Анализ комплементации сплит-люциферазы для временно разрешенного измерения клиренса тау в микроглии

Краткое содержание

Мы описываем чувствительную, временно разрешённую количественную платформу для измерения клиренса внеклеточного тау в микроглии, полученной из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), с помощью системы люминесценции на основе микропластин. Этот подход позволяет чувствительно обнаруживать кинетику деградации тау в формате микроскважины, что позволяет проводить высокопроизводительный анализ обращения с тау в различных экспериментальных условиях.

Аннотация

Будучи резидентными иммунными клетками центральной нервной системы, микроглия являются центральными регуляторами гомеостаза мозга и ключевыми медиаторами нейродегенеративных заболеваний. Эти клетки непрерывно исследуют нейронную среду и играют ключевую роль в распознавании, внутренней приобретении и деградации внеклеточных субстратов, включая неправильно свернутые и агрегированные белки, такие как патологические тау. Несмотря на растущее количество доказательств причастности микроглии к очистке тау, существующие методы измерения поглощения и деградации тау не обладают временной разрешённостью и чувствительностью, необходимыми для полного отражания этих динамических процессов. Здесь мы разработали люминесцентный анализ для количественного мониторинга клиренса тау в микроглии, вызванной человеком с плюрипотентными стволовыми клетками (iPSC). Эта платформа использует систему комплементации на основе сплит-люциферазы, обеспечивающую высокочувствительное обнаружение тау в реальном времени в живых клетках, что позволяет точно отслеживать их внутриклеточную обработку. Этот анализ масштабируем и адаптируем для различных типов клеток, предоставляя универсальный инструмент для изучения эндолизосомных путей и клеточных механизмов, управляющих обработкой тау при нейродегенеративных заболеваниях, включая болезнь Альцгеймера.

Введение

Тауопатии, включая болезнь Альцгеймера (АД), характеризуются агрегацией и распространением белка, ассоциированного с микротрубочками, по нейронным^{цепям 1,2}. Глия всё больше ценится как регулятор динамики болезни тау, включая поглощение, деградацию и^{распространение 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12}. Понимание того, как глия влияет на тауопатии, является важной задачей для решения ключевых проблем заболеваний, включая нейровоспаление и распространение тау. Среди глиальных популяций микроглии — фагоциты мозга — уникально расположены для опосредования клиренса тау.

Несмотря на острую необходимость разъяснения механизмов обработки тау в микроглии, область остаётся ограниченной в разрешении и пропускной способности доступных анализов. Ключевые вопросы, касающиеся интернализации тау, внутриклеточного трафика и клеточного клиренса, остаются нерешёнными. Каждый из этих этапов представляет собой механистически отдельный процесс: поглощение означает внутреннюю интернализацию внеклеточного тау в плазматической мембране; Торговля включает сортировку и транспортировку внутренне ТАУ через эндосомные, лизосомные и другие внутриклеточные компартменты; а деградация обозначает протеолитический распад тау, главным образом через лизосомные и протеасомные пути. Хотя эти этапы последовательны для внеклеточной обработки тау, поскольку внутренне зажатый тау должен пройти через внутриклеточные компартменты перед достижением деградирующего механизма, они регулируются независимо друг от друга, и заданное экспериментальное возмущение может повлиять на один этап, не изменяя другие. Например, снижение внутриклеточного сигнала тау может отражать ухудшение поглощения, неправильное направление от деградирующих компартментов или усиление деградации. Для разрешения этих процессов необходимы новые платформы анализа, которые могут обнаруживать наличие белков и сочетаться с существующими мерами для определения судьбы белка со временем.

