Обогащение тиротропов гипофиза у мышей с помощью сортировки клеток, активируемой флуоресценцией, на основе CD90

Краткое содержание

Этот протокол описывает обогащение тиротропов из гипофиза взрослых мышей с помощью ферментативной диссоциации и сортировки клеток, активируемых флуоресценцией на основе CD90, что позволяет проводить молекулярный анализ и кратковременную первичную культуру популяции клеток, обогащённых тиротропом.

Аннотация

Тиротропы — это специализированные эндокринные клетки передней части гипофиза, которые выделяют гормон, стимулирующий щитовидную железу (ТТГ) и регулирующие активность щитовидной железы. Секреция ТТГ положительно регулируется гипоталамическим тиреотропин-рилизинг-гормоном и отрицательно регулируется циркулирующими гормонами щитовидной железы. Тиротропы составляют лишь небольшую долю клеток гипофиза (~5%), что усложняет изучение их физиологии. Здесь мы описываем расширенный подход к выделению тиротропов у взрослых мышей у гипотиреоидов. Гипотиреоз был вызван для расширения популяции тиротропов перед ферментативной диссоциацией передней части гипофиза и сортировкой клеток, активируемых флуоресценцией, с использованием поверхностного антигена CD90.2. Обработка передних гипофизов у двенадцати мышей дала примерно 1,5 × 10⁶ CD90.2-положительных клеток, обогащённых экспрессией мессенджерной РНК Tshb . CD90,2-положительные клетки составляли примерно 25% передней части гипофиза и демонстрировали примерно в пять раз более высокую экспрессию Tshb по сравнению с CD90,2-отрицательными клетками, что свидетельствует о значительном обогащении тиротропов. Изолированные клетки оставались жизнеспособными в краткосрочной культуре и сохраняли чувствительность к терапии трийодотиронином. Этот протокол позволяет обогащать и культурировать тиротропы мышей для молекулярных, транскриптомных, эпигеномных и физиологических анализов по следующим этапам.

Введение

Гипофиз — это эндокринный орган, расположенный у основания мозга, который осуществляет иерархический контроль над гормональным гомеостазом. Его активность регулируется гипоталамическими сигналами, которые стимулируют или подавляют выработку гормонов гипофиза, которые, в свою очередь, управляют функционированием периферических эндокринных органов. Железа содержит гетерогенную и динамичную популяцию клеток, включая стволовые и предшественники и дифференцированные гормонообразующие клетки¹. В ответ на физиологический стресс или повреждение стволовые и предшественники гипофиза могут активироваться, самообновляться и дифференцироваться в несколько линий, выделяющих^{гормоны 2,3}. Структурно гипофиз организован в две основные доли: заднюю долю (PL), состоящую из питуицитов и нейросекреторных терминалов, выделяющих окситоцин и вазопрессин, и переднюю долю (AL), содержащую специализированные эндокринные клетки, выделяющие гормон роста, пролактин, гормон стимулирования щитовидки (TSH), адренокортикотропный гормон, а также гонадотропины — фолликулостимулирующий гормон (FSH) и лютеинизирующий гормон (LH). Передний гипофиз также содержит негормональные типы клеток, такие как S100B-положительные фолликулостеллатные клетки, эндотелиальные клетки и перициты, поддерживающие эндокринную^{функцию 4,5,6}. Грызуны также содержат меланотрофы в промежуточной доле^{гипофиза 7,8}.

Интерес к функции, дифференциации и развитию гипофиза способствовал разработке множества протоколов, направленных на изоляцию стволовых и предшественников взрослых гипофиза в моделях грызунов. Крысы часто используются в исследованиях физиологии гипофиза, поскольку их крупные гипофизы обеспечивают большее количество клеток и улучшают восстановление во время обработки^{тканей 4,9}. В отличие от этого, изоляция клеток гипофиза у мышей остаётся технически сложной, а стандартизированные протоколы ограничены. Современные протоколы с использованием агрегатов стволовых и прогениторных клеток взрослого гипофиза предоставляют полезные инструменты для моделирования развития и его^{функции 10}; однако эти системы пока не позволяют напрямую изолировать конкретные популяции эндокринных клеток. Среди гормонообразующих типов клеток переднего гипофиза тиротропы являются главными регуляторами оси гипоталамо–гипофиз–щитовидная железа (ГПТ), контролируя синтез и секрецию гормонов щитовидной железы (ТГ) у млекопитающих. ТТГ, производимый тиротропами, представляет собой гетеродимерный гликопротеин, состоящий из общей α-субъединицы (кодируемой Cga и разделённой с ФСГ и ЛГ) и β-субъединицы (кодируемой Tshb), которая обеспечивает специфичность рецепторов. Эти клетки очень чувствительны к циркулирующим уровням трийодотиреонина (T3) и тироксина (T4). Популяция тиротропов расширяется при низком уровне Т3 и Т4 во время гипотиреоза и сокращается при гипертиреозе с помощью классического механизма отрицательной^{обратной связи} 11,12,13.

