Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Трехмерная модель ангиогенеза на основе микроносителей с использованием эндотелиальных клеток вены пупочки

131 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71877

⸱

7 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Yunnan First People's Hospital, 2The Affiliated Hospital of Kunming University of Science and Technology, 3The Affiliated Stomatology Hospital of Kunming Medical University, 4Yunnan Key Laboratory of Stomatology, Kunming Medical University, 5Kunming Stomatological Hospital North City District Branch, 6Shiyan Key Laboratory of Comprehensive Prevention and Treatment of Oral Cancer, Department of Stomatology, Taihe Hospital, Hubei University of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает трёхмерную модель ангиогенеза на основе микроносителей с использованием эндотелиальных клеток пуповиной вен. Анализ позволяет напрямую визуализировать прорастание эндотелиалов и формирование просветоподобной структуры, а также может применяться для изучения ангиогенных механизмов и терапевтических вмешательств.

Аннотация

Ангиогенез — это многоступенчатый биологический процесс, включающий активацию эндотелиальных клеток, миграцию, удлинение, образование просвета, ветвление и анастомоз. Традиционные двумерные системы культуры полезны для предварительной оценки лекарств, генов или условий культуры, но они недостаточно воспроизводят пространственную организацию эндотелиального морфогенеза в трёхмерном внеклеточном матриксе. Настоящий протокол описывает трёхмерный анализ ангиогенеза на основе микроносителей с использованием эндотелиальных клеток пуповиных вен человека (HUVEC). HUVEC сначала засеиваются на микроносительные шарики, содержащие химически связанный кислотно-денатурированный свиной коллаген типа I, а затем встраиваются в матрицу базальной мембраны. Затем сверху геля посеиваются слизистые фибробласти, обеспечивающие паракринную поддержку для прорастания эндотелий и формирования сосудистых структур. Культурная среда меняется каждые 2 дня, а поведение прорастания и ангиогенные фенотипы контролируются с помощью инвертированной микроскопии. При подходящих условиях культуры эндотелиальные ростки появляются в течение нескольких дней, за которыми формируются просветоподобные структуры и межпобеговые соединения. Этот метод предоставляет удобную и воспроизводимую платформу для in vitro исследований эндотелиального морфогенеза и может быть дополнительно применён для исследований генной обработки, фармакологического вмешательства и моделирования заболеваний.

Введение

Прорастание эндотелиума является ключевым событием ангиогенеза и включает появление, миграцию, пролиферацию и выравнивание эндотелиальных клеток из уже существующих сосудистых структур, за которым следует образование просвета и формирование взаимосвязанных сосудистыхсетей 1,2. Хотя традиционные двухмерные системы культуры и гелевые анализы на формировании трубок технически просты, их способность воспроизводить пространственное ремоделирование эндотелиальных клеток в трёхмерноймикросреде 3,4 ограничены. Классический трёхмерный анализ прорастания на основе микроносителей (microcarrier beet) воспроизводит несколько стадий ангиогенеза in vitro, включая прорастание, удлинение, образование просвета и сборку сети, поэтому стал широко используемым методом для исследований ангиогенеза.