Современные методы устранения интернализации и деградации тау основаны на иммуноцитохимии, потоковой цитометрии, вестерн-блотинге и флуоресцентной маркировке методов для количественной оценки поглощения, субклеточной локализации и внутриклеточной обработки видов тау 13,14,15,16,17,18. Однако каждый из этих подходов страдает от фундаментальных ограничений при изучении динамики клиренса белков. Иммуноцитохимия и вестерн-блоттинг не обладают чувствительностью для обнаружения видов тау с низкой численностью и требуют трудоёмки. Проточная цитометрия и флуоресцентные анализы не позволяют точно отражать клиренс белков, поскольку фторофоры могут сохраняться после деградации сопряжённого^{белка 19}, тем самым отделяя флуоресцентный сигнал от реальной судьбы интересующего белка. В совокупности эти ограничения оставляют критический пробел: ни один существующий метод одновременно не обеспечивает чувствительность, временное разрешение и масштабируемость, необходимые для количественного отслеживания динамики очистки тау. Таким образом, одним из основных препятствий для понимания динамики обработки тау в микроглии является отсутствие количественных, временно разрешенных и высокопроизводительных анализов для измерения клиренса тау в живых клетках.

Чтобы решить проблему отсутствия количественной платформы для мониторинга динамики живого тау, мы разработали чувствительный люминесцентный анализ, который можно использовать для обнаружения внутриклеточной динамики белков тау. Этот подход использует систему комплементации на основе сплит-люциферазы, при которой небольшой пептидный метка (High Affinity Binary Technology или HiBiT) сливается с тау, что позволяет проводить кинетические измерения в живых клетках. При взаимодействии со своим комплементарным связывающим партнёром (Large Binary Technology или LgBiT) отмеченный белок восстанавливает активный фермент люциферазы, генерируя количественный биолюминесцентный^сигнал 20,21,22. Этот люминесцентный сигнал обеспечивает прямое, чувствительное измерение содержания белка, позволяя динамически отслеживать изменения внутриклеточных уровней со временем. В результате люминесценция может использоваться как надёжный репортер присутствия или потери белка, как в случае внутриклеточного разложения. В совокупности эта платформа позволяет точно, временно разрешённое измерение обработки тау и предлагает широко применимую стратегию изучения оборота белков.

Протокол

Все клеточные эксперименты проводились в соответствующей лаборатории уровня биобезопасности 2, одобренной Службой охраны окружающей среды и здоровья Университета Массачусетса в Амхерсте.

1. Экспрессия, очистка и удаление эндотоксинов белка Tau-SLP

1. Добавьте пептид сплит-люциферазы или тег SLP (VSGWRLFKKIS) к конструкции Tau для создания метированной конструкции (Tau-SLP) с использованием стандартных методов клонирования, таких как сборка^{Gibson 23}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Комплементация метки сплит-люциферазного пептида создаёт надёжный сигнал при размещении либо на C-терминале, либо на N-терминале, либо во внутренних областях 2N4R^{Tau 24}.
2. Экспрессируйте и очищайте Tau-SLP с использованием ранее описанных^{методов 25,26} и обеспечивайте чистоту с помощью SDS-PAGE и иммуноблотирования.
3. Для применения с микроглиальными клетками следует опубликованным протоколам для удаления бактериального эндотоксина после очистки Tau-SLP с целью ограничения смешанной^{реактивности 27}.
4. Количественно определите концентрацию белка Tau-SLP с помощью стандартного анализа бицинхониновой кислоты (BCA) или анализа^{Брэдфорда 28,29}.
5. Если желаете, агрегируйте Tau-SLP по ранее описанным^{протоколам 24}.
6. Проверить функциональную люминесценцию Tau-SLP, сгенерировав стандартную кривую с использованием коммерчески доступного субстрата люциферазы и комплементационного реагента, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).

2. Культура микроглии (iTF-Microglia) из iPSC

1. Культивировать микроглиальные клетки в 5%_CO2 при 37 °C в соответствующей культурной среде.
2. Дифференцировать индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (iPSC), содержащую шесть транскрипционных факторов, индуцируемых доксициклином, для образования клетки, похожей на микроглию (индуцированную транскрипционно-факторную микроглию или iTF-Microglia), используя валидированный протокол³⁰ (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ не ограничивается iTF-Microglia и может использоваться с любой клеточной линией. Оптимизация времени зазора может потребоваться при работе с другими ячейковыми линиями.