Несмотря на их важную физиологическую роль, тиротропы остаются труднодоступными для изучения, поскольку составляют лишь небольшую часть клеток переднего гипофиза (примерно 5%) и имеют фенотипические характеристики с другими эндокринными популяциями. Эта дефицитность, вместе с отсутствием надёжных in vitro моделей, ограничила механистические исследования регуляции тиротропа и управления осями HPT. Линия опухолевых клеток TαT1 представляет собой широко используемую^модель 14, похожую на тиротроп, но не полностью отражает физиологические реакции; в частности, T3-зависимое подавление Tshb часто трудно оценить из-за очень низкого базального уровня^{транскрипции 15}. В результате многие исследования опирались на нетиротропные клеточные линии, такие как HEK293, COS, CV1, GH3 или JEG3, экспрессирующие различные конструкции Tshb ¹⁵. Однако это гетерологичные системы, которые могут вводить нефизиологические регуляторные артефакты, включая эффекты, вызванные плазмидными хвоночниками, а не эндогенными транскрипционными механизмами.

Здесь мы представляем пошаговый протокол выделения тиротропов из гипофиза взрослой мыши, адаптированный из ранее установленного метода у^{крыс 9} и оптимизированный для меньшего размера и низкого содержания тиротропов в гипофизе мыши. Были внесены несколько ключевых модификаций для повышения выхода клеток, экспрессирующих Tshb, и обеспечения надёжного дальнейшего анализа. Протокол использует экспрессию поверхностного антигена CD90 — поверхностного маркера, обогащённого тиротропами. CD90 (также известный как THY1) — это мембранный белок^16,17, закреплённый на гликозилфосфатидилинозитоле^{, который} опосредует сигнализацию юкстакрина через гетеротипические взаимодействия с интегрин-β2-лиганды (ITGB2). Хотя CD90 часто ассоциируется с иммунными и нейроклетными популяциями, предыдущие транскриптомические исследования выявили обогащение Thy1 в тиротропах. Контактная сигнализация, зависящая от THY1, происходит в различных типах клеток, включая гемопоэтические клетки, Т-клетки, фибробласты, эндотелиальные клетки и нейроны, где она регулирует адгезию, миграцию, апоптоз, подавление опухолей и^фиброз 18,19,20.

Важно, что одноклеточное транскриптомическое профилирование переднего гипофиза у крысы определило Thy1 как один из наиболее выраженных генов, связанных с адгезией, в тиротропах⁵, что говорит о том, что THY1 является поверхностным маркером, обогащённым тиротропами. Кроме того, общедоступные наборы данных по секвенированию одноклеточной рибонуклеиновой кислоты (РНК) гипофиза мыши показывают, что экспрессия Thy1/CD90 обогащается^{тиротропами 22,23}. Однако его экспрессия не ограничивается полностью этой линией: экспрессия обнаруживается в подмножествах клеток линии PIT1, включая соматотропов и лактотропов, а также в популяциях, похожих на предшественников. Одноклеточные транскриптомические исследования показали значительное перекрытие между клетками гипофиза линии PIT1, включая выявление общей популяции предков PIT1, способной генерировать соматотропы, лактотропы и^{тиротропы 24}. Аналогично, Thy1/CD90 не определяет исключительно популяцию тиротропов, но может использоваться для обогащения тиротропов мышей. Основываясь на этих данных, использование антител, направленных на THY1, в нашей стратегии изоляции обеспечивает эффективный метод обогащения тиротропов после расширения, вызванного гипотиреозом, и позволяет проводить функциональные исследования, включая оценку гормональных ответов на Т3.

Протокол начинается с кормления мышей дикого типа C57BL/6 низкойодной диетой и ингибирования функции щитовидной железы метимазолом (MMI) и перхлоратом калия (_{KClO 4}) в питьевой^{воде 25}. Такое лечение вызывает значительный гипотиреоз в течение одной недели и расширяет популяцию тиротропов, экспрессирующих Tshb, в передней части гипофиза. Клетки, продуцирующие ТТГ в условиях гипотиреоза, проходят значительные физиологические и морфологические адаптации, включая гиперплазию, гипертрофию, обильное количество вакуолированной цитоплазмы, заметные цитоплазматические процессы и увеличенные лизосомы, что отражает адаптацию к отсутствию обратной связи^ТГ 26,27,28. Таким образом, индукция гипотиреоза может использоваться как стратегия расширения популяции тиротропов.

