Трехмерная модель ангиогенеза на основе микроносителей с использованием эндотелиальных клеток вены пупочки

Краткое содержание

Этот протокол описывает трёхмерную модель ангиогенеза на основе микроносителей с использованием эндотелиальных клеток пуповиной вен. Анализ позволяет напрямую визуализировать прорастание эндотелиалов и формирование просветоподобной структуры, а также может применяться для изучения ангиогенных механизмов и терапевтических вмешательств.

Аннотация

Ангиогенез — это многоступенчатый биологический процесс, включающий активацию эндотелиальных клеток, миграцию, удлинение, образование просвета, ветвление и анастомоз. Традиционные двумерные системы культуры полезны для предварительной оценки лекарств, генов или условий культуры, но они недостаточно воспроизводят пространственную организацию эндотелиального морфогенеза в трёхмерном внеклеточном матриксе. Настоящий протокол описывает трёхмерный анализ ангиогенеза на основе микроносителей с использованием эндотелиальных клеток пуповиных вен человека (HUVEC). HUVEC сначала засеиваются на микроносительные шарики, содержащие химически связанный кислотно-денатурированный свиной коллаген типа I, а затем встраиваются в матрицу базальной мембраны. Затем сверху геля посеиваются слизистые фибробласти, обеспечивающие паракринную поддержку для прорастания эндотелий и формирования сосудистых структур. Культурная среда меняется каждые 2 дня, а поведение прорастания и ангиогенные фенотипы контролируются с помощью инвертированной микроскопии. При подходящих условиях культуры эндотелиальные ростки появляются в течение нескольких дней, за которыми формируются просветоподобные структуры и межпобеговые соединения. Этот метод предоставляет удобную и воспроизводимую платформу для in vitro исследований эндотелиального морфогенеза и может быть дополнительно применён для исследований генной обработки, фармакологического вмешательства и моделирования заболеваний.

Введение

Прорастание эндотелиума является ключевым событием ангиогенеза и включает появление, миграцию, пролиферацию и выравнивание эндотелиальных клеток из уже существующих сосудистых структур, за которым следует образование просвета и формирование взаимосвязанных сосудистых^{сетей 1,2}. Хотя традиционные двухмерные системы культуры и гелевые анализы на формировании трубок технически просты, их способность воспроизводить пространственное ремоделирование эндотелиальных клеток в трёхмерной^{микросреде 3,4} ограничены. Классический трёхмерный анализ прорастания на основе микроносителей (microcarrier beet) воспроизводит несколько стадий ангиогенеза in vitro, включая прорастание, удлинение, образование просвета и сборку сети, поэтому стал широко используемым методом для исследований ангиогенеза.

В настоящем протоколе устанавливается трёхмерная модель прорастания на основе бусинок с использованием нормальных эндотелиальных клеток вены пупочки человека. Основываясь на ранее опубликованных анализах прорастания эндотелиальных микроносителей^{бусинок 5,6,7}, этот метод сохраняет основную структуру покрытия эндотелиальных клеток на микроносительных шариках, встраивающихся в трёхмерную матрицу и культуру наложения фибробластов, при этом заменяя традиционный фибриновый гель на базальную мембрану для упрощения процедуры и облегчения рутинной визуализации. Матрица базальной мембраны была выбрана в этом модифицированном протоколе по ряду практических и биологических причин. Экспериментально она обеспечивает готовую к использованию трёхмерную матрицу, позволяющую быстро формировать гель, простое вложение шариков и удобное рутинное микроскопическое наблюдение без дополнительных этапов полимеризации, необходимых для приготовления фибринового геля. С биологической точки зрения матрица базальной мембраны содержит компоненты внеклеточного матрикса, которые поддерживают адгезию эндотелиальных клеток, миграцию, расширение проростков и формирование просветоподобной структуры. Поэтому эта модификация подходит для исследований, требующих прямой визуализации поведения прорастания эндотелиев, сравнения ангиогенных фенотипов и оценки фармакологических или генетических вмешательств в трёхмерной культурной среде. Однако, поскольку матрица базальной мембраны отличается от фибринового геля по составу матрицы, механическим свойствам, разлагаемости и биоактивным сигналам, данный анализ следует интерпретировать как модифицированную модель прорастания на основе микроносителей, а не как прямую замену классического анализа на основе фибрина. Эти матричные различия могут влиять на кинетику прорастания, стабильность просвета и морфологию сети, и должны учитываться при сравнении результатов в различных трёхмерных системах ангиогенеза. Эта модель подходит для наблюдения поведения эндотелиального прорастания в трёх измерениях и может быть дополнительно применена для изучения фармакологического вмешательства, манипуляций с генами и ангиогенных механизмов.

