванную вариативностью операционных действий при получении изображений в научных исследованиях, а также сложностью анализа большого количества образцов традиционными методами, мы представляем протокол окрашивания клеток HT22 с помощью PI и Hoechst 33342 с последующей визуализацией и анализом данных с использованием системы высокопроизводительного имиджинга (High-Content Imaging System). Данный рабочий процесс направлен на установление надежных параметров настроек визуализации и строгих стандартов контроля качества. В работе демонстрируются настройки прибора и алгоритм действий для трех различных методов обработки изображений, реализованных в системе: многоволновой подсчет клеток (Multi-Wavelength Cell Scoring, Multi), определение живых и мертвых клеток (Live-Dead, Live) и редактор пользовательских модулей (Custom Module Editor, CME). Для подтверждения эффективности эти методы обработки изображений сравниваются с традиционным методом в программе ImageJ. В итоге в исследовании обобщается рабочий процесс использования системы высокопроизводительного имиджинга для определения жизнеспособности клеток методом двойного окрашивания PI и Hoechst. Благодаря стандартизации всего процесса визуализации и обработки данных данное исследование значительно повышает воспроизводимость и достоверность получения изображений в научных работах, обеспечивая тем самым надежную методологическую поддержку для сравнения данных между различными лабораториями и способствуя развитию научных исследований.

Введение

Система высокопроизводительной визуализации является важнейшим инструментом в современных научных исследованиях, обеспечивая высокоскоростную съемку и многопараметрическую оценку поврежденных или неповрежденных клеток1,2,3. Она играет незаменимую роль в различных дисциплинах. В области наук о жизни она помогает исследователям изучать микроскопический мир клеток и тканей4,5. Например, точное детектирование флуоресцентно меченных молекул и структур внутри клеток позволяет четко визуализировать тонкие клеточные структуры и динамические изменения6. В нейробиологических исследованиях с ее помощью можно выполнять трехмерную визуализацию нейронов, что способствует анализу сложных связей и механизмов передачи сигналов в нейронных сетях, предоставляя важные данные для понимания функций мозга и патогенеза неврологических заболеваний7,8,9.

Несмотря на значительные преимущества технологии систем высокопроизводительного имиджинга (High-Content Imaging System), в процессе получения изображений сохраняется ряд проблем. На этапе подготовки образцов наблюдается высокая степень субъективности. В подготовке биологических образцов такие процессы, как работа с клетками и окрашивание, не имеют соответствующих стандартов. Что касается параметров съемки, существуют заметные различия в выдержке и выборе многолуночных планшетов в разных лабораториях и для разных моделей высокопроизводительных микроскопов. На этапе обработки данных отсутствует стандартизация: от шумоподавления и настройки контрастности исходных изображений до идентификации параметров и определения целевых признаков. Эти проблемы напрямую приводят к систематическим ошибкам в результатах микроскопии, что вызывает кризис воспроизводимости.

Протокол

В данном протоколе используется коммерческая клеточная линия (HT22, ATCC); участие людей или использование первичных тканей человека не предполагалось. В этом исследовании животные не использовались.

1. Стандартизированная подготовка образцов

  1. Подготовка клеток HT22
    1. Когда конфлюэнтность клеток HT22 достигнет 80%10,11, удалите старую среду. Используйте 0,25% трипсин для открепления клеток, инкубируя в течение 1–2 мин при комнатной температуре.
    2. Добавьте модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM) в объеме, в 3 раза превышающем объем 0,25% трипсина, чтобы остановить процесс открепления. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 mL.
    3. Центрифугируйте при 175 x g в течение 3 мин при комнатной температуре, затем удалите супернатант. Ресуспендируйте клетки в полной среде DMEM для получения суспензии одиночных клеток.
    4. Подсчитайте количество клеток с помощью камеры Горяева. Посейте по 5 000 клеток в лунку в 100 µL полной среды в 96-луночный планшет12.
    5. Инкубируйте планшет при 37 °C с 5% CO2 в течение 24 ч. Выполните распределение образцов по группам, дозирование и окрашивание в 96-луночном планшете в соответствии с дизайном эксперимента.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 96-луночный планшет, совместимый с системой визуализации. Выберите планшет с соответствующей толщиной и геометрией дна согласно спецификациям производителя. Для обеспечения более высокого качества изображений рекомендуются планшеты со стеклянным дном (толщина дна 130–170 µm)13,14,15,16.
  2. Процедура окрашивания
    1. Убедитесь, что клетки образуют единый, хорошо распределенный монослой и их конфлюэнтность не превышает 70%, чтобы минимизировать перекрытие клеток (Рисунок 1B).
    2. Разделите образцы по группам в соответствии с требованиями эксперимента и приступайте к окрашиванию после обработки. Приготовьте рабочие растворы красителей с конечной концентрацией 6,684 µg/mL для PI и 10 µg/mL для Hoechst 3334217,18.
    3. Удалите старую среду из 96-луночного планшета и дважды промойте каждую лунку 100 µL PBS. Добавьте рабочий раствор красителя и инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин для окрашивания.
    4. Дважды промойте каждую лунку 100 µL PBS, затем добавьте DMEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от дизайна эксперимента параметры загрузки образцов и окрашивания могут варьироваться.