После индукции гипотиреоза мышей анестезируют изофлураном и подвергают сердечной перфузии с помощью физиологического раствора Ca²⁺/Mg^2+-свободного HEPES-буферного раствора для максимизации жизнеспособности клеток во время диссоциации тканей. После отбора передний гипофиз проходит мягкое ферментативное расщепление для образования одноклеточной суспензии, которая инкубируется фикоэритрин-цианиновым 7-конъюгированным антителом против CD90.2 для обогащения тиротропов с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS). Маркированные клетки затем собирают либо в среду роста для краткосрочного культурирования, либо в TRIzol для экстракции РНК. Для подтверждения стратегии обогащения экспрессия РНК Tshb была измерена в отсортированных популяциях и оказалась высоко обогащённой в клетках CD90. Этот метод поддерживает широкий спектр дальнейших применений у мышей, включая профилирование экспрессии генов, транскриптомные и эпигеномные анализы, высокопроизводительные анализы и первичную клеточную культуру, а также предоставляет ценную платформу для изучения клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе функции тиротропа и регуляции оси HPT.

Протокол

Этот протокол описывает выделение тиротропов из AL свежеразрезанных гипофизов, полученных у взрослых мышей после не менее 1 недели индукции гипотиреоза. Все процедуры на животных проводились в соответствии с институциональными и Национальными институтами здравоохранения рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных. Институциональный комитет по уходу и использованию животных Медицинского отдела Техасского университета одобрил все процедуры с животными.

В ходе экспериментов были объединены самцы и самки мышей, поскольку не было выявлено половых различий в выходе тиротропа или анализах по следующим линиям. В каждом эксперименте использовалось примерно 12 мышей, хотя более крупные когорты до 20 животных могут быть обработаны пропорционально масштабированием всех объёмов реагентов.

Успешная изоляция зависит от быстрой и стабильной перфузии, минимального времени вскрытия, полного удаления PL и высокоплотного покрытия первичных клеток. Рекомендуемое максимальное время обработки между эвтаназией, перфузией, рассечением гипофиза и началом ферментативного пищеварения составляло 6 часов. Клетки были покрыты с плотностью 2,0–2,5 × 10⁵ ячеек на 0,7^{см 2} скважины (площадь поверхности одной ямы стеклянной камеры с 8 лунками). Минимальная жизнеспособность составляла 95% для поддержки краткосрочной культуры тиротропов.

Все реагенты, используемые для генерации одноклеточной суспензии, были подготовлены в стерильных условиях. Рабочие поверхности стерилизовались 70% этанолом, дисекционные инструменты были автоклавированы перед использованием, а все этапы подготовки клеточной культуры выполнялись в биобезопасном шкафу с использованием асептической техники. Этот протокол был стандартизирован для 12 животных. Масштабируйте все объёмы реагентов пропорционально при использовании разного количества мышей. Обратитесь к Таблице материалов для всех реагентов, расходных материалов и оборудования.

Во время индукции гипотиреоза мышей содержались в определённых условиях, свободных от патогенов, при температурах 20°C–24°C и относительной влажности 40%–60%, с 12-часовым световым и 12-часовым тёмным циклом и иммиграционным доступом к пище и воде. Животных содержали в группах (до трёх мышей в клетке) в индивидуально проветриваемых клетках со стандартной подстилкой и обогащением окружающей среды, включая материалы для гнездования и укрытия. Успешная индукция гипотиреоза была подтверждена путём измерения экспрессии печеночной йодотиреронидейодиназы (Dio1). Снижение экспрессии дио1-мессенджерной РНК (мРНК) не менее чем на 50% по сравнению с мышами с эутиреоидным контролем считалось признаком успешной индукции гипотиреоза.

1. Индукция гипотиреоза у мышей C57BL/6

ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите эту процедуру в течение 7–10 дней, чтобы вызвать гипотиреоз in vivo с помощью йододефицитной диеты и химического ингибирования функции щитовидной железы. См. рисунок 1A для экспериментального дизайна и рисунок 1B для подтверждения индукции гипотиреоза.

Рисунок 1. Индукция гипотиреоза у мышей C57BL/6. (A) Схематическое представление экспериментального рабочего процесса, используемого для индуцирования гипотиреоза у взрослых мышей C57BL/6. Мыши получали 0,05% метимазола (MMI) и 0,1% перхлората калия (KClO₄) в питьевой воде вместе с йододефицитной диетой в течение 7 дней перед выделением переднего гипофиза. (B) Анализ экспрессии дио1-мессенджерной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) печени с помощью количественной полимеразной цепной реакции (RT-qPCR). В качестве эталонного гена использовался циклофилин A (CyA). Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD) (n = 6 на группу). Статистическая значимость определялась с помощью t-теста Студента. **P < 0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