В настоящем протоколе устанавливается трёхмерная модель прорастания на основе бусинок с использованием нормальных эндотелиальных клеток вены пупочки человека. Основываясь на ранее опубликованных анализах прорастания эндотелиальных микроносителейбусинок 5,6,7, этот метод сохраняет основную структуру покрытия эндотелиальных клеток на микроносительных шариках, встраивающихся в трёхмерную матрицу и культуру наложения фибробластов, при этом заменяя традиционный фибриновый гель на базальную мембрану для упрощения процедуры и облегчения рутинной визуализации. Матрица базальной мембраны была выбрана в этом модифицированном протоколе по ряду практических и биологических причин. Экспериментально она обеспечивает готовую к использованию трёхмерную матрицу, позволяющую быстро формировать гель, простое вложение шариков и удобное рутинное микроскопическое наблюдение без дополнительных этапов полимеризации, необходимых для приготовления фибринового геля. С биологической точки зрения матрица базальной мембраны содержит компоненты внеклеточного матрикса, которые поддерживают адгезию эндотелиальных клеток, миграцию, расширение проростков и формирование просветоподобной структуры. Поэтому эта модификация подходит для исследований, требующих прямой визуализации поведения прорастания эндотелиев, сравнения ангиогенных фенотипов и оценки фармакологических или генетических вмешательств в трёхмерной культурной среде. Однако, поскольку матрица базальной мембраны отличается от фибринового геля по составу матрицы, механическим свойствам, разлагаемости и биоактивным сигналам, данный анализ следует интерпретировать как модифицированную модель прорастания на основе микроносителей, а не как прямую замену классического анализа на основе фибрина. Эти матричные различия могут влиять на кинетику прорастания, стабильность просвета и морфологию сети, и должны учитываться при сравнении результатов в различных трёхмерных системах ангиогенеза. Эта модель подходит для наблюдения поведения эндотелиального прорастания в трёх измерениях и может быть дополнительно применена для изучения фармакологического вмешательства, манипуляций с генами и ангиогенных механизмов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эндотелиальные клетки пуповины человека, используемые в этом протоколе, были выделены и культивированы из тканей пуповины человека, собранных в Департаменте акушерства Первой народной больницы провинции Юньнань. Письменное информированное согласие было получено от всех доноров перед сбором образцов. Все процедуры с использованием материалов, полученных от человека, были одобрены Комитетом по медицинской этике Первой народной больницы провинции Юньнань (одобрение No KHLL2023-KY198). Человеческие слизистые фибробласти (HOMF) были любезно предоставлены исследовательской группой доктора Цзэмэй Чжай в Аффилированной стоматологической больнице Медицинского университета Куньмина. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка клеток

  1. Культивировать эндотелиальные клетки человеческой пуповины (HUVEC) в среде для роста эндотелиальных клеток, дополненных дополнительной сывороткой плода (FBS) до конечной концентрации 10% при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂. Клетки, используемые для анализа, должны быть свободны от загрязнения, демонстрировать стабильный рост и находиться в логарифмической фазе роста. Используйте клетки в проходах 4–6.
  2. Культура человеческих оральных фибробластов (HOMF) в базальной среде с высоким содержанием глюкозы, дополненных 10% плодовой бычьей сывороткой (FBS) при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂. Используйте клетки в проходах 4–6.
  3. Перед покрытием микронесущей бусинкой убедитесь, что оба типа клеток находятся в соответствующей точке слияния. Избегайте чрезмерного совпадения культур или чрезмерного ферментативного пищеварения, так как это может негативно повлиять на последующее прорастание.

2. Подготовка микронесущих бусин

  1. Гидратировать 0,5 г сухих микронесущих шариков в 50 мл PBS минимум 3 часа. После промывки подвесьте шарики в 50 мл PBS, чтобы получить микронесущую суспензию 10 мг/мл, что соответствует примерно 3 × 10⁴ шариков/мл.
  2. Переложите суспензию в кремнизованную стеклянную бутылку, простерилизуйте её при автоклавировании при 115 °C в течение 15 минут и храните при 4 °C до использования.
  3. Перед нанесением покрытия эндотелиальных клеток удалите раствор для хранения и промывайте шарики стерильным PBS. Уравновесить шарики в среде роста эндотелиальных клеток при 37 °C не менее 30 минут.
  4. Аккуратно подвесите уравновешенные бусины непосредственно перед использованием, чтобы избежать осадка и скопления бусин.
  5. Перед покрытием клетки осмотрите небольшой аликвот суспензии шарика под перевёрнутым микроскопом. Продолжайте только после того, как шарики полностью увлажнены, равномерно подвешены и свободны от видимых агрегатов или фрагментов.