2. Спецификации визуализации и настройки параметров

  1. Стандарты параметров визуализации
    ​ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании представлен только рабочий процесс широкопольной визуализации для прибора после окрашивания PI и Hoechst 33342.
    1. Включите прибор, затем запустите компьютер. Откройте аналитическое программное обеспечение, поставляемое с устройством.
    2. Загрузите 96-луночный планшет в прибор. Выберите поле зрения с образцами для визуализации.
    3. В настройках объектива и камеры (Objective and Camera) установите увеличение (Magnification) на "20XPh1SPlanFluorELWDADM" (Nikon, S Plan Fluor, ELWD, 20X/0.45, ∞/0-2, WD 8.2-6.9, OFN22, Ph1, AMD, MRH48230), биннинг камеры (Camera binning) на "2" и режим сбора данных (Acquisition Mode) на "Widefield".
    4. В режиме планшета (plate mode) выберите соответствующие параметры 96-луночного планшета и настройте параметры планшета в соответствии с данными о размере изделия.
    5. В разделе параметров площадок (Site Option) обычно выбирают 9 полей на лунку для плотной визуализации. В параметрах автофокусировки (Autofocus) выберите Enable laser-based focusing.
    6. Отрегулируйте параметры лазерного автофокуса в разделе Autofocus на основе средней толщины дна планшета, измеренной как минимум в трех контрольных лунках. Соответственно настройте параметры Bottom thickness, Bottom thickness max variation, Adjacent well max variation, Intra-well max variation и Plate max variation.
    7. В разделе длин волн (Wavelengths) установите количество длин волн (Number of wavelengths) на 3. Для первого освещения (Illumination) выберите DAPI. В разделе коррекции затенения (Shading Correction) выберите "Auto Correction for FL" (Рисунок 2B).
    8. После нахождения изображения установите начальную экспозицию (Exposure (ms)) на 20–30. Наблюдайте за полученными изображениями и непрерывно регулируйте экспозицию до достижения умеренной интенсивности флуоресценции без переэкспонирования, и установите разрядность (bit depth) на 16 (Рисунок 2A).
    9. Выберите Laser with z-offset для регулировки фокусировки. Если фокус нечеткий, отметьте Use Z stack, нажмите Calculate Offset и выберите подходящее фокусное расстояние. Отметьте Digital Confocal (info) и установите параметры регулировки для Increase Sharpness и Reduce Noise на 0.200.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если экспозиция или четкость изображения неудовлетворительны, отрегулируйте экспозицию и заново рассчитайте параметры смещения (offset).
    10. Для второго освещения выберите Cy3. Следуйте тем же настройкам, что и в шагах 2.1.7-2.1.9.
    11. Для третьего освещения выберите TL 25. Следуйте тем же настройкам, что и в шагах 2.1.7-2.1.9.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настраивайте коррекцию затенения (Shading correction) в зависимости от канала; для TL 25 следует выбрать Auto Correction for TL. В разделе Wavelengths канал TL должен быть установлен для позиционирования клеток и морфологического наблюдения.
    12. На вкладке Run назовите планшет в соответствии с соглашением об именовании: имя планшета-тип клеток-ID эксперимента-дата-увеличение объектива-тип визуализации. Подтвердите параметры, связанные с каналом визуализации, в разделе Description.
    13. Нажмите Acquire Plate, чтобы начать визуализацию. После завершения визуализации последовательно выключите программное обеспечение, прибор и компьютер.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: В дальнейшем компьютер можно включать только для экспорта изображений, обработки данных и анализа результатов.
  2. Стандарты и требования к проведению визуализации
    1. Центрируйте поле зрения по лунке, чтобы избежать краевых эффектов (Рисунок 1A). При настройке параметров визуализации в качестве эталона используйте положительный контроль с самой высокой интенсивностью флуоресценции. Кроме того, при фокусировке выбирайте поле зрения с одним слоем клеток, чистое и свободное от мусора.
    2. Для камеры строго контролируйте, чтобы значения пикселей были ниже 60000 (максимальное значение — 65535) во избежание насыщения, которое может привести к безвозвратной потере информации. При появлении перенасыщенных ярких точек или областей сократите время экспозиции. В то же время не устанавливайте слишком низкое время экспозиции, иначе в изображении будет преобладать шум.
    3. При слабых сигналах флуоресценции отдавайте приоритет небольшому увеличению экспозиции, а не принудительному повышению параметров, чтобы избежать необратимых повреждений, вызванных фотообесцвечиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации в светлом поле эти принципы могут быть несколько смягчены, но основной акцент по-прежнему делается на целостности сигнала и защите образца.
    4. Убедитесь, что контуры краев образца четко различимы, а внутренние тонкие структуры (такие как гранулы, волокна, органеллы) имеют отчетливую текстуру, не размыты, а рассеянный свет фона распределен равномерно, без локальных ярких пятен или размытых ореолов. Строго избегайте перефокусировки и недофокусировки.
    5. Убедитесь в наличии нормальной, положительной, отрицательной и экспериментальных групп, и что каждая группа обработки имеет не менее 3 параллельных лунок. Рекомендуется располагать параллельные лунки вертикально.