1. Приготовьте питьевую воду MMI/KClO₄
   1. Растворите 1 г MMI и 2 г KClO₄ в 2 литрах фильтрованной воды.
   2. Перемешайте раствор при комнатной температуре (20°C–25°C) в течение 1 часа до полного растворения.
      ВНИМАНИЕ: MMI и KClO₄ — опасные химикаты. Наденьте перчатки, лабораторный халат и защиту для глаз во время подготовки и обращения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: MMI ингибирует организацию йодида, тогда как KClO₄ блокирует поглощение йодида через натрий-йодидовый^{симпортер 25}. Меняйте питьевой раствор каждые 2 дня, чтобы поддерживать правильную дозировку и минимизировать загрязнение от постельного белья, пищевых остатков и микробного роста. Если не использовать сразу, храните раствор в плотно запечатанной светостойкой ёмкости при 4°C до 14 дней.
2. Индуцировать гипотиреоз
   1. Содержать 8-недельных самцов или самок мышей C57BL/6 в группах по три животных в клетке в условиях содержания без йода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Домашние мыши в определённых условиях, свободных от патогенов, при 20°C–24°C и относительной влажности 40%–60%, с циклом света 12 часов и 12 часов темноты, а также иммиграционным доступом к пище и воде. Содержать животных в индивидуально вентилируемых клетках, содержащих стандартную подстилку и обогащение окружающей среды, включая материалы для гнездования и укрытия. Акклиматизируйте животных в течение 3 дней перед началом лечения. Содержат самцов и самок мышей отдельно. В описанных здесь экспериментах группа эвтиреоидов состояла из шести самцов и шести самок, размещённых в отдельных клетках, а группа гипотиреоидов — из шести самцов и шести самок в отдельных клетках. При подготовке клеток собирали AL у самцов и самок мышей в одной группе лечения, поскольку не было выявлено половых различий в выходе тиротропа или анализах пола.
   2. Кормите мышей йододефицитной диетой ad libitum в течение 7–10 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инициируйте диету, содержащую дефицит йода, и лечение MMI/KClO₄ одновременно.
   3. Обеспечивать питьевой водой с 0,05% MMI и 0,1% KClO₄ ad libitum на протяжении всего периода обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте лечение до эвтаназии. Ежедневно отслеживайте массу тела, потребление пищи, потребление воды и клинические симптомы во время индукции гипотиреоза. Успешная индукция гипотиреоза обычно связана с уменьшением набора массы тела и клиническими признаками, такими как снижение активности или тусклое покрытие шерсти по сравнению с эутиреоидными контролями. Семидневные и десятидневные периоды индукции обеспечивают сопоставимую эффективность обогащения тиротропом.

2. Сердечная перфузия и расщепление AL

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте эту процедуру примерно за 15 минут на мышь, чтобы максимизировать жизнеспособность тканей и сохранить целостность клеток при изоляции гипофиза.

