Эффективный протокол разведения и микроинъекции для генетической модификации конюшней мухи Stomoxys calcitrans

Summary

Этот протокол описывает надёжный метод микроинъекции эмбриона для интеграции чужеродного генетического материала в стабильный геном мухи, систему флуоресцентного скрининга для мониторинга послеинъекного развития эмбриона и субстрат для выращивания личинок из агара желтка, добавленного активированным углётом, инокуленного Escherichia coli , который поддерживает развитие от яйца до взрослой особи.

Abstract

Конюшнические мухи — это кровопитательные вредители скота, домашних животных и людей, и встречаются на всех континентах, кроме Антарктиды. Болезненные укусы как у самцов, так и у самок вызывают стрессовое поведение у скота, что приводит к потере веса и значительным экономическим потерям для производителей. И самцы, и самки конюшних мух являются обязательными кровопитающимися, что представляет собой сложность для стерильных методов борьбы с насекомыми и других методов борьбы с вредителями, требующих массового выпуска самцов. Текущие стабильные стратегии борьбы с мухами часто не обеспечивают достаточного контроля популяций мух. Хотя было разработано множество методов генетической манипуляции для внесения экзогенного генетического материала или индуцирования генных нокаутов для комаров, дрозофил и других модельных групп насекомых, методы генетической трансформации стабильных мух остаются ограниченными. Этот протокол описывает надёжный и усовершенствованный подход к введению чужеродного генетического материала в стабильных мух с использованием гиперактивного варианта транспозазы piggyBac и нового твердого среды для разведения личинок, поддерживающего восстановление, вылупление, кормление и флуоресцентный скрининг после эмбриональной микроинъекции.

Introduction

Конюшнические мухи (Stomoxys calcitrans L., 1758) являются экономически важными вредителями и переносчиками болезней для^{скота 1, 2, 3}и имеют космополитичное распространение по всему миру. Интегрированные стратегии борьбы с вредителями (IPM) часто не способны адекватно контролировать стабильные популяции мух ^2,3, что приводит к ежегодным потерям, оцениваемым в более 2 миллиардов долларов США только в Соединённых Штатах³. Кроме того, устойчивость к инсектицидам зафиксирована в стабильных популяциях мух в Европе ^4,5, а также в Соединённых Штатах⁶. В результате генетические методы контроля, такие как стерильная техника насекомых (SIT) и системы генного драйва, являются желательными дополнениями к традиционным программам IPM.

Предыдущие попытки разработать методы генетического контроля у стабильных мух, включая генерацию генетических штаммов для SIT, основывались на селективном разведении и радиационной^{транслокации 7,8}. Эти подходы трудоёмки и ограничены нетрансгенными модификациями. Впоследствии О'Брохта и др.⁹ показало, что использование системы транспозазы Hermes способно интегрировать трансгены в S. calcitrans; однако протокол показал низкую эффективность трансформации: примерно 0,11% введённых эмбрионов давали трансгенное потомство, а также слабую экспрессию маркера усиленного зелёного флуоресцентного белка (eGFP) под контролем экзогенного^{промотора 9}.

Другие методы генетической манипуляции, включая системы CRISPR-Cas, пока не получили широкого распространения у стабильных мух, отчасти из-за трудностей проникновения в устойчивый хорион. Твёрдый внешний хорион сопоставим с характером других мускулистых мух^{10, 11}. Попытки инъекции через хорион с помощью кварцевых игл или удаления хориона с помощью двусторонней клеевой ленты оказались безуспешными, что потребовало обработки окисляющим раствором (3% натриевого гипохлорита, NaOCl), что снижает скорость вылупления яиц.

Стабильных мушек можно поддерживать длительно в лабораторных условиях, а незрелые стадии обычно выращиваются в ферментированных целлюлозных субстратах, таких как древесная щепка, пшеничные отруби или солома, дополненные источниками азота, включая белоковые добавки телёнка или рыбные^{хлопья 12}. Однако эти субстраты имеют ряд недостатков при выращивании микроинъекционных эмбрионов. Их непрозрачность и высокая автофлуоресценция затрудняют идентификацию личинок с положительным GFP после вылупления и проникания в субстрат. Кроме того, хотя для выживания личинок требуется некоторое присутствие бактерий^, ферментированные среды создают непредсказуемые бактериальные и грибковые сообщества, которые могут повредить или поглотить эмбрионы до вылупления. Эти ограничения препятствовали восстановлению трансформированных личинок с использованием описанных ранее методов инъекций и^{выращивания 9}, что подчёркивает необходимость более надёжного протокола инъекций, который также позволяет проводить флуоресцентный скрининг на протяжении всего развития.