Протокол

Эндотелиальные клетки пуповины человека, используемые в этом протоколе, были выделены и культивированы из тканей пуповины человека, собранных в Департаменте акушерства Первой народной больницы провинции Юньнань. Письменное информированное согласие было получено от всех доноров перед сбором образцов. Все процедуры с использованием материалов, полученных от человека, были одобрены Комитетом по медицинской этике Первой народной больницы провинции Юньнань (одобрение No KHLL2023-KY198). Человеческие слизистые фибробласти (HOMF) были любезно предоставлены исследовательской группой доктора Цзэмэй Чжай в Аффилированной стоматологической больнице Медицинского университета Куньмина. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка клеток

1. Культивировать эндотелиальные клетки человеческой пуповины (HUVEC) в среде для роста эндотелиальных клеток, дополненных дополнительной сывороткой плода (FBS) до конечной концентрации 10% при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂. Клетки, используемые для анализа, должны быть свободны от загрязнения, демонстрировать стабильный рост и находиться в логарифмической фазе роста. Используйте клетки в проходах 4–6.
2. Культура человеческих оральных фибробластов (HOMF) в базальной среде с высоким содержанием глюкозы, дополненных 10% плодовой бычьей сывороткой (FBS) при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂. Используйте клетки в проходах 4–6.
3. Перед покрытием микронесущей бусинкой убедитесь, что оба типа клеток находятся в соответствующей точке слияния. Избегайте чрезмерного совпадения культур или чрезмерного ферментативного пищеварения, так как это может негативно повлиять на последующее прорастание.

2. Подготовка микронесущих бусин

1. Гидратировать 0,5 г сухих микронесущих шариков в 50 мл PBS минимум 3 часа. После промывки подвесьте шарики в 50 мл PBS, чтобы получить микронесущую суспензию 10 мг/мл, что соответствует примерно 3 × 10⁴ шариков/мл.
2. Переложите суспензию в кремнизованную стеклянную бутылку, простерилизуйте её при автоклавировании при 115 °C в течение 15 минут и храните при 4 °C до использования.
3. Перед нанесением покрытия эндотелиальных клеток удалите раствор для хранения и промывайте шарики стерильным PBS. Уравновесить шарики в среде роста эндотелиальных клеток при 37 °C не менее 30 минут.
4. Аккуратно подвесите уравновешенные бусины непосредственно перед использованием, чтобы избежать осадка и скопления бусин.
5. Перед покрытием клетки осмотрите небольшой аликвот суспензии шарика под перевёрнутым микроскопом. Продолжайте только после того, как шарики полностью увлажнены, равномерно подвешены и свободны от видимых агрегатов или фрагментов.

3. Покрытие эндотелиальных клеток на микроносительные шарики

1. Отсоедините HUVEC с помощью трипсина и восстановите клетки в среде роста эндотелиальных клеток.
2. Покрытие микронесущих шариков плотностью 1500 клеток на бусину. Смешайте 3 × 10⁶ HUVEC с 2000 микроносителями шариков в 1,5 мл среды роста эндотелиальных клеток.
3. Переместить смесь клеток и шариков в микроцентрифугу и инкубировать 12 часов в инкубаторе клеточной культуры. В течение всего 12-часового инкубационного периода аккуратно переворачивайте трубку каждые 20 минут, чтобы поддерживать адекватный контакт между клетками и шариками и способствовать равномерному прикреплению эндотелиальных клеток.
4. Через 12 часов переместите покрытые шарики в колбу с 25^{см 2} клеточной культуры с 4 мл среды для эндотелиального роста клеток и продолжите инкубацию в течение ночи, чтобы обеспечить прочное прикрепление эндотелиальных клеток к поверхности микроносителя.
5. Перед вложением рассмотрите представительные покрытые бусины под перевёрнутым микроскопом. Переходите к вложению в матрицу только тогда, когда более 80% исследуемых шариков демонстрируют непрерывный и относительно однородный эндотелиальный клеточный слой на поверхности шарика с минимальным количеством свободно плавающих клеток, отсутствием явных сгустков клеток и отсутствием сильной агрегации бусин. Бусины с неравномерным покрытием, крупными группами клеток или обширной агрегацией не следует использовать для вложения.
6. Если бусины прилипли к дну колбы, аккуратно потрясите фляжку, чтобы их освободить. Избегайте интенсивного пипетирования, которое может вызвать скопление шариков или отслоение клеток.