3. Покрытие эндотелиальных клеток на микроносительные шарики

  1. Отсоедините HUVEC с помощью трипсина и восстановите клетки в среде роста эндотелиальных клеток.
  2. Покрытие микронесущих шариков плотностью 1500 клеток на бусину. Смешайте 3 × 106 HUVEC с 2000 микроносителями шариков в 1,5 мл среды роста эндотелиальных клеток.
  3. Переместить смесь клеток и шариков в микроцентрифугу и инкубировать 12 часов в инкубаторе клеточной культуры. В течение всего 12-часового инкубационного периода аккуратно переворачивайте трубку каждые 20 минут, чтобы поддерживать адекватный контакт между клетками и шариками и способствовать равномерному прикреплению эндотелиальных клеток.
  4. Через 12 часов переместите покрытые шарики в колбу с 25см 2 клеточной культуры с 4 мл среды для эндотелиального роста клеток и продолжите инкубацию в течение ночи, чтобы обеспечить прочное прикрепление эндотелиальных клеток к поверхности микроносителя.
  5. Перед вложением рассмотрите представительные покрытые бусины под перевёрнутым микроскопом. Переходите к вложению в матрицу только тогда, когда более 80% исследуемых шариков демонстрируют непрерывный и относительно однородный эндотелиальный клеточный слой на поверхности шарика с минимальным количеством свободно плавающих клеток, отсутствием явных сгустков клеток и отсутствием сильной агрегации бусин. Бусины с неравномерным покрытием, крупными группами клеток или обширной агрегацией не следует использовать для вложения.
  6. Если бусины прилипли к дну колбы, аккуратно потрясите фляжку, чтобы их освободить. Избегайте интенсивного пипетирования, которое может вызвать скопление шариков или отслоение клеток.

4. Встраивание покрытых бусинок в трёхмерную матрицу

  1. Переместите микронесущие шарики, покрытые эндотелиальными клетками, в центрифужную трубку объемом 15 мл и дайте шарикам осеть под действием гравитации. Удалите лишний материал и добавьте соответствующее количество свежего материала.
  2. Смешайте суспензию микронесущей шарики с предварительно охлаждённой матрицей базальной мембраны в соотношении 1:1 (v/v) для получения конечной концентрации шариков 500 шариков/мл.
  3. Добавьте 100 мкл матричной шариковой суспензии в центр каждой скважины пластины с 24 лунками, позволяя смеси образовывать одну куполообразную гель-каплю без контакта со стенкой скважины. Аккуратно перемешайте суспензию сразу перед подачей и избегайте появления пузырьков воздуха.
  4. Оставьте пластину с 24 лунками при комнатной температуре на 5 минут, чтобы дать первоначальное желирование и стабилизацию капли геля. Затем инкубировать пластину вертикально при 37 °C при 5% CO₂ в течение 15 минут, после чего дополнительно 15 минут инкубировать в перевёрнутом положении для обеспечения полного гелирования и правильного образования геля.
  5. После полного затвердевания геля немедленно приступайте к наложению фибробластов.

5. Культура наложения фибробластов

  1. Ресуспензировать 3 × 10⁴ человеческих слизистых фибробластов (HOMF) в 1 мл среды для роста эндотелиальных клеток и аккуратно добавить суспензию клетки вдоль стенки каждой колодцы, позволяя клеткам распределяться по поверхности геля, не нарушая напрямую гелевый купол.
  2. Продолжить инкубацию в среде роста эндотелиальных клеток при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂. Фибробласты слизистой слизистой лица человека используются в качестве поддерживающих клеток, поскольку они обеспечивают паракринные сигналы, происходящие из стромы, способствующие расширению, стабилизации эндотелиального ростка и сосудистому ремоделированию в трёхмерной культурной системе.

6. Поддержание культуры и микроскопическое наблюдение

  1. Меняйте посевную среду каждые 2 дня. При замене среды медленно аспирируйте отработанную среду и добавляйте свежую культурную среду вдоль стенки колодца, чтобы не нарушать гель.
  2. Наблюдайте культуры ежедневно или через день под инвертированным микроскопом, используя режим яркого поля или фазового контраста. Для продольного количественного анализа выберите несколько полей обзора в каждой скважине на 7-й день и сфотографируйте одни и те же заранее определённые поля на 9 и 11 днях.
  3. При оптимальных условиях культуры очевидное проращивание эндотелий обычно наблюдается на 4–6 днях, просветоподобные структуры появляются на 5–7 днях, а взаимосвязанные микрососудистые сети постепенно формируются после 7-го дня.
  4. Определите успешное прорастание как наличие множества эндотелиальных расширений, растущих радиально от поверхности шарика в окружающую трёхмерную матрицу. Росток следует считать только тогда, когда он явно выходит за пределы поверхности бусины и остаётся соединённым с эндотелиальным клеточным слоем.
  5. Определите формирование просветоподобной структуры как появление вытянутых эндотелиальных структур с видимым центральным прозрачным пространством или трубчатой морфологией. Межпобеговые соединения определяются как прямые контакты или непрерывные структуры, образующиеся между соседними ростками.
  6. Культуры с обширной гибелью клеток, сильным скоплением шариков, нарушением структуры геля, обильными пузырьками, коллапсом матрицы или лишь короткими, неправильными клеточными выступлениями должны считаться неоптимальными и исключаться из количественного анализа.