Здесь представлен воспроизводимый протокол микроинъекций, который включает улучшения в селекции транспозазы, методологии инъекций, а также в скрининге и среде выращивания. Эти модификации способствуют разработке генетически модифицированных стабильных мух для применения, включая генетические половые штаммы для SIT, генные драйвы и генные нокауты, опосредованные CRISPR-Cas. Ключевые улучшения включают использование гиперактивной piggyBac^{транспозазы 14} под контролем стабильного промотора белка теплового шока мухи (hsp)83, высушку эмбриона для минимизации потери ооплазмы после инъекции, а также удаление клейкой ленты и галоуглеродного масла во время инъекции эмбриона.

Восстановление инъекционных эмбрионов было дополнительно улучшено за счёт замены массовых материалов для выращивания на плоские, пигментированные агарные пластины, инокуленные газоном Escherichia coli. Эта формулировка агара обладает двумя основными преимуществами. Во-первых, он обеспечивает предсказуемый моногенный бактериальный источник пищи для развития личинок. Во-вторых, он обеспечивает высококонтрастный, низко-автофлуоресцентный фон, что облегчает наблюдение морфологии, развития и экспрессии GFP у личинок первого поколения (G0). Домашние мухи и стабильные мухи развиваются и окукливаются нормально на агарных пластинах, инокуленных E. coli, на основе желтка^13,15. Формулировка, описанная здесь, содержит порошок активированного угля как нереактивную, безопасную для пищи добавку для дальнейшего снижения фоновой флуоресценции.

Protocol

Все эксперименты и операции проводились с одобрения Институционального комитета по биобезопасности Техасского университета A&M (протокол IBC2019-081). Реагенты, химикаты и инструменты, используемые в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов.