1. Подготовка растворов для перфузии и сбора
   1. Приготовьте физиологический раствор, буферируемый HEPES (HBSS) без Ca²⁺ и Mg²⁺
      1. Комбинируйте 667 мл 0,9% NaCl, 20 мл 1 M HEPES и 313 мл двойной дистиллированной воды (ddH₂O), чтобы получить 1 л индивидуально приготовленного HBSS без Ca²⁺ и Mg²⁺.
      2. Автоклавуйте раствор и храните при 4°C до использования.
   2. Приготовьте гепаринизированный HBSS без Ca²⁺ и Mg²⁺
      1. Добавьте 27 мкл эноксапарина натрия (100 мг/мл стандартного раствора) на 50 мл индивидуально приготовленного HBSS без Ca²⁺ и Mg²⁺.
   3. Подготовка среды для сбора (КМ)
      1. Объедините 440 мл модифицированной среды Eagle от Dulbecco, 50 мл теплово инактивированной сыворотки плода (FBS), 4 мл L-глутамин и 10 мл 1 M HEPES в итоговый объём 500 мл.
      2. Фильтруйте раствор с помощью фильтра 0,22 мкм и храните при 4°C до месяца.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Перед хранением подготовьте аликвоты объёмом 50 мл под шкафом для биобезопасности, чтобы минимизировать загрязнение.
      3. Прогрейте CM до 20°C до 25°C перед использованием.
   4. Стерилизация диссектирующих инструментов
      1. Перед использованием стерилизуйте ножницы, щипцы, пинцеты, держатели для игл, щипцы радужки, хирургические ложки и тупые зонды с помощью 75% этанола.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте инструментам полностью высохнуть на воздухе после стерилизации этанола до контакта с тканями.
2. Проведите кардиоперфузию
   1. Глубоко анестезируйте мышь с помощью изофлурана, подаваемого в 100% кислороде. Индуцировать анестезию в камере с 5% изофлурана и поддерживать анестезию через носовой конус при 3% изофлуране с постоянным мониторингом и удалением отходов.
      ВНИМАНИЕ: Проводите процедуры анестезии изофлураном в соответствии с институциональными стандартами безопасности и используйте соответствующие системы удаления средств для минимизации воздействия вдыхания.
   2. Подтвердите полную анестезию, проверив отсутствие рефлектора отмены педалей с помощью защемления пальца ноги.
   3. Распылите животное 75% этанола и поместите его на стадию перфузии в кастрюле для сбора.
   4. Закрепите конечности, чтобы обнажить брюшинную область.
   5. Аккуратно открывайте грудную полость, избегая повреждения основных органов и кровеносных сосудов.
   6. Разрежьте вдоль рёбер, чтобы создать грудной клапан, сложите её над головой и закрепите гемостатом.
   7. Стабилизируйте сердце с помощью зажима и введите иглу 23-го калибра в вершину левого желудочка.
   8. Подключите иглу к перистальтическому насосу с помощью силиконовой трубки.
   9. Начните перфузию с гепаринизированным HBSS без Ca²⁺ и Mg²⁺ при комнатной температуре.
   10. Разрез правого предсердия сразу после начала перфузии, чтобы обеспечить дренаж.
   11. Пропустите животное в течение 5 минут при расходе 3 мл/мин.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите успешную перфузию, наблюдая видимое бледнение печени.
3. Изолировать AL
   1. Обезглавить мышь сразу после перфузии.
   2. Удалять кожу головы и черепные кости с помощью тонких ножниц и щипцов, чтобы обнажить мозг.
   3. Вставьте хирургическую ложку между мозгом и черепом.
   4. Аккуратно поднимите мозг и перережьте зрительную хиазму.
   5. Удалите тонкую менингеальную мембрану (дура матер), покрывающую гипофиз, под стереомикроскопом с помощью тонкого пинцета.
   6. Аккуратно разберите и отбросьте PL, как показано на рисунке 2A.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите AL как крупную розовую ткань, расположенную рострально. Определите PL как меньшую бело-прозрачную ткань, расположенную сверху.
   7. Обрезать окружающую соединительной ткани и остаточные менингеальные мембраны тупым зондом для улучшения доступа к AL.
   8. Захватите AL тупым пинцетом и переместите его в полипропиленовую трубку объёмом 15 мл с 1,8 мл КМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пулируйте AL от 12 животных в одну трубку для сбора животных.
   9. Держите образец при комнатной температуре до завершения всех вскрытий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 3 часа между сбором тканей и запуском ферментативного пищеварения, чтобы минимизировать потерю жизнеспособности клеток.
4. Подтверждение индукции гипотиреоза
   1. Возьмите небольшой образец печени (примерно 50 мг) с каждой мыши.
   2. Количественно оценить экспрессию мРНК дио1 печени с помощью реального времени обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции и сравнить её с необработанными эутиреоидными контролями (рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите успешную индукцию гипотиреоза как снижение экспрессии Дио1 в печени не менее чем на 50% по сравнению с контролем по эутиреозу. Экспрессия Dio1 положительно коррелирует с циркулирующими уровнями^{TH 29}; следовательно, сниженная экспрессия Dio1 подтверждает успешную индукцию гипотиреоза.
5. Повторный сбор тканей
   1. Повторите шаги 2.2–2.4. пока не будут собраны AL из 12 мышей.
   2. Немедленно переходите к шагу 3.

Рисунок 2. Подготовка одной клеточной суспензии из переднего гипофиза мыши. (A) Рабочий процесс, иллюстрирующий диссекцию передней доли (AL), ферментативную диссоциацию и подготовку одноклеточной суспензии для флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS). Рабочий процесс включает удаление задней доли, переваривание коллагеназы, переваривание трипсина–этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и фильтрацию перед анализом FACS. (B) Репрезентативные изображения окрашивания с окрашиванием жизнеспособности и автоматического подсчёта клеток диссоциированных клеток переднего гипофиза у мышей у эвтиреоидных и гипотиреоидных мышей. Показаны общий выход ячеек и концентрация жизнеспособных ячеек. Шкала = 200 мкм. (C) Распределение диаметров передних клеток гипофиза после диссоциации ткани и подготовки к дальнейшему анализу FACS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры. 

3. Подготовка суспензии с одной ячейкой из мыши AL

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эту процедуру примерно за 60 минут, чтобы создать суспензию из передней части гипофиза.