3. Анализ очистки тау

1. В пластину с 24 лунками пластинчатые ячейки плотностью 1 x 10⁵ ячеек на колодцу, в тройном экземпляре в каждом состоянии, с культурной средой (250 мкл) и инкубируют ночью при 37 °C и 5%_CO2 (рисунок 1A).
2. Удалите культурную среду, промыйте клетки один раз PBS (250 мкл) и замените на 250 мкл культурную среду.
3. Для измерения временного клиренса Tau-SLP подвергайте клетки воздействию Tau-SLP поэтапно, чтобы все скважины были собраны одновременно и различались только по времени очистки. Например, для групп зачистки 0, 2 и 4 часа добавьте среды с 100 нМ Tau-SLP сначала к группе 4 h, затем 1 час позже к группе 2 h и, наконец, на 1 час позже к группе 0 h (см. рисунок 1B для рекомендаций по времени). После завершения окончательного периода внутренней обработки все скважины проходят одинаковый период воздействия Tau-SLP, но различаются только по длительности очистки (см. рисунок 1B).
4. Включите скважины, не получающие обработку Tau-SLP для фонового вычитания (рисунок 1C).
5. В конце периода интернализации удалите среду, содержащую Tau-SLP. Промыйте клетки трижды PBS, чтобы удалить внеклеточную Tau-SLP, и замените на культурную среду без Tau-SLP.
6. Инкубировать клетки в течение назначенного периода очистки (рисунок 1A). Группа 0 часа очистки, собранная сразу после периода внутренней обработки, представляет общее количество внутренне изнурённого Tau-SLP в начале фазы очистки.
7. Соблюдая все точки времени очистки, удалите материалы из скважин и промывайте 250 мкл PBS.
8. Обрабатывайте каждую температуру 250 мкл Trypsin-EDTA 0,25% в течение 5 минут при 37 °C. Этот этап удаляет поверхностно связанный тау для обеспечения отражения люминесценции внутренне зажатого Tau-SLP. Нейтрализуйте каждую яме ингибитором трипсина по 250 мкл (5 мг/мл).
9. Каждую скважину соберите в правильно маркированную микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл и гранулы с помощью центрифугации (500 x г, 5 мин).
10. Подготовьте соответствующее количество лизисного буфера с субстратом люциферазы и комплементационными компонентами (см. Таблицу материалов; 50 мкл x # скважин + 10%).
11. Удалите каждый супернатант с помощью аспирационной пипетки и ре-суспендуйте клеточную гранулу в 50 мкл лизисного буфера, содержащего субстрат люциферазы и компоненты комплемента. Это приведёт к созданию комплекса комплементации сплит-люциферазы и люминесценции (рисунок 1D).
12. Перенесите лизированные клетки на белую пластину с половинным объёмом и 96 ячеек.
13. Перед чтением считывают люминесценцию на считывателе микропластин с орбитальными колебаниями в течение 10 секунд при комнатной температуре (~23 °C), чтобы обеспечить полный лиз клеточных гранул.
14. Определите нормированное количество Tau-SLP, сначала вычитая среднее значение люминесценции, полученное из скважин, не подвергшихся воздействию Tau-SLP. Нормализуйте каждое значение до среднего фонового вычитаемого сигнала группы зазора 0 h.
15. График нормализовал численность Tau-SLP как функцию времени очистки. Постепенное снижение люминесценции указывает на уменьшение внутриклеточного количества Tau-SLP и интерпретируется как клиренс Tau-SLP, тогда как стабильные значения люминесценции указывают на нарушение или задержку клиренса. Рассчитайте процент клиренса как: % Клиренс = [1 − (RLUt / RLUt = 0)] x 100.