1. Выращивание мух для производства яиц

1. Подготовка взрослых клеток
   1. Установите термостат камеры инкубатора на 28°C и смешайте 3 кг хлорида натрия с ~5 литрами водопроводной воды в 10-литровой кастрюле, растворив ~50% соли.
   2. Поставьте этот открытый рассол на дно камеры инкубатора, чтобы влажность оставалась около 80%. Поддерживайте цикл 16:8 день и ночь в камере или комнате.
   3. Выстилайте днище клеток для насекомых (30 x 30 x 30 см клетки из нержавеющей и алюминиевой сетки) двумя слоями бумажных полотенец и положите на слой слоя бумажных полотенец одноразовый стакан для приправ объёмом 45 мл с гранулированным столовым сахаром (рисунок 1A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Бумажные полотенца помогают впитывать мухи, а сахар служит источником пищи перед кормлением кровью.
   4. Наполните стакан Griffin объемом 250 мл примерно 100 мл водопроводной воды комнатной температуры и упакуйте в воду квадрат чёрной хлопковой ткани размером 20 см x 20 см (вырезанной из простой чёрной наволочки или простыней) до тех пор, пока ткань не смочится. Отрегулируйте чёрную ткань так, чтобы её края выходили на 1-2 см за край колбы (рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта влажная ткань обеспечивает как жидкую воду, так и поверхность для откладки яиц для взрослых мух. Гибель может произойти быстро, если взрослые не имеют доступа к источнику влаги.
   5. Переложите 500–1 500 стабильных куколок мух в небольшую тарелку или стакан и поместите их в клетку насекомых. Поместите взрослую клетку в влажную камеру для выращивания (шаг 1.1.1) и ежедневно следите за эклозией. После выхода взрослых особей начните ежедневно кормить цитированной бычьей кровью (раздел 1.2).
2. Кормление взрослых мух
   1. Приготовьте цитратную бычью кровь, добавив финальную концентрацию 10,9 мМ тринатрия цитрат дигидрата к свежесобранной бычьей крови.
   2. Кратко подвесьте ~12,8 грамма цитратной соли в минимальном объёме деионизированной воды и добавьте до 4 литров крови, собранной на местной бойне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контейнеры с кровью должны иметь крышки с винтовой крышкой (например, квадратные, с широким горлом, 4-литровые бутылки) и тщательно очищаться тёплым мылом и водой перед использованием. На бойне избегайте сбора первого ~1 литра бычьей крови от забитого животного, чтобы минимизировать загрязнение шерстью, потом, грязью и другими коагулянтами.
   3. Замораживайте цитированную бычью кровь в 200 мл аликвотов и размораживайте по необходимости, храня размораживаемые аликвоты в холодильнике при 4°C до недели.
   4. Подавайте ~40 мл крови комнатной температуры на каждую 600 мух в каждую взрослую клетку.
   5. Кровь может подаваться в контейнере для приправ или стакане, а в сосуд следует вставить сложенную нестерильную ватную губку для отведения крови. Перемешайте фитиль до полного насыщения хлопка и вставьте его в клетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь следует менять ежедневно, начиная с 24 часов после эклозии.
3. Коллекция яиц
   1. Когда яйца появятся на чёрной хлопковой ткани, снимите ткань с стакана и помойте яйца в отдельном неглубоком пластиковом контейнере объемом ~700 мл с помощью бутылки для мытья (рисунок 2A). Яйцекладка обычно происходит, когда мухам 7-10 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте кровяные чашки на наличие яиц и соберите все случайные яйца, которые могут там отложиться.
   2. Собирайте яйца на фильтрующей бумаге с помощью вакуумной фильтрации. Это делается путем размещения черной фильтрующей бумаги в воронке Бухнера, применения вакуума и выливания яиц из шага 1.3.1 поверх установки.
   3. Затем переместите яйца в градуированный цилиндр или градуированную микроцентрифугную трубку объемом 1,7 мл с помощью бутылки для мытья и запишите объем собранных яиц (рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте длительного погружения яиц в воду, так как смертность начинает увеличиваться через ~10 минут после погружения.
4. Подготовка массовой личиночной среды
   1. Сбор материалов для массовых личиночных сред (рисунок 3A), как показано в таблице 1.
   2. В колбу на 1000 мл добавьте белоковую добавку телёнка и всю водопроводную воду. Дайте увлажниться на ночь при комнатной температуре.
   3. Добавьте пшеничные отруби и вермикулит в отдельную большую ёмкость для смешивания.
   4. После ночного увлажнения тщательно перемешайте увлажнённую добавку для разбиения комков, затем вылейте смесь в контейнер с пшеничными отрубями и вермикулитом. Тщательно перемешайте до однородной формы, пока вся пшеничная отрубь не будет покрыта суспензией для телёночных добавок.
   5. Переместите массовую среду в полипропиленовый контейнер для хранения пищи в слое глубиной ~8 см, покрывающий всю дно контейнера (рисунок 3B).
   6. Добавьте ~1 000 эмбрионов (примерно 0,2 мл яйцеклеток на 2,2 л объёмной среды) путем сбора эмбрионов с помощью .вакуумная фильтрация на круглой фильтрующей бумаге диаметром 90 мм, а затем размещение фильтрующей бумаги с яйцами, лицевой стороной вниз, в центр медиаконтейнера (рисунок 3B, C).
   7. Накройте фильтрующую бумагу ~1 см материала для удержания влаги (рисунок 3C) и накройте контейнер огромным прямоугольником из чёрной хлопковой ткани, с 5 см нависающей хлопковой ткани за край контейнера.
   8. Вырежьте большое отверстие (~12 см в диаметре) в крышке контейнера с продуктами для газообмена и защёлкните крышку на контейнер для медиа, зажав чёрную хлопковую ткань между контейнером и крышкой (рисунок 3D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это служит прокладкой, предотвращая зазор между крышками и контейнером задерживать личинки^{первого возраста} в каплях конденсата.
   9. Поместите готовый контейнер в камеру для выращивания взрослых до куколки и контролируйте развитие личинок (рисунок 4) (окукление происходит в ~10 дней в зависимости от температуры среды и плотности личинок).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тканевое покрытие должно быть достаточно тонким, чтобы предотвратить проход личинок первого возраста, но достаточно проницаемым, чтобы предотвратить образование конденсата на внутренних стенках медиаконтейнеров, которые могут захватывать и топить личинки.
5. Отделение куколок
   1. Снимите тканевое покрытие с куколочных контейнеров и соберите куколки ложкой или ложкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильные куколки мух выглядят как неподвижные красно-коричневые цилиндры длиной 4–7 мм, в отличие от подвижных желто-белых личинок. Куколки обычно скапливаются на внешней периферии стенок контейнера или на влажных, возвышенных местах в среднем контейнере, когда мухи начинают метаморфоз от личинок к куколкам и к взрослым особям.
   2. Выложите куколки 500–1 500 ~1 см глубиной на блюдо и поместите в новую чистую клетку, как описано в разделе 1.1, чтобы размножить следующее поколение.

Рисунок 1: Материалы для выращивания взрослых мух. (A) Клетка для выращивания взрослых мух с сахарозной чашкой (S) и чашкой для откладки яиц (O). (B) Чашка для откладки яиц, приготовленная из насыщенной водой чёрной хлопковой ткани, немного выходящей за край стакана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Сбор яиц. (A) Сбор яиц из яичной ткани с помощью бутылки для мытья. (B) Извлечение яиц вакуумной фильтрацией на бумагу с высоким контрастом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Материалы для массовых личиночных сред
Реагент	Масса (g)
Вода	900
Пшеничные отруби	230
Добавка для икрённых мышц	100
Вермикулит (крупный A4)	70
Материалы для растворов для дехорионации
Решение	Состав
Окисляющая ванна	3% гипохлорита натрия в деионизированной воде
Ванна для умывания	Раствор Triton X-100 0,02% в деионизированной воде
Полоскать	Деионизированная вода
Материалы для экранирования и выращивания пластин чёрного агара
Реагент	Масса (g)
Вода	500
Порошковые желтки	18
Активированный древесный уголь	4
Хлорид натрия	1

Таблица 1: Реагенты для массовой личиночной среды, растворы дехорионации и пластины чёрного агара. Реагенты, используемые для подготовки крупной личиночной среды для поддержания колонии, а также для состава растворов для ослабления и удаления хориона из стабильных эмбрионов мух, а также материалов, необходимых для подготовки 500 мл среды для фильтрации и выращивания чёрного агара.