1. Приготовьте ферментативные растворы для пищеварения
   1. Приготовьте раствор коллагеназы 2%
      1. Растворить 100 мг коллагеназы из Clostridium histolyticum (>125 единиц переваривания коллагеназы/мг твёрдого вещества) в 4,9 мл ddH₂O.
      2. Добавьте 100 мкл 1 М HEPES для получения итогового объёма 5 мл.
      3. Стерилизуйте раствор с помощью фильтра 0,22 мкм.
      4. Раствор наливайте в объёмы 200 мкл и храните при −30°C до 2 месяцев.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторяющихся циклов заморозки и оттаивания. Не используйте повторно размораживанные аликвоты коллагенази.
   2. Приготовьте 0,25% трипсина–этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА)
      1. Смешайте 1 мл 0,5% трипсина–ЭДТА с 1 мл HBSS без Ca²⁺ и Mg²⁺.
      2. Храните раствор при 4°C до использования.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте разбавленный раствор трипсина и EDTA в день приготовления. Не храните и не используйте повторно разбавленный трипсин–ЭДТА.
2. Проведите переваривание коллагеназы
   1. Добавьте 200 мкл раствора 2% коллагеназы в собранные ткани AL.
   2. Аккуратно перемешайте ткань, пипетируя с помощью микропипетки P1000 с наконечниками с низким удержанием.
   3. Инкубировать суспензию в водяной бане при температуре 37°C в течение 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите крышку трубки закрытой во время инкубации, чтобы минимизировать загрязнение.
   4. Осторожно постукивайте по трубке каждые 5 минут во время инкубации.
3. Проведите пищеварение дезоксирибонуклеазы I (DNase I)
   1. Добавьте 5 мкл ДНКазы I (1 U/μL) непосредственно в суспензию, не удаляя супернатант.
   2. Аккуратно постучите по трубке 10 раз, чтобы перемешать раствор.
   3. Инкубировать подвеску при 37°C в течение 5 минут.
4. Пеллетируйте ткань
   1. Центрифугуйте подвеску при 100 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
   2. Аккуратно удалите супернатант с помощью пипетки объемом 1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте примерно 50 мкл остаточной жидкости над гранулой во время супернатантного удаления, чтобы минимизировать потерю клеток.
5. Проведите пищеварение трипсина
   1. Добавьте 2 мл 0,25% трипсина–ЭДТА в пеллет.
   2. Инкубировать суспензию при 37°C в течение 10–15 минут, пока не останется никаких видимых целостных фрагментов ткани.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 15 минут, чтобы избежать чрезмерного переваривания тканей и снижения жизнеспособности клеток.
6. Остановить ферментное пищеварение и диссоциировать ткань
   1. Добавьте 2 мл CM, чтобы остановить трипсинизацию.
   2. Пипетировать суспензию аккуратно вверх и вниз 10–20 раз с помощью микропипетки, установленной на 1 мл, пока не останется видимых фрагментов ткани.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При механической диссоциации используйте наконечники пипеток с низким удержанием. Допустимая суспензия с одной ячейкой — это однородная, низковязкая суспензия, содержащая преимущественно одиночные клетки с минимальным количеством видимых заполнителей или мусора (≤5–10% комков при микроскопическом осмотре с использованием исключения Trypan Blue).
7. Собрать подвеску с одной ячейкой
   1. Центрифугуйте подвеску при 100 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
   2. Аккуратно снимите супернатант.
   3. Немедленно переходите к шагу 4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начинайте окрашивание в течение 15 минут после подготовки к суспензии в одной клеточной суспензии и завершите сортировку клетки в течение 1 часа, когда это возможно. Сохраняйте клетки на льду в этот период, чтобы минимизировать потерю жизнеспособности.

4. Окрашивание для сортировки клеток с флуоресценцией

ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите эту процедуру примерно за 60 минут, чтобы окрашить диссоциированные клетки переднего гипофиза на FACS CD90-положительных клеток.