Результаты

Используя этот чувствительный люминесцентный анализ, внутриклеточное количество Tau-SLP можно было отслеживать со временем после синхронизированного периода поглощения в микроглии, полученной от iPSC, человека. После промывки Tau-SLP люминесценция постепенно снижалась, что соответствует внутриклеточному клиренсу Tau-SLP. Эта платформа была достаточно чувствительна для выявления различий в обращении с мономерными и фибриллярными видами Tau-SLP микроглией. Мономерный Tau-SLP был полностью очищен в iTF-Microglia в течение 60 минут, тогда как фибриллярный Tau-SLP сохранялся более 240 минут (рисунок 2A). Кроме того, мы проводили анализ с мутантным тау (например, N279K) для оценки кинетики клиренса и обнаружили, что TauN279K-SLP демонстрирует значительно снижение кинетики клиренса всего за короткие моменты (15 мин) (рисунок 2B). Эти результаты свидетельствуют о том, что наблюдаемое разрушение может быть заметно только благодаря высокой чувствительности этого анализа. Мы провели эксперимент по деградации Tau-SLP с использованием малой молекулы L-лейцил-L-лейцинового метилэфира (LLOMe) для подтверждения лизосомного вовлечения. LLOMe — это субстрат катепсина C, который проникает в лизосомные мембраны, нарушая лизосомную^{активность 31}. При обработке LLOMe мы наблюдали значительное повышение устойчивого уровня Tau-SLP при t=0 (рисунок 3A) и значительно снижение скорости деградации (рисунок 3B) при четырёхкратном увеличении Tau-SLP после 60 минут очистки. Наконец, мы провели клиренс-тест Tau-SLP в нейронах, полученных на iPSC, чтобы подтвердить совместимость анализов между типами клеток. Здесь мы обнаружили, что нейроны, полученные от iPSC, имеют сниженную кинетику клиренса как для мономерных (рисунок 4A), так и для фибрилловых форм (рисунок 4B) Tau-SLP. Особенно примечательно, что уровень фибриллы Tau-SLP остаётся стабильным на уровне ~100% на протяжении 240 минут зазора, тогда как за тот же период уровень фибриллы Tau-SLP в iTF-Microglia упал ниже 50%. Эти результаты показывают, что наша платформа комплементации на основе сплит-люциферазы обеспечивает надёжное и надежное обнаружение внутриклеточного эндолизосомного клиренса Tau-SLP и демонстрирует высокоадаптивную конструкцию анализа, которая может применяться к множеству других белков или типов клеток.