4. Встраивание покрытых бусинок в трёхмерную матрицу

1. Переместите микронесущие шарики, покрытые эндотелиальными клетками, в центрифужную трубку объемом 15 мл и дайте шарикам осеть под действием гравитации. Удалите лишний материал и добавьте соответствующее количество свежего материала.
2. Смешайте суспензию микронесущей шарики с предварительно охлаждённой матрицей базальной мембраны в соотношении 1:1 (v/v) для получения конечной концентрации шариков 500 шариков/мл.
3. Добавьте 100 мкл матричной шариковой суспензии в центр каждой скважины пластины с 24 лунками, позволяя смеси образовывать одну куполообразную гель-каплю без контакта со стенкой скважины. Аккуратно перемешайте суспензию сразу перед подачей и избегайте появления пузырьков воздуха.
4. Оставьте пластину с 24 лунками при комнатной температуре на 5 минут, чтобы дать первоначальное желирование и стабилизацию капли геля. Затем инкубировать пластину вертикально при 37 °C при 5% CO₂ в течение 15 минут, после чего дополнительно 15 минут инкубировать в перевёрнутом положении для обеспечения полного гелирования и правильного образования геля.
5. После полного затвердевания геля немедленно приступайте к наложению фибробластов.

5. Культура наложения фибробластов

1. Ресуспензировать 3 × 10⁴ человеческих слизистых фибробластов (HOMF) в 1 мл среды для роста эндотелиальных клеток и аккуратно добавить суспензию клетки вдоль стенки каждой колодцы, позволяя клеткам распределяться по поверхности геля, не нарушая напрямую гелевый купол.
2. Продолжить инкубацию в среде роста эндотелиальных клеток при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂. Фибробласты слизистой слизистой лица человека используются в качестве поддерживающих клеток, поскольку они обеспечивают паракринные сигналы, происходящие из стромы, способствующие расширению, стабилизации эндотелиального ростка и сосудистому ремоделированию в трёхмерной культурной системе.

6. Поддержание культуры и микроскопическое наблюдение

1. Меняйте посевную среду каждые 2 дня. При замене среды медленно аспирируйте отработанную среду и добавляйте свежую культурную среду вдоль стенки колодца, чтобы не нарушать гель.
2. Наблюдайте культуры ежедневно или через день под инвертированным микроскопом, используя режим яркого поля или фазового контраста. Для продольного количественного анализа выберите несколько полей обзора в каждой скважине на 7-й день и сфотографируйте одни и те же заранее определённые поля на 9 и 11 днях.
3. При оптимальных условиях культуры очевидное проращивание эндотелий обычно наблюдается на 4–6 днях, просветоподобные структуры появляются на 5–7 днях, а взаимосвязанные микрососудистые сети постепенно формируются после 7-го дня.
4. Определите успешное прорастание как наличие множества эндотелиальных расширений, растущих радиально от поверхности шарика в окружающую трёхмерную матрицу. Росток следует считать только тогда, когда он явно выходит за пределы поверхности бусины и остаётся соединённым с эндотелиальным клеточным слоем.
5. Определите формирование просветоподобной структуры как появление вытянутых эндотелиальных структур с видимым центральным прозрачным пространством или трубчатой морфологией. Межпобеговые соединения определяются как прямые контакты или непрерывные структуры, образующиеся между соседними ростками.
6. Культуры с обширной гибелью клеток, сильным скоплением шариков, нарушением структуры геля, обильными пузырьками, коллапсом матрицы или лишь короткими, неправильными клеточными выступлениями должны считаться неоптимальными и исключаться из количественного анализа.