3. Обработка и анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: В данном документе описаны три метода обработки изображений, реализованных в сопутствующем программном обеспечении прибора, каждый из которых подходит для протокола окрашивания, использованного в этом исследовании. Несмотря на то, что в основе этих методов лежит один и тот же принцип распознавания, они различаются конкретными методами обработки и типами получаемых данных. Общий рабочий процесс обработки изображений был следующим: открыть файл → загрузить исходное изображение, выбрав соответствующий метод обработки → установить подходящие параметры канала → создать маску → выбрать тип измеряемых данных в меню Measure → запустить анализ → изучить результаты → экспортировать данные.

  1. Откройте программное обеспечение для анализа, поставляемое с прибором → Review Plate → Select Plate.
  2. В режиме просмотра по дате (Date view) выберите Well arrangement и в качестве эталона выберите поле зрения из положительной группы.
  3. В разделе Run Analysis выберите соответствующую программу обработки и установите параметры обработки изображений или выполните экспорт изображения.
  4. После настройки и сохранения параметров выберите Run on all wells / Run on selections / Run on displayed site в зависимости от объекта настройки параметров.
  5. После того как компьютер завершит обработку данных, во вкладке Measurements в разделе Analysis выберите соответствующую программу обработки данных, а в разделе Measurement выберите различные результаты измерений для проверки данных.
  6. Нажмите Open Log, чтобы начать экспорт данных. Установите следующие детали в настройках параметров для трех методов обработки изображений:
    1. Метод обработки изображений один: Multi-Wavelength Cell Scoring
      1. Выберите программу Multi-Wavelength Cell Scoring и настройте параметры. Укажите Number of wavelengths. В поле Algorithm выберите Standard.
      2. Установите параметры распознавания для всех ядер на основе результатов окрашивания PI. По умолчанию исходным изображением W1 Source является канал DAPI.
      3. Установите Approximate min width на 8–10 µm и Approximate max width на 30–35 µm, исходя из размера отдельных распознаваемых объектов.
      4. Установите интенсивность выше локального фона (intensity above local background) в диапазоне 2 000–10 000 уровней серого. Используйте Preview для тестирования и корректировки настроек на основе результатов распознавания.
      5. Установите параметры W2 на основе результатов окрашивания Hoechst 33342. Присвойте название этому каналу. Исходным изображением W2 Source является Cy3.
      6. В поле Stained area выберите область, окрашенную этим каналом, как Nucleus. Для последующих настроек используйте те же параметры, что и в пунктах 3.6.1.3–3.6.1.4. В Configure Summary Log или Configure Data Log (Cells) выберите соответствующую конфигурацию параметров (Parameter configuration) в зависимости от желаемых параметров результата.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно Configure Summary Log используется для установки необходимых типов данных, а Configure Data Log (Cells) — в случаях, когда требуется специальная маркировка отдельных клеток.
      7. Выполните тестовый запуск (Test Run), чтобы проверить распознавание. Если результаты распознавания удовлетворительны, сохраните настройки.
    2. Метод обработки изображений два: Live-Dead
      1. Выберите программу Live-Dead и приступите к настройке параметров. Последовательно установите Wavelength 1 Parameters и Wavelength 2 Parameters.
      2. В Wavelength 1 Parameters установите Wavelength 1 Source на DAPI. Алгоритм по умолчанию — «Standard».
      3. На основе условий окрашивания установите Stained cell type на All Cells, а Stained area на Nucleus. Установите Approximate min width, Approximate max width и интенсивность выше локального фона, используя те же настройки, что и для метода Multi-Wavelength Cell Scoring.
      4. Отметьте Split touching objects и используйте Preview для тестирования.
      5. В Wavelength 2 Parameters установите Wavelength 2 Source на Cy3.
      6. На основе специфического окрашивания установите Stained cell type на Dead, а Stained area на Nucleus. Установите Approximate min width, Approximate max width и интенсивность выше локального фона, используя те же настройки, что и для метода Multi-Wavelength Cell Scoring.
      7. Нажмите Configure Summary Log и выберите конфигурацию параметров (Parameter configuration) в зависимости от требуемых типов данных. Выполните тестовый запуск (Test Run) для проверки распознавания. Если результаты распознавания удовлетворительны, сохраните настройки.
    3. Метод обработки изображений три: режим разработчика CME
      1. Выберите программу Custom Module (CME) и приступите к настройке параметров. Задайте Image Names и каналы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения последующей настройки параметров обычно рекомендуется указывать названия каналов, которые использовались при съемке.
      2. В разделе Find Objects откройте Simple Threshold, чтобы настроить распознавание для всего набора.
      3. Установите Source в соответствии с Image Name. Исходя из 16-битного диапазона значений шкалы серого, введите 0 в Threshold Low и 65535 в Threshold High.