Рисунок 1: Репрезентативный экспериментальный дизайн разрешительного теста Tau-SLP. (A) Репрезентативное изображение iTF-Microglia, используемое для этого анализа (шкала = 100 мкм) (B) Человеческая микроглия (iTF-Microglia) подвергается воздействию рекомбинантного 2N4R-SLP поэтапно, что обеспечивает надёжное обнаружение на основе люминесценции. После 1-часовой инкубации внеклеточный тау удаляется средством обмена средами, а клетки промываются PBS. Клетки сохраняются в базальных средах в течение соответствующего периода очистки (0, 2, 2, 4 часа) перед сбором. В конечной точке клетки лизируют и измеряют люминесценцию. (C) Предлагаемая конструкция пластины для измерения зазора Tau-SLP, сравнивая деградацию мономерных и фибриллярных. (D) Белок Tau-SLP внутренне внедряется в клетки и направляется к лизосомному разложению. Добавление LgBiT даёт количественный анализ количества Tau-SLP, оставшегося в клетке путём комплементации и производства люминесценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: iTF-Microglia прозрачный внеклеточный Tau-SLP. (A) iTF-Microglia подвергались воздействию мономерного Tau-SLP (100 нМ) или фибриллярного Tau-SLP (50 нМ), образцы нормализовались до соответствующих начальных поглощений (t = 0; 100%) и к клеткам, не подвергающимся воздействию Tau-SLP (0%) (среднее ± SD; n = 9 по трем независимым дифференциациям). (B) iTF-Microglia инкубировали с помощью мономерных Tau-SLP или TauN279K-SLP (100 нМ), а образцы нормализовались до соответствующих начальных поглощений (t = 0; 100%) и клеток, не подвергавшихся воздействию Tau-SLP (0%) (среднее ± SD; n ≥ 7 из трёх независимых дифференциаций; ∗ p < 0,05 с использованием непарного t-теста Уэлча). Данные перепечатаны из Шульца и др., 2025²⁴ и использованы по лицензии Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Лизосомное торможение ухудшает клиренс Tau-SLP. (A) Лечение лизосомным ингибитором L-лейцил-L-лейцинового метилэфира (LLOMe) с концентрацией 1 мМ увеличивало начальное поглощение Tau-SLP (t = 0) в клетках нейроглиомы H4 (среднее ± SD; n = 9 независимых культур; ∗ p < 0,05 с использованием непарного t-теста Уэлча). (B) Обработка LLOMe (1 мМ) в течение 24 часов увеличила % нормализованного Tau-SLP RLU после 60 минут зазора (t = 60 мин) по сравнению с автомобилем (DMSO). Люминесцентный сигнал нормализуется до соответствующих начальных уровней поглощения (100%) и клеток, не подвергавшихся воздействию Tau-SLP (0%) (средние ± SD; n = 9 независимых культур; ∗∗∗∗ p < 0,0001, ∗ p < 0,05 с использованием непарного t-теста Уэлча). Данные перепечатаны из Шульца и др., 2025²⁴ и использованы по лицензии Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: iTF-Microglia и iNeurons демонстрируют различия в клиренсе Tau-SLP. (A) iTF-Microglia или iNeurons инкубировали с мономерным Tau-SLP (100 нМ), образцы нормализовались до соответствующих начальных поглощений (t=0; 100%), а клетки, не подвергавшиеся воздействию Tau-SLP (0%) (средне±SD; n ≥ 6 на основе двух-трёх независимых дифференциаций; ∗∗ p < 0,01, ∗∗∗∗ p < 0,0001 с использованием двунаправленной ANOVA; время: F(1, 28) = 7,489, p = 0,0107; тип клетки: F(1, 28) = 46,61, p < 0,0001; взаимодействие: F(1, 28) = 3,229, p = 0,0831; Тест множественных сравнений Сидака, p-значения указаны на рисунке, значения t=0 показаны для справки, но были исключены из статистического анализа. (B) iTF-Microglia или iNeurons инкубировали фибрилларными Tau-SLP (50 нМ), образцы нормализовались до соответствующих начальных поглощений (t=0; 100%), а клетки, не подвергавшиеся воздействию Tau-SLP (0%) (средне±SD; n ≥ 6 — от двух до трёх независимых дифференцировок; ∗∗ p < 0,01, ∗∗∗∗ p < 0,0001 с использованием двунаправленной ANOVA; время: F(1, 26) = 0,3888, p = 0,5384; тип клетки: F(1, 26) = 43,09, p < 0,0001; взаимодействие: F(1, 26) = 1,209, p = 0,2816; Тест множественных сравнений Сидака, p-значения указаны на рисунке, значения t=0 показаны для справки, но были исключены из статистического анализа. Данные перепечатаны из Шульца и др., 2025²⁴ и использованы по лицензии Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Этот анализ предоставляет масштабируемую и количественную платформу для измерения внеклеточного клиренса Tau-SLP с помощью микроглии с высокой чувствительностью и временным разрешением. В отличие от традиционных методов на основе визуализации, которые часто требуют трудоёмкой обработки образцов и ограничены по пропускной способности и временному отбору, эта система на основе люминесценции позволяет напрямую, на популяционном уровне количественно оценивать обработку тау в формате микропластин. Полученный показатель обеспечивает количественное измерение клиренса Tau-SLP после воздействия внеклеточного тау. Поскольку измерения можно многократно получать на нескольких временных точках и при более длинных инкубационных периодах, анализ позволяет проводить высокопроизводительный, кинетически разрешённый анализ динамики захвата и очистки тау. Кроме того, изменения люминесценции со временем соответствуют изменениям внутриклеточного количества Tau-SLP, но не различают трафик, деградацию или секрецию без комплементарных подходов. Хотя маркировка Tau-SLP не повлияла существенно на поглощение или агрегацию тау в нашем сопутствующем^{исследовании 24}, экзогенные метки могут влиять на поведение других белков. Поэтому результаты анализов следует дополнять с помощью ортогональных подходов и сравнивать с немаркированными препаратами тау, где это возможно. Дополнительным ограничением является то, что этот анализ использует рекомбинантные виды тау-SLP, а не эндогенные тау или патологические агрегаты тау, полученные от пациента. Хотя рекомбинантный тау 2N4R обеспечивает воспроизводимый экспериментальный субстрат, он не полностью воспроизводит эндогенную гетерогенность (то есть посттрансляционные модификации) видов тау, изолированных из мозга пациентов. Существует множество протоколов для in vitro фосфорилирования рекомбинантного тау-белка, которые легко могут быть интегрированы в этот рабочий процесс. Эта платформа также может быть адаптирована для изучения эндогенного тау; для этого потребуется генная инженерия для включения последовательности меток SLP в локусе тау (MAPT).