7. Получение изображений и количественный анализ

1. Выберите несколько полей зрения в каждой скважине на седьмой день и получите изображения из тех же заранее определённых полей на 9 и 11 днях. Изображения должны собираться с использованием одинакового увеличения, настройки экспозиции и условий изображения во всех точках времени.
2. Количественно определите количество ростков на одну микронесущую бусину и сосудистую область.
   1. Для измерения васкуляризованной области используйте открытое программное обеспечение для анализа изображений. Откройте полученное изображение и вручную определите границу васкуляризированной области интереса (ROI) с помощью многоугольника или инструмента свободного выбора. Добавьте выбранный ROI в менеджер ROI.
   2. Для визуализации используйте плагин визуализации региона интереса, чтобы отобразить очерченную рентабельность инвестиций. Включите измерение площади в настройках измерения и измерите выбранный ROI для получения васкуляризированной области. Примените одинаковые настройки анализа ко всем изображениям.
   3. Для анализа ангиогенной скорости используйте васкуляризированную область на 7-й день в качестве исходной линии и рассчитывайте относительное изменение васкуляризированной площади на 9 и 11 днях.
3. Считайте количество отдельных ростков независимо тремя наблюдателями и используйте среднее значение для анализа.

Результаты

Ангиогенез в трёхмерной модели HUVEC

В успешно устоявшихся культурах эндотелиальные клетки равномерно распределены на поверхности микроносителей, и явного скопления шариков не наблюдается. Динамические наблюдения показали прогрессирующее прорастание эндотелиума и формирование микрососудистых сетей на 7, 9 и 11 днях (рисунок 1A). Количественный анализ дополнительно подтвердил прогрессирующий ангиогенный ответ в этой модели. Используя 7-й день в качестве базы, ангиогенный уровень был установлен на 0% на 7-й день и достиг 66,94% ± 18,49% на 9-й день и 169,51% ± 100,83% на 11-й день, что указывает на постепенное расширение васкуляризированной области во время культуры (рисунок 1B). Репрезентативная яркопольная визуализация показала, что эндотелиальные ростки радиально выходили из поверхности шарика в окружающую трёхмерную матрицу после 7 дней культуры (рисунок 1C). Кроме того, конфокальная микроскопия дала обзор общей морфологии и пространственной организации трёхмерной системы культурирования (рисунок 1D). Среднее количество ростков на микроносительскую бусину составляло 31,3 ростков на бусину, исходя из независимых подсчётов трёх наблюдателей (рисунок 1E). Эти результаты свидетельствуют о том, что модель поддерживает прорастание эндотелиев, удлинение, морфологию, подобную просвете, и сосудистую ремоделирование в трёхмерной среде.

Субоптимальные результаты в трёхмерной модели HUVEC

В неудачных или субоптимальных культурах можно наблюдать несколько характерных аномалий, включая гибель клеток (рисунок 2A), разрыв микроносителей шариков (рисунок 2B), аномальное скопление клеток на поверхности шарика (рисунок 2C), обширное образование пузырьков внутри геля (рисунок 2D), локальный коллапс матрицы (рисунок 2E), чрезмерно высокую плотность шариков (рисунок 2F), неравномерное покрытие клеток на микроносителях (рисунок 2G), скопление бусинок (рисунок 2H), и либо отсутствие явного прорастания, либо лишь ограниченное образование проростков (рисунок 2I, J). Эти аномалии указывают на то, что успешное создание модели может быть связано с недостаточной жизнеспособностью клетки, недостаточным покрытием клетки, неправильным контролем температуры матрици базальной мембраны, чрезмерной интенсивной реанимацией или нарушением геля во время замены среды.