      4. Присвойте название результату обработки в поле Result, примените настройки и оцените результат маркировки. В Find Objects откройте Find Blobs для создания маски (Mask).
      5. Установите Source в соответствии с Image Name, как в Simple Threshold. Установите Approximate min width, Approximate max width и интенсивность выше локального фона согласно настройкам Multi-Wavelength Cell Scoring.
      6. Присвойте название результату обработки в поле Result, примените настройки и оцените результат маркировки. Для результата распознавания Find Blobs используйте инструмент Modify Objects для фильтрации, расширения (grow), сужения (shrink) и инверсии.
      7. В разделе Measure установите Modified. В Measurement Inputs введите 1 для Standard Area Value и отметьте Create Object Overlay.
      8. В Objects to Measure выберите источник маркированных объектов в Mask of Objects и исходное изображение для измерения в Image to Measure. Выберите соответствующее название измерения (Measurement Name) в зависимости от требуемых параметров результата обработки, примените настройки и оцените результат распознавания параметров.
      9. После подтверждения настроек параметров сохраните конфигурацию.
    4. Общий метод: ImageJ
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Проанализируйте результаты визуализации с помощью метода ImageJ для флуоресцентных изображений19, а затем проведите сравнительный анализ с тремя методами данного прибора.
      1. Откройте программное обеспечение ImageJ. Импорт изображения: File → Open → выберите оригинальное изображение в оттенках серого для анализа.
      2. Преобразуйте изображение в 8-битный формат: Image → Type → 8-bit. Распознавание значений серого: Image → Adjust → Threshold → Default, Red → отметьте Dark background → Set → OK.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если распознавание красной области неудовлетворительно, замените Default одной из 16 других встроенных моделей распознавания ImageJ или отрегулируйте ползунок в диалоговом окне.
      3. Установите параметры: Analyze → Set Measurements. В появившемся диалоговом окне отметьте Area, Mean gray value, Integrated density, Limit to threshold, Display label, Redirect to None (по умолчанию) и введите 2 в поле Decimal places (0-9). Нажмите OK.
      4. Проанализируйте результаты распознавания: Analyze → Measure. Сохранение результатов: в появившемся диалоговом окне результатов выберите File → Save As и укажите место сохранения.
  7. Экспорт изображений
    1. Выберите качественное поле зрения в положительной лунке в качестве эталона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основные требования к качеству: достоверность, точная фокусировка, подходящая экспозиция (16 бит) и надлежащий контраст (чем выше отношение сигнал/шум, тем лучше). Дополнительные требования к высокому качеству включают четкость признаков, контрастность, практичность, интуитивно понятные морфологические изменения и выделение ключевых моментов.
    2. В Run Analysis в разделе Analysis выберите ExportPro и запустите Run Setup for Analysis. В Select output options выберите Individual channel, Color overlay, shrink image (опционально) и Scale bar (опционально) в соответствии с требованиями к изображению.
    3. Выберите флуоресцентные каналы, которые необходимо экспортировать для каждого поля зрения. В Individual Channel выберите цвет для каждого канала, например, Blue для канала DAPI и Monochrome для канала TL.
    4. В Color overlay последовательно выберите каналы, соответствующие BRIGHTFIELD, RED, BLUE и GREEN (выберите длину волны цвета для наложения цветов). Установите Number на 100; просмотрите предварительное изображение и примите результат превью.
    5. В разделе output выберите папку для хранения экспортированных изображений в Export to folder. Запустите выполнение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения из одной партии не должны экспортироваться по отдельности; партия изображений представляет собой совокупность снимков четырех основных образцов: отрицательного контроля, положительного контроля, базовой контрольной группы и целевой экспериментальной группы, полученных при полностью идентичных условиях эксперимента.
  8. Сравнение методов обработки изображений
    1. Выберите 9 полей зрения и сравните традиционный ручной подсчет живых и мертвых клеток с методами Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME и ImageJ по количеству живых клеток, мертвых клеток и соотношению мертвых клеток к живым. Используйте GraphPad Prism версии 10.1 для проведения однофакторного ANOVA с последующим множественным тестом Тьюки для анализа различий.
    2. Выберите 81 поле зрения и сравните различия в подсчете клеток, площади и интенсивности между методами Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME и ImageJ. Используйте GraphPad Prism версии 10.1 для проведения однофакторного ANOVA с последующим множественным тестом Тьюки для анализа различий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты по культивированию и окрашиванию клеток должны проводиться в боксе биологической безопасности. Утилизируйте жидкие отходы, наконечники и другие экспериментальные отходы в соответствии с правилами лаборатории. Обеспечьте полную защиту на протяжении всего эксперимента.