Рисунок 3: Подготовка объёмной личинковой среды. (A) Материалы, используемые для подготовки личинковых сред: белоковая добавка телячки (CM), пшеничные отруби (WB), вермикулит (VM), контейнер для хранения (SC), крышка (L) и прокладка ткани (FG). (B) Тщательное смешивание компонентов среды. (C) Размещение фильтровой бумаги с яйцем (EP) лицевой стороной вниз на поверхность носителя и покрытие дополнительным материалом для предотвращения высыхания. (D) Установка уплотнения из хлопковой ткани между контейнером и крышкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Развитие личинок в массовых средах. Прозрачные контейнеры позволяют отслеживать развитие личинок и состояние среды. Личинки (L) видны на стенках контейнера, крышке и внутри среды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

2. Подготовка к инъекциям: дехорионация и высушка

1. Положите влажную чёрную хлопковую ткань в стакан, как описано в шаге 1.1.4, и перенесите её в клетку для взрослых на 25 минут для сбора яиц. Промывайте яйца на решете из нержавеющей стали 106 мкм с помощью бутылки для стирки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: За 25-минутный период сбора обычно получается примерно 400 яиц.
2. Дайте эмбрионам спокойно отдохнуть на решете ещё 30 минут.
3. Во время выдержки эмбрионов подготовьте по 150 мл растворов для окисления, промывания и промывания, описанных в разделе «Материалы для растворов для дехорионации» в таблице 1 (рисунок 5). Используйте достаточный объём, чтобы покрыть эмбрионы примерно 1 см раствора.
4. Погрузите решето с эмбрионами в окисляющую ванну на 2 минуты и аккуратно перемешайте эмбрионы с помощью пипетки Пастера (рисунок 6A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Многократное аспирирование и раздача раствора для создания кругового вихря помогает концентрировать эмбрионы в центре сита и предотвращает прилипывание свеже-дехорионированных эмбрионов к стенкам сита.
5. Снимите сито из окисляющей ванны и стирайте лишний раствор. Перенесите сито в раствор для промывания и перемешивайте аспирацией и отпускайте в течение 2 минут.
6. Перенесите решето, содержащее эмбрионы, в раствор для промывания и перемешивайте, как описано в шаге 2.4, в течение 2 минут. Удалите сито из раствора для промывания и смойте лишнюю воду.
7. Положите стерильный стеклянный покров на решето и под микроскопом для расщепления используйте кисть с тонким наконечником нейлоновой кисти для переноса эмбрионов (рисунок 6B) от сита к краю покрытия. Размещайте эмбрионы близко друг к другу, не позволяя им соприкоснуться, при этом более широкий задний столб будет обращён к краю покрытия. Избегайте изгиба, искажения или разрыва эмбрионов во время переноса.
8. Подготовьте камеру для высушки, накрыв дно колбы объёмом 1 л 100 мл осушителя сульфата кальция и запечатав колбу резиновым пробкой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После 24 часов равновесия камера высушивания обычно достигает относительной влажности <5% при 23 °C.
9. Удалите лишнюю воду из накладки и поместите на осушитель с дехорионированными эмбрионами. Запечатайте колбу резиновым пробком и высушите эмбрионы на 8 минут.
10. Снимите накладку из камеры высушивания и поместите его на стадию микроскопа под объективом 20× для микроинъекции.

Рисунок 5: Решения для дехорионации. Слева направо: решето из нержавеющей стали, окислительный раствор, раствор для промывания и раствор для промывания, используемые для дехорионации эмбрионов. Гипохлорит натрия поддерживается как 6% запасной раствор, защищённый от света, а Triton X-100 поддерживается как 10× стандартный раствор и разбавляется до конечной концентрации 0,02% перед использованием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Дехориона эмбриона. (A) Мягкая аспирация и раздача раствора создают вихрь, концентрирующий эмбрионы в центре сита и снижая адгезию к стенкам сита. (B) Дехорионированный эмбрион, появляющийся из полупрозрачного хориона после промывания. Передний полюс (более узкий конец) обычно выходит перед задним полюсом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