Рисунок 1: Ангиогенез в трёхмерной модели HUVEC. (A) Динамическая оценка ангиогенеза в трёхмерной модели HUVEC на 7, 9 и 11 днях. Изображения были получены с увеличением 20×. Шкала = 10 мкм. (B) Количественный анализ ангиогенной скорости. Ангиогенная скорость определялась как относительное изменение васкуляризированной площади со временем на 7, 9 и 11 днях, используя 7-й день в качестве базы. Он был рассчитан следующим образом: ангиогенная скорость = [(васкуляризированная область в указанном времени − васкуляризированная зона на 7-й день) / васкуляризированная зона на 7-й день] × 100%. Данные ангиогенной скорости представлены как среднее ± SD из трёх независимых экспериментов. (C) Репрезентативное изображение прорастания эндотелиума в HUVEC через 7 дней культуры. Изображение было получено с помощью увеличения 20×. Шкала = 10 мкм. (D) Конфокальное обзорное изображение, показывающее общую морфологию трёхмерной системы культуры. Изображение было получено с помощью 4× сканирования. Шкала = 500 мкм. (E) Количественный анализ количества проростков в HUVEC. Количество проростков подсчитывалось независимо тремя наблюдателями, и среднее значение использовалось для анализа. Статистические сравнения для этих описательных количественных анализов не проводились. Эндотелиальные прорастающие структуры, показанные на рисунке, происходят из микронесущих шариков, покрытых HUVEC; HOMF использовались в качестве опорных ячеек наложения и не имели явной маркировки на изображениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Субоптимальные результаты в трёхмерной модели HUVEC. (A) Клеточная гибель. Как показывает белая стрелка, клетки выглядят как пунктирующий мусор, а поверхность микронесущей шарика становится гладкой. Шкала = 50 мкм. (B) Разрыв микронесущей шарики, отмеченный белой стрелкой. Шкала = 50 мкм. (C) Агрегация клеток на поверхности микронесущих шариков. Как видно белой стрелкой, клетки имеют бусинообразный вид с группировками. Чешуя полоса = 50 мкм. (D) Обширное образование пузырьков внутри геля, как указано белой стрелкой. Шкала = 100 мкм. (E) Локальный коллапс матрицы, указанный белой стрелкой. Шкала = 10 мкм. (F) Чрезмерно высокая плотность микронесущих шариков. Шкала = 10 мкм. (G) Неравномерное покрытие клетки на микронесущей шарике. Как указывает белая стрелка, одна сторона поверхности бусины остаётся гладкой. Шкала = 50 мкм. (H) Агрегация бусин. Шкала = 50 мкм. (I,J) Отсутствие явного прорастания или лишь ограниченное образование ростков. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Схематическая иллюстрация экспериментального рабочего процесса. (A) Подготовка HUVEC, HOMF и микронесущих шариков с химически связанным кислотно-денатурированным свиным коллагеном типа I при соответствующих условиях перед установкой анализа. (B) Смешивание HUVEC с подготовленными микроносителями для стимулирования прикрепления эндотелиальных клеток к поверхности шарика. (C) Инкубация с покрытием бусинок с мягкой инверсией каждые 20 минут в течение 12 часов для равномерного прикрепления эндотелиальных клеток. (D) Перенос покрытых шариков в колбу для дальнейшей инкубации, чтобы обеспечить прочное прикрепление эндотелиальных клеток к поверхности микроносителя. (E) Встраивание микронесущих шариков с покрытием HUVEC в матрицу базальной мембраны, затем посев HOMF поверх геля для обеспечения стромально-полученной паракринной поддержки для прорастания эндотелий и сосудистого ремоделирования. (F) Микроскопическое наблюдение и количественный анализ прорастания эндотелиев, формирования структуры, похожих на просвет, межпобеговых соединений, количества ростков и васкуляризированной области на 7, 9 и 11 днях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Настоящий протокол описывает модифицированную трёхмерную модель эндотелиального прорастания на основе микронесущих шариков. Рисунок 3 даёт схемный обзор экспериментального рабочего процесса. Протокол был адаптирован из классического анализа ангиогенеза, представленного Накацу и Хьюзом, и оптимизирован для достижения целей настоящего исследования ^8,9. В классической системе эндотелиальные клетки покрываются микронесущими шариками, покрытыми коллагеном, встраиваются в трёхмерный матрикс и совместно культивируются с фибробластами для поддержки прорастания, удлинения, образования просвета и сосудистого анастомоза ^7,10. В настоящем протоколе вместо фибринового геля использовалась матрица базальной мембраны, а в качестве опорных клеток использовались человеческие слизистые фибробласти, что позволило создать удобную трёхмерную систему культуры для in vitro наблюдения эндотелиального ангиогенного поведения. Структуры прорастания, показанные на репрезентативных изображениях, получены из микронесущих бусин, покрытых HUVEC, тогда как фибробласты слизистой слизистой у человека засеяны как наложенные поддерживающие клетки и не имеют конкретной маркировки на этих изображениях.