7. Получение изображений и количественный анализ

  1. Выберите несколько полей зрения в каждой скважине на седьмой день и получите изображения из тех же заранее определённых полей на 9 и 11 днях. Изображения должны собираться с использованием одинакового увеличения, настройки экспозиции и условий изображения во всех точках времени.
  2. Количественно определите количество ростков на одну микронесущую бусину и сосудистую область.
    1. Для измерения васкуляризованной области используйте открытое программное обеспечение для анализа изображений. Откройте полученное изображение и вручную определите границу васкуляризированной области интереса (ROI) с помощью многоугольника или инструмента свободного выбора. Добавьте выбранный ROI в менеджер ROI.
    2. Для визуализации используйте плагин визуализации региона интереса, чтобы отобразить очерченную рентабельность инвестиций. Включите измерение площади в настройках измерения и измерите выбранный ROI для получения васкуляризированной области. Примените одинаковые настройки анализа ко всем изображениям.
    3. Для анализа ангиогенной скорости используйте васкуляризированную область на 7-й день в качестве исходной линии и рассчитывайте относительное изменение васкуляризированной площади на 9 и 11 днях.
  3. Считайте количество отдельных ростков независимо тремя наблюдателями и используйте среднее значение для анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ангиогенез в трёхмерной модели HUVEC

В успешно устоявшихся культурах эндотелиальные клетки равномерно распределены на поверхности микроносителей, и явного скопления шариков не наблюдается. Динамические наблюдения показали прогрессирующее прорастание эндотелиума и формирование микрососудистых сетей на 7, 9 и 11 днях (рисунок 1A). Количественный анализ дополнительно подтвердил прогрессирующий ангиогенный ответ в это...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Настоящий протокол описывает модифицированную трёхмерную модель эндотелиального прорастания на основе микронесущих шариков. Рисунок 3 даёт схемный обзор экспериментального рабочего процесса. Протокол был адаптирован из классического анализа ангиогенеза, представленного Накацу и Хьюзом, и оптимизирован для достижения целей настоящего исследования 8,9. В классической системе эндотелиальные клет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы признают финансовую поддержку от экспертной рабочей станции Чжан И провинции Юньнань (202305AF150444) и Фонда инноваций в высшем образовании Куньминского медицинского университета (2025S234).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1.5 мл микроцентрифужная пробиркаBeyotimeFTUB306Прозрачная, свободная от нуклеаз
15 мл центрифужная пробиркаHaier311005С конусным дном, стерильная, упакованная в пакет
24-лунковая пластинка для культивирования клетокHaier612003С плоским дном, обработанная для культивирования тканей, упакованная поштучно, для культивирования адгезивных клеток
Автоматическая скользящая прокладка для подсчета клетокCountstar12-0005-50Одноразовая прокладка для автоматического счетчика клеток, 50 прокладок/коробка
Инкубатор для культивирования клеток с CO2Thermo Fisher Scientific3110Используется для культивирования клеток при 37 °C с 5% CO2
Микропереносители Cytodex 3Cytiva17048503Сухой порошок; коллагенопокрытые декстрановые микропереносители
Плагин точечно-линейной визуализацииN/AN/AПлагин для визуализации области интереса, используемый для отображения очерченных сосудистых зон
Модифицированная среда Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозыEvaCell (EVA Life Sciences)E2102Основная DMEM (1×), содержащая 4,5 г/л D-глюкозы, L-глутамин и 110 мг/л натрия пирувата, 500 мл
Среда для культивирования эндотелиальных клеток (ECM)ScienCell Research Laboratories1001Среда для культивирования эндотелиальных клеток, дополненная добавочным сывороточным альбумином до конечной концентрации 10% перед использованием
Фетальный бычий сывороточный альбумин (FBS)Gibco10099141CКвалифицированный, одноразовый формат, австралийское происхождение, 500 мл
Первичные фибробласты человеческой полости рта (HOMFs)Научно-исследовательская группа Джие Мэй, Стоматологическая больница, присоединенная к Куньминскому медицинскому университетуN/AПервичные фибробласты, изолированные из человеческой слизистой оболочки полости рта; предоставлены другой лабораторией
Первичные эндотелиальные клетки человеческих пуповиных вен (HUVECs)ВнутренняяN/AПервичные эндотелиальные клетки, изолированные из человеческих пуповиных вен; нет каталожного номера
Программное обеспечение ImageJНациональный институт здравоохранения (NIH), СШАN/AПрограммное обеспечение с открытым исходным кодом; версия 1.54p
Инвертированный микроскопOlympus, ЯпонияN/AДля яркого поля, фазового контраста и флуоресцентного изображения
Конфокальный микроскоп с лазерным сканированиемNikon, ЯпонияN/AДля конфокального изображения; модель не указана
Матригельная базальная мембранаCorning354262Высокая концентрация (HC), без фенол-красного, без LDEV, 10 мл
Пенicillin-стрептомицин (Pen-Strep)Gibco15140-122Раствор пенициллин-стрептомицин для культивирования клеток, 100×, 100 мл
Фосфатно-буферный раствор (PBS)LiJi BioAC08L0111×, стерильный, 500 мл
Пластинка для культивирования клеток T25ABCBIOABC707008T25, с проветривающимся колпачком, обработанная для культивирования тканей, для культивирования адгезивных клеток
Трипсин-ЭДТА (0,25%)Gibco25200-0560,25% раствор трипсина-ЭДТА, 100 мл