3. Микроинъекции

1. Извлекайте кварцевые микроинъекционные иглы из стеклянных капилляров с нитью 100 мм (I.D. 0,7 мм, O.D. 1.0 мм), используя параметры, указанные в таблице 2. Храните иглы в месте без пыли до использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Также могут использоваться боросиликатные иглы с похожей геометрией.
2. Подготовьте инъекционный буфер (0,1% с в/в фенол-красный раствор в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), pH 7,4) и фильтруйте-стерилизуйте через шприцовый фильтр толщиной 0,22 мкм.
3. Приготовьте 20 мкл инъекционной смеси, соединив по 10 мкг плазмиды помощника piggyBac и донорской плазмиды, которая содержит генетический груз между левым и правым инвертированными конечными повторами piggyBac, с 4 мкл буфера для инъекций. Разведите до конечной концентрации 500 нг/мкл с использованием воды без нуклеазы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вспомогательная плазмида включает 3,1 кб последовательность промоторов hsp83 выше стартового кодона HSP83 и гиперактивную кодирующую последовательность транспозазы piggyBac.
4. Переведите инъекционную смесь в шприцовый фильтр PTFE с малым объёмом 0,20 мкм и поместите фильтр в отверстие микроцентрифугной трубки объёмом 0,5 мл (рисунок 7A). Центрифугуйте при ≥11 000 x g в течение 10 минут или пока вся смесь не пройдёт через фильтр. Храните неиспользованную инъекционную смесь при -20 °C.
5. Заполните иглу для микроинъекции кварца примерно 2 мкл инъекционной смеси с помощью наконечника пипетки с микрогелем (рисунок 7B). Избегайте появления воздушных пузырьков во время загрузки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентируйте иглу для микроинъекции параллельно длинной оси эмбриона и сохраняйте нулевое горизонтальное и вертикальное смещение, чтобы минимизировать разрывы и сдвиг.
6. Аккуратно постукуйте кончиком иглы по краю стеклянного затвора, пока инъекционная смесь не пройдёт через кончик иглы (рисунок 7C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Постепенно ломайте кончик иглы, чтобы создать самое маленькое и острое отверстие, которое всё равно позволит проходить поток инъекции и смеси.
7. Вводите эмбрион через задний полюс сразу после высыхания, используя давление примерно 700 гПа и обратное давление 300 гПа.
8. Аккуратно проколите эмбрион и введите примерно одну десятую его объёма инъекционной смесью (рисунок 7D–F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизировать проникновение иглы для уменьшения нарушения вителлиновой мембраны и предотвращения потери ооплазмы при извлечении иглы.
9. Сразу после инъекции переложите накладку на чашку Петри, выстланную стерильной, увлажненной чёрной фильтрующей бумагой толщиной 90 мм, и инкубировать при комнатной температуре в течение 48 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Завершите все инъекции в течение 2 часов после откладки яиц, чтобы нацелиться на эмбрионы до синцитиальной стадии.
10. Осматривайте эмбрионы на вылупление каждые 12–16 часов. Перенесите недавно вылупившиеся личинки и стеклянную пластину на инокулированную и кондиционированную агарную пластину, подготовленную как описано в разделе 4.

Параметр	Жара	Fil	Вел	Дел	Тяни
Ценность	825	5	60	150	175

Таблица 2: Параметры вытягивания иглой . Параметры, используемые для получения кварцевых микроинъекционных игл.

Рисунок 7: Микроинъекция эмбриона. (A) Фильтрация инъекционной смеси с помощью фильтра шприца, встроенного в микроцентрифугную трубку объёмом 0,5 мл. (B) Загрузка фильтрованной инъекционной смеси в иглу для микроинъекции с использованием гелевой наконечника пипетки. (C) Конечная геометрия кварцевой микроинъекционной иглы. (D) Выравнивание иглы с задним полюсом эмбриона. (E) Проникновение поверхности эмбриона с минимизацией нарушения вителлиновой мембраны. (F) Введение примерно одной десятой объема эмбриона с последующим удалением иглы. Повышенная прозрачность указывает на смещение ооплазмы инъекционной смесью. Шкала = 400 мкм (D–F) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