Результаты

Влияние стандартизированной подготовки на качество визуализации

Параметры планшета были настроены таким образом, чтобы прибор мог надежно определить слой с изображениями клеток. Образцы, подготовленные в виде монослоя клеток с умеренной конфлюэнтностью, облегчали фокусировку изображения при различных увеличениях объектива, а также улучшали распознавание изображений и количественный анализ. Стандартизированная подготовка образцов и оптимизированные параметры планшета эффективно минимизировали краевые эффекты, наложение клеток и другие факторы, способствующие получению изображений низкого качества (Рисунок 1).

Сравнение функций методов расчета изображений

Для разграничения живых и мертвых клеток использовали метод двойного окрашивания PI/Hoechst 33342. Методы Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead и CME успешно обработали эти изображения, идентифицируя объекты на основе интенсивности флуоресценции и размера объектов, в то время как ImageJ идентифицировал объекты на основе значений оттенков серого. Результаты маркировки, полученные с помощью этих методов, в целом были сопоставимы (Рисунок 3A–E).

Метод многоволнового подсчета клеток требует окрашивания ядер для идентификации всех клеток (Рисунок 4A). Он позволяет обрабатывать до 7 каналов визуализации и рассчитывать такие параметры, как количество клеток, площадь и оптическая плотность.

Метод Live-Dead оказался более гибким, чем метод подсчета клеток по нескольким длинам волн (Multi-Wavelength Cell Scoring). Оба канала предоставляют модули для окрашивания ядер, цитоплазматического окрашивания или комбинированного ядерно-цитоплазматического окрашивания для идентификации всех клеток, живых или погибших клеток. Функция Split touching objects разделяет перекрывающиеся объекты, что позволяет рассчитывать количество клеток, их площадь и оптическую плотность. Однако, поскольку данный метод обрабатывал только двухканальные данные, он был особенно подходящим для анализа жизнеспособности клеток с двойным окрашиванием PI/Hoechst 33342 (Рисунок 4B).

Метод CME основывался на определяемой пользователем логике обработки изображений. Количество обрабатываемых каналов соответствовало количеству полученных каналов. Результаты распознавания уточнялись с помощью таких функций, как Fill Holes (заполнение отверстий), Invert Objects (инверсия объектов), Grow Objects (расширение объектов), Shrink Objects (сужение объектов), Logical Operations (логические операции), Remove Border Objects (удаление граничных объектов), Keep Marked Objects (сохранение отмеченных объектов), Grow Objects without Touching (расширение объектов без соприкосновения), Mark Object Centers (маркировка центров объектов), Watershed (водораздел), Remove Marked Objects (удаление отмеченных объектов) и Filter Mask (фильтрация маски) для устранения примесей и других источников помех. Данный метод также позволял рассчитывать множество параметров объектов для многомерного анализа.

ImageJ не позволял обрабатывать несколько каналов одновременно. Для пакетов изображений со значительными вариациями фона требовались ручная обработка и настройка порога, что повышало субъективность и снижало воспроизводимость.

Анализ различий в результатах обработки

Сравнительный анализ методов обработки изображений не выявил значимых различий в общем количестве клеток, количестве погибших клеток или отношении погибших клеток к общему числу клеток между методами Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME, ImageJ и традиционным ручным подсчетом по 9 полям зрения (Рисунок 5A–C, Дополнительный файл 1).

Аналогичным образом, не было обнаружено значимых различий в соотношении площади погибших клеток к общей площади клеток при использовании методов Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME и ImageJ. Однако при сравнении методов Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead и CME на основе данных, полученных из 81 поля зрения, было отмечено значимое различие в соотношении средней интенсивности флуоресценции погибших клеток к интенсивности всех клеток (Рисунок 5D–F).

На основании этих результатов был разработан стандартизированный рабочий процесс для системы высокопроизводительного имиджинга (Рисунок 6).

Изображения флуоресцентной микроскопии, клетки, окрашенные DAPI и Cy3, светлое поле, клеточный анализ.
Рисунок 1: Результаты визуализации низкого качества. (A) Поле зрения находится близко к краю лунки, что приводит к появлению теней от края лунки (в данном случае клетки BV2). (B) Стрелки a и b указывают на перекрытие клеток в канале DAPI и канале TL при чрезмерной конфлюэнтности клеток, наличии второго слоя или некоторых плавающих клеток. (C) В поле зрения нет клеток; параметры планшета заданы неверно; фокус не настроен на слой клеток или клетки не окрашены, в результате чего в данном поле зрения изображение отсутствует. Масштабный отрезок = 100 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Схема установки для флуоресцентной микроскопии, окрашивание DAPI, настройки получения изображений, анализ изображений клеток.
Рисунок 2: Настройки параметров визуализации. (A) Стрелка a указывает на значок разрядности цвета. (B) Стрелка b указывает положение функции коррекции затенения (Shading Correction). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Классификация клеток с помощью флуоресцентной микроскопии; диаграмма; многоцветный набор данных; идентификация типов клеток.
Рисунок 3: Результаты анализа одного и того же поля зрения, полученные несколькими методами. (A) Результаты маски Multi-Wavelength Cell Scoring: серые и красные области представляют все ядра клеток, идентифицированные в канале DAPI, при этом красная область соответствует ядрам мертвых клеток, идентифицированным в канале Cy3. (B) Результаты маски Live-Dead: зеленые и красные области представляют все ядра клеток, идентифицированные в канале DAPI, при этом красная область соответствует ядрам мертвых клеток, идентифицированным в канале Cy3. (C) Результат маски CME: желтые и синие области представляют все ядра клеток, идентифицированные в канале DAPI, при этом синяя область соответствует ядрам мертвых клеток, идентифицированным в канале Cy3. (D) Результат маски ImageJ в канале DAPI. (E) Результат маски ImageJ в канале Cy3. Масштабная линейка = 100 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Экраны настройки многоволнового подсчета клеток; параметры обнаружения ядер при анализе изображений.
Рисунок 4: Страницы частичной настройки параметров. (A) Место, отмеченное буквой a, показывает, что в первом канале многоволнового подсчета клеток можно выбрать только ядро; (B) b и c указывают на то, что режим Live-Dead может обрабатывать только два канала, поддерживая двойное окрашивание PI/Hoechst 33342 для мертвых и живых клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Столбчатые диаграммы анализа жизнеспособности клеток; общее количество, количество погибших клеток и их соотношение; результаты сравнительного графика.
Рисунок 5: Различия в результатах обработки флуоресцентных изображений. (A) Различия в общем количестве клеток между пятью методами обработки. (B) Различия в количестве погибших клеток между пятью методами обработки. (C) Различия в соотношении погибших клеток к общему числу клеток между пятью методами обработки. (D) Различия в соотношении погибших клеток к общему числу клеток между четырьмя методами обработки. (E) Различия в соотношении площади погибших клеток к общей площади всех клеток между четырьмя методами обработки. (F) Различия в соотношении средней интенсивности флуоресценции погибших клеток к интенсивности всех клеток для четырех методов обработки. Все планки погрешностей на графиках представляют собой стандартные отклонения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