Ссылки

  1. Shaw P, et al. VEGF signaling: role in angiogenesis and beyond. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2024;1879(2):189079.
  2. Dudley AC, Griffioen AW. The modes of angiogenesis: an updated perspective. Angiogenesis. 2023;26(4):477-480.
  3. Naderi-Meshkin H, et al. Vascular organoids: unveiling advantages, applications, challenges, and disease modelling strategies. Stem Cell Res Ther. 2023;14(1):292.
  4. Davis GE, Kemp SS. Extracellular matrix regulation of vascular morphogenesis, maturation, and stabilization. Cold Spring Harb Perspect Med. 2023;13(4):a041156.
  5. Berndt S, et al. Angiogenesis is differentially modulated by platelet-derived products. Biomedicines. 2021;9(3):251.
  6. Eglinger J, Karsjens H, Lammert E. Quantitative assessment of angiogenesis and pericyte coverage in human cell-derived vascular sprouts. Inflamm Regen. 2017;37:2.
  7. Carpentier G, et al. Angiogenesis Analyzer for ImageJ: a comparative morphometric analysis of endothelial tube formation assay and fibrin bead assay. Sci Rep. 2020;10:11568.
  8. Boscolo E, et al. NRASQ61R mutation in human endothelial cells causes vascular malformations. Angiogenesis. 2022;25(3):331-342.
  9. Nakatsu MN, Hughes CCW. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 2008;443:65-82.
  10. Gordon E, Schimmel L, Frye M. The importance of mechanical forces for in vitro endothelial cell biology. Front Physiol. 2020;11:684.
  11. Huang X, et al. Current advances in 3D dynamic cell culture systems. Gels. 2022;8(12):829.
  12. Langhans SA. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Front Pharmacol. 2018;9:6.
  13. Friend NE, McCoy AJ, Stegemann JP, Putnam AJ. A combination of matrix stiffness and degradability dictate microvascular network assembly and remodeling in cell-laden poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomaterials. 2023;295:122050.
  14. Wang WY, et al. Direct comparison of angiogenesis in natural and synthetic biomaterials reveals that matrix porosity regulates endothelial cell invasion speed and sprout diameter. Acta Biomater. 2021;135:260-273.
  15. Liu J, et al. Synthetic extracellular matrices with tailored adhesiveness and degradability support lumen formation during angiogenic sprouting. Nat Commun. 2021;12(1):3402.
  16. Boos F, et al. The endothelial-enriched lncRNA LINC00607 mediates angiogenic function. Basic Res Cardiol. 2023;118(1):5.
  17. Lee S, et al. Angiogenesis-on-a-chip coupled with single-cell RNA sequencing reveals spatially differential activations of autophagy along angiogenic sprouts. Nat Commun. 2024;15:230.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

БиологияВыпуск 234Выпуск 234Пустое значениеВыпускмикроносителитрехмерное культивирование клетокэндотелиальное ветвлениематрикс базальной мембраныкокультивирование с фибробластамиформирование просвета

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.