4. Подготовка обработанной тарелки

1. Формулировка агаровой среды
   1. Подготовьте среду, описанную в разделе «Материалы для покрытия и выращивания пластин чёрного агара» таблицы 1, и автоклав на 15 минут при 121 °C. Залить агар при 40 °C или хранить при комнатной температуре, затем разогревать и разливать в чаши Петри диаметром 90 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Энергично покрутите, прежде чем вылить, чтобы снова суспензировать твёрдые частицы.
2. Инокуляция пластин
   1. Разбавьте 24-часовую культуру K12 Escherichia coli. до OD600 = 0,200 в бульоне Лурия-Бертани и насыпьте 200 мкл на охлаждённую, затвердевшую агарную тарелку. Равномерно распределите культуру с помощью стерильных стеклянных бусинок или стеклянного размазывателя и дайте пластине впитать избыточную влагу (рисунок 8A, B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте агарные тарелки в течение месяца после заливки или убрать их, чтобы обеспечить надёжный рост бактерий и личинок.
3. Кондиционирование пластин
   1. Сверните 6 × 6 см кусочков чёрной фильтрующей бумаги, чтобы создать 6-10 гофрированных гребней, и стерилизуйте с помощью выпечки или автоклава. Положите одну стерильную гофрированную фильтрующую бумагу асептически на инокуленную чашку Петри и смочите её несколькими каплями стерильной воды (рисунок 8C).
   2. Поверхностно стерилизуйте необработанные, неинъекционируемые личинки первого возраста дикого типа (WT) и перенесите 10 личинок на увлажнённую фильтрующую бумагу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте эмбрионы WT, погружая их в 10% отбеливатель (0,6% NaOCl) на 1 минуту, затем промывайте в стерильной деионизированной воде в течение 2 минут.
   3. Между крышкой и корпусом чашки Петри положите фильтровую бумагу толщиком 90 мм, чтобы она служила прокладкой.
   4. Дайте личинкам WT кондиционировать пластины в течение 24 часов перед добавлением инъекционных эмбрионов на стеклянные покрытия (рисунок 8C). Удалять личинки WT после вылупления первых введённых эмбрионов.

Рисунок 8: Подготовка агаровой пластины и восстановление после инъекций. (A) Инокуляция агарных пластин культурой Escherichia coli с OD600 = 0,2 с использованием стерильных стеклянных бусин. (B) Поглощение избыточной поверхностной влаги перед переносом эмбрионов. (C) Размещение фильтрующей бумаги диаметром 90 мм между крышкой и корпусом чашки Петри. (D) Скрининг личинок на флуоресцентные маркеры на кондиционированных агарных пластинах. Инъекционные эмбрионы извлекаются на деионизированной водой фильтрующей бумаге диаметром 90 мм, помещаемой в крышку перевёрнутой чашки Петри и инкубируемой в течение 48 часов перед передачей в скрининговые пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Results

С помощью этого протокола 431 стабильный эмбрион мухи был дехорионирован и введен донорской плазмидой piggyBac-Hsp83 и помощником Hsp83 при конечной концентрации 500 нг/мкл. Из 431 инъекционных эмбрионов 18 личинок ZsGreen-положительных (4,2%) и 8 Zs-отрицательных личинок (1,9%) вылупились через 48–76 часов после инъекции при скрининге на чёрных углеродных агарных пластинах (Таблица 3). В целом вылупилось 26 из 431 инъекционного эмбриона (6,0%), а 16 из 26 вылупившихся личинок дожили до взрослого возраста (61,5%).

Виды	Тип инъекции	Конструкция	# введён	ZsGreen(+) L1	ZsGreen(-) L1	ZsGreen(+) Куколки	ZsGreen(-) Куколки	ZsGreen(+) взрослые	ZsGreen(-) взрослые	# Взрослые особи, производящие потомство ZsGreen(+)
Stomoxys calcitrans	Введение транспозазой	Hsp83:hy-pBac (помощник, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (донор, 500 нг/ул)	226	5	8	5	6	3	6	1
Stomoxys calcitrans	Введение транспозазой	Hsp83:hy-pBac (помощник, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (донор, 500 нг/ул)	205	13	0	7	0	7	0	5

Таблица 3: Статистика инъекций. Показатели выживаемости, трансформации и восстановления после микроинъекции эмбриона.

Из 18 личинок G0, положительных на ZsGreen, 12 дожили до окукливания (66,7%), а 10 были закрыты во взрослом возрасте. Шесть взрослых, положительных на ZsGreen, (1,4% инъекционных эмбрионов, 60% оплодотворённых выживших с G0) произвели потомство с положительным ZsGreen. Эти потомки (рисунок 9A–E) были самоскрещены и поддерживали флуоресценцию в течение шести поколений на момент написания.

Из восьми ZsGreen-отрицательных личинок шесть дожили до взрослого возраста (75%). Ни один из взрослых особей, не обладающих флуоресцентными эффектами, не породил люминесцентного потомства.

Рисунок 9: Флуоресцентный скрининг трансгенных мух. (A) Сравнение личинок F1, экспрессирующих ZsGreen, и личинок WT. (B) Флуоресценция, видимая через кутикулу куколки, что позволяет проводить трансгенный скрининг на стадии куколки. (C,D) Сравнение трёх личинок и куколок, экспрессирующих ZsGreen, с тремя личинками и куколками WT (справа) при белом свете (C) и флуоресцентном освещении (D). (E) Взрослая трансгенная муха F1, экспрессирующая ZsGreen (слева) по сравнению со взрослой мухой WT (справа). Масштабные планки = 1 мм (A), 2 мм (B, E) и 3 мм (C, D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Генетическая трансформация немодельных видов насекомых остаётся основным узким местом в разработке и оценке стратегий генетического контроля за членистоногими вредителями и переносчиками.