Схема процесса высокопроизводительной визуализации: инокуляция, доставка препарата, флуоресцентное окрашивание, обработка изображений.
Рисунок 6: Стандартизированный рабочий процесс. Схема, обобщающая стандартную процедуру подготовки образцов, флуоресцентного окрашивания, высокопроизводительной визуализации, обработки изображений, экспорта изображений и анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1. Исходные данные анализа количества клеток, их площади и интенсивности флуоресценции, представленные на рисунке 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

При использовании метода двойного окрашивания PI и Hoechst для определения жизнеспособности клеток, например, прибор для высокопроизводительного анализа может быстро и в высокопроизводительном режиме рассчитать жизнеспособность клеток в одной партии с помощью встроенных программных модулей. Данный метод обладает рядом преимуществ, включая малый объем образца, низкую стоимость, минимальное повреждение клеток, слабое выгорание флуоресценции, устойчивость к тушению и возможность получения нескольких изображений. Кроме того, время имиджинга для 96-луночного планшета обычно составляет всего 30–45 min20.

В экспериментальном протоколе для обеспечения качества визуализации следует обратить внимание на следующие этапы: во-первых, обеспечьте надлежащую плотность посева на планшете, чтобы избежать избыточной плотности клеток, которая может привести к переполнению изображения, или недостаточной плотности, при которой клетки могут смыться во время окрашивания и промывки. Во-вторых, тщательно удалите краситель, чтобы остатки вещества не повлияли на качество визуализации. При работе с клетками с низкой адгезией аккуратно и медленно добавляйте и удаляйте жидкость до и после окрашивания, избегая вертикального введения. Используйте добавление раствора по стенке лунки, чтобы предотвратить потерю клеток в центре поля зрения, уделяя особое внимание откреплению мертвых клеток при анализе жизнеспособности. При необходимости рассмотрите возможность центрифугирования планшета с образцами для уменьшения экспериментальных погрешностей. В-третьих, выберите подходящее время экспозиции. Слишком длительная экспозиция увеличит общее время визуализации и может привести к выходу за пределы окна детекции, что потенциально вызовет переэкспозицию некоторых клеток или появление фонового шума. Слишком короткая экспозиция может привести к неполноте информации на изображении и потере некоторых характерных деталей.

Если при съемке не удается получить четкое изображение, следует проанализировать такие факторы, как состояние клеток, наличие остатков красителя, настройки параметров и другие причины. Если в ходе эксперимента на дне лунки отсутствуют клетки, изображение в поле зрения не будет обнаружено. Образование двух или более неравномерных слоев клеток на дне лунки затрудняет фокусировку, что приводит к размытости изображения. Избыток остатков красителя может вызвать сильный фоновый сигнал, из-за чего целевое изображение станет менее выраженным. Обширные области остатков красителя могут перекрывать клетки в поле зрения, а мелкие частицы остатков, сопоставимые по размеру с клетками, могут помешать последующему распознаванию и сегментации изображений. Если высота планшета и высота лунки установлены не в соответствии со спецификациями производителя для 96-луночного планшета, изображение в поле зрения может не обнаружиться, либо положение образца может сместиться, что создает риск повреждения объектива.

Учитывая гибкость и простоту в эксплуатации, а также хорошие результаты обработки данных, оптимальным модулем обработки изображений для метода двойного окрашивания PI и Hoechst является Live-Dead. Эта программа специально оптимизирована для красителей PI и Hoechst и, по сравнению с другими методами и программным обеспечением, проста в использовании, обеспечивает быстрые вычисления и позволяет легко загружать изображения в базу данных пакетами с согласованными настройками параметров. Полученные результаты более сопоставимы, чем данные, полученные с помощью широко распространенного в настоящее время программного обеспечения ImageJ. Для различных режимов экспериментов можно использовать соответствующие проприетарные методы или общий режим вычислений Multi-Wavelength Cell Scoring; проприетарные методы более удобны, в то время как общий режим вычислений накладывает меньше ограничений на методы окрашивания. Различные протоколы окрашивания требуют различных оптимальных модулей обработки изображений. Разрабатывайте вычислительные методы, адаптированные под цели эксперимента. Метод ExportPro для экспорта изображений прост и легко осваиваем, позволяя предварительно просматривать эталонные объекты. Он подходит для начинающих благодаря графическому интерфейсу, который четко объясняет значение параметров и упрощает измерения, что устраняет барьеры при анализе с использованием нескольких программ и экономит время на изучение инструментов.