Важной особенностью этого протокола является использование матрицы базальных мембран вместо классической системы фибринового геля. Экспериментально матрица базальной мембраны упрощает установку анализа, поскольку готова к использованию, проходит быстрое температурно-зависимое желирование и позволяет удобно встраивать микроносители с эндотелиальной клеточной покрытостью без необходимости отдельной подготовки фибриногенов, тромбина или апротинина. Эта особенность делает протокол относительно простым и подходящим для рутинных микроскопических наблюдений. Однако эта модификация также меняет биологическую микросреду анализа. В отличие от фибринового геля, матрица базальной мембраны содержит компоненты внеклеточного матрикса, ассоциированные с базальной мембраной, и биоактивные сигналы, которые могут влиять на адгезию эндотелия, миграцию, расширение проростка, морфологию, похожую на просвет, и ремоделирование сети. Кроме того, различия в жесткости матрицы, разлагаемости и составе лиганда могут влиять на кинетику прорастания и морфологию сети. Поэтому результаты, полученные с использованием этого модифицированного анализа, следует интерпретировать как результат модели прорастания микроносителей на основе матрицы базальных мембран, а не как прямой эквивалент исходного анализа на основе фибрина.

Успешное создание этой модели зависит от нескольких критически важных шагов. Равномерное покрытие эндотелиальных клеток на поверхности микроносителя является необходимым для равномерного инициации и удлинения прорастания. Недостаточное или неравномерное покрытие может привести к снижению количества ростков, плохому направленному росту и снижению воспроизводимости. Стабильное образование геля — ещё один ключевой фактор, определяющий эффективность анализа. Во время подготовки и вложения матрицы неправильный контроль температуры может привести к преждевременному гелированию, неравномерному распределению шариков или образованию пузырей, что может мешать прорастанию эндотелиев. Кроме того, поддерживающие фибробласты необходимы для обеспечения устойчивых паракринных сигналов, способствующих росту и стабилизации ростков. Поэтому тщательный контроль этих этапов необходим для получения стабильных и воспроизводимых результатов.

Некоторые меры могут повысить консистентность анализов. Репрезентативные субоптимальные результаты, показанные на рисунке 2 , могут использоваться как практические индикаторы устранения неполадок. Обширная гибель клеток может быть вызвана низкой жизнеспособностью клеток, переварением во время отсоединения клеток, неправильным количеством проходов или задержкой замены среды; Поэтому рекомендуется использовать здоровые эндотелиальные клетки логарифмической фазы и мягкое ферментное пищеварение. Разрыв микронесущих шариков или агрегации шариков может быть вызван интенсивным пипетированием, чрезмерным механическим перемешиванием или недостаточной ресуспензией бусины, и может быть уменьшен при аккуратном смешивании и аккуратном обращении при подготовке и нанесении бусины. Неравномерное покрытие эндотелиальных клеток или крупные клеточные кластеры на поверхности шарика обычно указывают на недостаточное смешивание, чрезмерную плотность клетки или недостаток контакта с бусинкой в период нанесения покрытия; В этом случае подвеску клеточного шарика следует аккуратно переворачивать с регулярными интервалами и осматривать перед вложением. Образование пузырьков и локальный коллапс матрицы обычно связаны с неправильным обращением с матрицей, преждевременным гелированием или нарушением геля при добавлении или замене среде; Держать матрицу на льду перед использованием, избегать пузырьков воздуха при разливании, обеспечивать полное гелирование и медленное добавление среды вдоль стенки колодца — это может уменьшить эти проблемы. Культуры, не показывающие явного прорастания или лишь ограниченное образование ростков, могут отражать плохое прикрепление эндотелиальных клеток, низкую жизнеспособность клеток, недостаточную поддержку, полученную от фибробластов, или нестабильное формирование матрикса, и должны быть исключены из количественного анализа.

По сравнению с традиционными двумерными анализами формирования трубок, эта трёхмерная модель на основе бусинок с микроносителями более эффективно воспроизводит пространственное поведение эндотелиальных клеток внутри внеклеточного матрикса и позволяет визуализировать прорастание эндотелиев, удлинение, формирование просветоподобной структуры и сборку сети. Кроме того, трехмерная среда культуры создаёт условия, более близкие к in vivo питательных веществ и распределению сигналов^11,12. По сравнению с микрофлюидными сосудистыми чипами, которые часто технически требовательны и дороги, этот метод относительно прост, воспроизводимый и экономически эффективен, что делает его отлично подходящим для рутинных исследований ангиогенеза in vitro.