Важно, что интерпретация снижения сигнала как деградации зависит от эффективного удаления внеклеточного и поверхностно связанного тау, например, с помощью трипсинизации или эквивалентных этапов стриппинга. Ложноотрицательные результаты могут возникнуть, если эффективное удаление не достигнуто. Также возможны кажущиеся потери сигнала, которые интерпретируются как ложноположительный результат деградации тау. Это может возникнуть из-за отсоединения или гибели клеток, секреции Tau-SLP или протеолитического расщепления, которое отделяет SLP от тау без разложения белка. Соответственно, снижение люминесценции следует интерпретировать как уменьшение внутриклеточного количества Tau-SLP, а не как прямые измерения разложения лизосом. Для более точного приписывания изменений сигнала деградации лизосомы рекомендуются ортогональные стратегии валидации. К ним могут относиться фармакологические нарушения лизосомной функции, такие как лечение бафиломицином A1 или LLOMe (рисунок 3), а также экспериментальные схемы импульсного погона для определения кинетики поглощения и деградации.

Гибкость этого анализа делает его отлично подходящим для изучения механизмов, регулирующих поглощение тау, внутриклеточную торговлю и деградацию, а также для скрининга фармакологических или генетических модуляторов клиренса тау в клеточных системах человека. Хотя платформа демонстрируется здесь на микроглиях, полученных из iPSC, она легко адаптируется к другим типам клеток (рисунок 4), что позволяет широко применяться в различных моделях биологии тау и нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера и другие первичные и вторичные тауопатии. Поскольку этот анализ основан на внеклеточном воздействии Tau-SLP и люминесценционном обнаружении, он должен быть легко адаптирован к астроцитам, олигодендроцитам или широко используемым клеточным линиям, хотя может потребоваться оптимизация условий поглощения. В совокупности этот подход предоставляет мощный инструмент для анализа клеточных путей, участвующих в протеостазе, и для продвижения механистического понимания нейродегенеративных заболеваний.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Accutase	Thermo Scientific	A1110501
Конические стерильные полипропиленовые центрифужные пробирки	Fisher Scientific	12-565-268
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free	Corning	356231
DMEM/F-12, HEPES	Thermo Scientific	11330057
Доксициклин	Clontech	631311
DPBS	Thermo Scientific	14-190-250
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061
Графическое ПО	GraphPad Prism (или аналог)	n/a
Human GM-CSF	Thermo Scientific	300-03
KnockOut DMEM	Thermo Scientific	10829018
Люминесцентный пластинковый анализатор	SpectraMax i3x (или аналог) - Molecular Devices	n/a
Микроцентрифужные пробирки	Fisher Scientific	02-682-002
Микропластины, 96 лунок, PS, половина поля, белые	Greiner	675075
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
Nano-Glo HiBiT Lytic Detection System	Promega	N3030
Poly-L-Lysine hydrobromide	Fisher Scientific	ICN15017750
Рекомбинантный человеческий IL-34	Thermo Scientific	200-34
Рекомбинантный человеческий M-CSF	Thermo Scientific	300-25
Рекомбинантный человеческий TGF-β1	Thermo Scientific	100-21C
Поверхностно обработанные стерильные пластинки для культуры тканей	Fisher Scientific	FB012927
Tau-HiBiT protein	In house	n/a	Белок Тау с пептидным тегом VSGWRLFKKIS
Ингибитор трипсина	Sigma Aldrich	T9128
Trypsin-EDTA	Thermo Scientific	5-200-072
Y-27632 dihydrochloride	Bio-techne	1254