1. Подготовьте подвеску камеры
   1. Добавьте 350 мкл буфера для окрашивания, состоящего из фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS, 1×), содержащего 2% FBS и 0,09% азида натрия, в клеточную гранулу.
   2. Аккуратно подвесьте гранулу, 10 раз подняв и опустив пипетку с помощью микропипетки P1000 с наконечниками с низким удержанием, чтобы получить подвеску на одну ячейку.
   3. Перенесите подвеску в микроцентрифугу с низким содержанием 1,5 мл.
2. Определить концентрацию и жизнеспособность клеток
   1. Удалите аликвот объемом 5 мкл из суспензии для подсчёта клеток.
   2. Смешайте аликвот с красителем на 5 мкл.
   3. Загрузите 10 мкл смеси в автоматический счётчик ячейок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переходите к FACS, когда жизнеспособность клеток достигает ≥85%, как определяется исключением красителей для жизнеспособности, и при минимальном количество обломков и заполнений клеток.
   4. Подтвердите, что общая концентрация клеток составляет примерно 1 × 10⁷ клеток/мл для образцов эутиреоидов и 2 × 10⁷ клеток/мл для образцов гипотиреоидов (рисунок 2B). Распределение размеров клетки после диссоциации показано на рисунке 2C.
3. Подготовьте компенсационные контроли
   1. Перенесите 50 мкл суспензии ячейки в буфер для окрашивания объемом 300 мкл.
   2. Разделите подвеску на три аликвоты по 100 мкл, размещённые в отдельных микроцентрифугных трубках по 1,5 мл.
   3. Подготовьте следующие контрольные методы: (i) неокрашенный контроль, (ii) контроль только с йодидом пропидия (PI) и (iii) контроль только с помощью фикоэритрин-цианина 7 (PE-Cy7) только CD90.2.
4. Окрашивайте клетки
   1. Добавьте 3 мкл PE-Cy7-конъюгированного анти-CD90.2 антитела к суспензии клеток 300 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация антител была определена в ходе предыдущих титровых экспериментов. Окончательное разбавление на 1:100 обеспечивало оптимальное разделение между положительными и отрицательными популяциями при минимизации фоновых окрашиваний.
   2. Добавьте 1 мкл антитела к контролю компенсации CD90.2 для получения окончательного разбавления 1:100.
   3. Инкубировать все образцы на льду в темноте в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно смешивайте образцы каждые 10 минут во время инкубации, чтобы сохранить однородное окрашивание.
5. Помой запятнанные клетки
   1. Добавьте 1 мл буфера для холодной окрашивания в каждую тюбику.
   2. Центрифугуйте образцы при 210 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть возможность, отключите тормоз центрифуги, чтобы минимизировать разрушение работы клеточной гранулы во время замедления.
   3. Аккуратно удалите и выбросьте супернатант.
6. Повторно подвесьте окрашенные клетки
   1. Повторно подвесьте основную ячейку в буфере для окрашивания объемом 300 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте PI непосредственно перед сортировкой до конечной концентрации 1 мкг/мл.
   2. Подвесьте каждый регулятор компенсации в буфере окрашивания на 100 мкл.
7. Фильтруйте суспензию ячейки
   1. Фильтруйте суспензию ячейки через проточную цитометрическую трубку с фильтром 35 мкм перед сортировкой.
8. Перейти к сортировке клеток с флуоресценцией
   1. Немедленно перейдите к шагу 5 и сортируйте окрашенные клетки с помощью флуоресцентно-активированного сортировщика.

5. Стратегия гейтинга и сортировки FACS

ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите эту процедуру примерно за 60 минут, чтобы выделить жизнеспособные CD90.2-положительные тиротропы с помощью FACS.

1. Настройте сортировщик ячеек
   1. Установите сопло 100 мкм на сортировщик ячеек.
   2. Установить давление в оболочке на 20 psi.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильную жидкость на основе PBS, поддерживаемую при комнатной температуре.
2. Осуществлять контроль качества приборов
   1. Проведите процедуры контроля качества приборов в соответствии с инструкциями производителя перед отбором образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогичные рекомендованные производителем рабочие процессы контроля качества могут использоваться на альтернативных сортировщиках ячеек.
   2. Проверьте задержку падения и стабильность потока с помощью калибровочных бусин.
3. Выполните компенсацию флуоресценции
   1. Приобретите регуляторы компенсации по одному цвету.
   2. Перед гейтингом и сортировкой выполните компенсацию флуоресценцией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитывайте компенсацию с помощью неокрашенных и однократных контролей. Проверяйте и корректируйте компенсационные матрицы вручную перед сортировкой, когда это необходимо.
4. Определите стратегию гейтинга
   1. Исключить мусор с помощью параметров прямого и бокового рассеяния (рисунок 3A,B).
   2. Одиночные элементы затвора с использованием высоты прямого рассеяния против площади прямого рассеяния и высоты бокового рассеяния против площади бокового рассеяния (рисунок 3A,B).
   3. Исключайте мёртвые клетки путём гейтинга PI-отрицательных клеток.
   4. Гейт CD90.2-положительные клетки для обогащения тиротропами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите CD90.2-положительные клетки как события, демонстрирующие интенсивность флуоресценции более 10³ в канале обнаружения CD90 (рисунок 3C–F).
5. Подготовьте сборные трубки
   1. Подготовьте сборные трубки в соответствии с предполагаемым следующим применением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно заполните пробирки с низкой задержкой либо 1 мл реагента для лизиса QIAzol для выделения РНК, либо Medium 199, дополненную сывороткой плода с 10% угольной очисткой для клеточной культуры.
6. Сортировать тиротропы CD90.2-положительные
   1. Сортируйте CD90.2-положительные одиночные клетки в сборные трубки.
   2. Собирайте клетки для анализа РНК
      1. Собирайте клетки непосредственно в реагент с лизисом 1 мл.
      2. Закрутите трубки в течение 1 минуты, чтобы лизировать клетки.
      3. Сразу заморозьте образцы на сухом льду.
      4. Храните образцы при −80°C до экстракции РНК.
   3. Собирайте клетки для первичной культуры
      1. Соберите клетки в культурную среду, дополненную 10% сывороткой плода с углём и 1% пенициллин-стрептомицином.
      2. Засеять клетки в стеклянные камеры с 8 лунками при плотности не менее 2 × 10⁵ клеток на колодцу в итоговом объёме 200 мкл.
      3. Культивировать клетки до 72 часов при 37°C в увлажнённом инкубаторе, содержащем 5% CO₂.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Приемлемая эффективность посева определяется видимым прикреплением клеток в течение 24 часов, примерно 60%–80% эффективности прикрепления и ≥70–80% жизнеспособности после 72 часов.
      4. При необходимости добавляйте 100 нм T3 в посевную среду.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Начинайте обработку T3 после прикрепления клетки, обычно через 24 часа после нанесения пластины, и продолжайте обработку до сбора образца через 72 часа. Приготовьте раствор T3 в 40 мМ NaOH и включите контрольные компоненты, обработанные транспортными средствами, при той же конечной концентрации растворителя.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка с углём поддерживает среду культуры, истощённую TH, и улучшает обнаружение экспериментально индуцированного T3-зависимого подавления экспрессии Tshb .