В данном исследовании был подтвержден только базовый протокол окрашивания. Для справки: другие экспериментальные протоколы, которые существенно отличаются от данного, все еще требуют валидации в соответствии с новым стандартом.

Система высококонтентного имиджинга служит основной технологической платформой, которая объединяет в себе визуализацию высокого разрешения, синхронное многопараметрическое детектирование, автоматизированный количественный анализ и высокопроизводительный скрининг21,22,23. Ожидается, что интегрированный дизайн возможностей визуализации и вычислений устройства позволит разработать и внедрить соответствующие экспериментальные протоколы и вычислительные модели для большего числа существующих методов имиджинга7,24, что в конечном итоге повысит согласованность и сопоставимость данных, полученных разными операторами, в разное время и в разных сериях экспериментов.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. При переводе рукописи Zhipu AI использовался исключительно для перевода, а не для генерации исследовательских данных, результатов экспериментов или основного академического содержания. Авторы несут полную ответственность за содержание рукописи.

Благодарности

Авторы выражают благодарность за поддержку, оказанную Фондом школы Чэндуского университета традиционной китайской медицины. Авторы благодарят за поддержку в рамках гранта MPRC2022034. Данное финансирование используется для разработки метода трехмерной динамической визуализации кишечных бактерий при применении отвара Эрчен (Erchen Decoction) для лечения мышей с простым ожирением. Авторы признательны за предоставление исследовательской платформы Инновационному институту китайской медицины и фармации Чэндуского университета традиционной китайской медицины и Институту междисциплинарных исследований.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Центрифужная пробирка 1,5 mLLabigic Technology Co., Ltd.MCT-001-150
Наконечники для пипеток 1000 µLLabigic Technology Co., Ltd.35423003E
Центрифужная пробирка 15 mLLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-15A
Наконечники для пипеток 2,5 µLQingdao Haier Biomedical Co., Ltd.B10T
Наконечники для пипеток 200 µLLabigic Technology Co., Ltd.T-001-200
Центрифужная пробирка 50 mLLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-50A
96-луночный планшет для культивирования клетокCorning Incorporated3599
Одноканальный дозатор с регулируемым объемом, 0,1–2,5 μLEppendorf SE3120000216
Одноканальный дозатор с регулируемым объемом, 100–1000 μLEppendorf SE3120000267
Одноканальный дозатор с регулируемым объемом, 20–200 μLEppendorf SE3120000259
Одноканальный дозатор с регулируемым объемом, 2–20 μLEppendorf SE3120000232
Чашка для культивирования клетокCorning Incorporated430167
КриопробиркиLabigic Technology Co., Ltd.BS-20-ST
Диметилсульфоксид (DMSO)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.D8371
Модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM)Life Technologies Limited11966-025В данном исследовании полная среда DMEM была приготовлена с использованием 10% FBS, 1% раствора пенициллина-стрептомицина и 89% DMEM.
Инкубатор CO2 ESCO CelCultureEsco Micro Pte. Ltd.CCL-170B-8
Фетальная бычья сыворотка (FBS, сверхчистая)Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.164210-50
Флуоресцентный краситель Hoechst 33342Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.B8040
Клетки HT22Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.CL-0697
ImageJNational Institutes of HealthImageJ — одно из программных обеспечений для обработки изображений, использованных в данной работе.
Конфокальная система высокопроизводительного анализа изображений ImageXpress MicroMolecular Devices, LLCImageXpress Micro ConfocalВ тексте работы название прибора заменено на «Система высокопроизводительного анализа изображений».
Низкоскоростная центрифуга для замораживанияHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.L530R
Программное обеспечение для сбора и анализа высокопроизводительных изображений MetaXpressMolecular Devices, LLCДанное ПО является дополнением к конфокальной системе высокопроизводительного анализа изображений ImageXpress® Micro. В тексте работы под фразой «Программное обеспечение для анализа, поставляемое с устройством» подразумевается данное ПО.
Вертикальный ламинарный шкаф OptiMairEsco Micro Pte. Ltd.ACB-4E1
Parafilm MPechiney Plastic Packaging Inc.PM996
PBS Shanghai Yuchun biology science and technology co., ltd YC-5013
Раствор пенициллина-стрептомицинаProcell Life Science & Technology Co.,Ltd.PB180120
Раствор пропидия иодида (PI)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.C0080
Раствор трипсин-ЭДТАBasalMedia Technology Co.,Ltd.S310KJ