Одним из важных ограничений этого протокола является использование матрицы базальной мембраны в качестве замены классической системы фибринового геля. По этой причине данный анализ следует рассматривать как модифицированную версию ранее описанной модели прорастания эндотелиальных микроносителей бусин, а не как прямое повторение исходного метода на основе фибрина. Поскольку разные матрицы различаются по составу, механическим свойствам и поведению при деградации, они могут влиять на кинетику прорастания, стабильность просвета и морфологию сосудистых^сетей 13,14,15. Поэтому необходимо проявлять осторожность при сравнении результатов, полученных по этой модели, с результатами, полученными с использованием традиционных систем на основе фибрина.

Эта модель имеет потенциал применения за пределами наблюдения базального эндотелиального прорастания. Он также может быть адаптирован для фармакологических интервенционных исследований, экспериментов по гиперэкспрессии генов или «knockdown», анализа сигнальных путей и исследований эндотелиальных фенотипов, связанных с^{болезнью 16,17}. При дальнейшей оптимизации этот трёхмерный анализ прорастания может служить надёжной in vitro платформой для изучения механизмов развития сосудов и терапевтических стратегий, направленных на ангиогенез.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1.5 мл микроцентрифужная пробирка	Beyotime	FTUB306	Прозрачная, свободная от нуклеаз
15 мл центрифужная пробирка	Haier	311005	С конусным дном, стерильная, упакованная в пакет
24-лунковая пластинка для культивирования клеток	Haier	612003	С плоским дном, обработанная для культивирования тканей, упакованная поштучно, для культивирования адгезивных клеток
Автоматическая скользящая прокладка для подсчета клеток	Countstar	12-0005-50	Одноразовая прокладка для автоматического счетчика клеток, 50 прокладок/коробка
Инкубатор для культивирования клеток с CO2	Thermo Fisher Scientific	3110	Используется для культивирования клеток при 37 °C с 5% CO2
Микропереносители Cytodex 3	Cytiva	17048503	Сухой порошок; коллагенопокрытые декстрановые микропереносители
Плагин точечно-линейной визуализации	N/A	N/A	Плагин для визуализации области интереса, используемый для отображения очерченных сосудистых зон
Модифицированная среда Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	Основная DMEM (1×), содержащая 4,5 г/л D-глюкозы, L-глутамин и 110 мг/л натрия пирувата, 500 мл
Среда для культивирования эндотелиальных клеток (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Среда для культивирования эндотелиальных клеток, дополненная добавочным сывороточным альбумином до конечной концентрации 10% перед использованием
Фетальный бычий сывороточный альбумин (FBS)	Gibco	10099141C	Квалифицированный, одноразовый формат, австралийское происхождение, 500 мл
Первичные фибробласты человеческой полости рта (HOMFs)	Научно-исследовательская группа Джие Мэй, Стоматологическая больница, присоединенная к Куньминскому медицинскому университету	N/A	Первичные фибробласты, изолированные из человеческой слизистой оболочки полости рта; предоставлены другой лабораторией
Первичные эндотелиальные клетки человеческих пуповиных вен (HUVECs)	Внутренняя	N/A	Первичные эндотелиальные клетки, изолированные из человеческих пуповиных вен; нет каталожного номера
Программное обеспечение ImageJ	Национальный институт здравоохранения (NIH), США	N/A	Программное обеспечение с открытым исходным кодом; версия 1.54p
Инвертированный микроскоп	Olympus, Япония	N/A	Для яркого поля, фазового контраста и флуоресцентного изображения
Конфокальный микроскоп с лазерным сканированием	Nikon, Япония	N/A	Для конфокального изображения; модель не указана
Матригельная базальная мембрана	Corning	354262	Высокая концентрация (HC), без фенол-красного, без LDEV, 10 мл
Пенicillin-стрептомицин (Pen-Strep)	Gibco	15140-122	Раствор пенициллин-стрептомицин для культивирования клеток, 100×, 100 мл
Фосфатно-буферный раствор (PBS)	LiJi Bio	AC08L011	1×, стерильный, 500 мл
Пластинка для культивирования клеток T25	ABCBIO	ABC707008	T25, с проветривающимся колпачком, обработанная для культивирования тканей, для культивирования адгезивных клеток
Трипсин-ЭДТА (0,25%)	Gibco	25200-056	0,25% раствор трипсина-ЭДТА, 100 мл