Для стабильных мух описанный здесь протокол снижает время, ресурсы, труд и вариабельность, связанные с инъекцией и выращиванием мух G0 после микроинъекции эмбриона. Кроме того, использование скрининговых пластин для чёрного агара позволяет непосредственно наблюдать за развитием на протяжении всего жизненного цикла, облегчая выявление и коррекцию проблем, возникающих во время инъекций, восстановления и разведения личинок. Используя плазмидные конструкции, оценённые в этом исследовании, протокол сгенерировал трансгенные стабильные линии мух с меньшим количеством введённых эмбрионов, чем ранее сообщаемые^{методы 9}. Хотя это выходит за рамки данной статьи о методах, подтверждение и локализация сайтов вставки трансгенов могут быть проведены с использованием устоявшихся методов, таких как обратная ПЦР и ПЦР со сплинкереттом.

Эффективный протокол инъекции также способствует будущим исследованиям в области функциональной геномики, включая характеристику промоторов с помощью флуоресцентных репортеров; компетентность векторов с помощью обратногенетического анализа генов, связанных с передачей патогена; характеристика нуклеаз, включая оценку CRISPR-Cas9 и других программируемых нуклеаз у стабильных мух; исследования устойчивости к инсектицидам с помощью модификации кандидатных аллелей резистентности; а также исследования базовой биологии, включая гены, участвующие в кормлении кровью, спаривании и развитии. Наш протокол также устраняет необходимость в инъекциях эмбрионов с погружением в масло и в камерах с кислородом для восстановления эмбриона после инъекции и восстановления, как это было задокументировано в предыдущей литературе по трансформации Musca domestic и Lucilia cuprina piggyBac^16,17.

Для успешного трансгенеза критически важны несколько параметров. Время высушки эмбриона и инъекции особенно важны, поскольку плазмидная ДНК должна быть введена до клеточной формации, чтобы обеспечить её включение в клетки-предшественники зародышевой линии. Однако точное время образования синцития у стабильных эмбрионов мух остаётся неизвестным. Кроме того, скорость развития эмбриона зависит от температуры, и хронология развития стабильных эмбрионов мух при различных условиях окружающей среды не была полностью охарактеризована. Будущие исследования скоростей развития и эмбриогенеза стабильных лабораторных штаммов мух могут дать представление об оптимизации протоколов микроинъекции и трансформации, тем самым ещё больше повышая эффективность и воспроизводимость протоколов. Однако до тех пор определение оптимального окна инъекции остаётся методологическим ограничением, которое может повлиять на эффективность трансформации. При низкой выживаемости можно провести устранение неполадок, сравнивая выживаемость вылуплений и взрослых эмбрионов между необработанными, дехорионированными эмбрионами, эмбрионами, введенными фильтрующей стерилизацией PBS, и эмбрионов WT, выращиваемых на агарных пластинах. Предыдущая литература, описывающая трансформацию Musca домашняя , дала 14 интеграционных событий из 1668 инъекций (0,84% инъекций)¹⁶, а трансформация вредителя овец Lucilia cuprina установила 3 трансгенные линии примерно из 900 инъекций эмбрионов (0,33% инъекций)¹⁷, что указывает на стабильный протокол трансформации мух, описанный в этом протоколе (6 событий интеграции в 431 инъекции, 1,4% от инъекционных видов) обеспечивает повышение эффективности инъекции по сравнению с другими видами вредительных двукрылых в литературе.

Стабильный конститутивный промотор hsp83 у мухи обеспечивал устойчивую экспрессию ZsGreen на протяжении всего развития и поддерживал экспрессию гиперактивной piggyBac транспозазы на ранних этапах эмбриогенеза, тем самым улучшая видимость флуоресцентных маркеров и эффективность трансформации по сравнению с ранее сообщенным протоколом стабильной трансформации^{мух 9}. Помощная плазмида, использованная в этом исследовании, была получена путём субклонирования 3,1 кб геномной ДНК непосредственно выше стартового кодона hsp83 в минимальный плазмидный вектор выше гиперактивной последовательности кодирования транспозазы piggyBac. Соотношение вспомогательных плазмид к грузу было эмпирически установлено в 1:1 по массе и использовалось на протяжении всего исследования. Хотя дополнительные соотношения плазмид не оценивались, альтернативные соотношения также могут оказаться эффективными.