Ссылки

  1. Dariolli R, Nir R, Mushlam T, Souza GR, Farmer SR, Batista ML. Optimized scaffold-free human 3D adipose tissue organoid culture for obesity and disease modeling. SLAS Discovery. 2025;31:100218.
  2. Menduti G, Boido M. Recent advances in high-content imaging and analysis in iPSC-based modelling of neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 2023;24(19).
  3. Park JC, Mook-Jung I. Toward brain organoid-based precision medicine in neurodegenerative diseases. Organoid. 2022;2.
  4. Geyer M, Schreyer D, Gaul LM, Pfeffer S, Pilarsky C, Queiroz K. A microfluidic-based PDAC organoid system reveals the impact of hypoxia in response to treatment. Cell Death Discovery. 2023;9:20.
  5. Huang CJ, Shieh PC, Yang JS, et al. Pterostilbene suppressed cell viability, induced apoptosis and autophagy of cisplatin-resistant gastric cancer cells. Anticancer Res. 2025;45(2):511-523.
  6. Wang G, Li Y, Sun T, et al. BMSC affinity peptide-functionalized β-tricalcium phosphate scaffolds promoting repair of osteonecrosis of the femoral head. J Orthop Surg Res. 2019;14(1):204.
  7. Uzoechi SC, Collins BE, Badeaux CJ, et al. Effects of amyloid beta (aβ) oligomers on blood–brain barrier using a 3D microfluidic vasculature-on-a-chip model. Appl Sci. 2024;14(9). doi:10.3390/app14093917
  8. Pereira JD, DuBreuil DM, Devlin AC, et al. Human sensorimotor organoids derived from healthy and amyotrophic lateral sclerosis stem cells form neuromuscular junctions. Nat Commun. 2021;12(1):4744.
  9. Cromwell EF, Leung M, Hammer M, Thai A, Rajendra R, Sirenko O. Disease modeling with 3D cell-based assays using a novel flowchip system and high-content imaging. SLAS Technol. 2021;26(3):237-248.
  10. Tabęcka-Łonczyńska A, Skóra B, Szlachcikowska D, et al. Impact of Hericium erinaceus and Ganoderma lucidum metabolites on AhR activation in neuronal HT-22 cells. Pharmacol Rep. 2025;77(6):1557-1572.
  11. Tang J, Chen R, Wang L, et al. Melatonin attenuates thrombin-induced inflammation in BV2 cells and then protects HT22 cells from apoptosis. Inflammation. 2020;43(5):1959-1970.
  12. Zhang W, Sun H, Zhao W, Li J, Meng H. Suppression of JNK pathway protects neurons from oxidative injury via attenuating parthanatos in glutamate-treated HT22 neurons. Sci Rep. 2024;14(1):25793.
  13. Thoudam T, Chanda D, Lee JY, et al. Enhanced Ca2+-channeling complex formation at the ER-mitochondria interface underlies the pathogenesis of alcohol-associated liver disease. Nat Commun. 2023;14(1):1703.
  14. Huang Z, Zhang Q, Wang Y, et al. Inhibition of caspase-3-mediated GSDME-derived pyroptosis aids in noncancerous tissue protection of squamous cell carcinoma patients during cisplatin-based chemotherapy. Am J Cancer Res. 2020;10(12):4287-4307.
  15. Andreyev AY, Yang H, Doulias PT, et al. Metabolic bypass rescues aberrant S-nitrosylation-induced TCA cycle inhibition and synapse loss in Alzheimer’s disease human neurons. Adv Sci. 2024;11(12):2306469.
  16. Backström A, Kugel L, Gnann C, et al. A sample preparation protocol for high throughput immunofluorescence of suspension cells on an adherent surface. J Histochem Cytochem. 2020;68(7):473-489.
  17. Hongxing Tang et al. Protective effects of hinokitiol on neuronal ferroptosis by activating the Keap1/Nrf2/HO-1 pathway in traumatic brain injury. J Neurotrauma. 2024;41(5-6):734-750.
  18. Teerawonganan P, Hasriadi, Dasuni Wasana PW, et al. Synthesis, cytotoxicity, and mechanistic evaluation of tetrahydrocurcumin-amino acid conjugates as LAT1-targeting anticancer agents in C6 glioma cells. Int J Mol Sci. 2024;25(20):11266.
  19. Shihan MH, Novo SG, Le Marchand SJ, Wang Y, Duncan MK. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 2021;25:100916.
  20. Gomez-Dopazo G, Nieves RJA, Rivera RLA, et al. Cellulose acetate microwell plates for high-throughput colorimetric assays. RSC Adv. 2024;14(22):15319-15327.
  21. DuBreuil DM, Chiang BM, Zhu K, et al. A high-content platform for physiological profiling and unbiased classification of individual neurons. Cell Rep Methods. 2021;1(1).
  22. Ronzetti M, Simeonov A. A comprehensive update on the application of high-throughput fluorescence imaging for novel drug discovery. Expert Opin Drug Discovery. 2025;20(6):785-797.
  23. Jiang X, Li M, Wang Y, et al. 1,2,4,5-tetrazine-tethered probes for fluorogenically imaging superoxide in live cells with ultrahigh specificity. Nat Commun. 2023;14(1):1401.
  24. Yu Y, Chen J, Zhang X, et al. Identification of anti-inflammatory compounds from zhongjing formulae by knowledge mining and high-content screening in a zebrafish model of inflammatory bowel diseases. Chin Med. 2021;16(1):42.

Перепечатки и разрешения

Теги

PI HoechstHT22Live DeadImageJ

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.