Описанные здесь улучшения могут быть применимы к протоколам трансгенеза для других членистоногих. Кроме того, система скрининга и выращивания на основе агара в настоящее время применяется для инъекции и скрининга эмбрионов чёрной мушки солдата (Hermetia illucens). Протокол может быть особенно полезен для трансгенеза у других мусцидных мух, включая Musca domestica и Haematobia irritans, благодаря схожей личиночной экологии и развитию в разлагающихся волокнистых субстратах. Использование агарных пластин, вакцинированных Escherichia coli, может предоставить практический подход к мониторингу после инъекций, одновременно позволяя исследователям оценивать развитие эмбриона, морфологию личинок, экспрессию маркеров, частоту вылупления и общее восстановление. Адаптация бактериального компонента среды к биологии целевого вида может дополнительно повысить полезность этого подхода для разработки и оптимизации протоколов трансгенеза.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L flask with rubber stopper (desiccation chamber)	VWR	214-1134	Дессикационная камера
Bacto Agar	Difco	281230	Агар для черных агар-пластин
Black pillowcases	Aisawate	3.45496E+11	Черная хлопковая ткань для коллекционных чашек яиц и фабричная прокладка для ячеек разведения личинок
Calcium sulfate desiccant	Drierite	21001	Дессикант для дессикационной камеры
Calf Manna Performance Supplement	Manna Pro	095668940010	Основной корм для личинок
Compound microscope	Leica Microsystems	DM750M	Инъекционный микроскоп
Dried Egg Yolks	Judee’s From Scratch	B098SP2LTV	Питательный источник для черных агар-пластин
E. coli	New England Biolabs	C2987H	Бактерии, используемые на черных агар-пластинах
Femtojet 4i microinjection pressure supply	Eppendorf	5252000021	Источник давления для микроинъекции
Fine-tipped nylon paintbrush	Transon	7.42298E+11	Перенос эмбрионов
Fire-polished quartz capillaries with filament, OD 1.0 mm, ID 0.70 mm, 10 cm length	World Precision Instruments	QF100-70-10	Капилляры для изготовления игл
Forceps	Fine Science tools	11251-20	Работа с образцами
Full height seive, 3” dia, No. 140 ASTM-E11 Standard test sieve (106 μm)	Cole-Parmer	UX-59987-24	Держит эмбрионы во время дехорионации
Germicidal Ultra Bleach (6% sodium hypochlorite)	Pure Bright	59647-21014	Раствор для отбеливания для удаления хориона
GladWare Family Size Food Storage Containers, XL 104 oz	Glad	012587701294	Контейнер для хранения основного корма для личинок
Grade 8613, 9cm Black qualitative filter papers	Ahlstrom	8613-0550	Сбор эмбрионов
LB Broth	BD Difco	DF0446-17-3	LB бульон для культуры E.coli
M60 zoom stereo dissecting microscope with Leica Ergo Tubes	Leica Microsystems	SP-M60-TS	Микроскоп для перемещения и выравнивания эмбрионов
Microloader tips 0.5-20 uL 100mm	Calibre Scientific	EPE 930001007	Используется для загрузки инъекционной смеси в иглы
Micromanipulator	Leica Microsystems	11520137	Микроманипуллятор для инъекции
Millex Syringe Filter, Hydrophilic PTFE, 0.2 μm	MilliporeSigma	SLLGR04NL	Используется для фильтрации инъекционной смеси
Nuclease-free water	Corning	46-000-CM	Буфер для инъекции
Organic coconut activated charcoal powder	Belle Chemical	B073BSNLJ3	Пигмент для черных агар-пластин
P-2000 Laser-based pipette puller	Sutter Instruments	P-2000/G	Устройство для изготовления игл из капилляров
PBS, pH 7.4	Gibco	10-010-023	Буфер для инъекции
Petri plates	VWR	391-0609	Петришки для агар-пластин черных яиц
Phenol red, CAS:143-74-8	Thermo scientific	B21710.09	Краситель для инъекции
Rubber stoppers	Stony Lab	NY-RubberStoppers-HI-5PK-#12	Прокладка дессикационной камеры
Soft wheat bran (soft red winter wheat) 50 lb	Siemer	55600050500000	Основной корм для личинок
Square Glass Coverslips, 18X18mm	Alkali Scientific	SM1818	Стеклянные крышки для микроинъекции
Stereo microscope fluorescent adapter	Nightsea	SFA-RB	Флуоресцентная лампа и фильтры для скрининга личинок
Sterile glass beads	VWR	1.04016.0500	Размещение бактерий на пластинах
Transfer Pipette Disposable 5mL	LabAid	BP1200	Мытье эмбрионов во время дехорионации
Triton X-100	Sigma-Aldritch	T8787-50ML	Дехорионация эмбрионов
Wash bottle	Safetyware	Z423335	Мытье эмбрионов с поверхностей