Рисунок 3. Стратегия гейтинга FACS и валидация обогащения тиротропом. (A,B) Последовательная стратегия гейтинга, используемая для выделения жизнеспособных одиночных передних клеток гипофиза. Элементы включают исключение обломков с использованием области прямого рассеяния (FSC-A) и бокового рассеяния (SSC-A), различения синглетов с помощью высоты прямого рассеяния (FSC-H) против FSC-A и боковой высоты рассеяния (SSC-H) против SSC-A, а также исключение мёртвых клеток йодида пропидия (PI)-положительных. (C–F) Репрезентативные графики FACS, показывающие идентификацию и обогащение CD90.2-положительных и CD90.2-отрицательных популяций клеток с использованием анти-CD90.2-конъюгированного антитела с фикоэритрин-цианином-7 (PE-Cy7). (G–I) Валидация обогащения тиротропами в отсортированных клеточных популяциях с помощью обратной транскрипции количественной полимеразной цепной реакции (RT-qPCR). Сокращения: FSC-A, зона рассеяния вперёд; SSC-A, зона бокового рассеяния; FSC-H, высота прямого рассеяния; SSC-H, высота бокового рассеяния; ПИ, пропидий-йодид; PE-Cy7, фикоэритрин–цианин 7; Нейротипичный — не лечился. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

6. Анализ экспрессии генов мРНК Tshb в CD90-положительных клетках по сравнению с CD90-отрицательными посредством реального времени полимеразной цепной реакции

ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите эту процедуру примерно за 5 часов для количественной оценки экспрессии мРНК Tshb в отсортированных популяциях клеток.

1. Собирайте отсортированные клетки для экстракции РНК
   1. Соберите равное количество CD90-положительных и CD90-отрицательных клеток (2,5 × 10⁵ клеток) в отдельные трубки по 1,5 мл, содержащие 1 мл лизисного реагента.
2. Лизировать клетки
   1. Интенсивно выкрутите образцы в течение 1 минуты, чтобы полностью лизировать клетки и поместить образцы на лёд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости перед экстракцией РНК храните лизированные образцы при температуре −80°C.
3. Извлечение полной РНК
   1. Извлекайте всю РНК согласно инструкциям производителя, предоставленным в комплекте для экстракции РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время очистки проведите переваривание DNase I без РНазы согласно инструкциям производителя для удаления остаточной геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) перед её размывкой.
   2. Измеряйте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте образцы с соотношением A260/A280 примерно 1,8–2,1 и соотношением A260/A230 больше 1,8 для синтеза комплементарной ДНК (cDNA).
4. Синтезировать кДНК
   1. Синтезировать кДНК из 100 нг общей РНК согласно инструкциям производителя, предоставленным в комплекте для синтеза кДНК первой цепочки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте олиго(dT) праймеры во время синтеза кДНК.
   2. Приготовьте шаблонно-грунтовую смесь согласно таблице 1.
   3. Аккуратно перемешайте реагенты и ненадолго центрифугируете, чтобы собрать образец на дне пробирки.
   4. Денатурировать шаблонно-грунтовую смесь при 65°C в течение 10 минут.
   5. Охладите образцы сразу на льду.
   6. Подготовьте смесь реакций обратной транскрипции согласно таблице 2 , чтобы получить итоговый объём 20 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте мастер-смесь, умножив объёмы реагентов, указанные в Таблице 2 , на общее количество образцов и добавив дополнительно 10% избыточного объёма для учёта вариабельности пипетирования.
   7. Аккуратно перемешайте реакцию без вихря и ненадолго центрифугайте.
   8. Инкубировать реакцию при 50°C в течение 60 минут.
   9. Инактивировать реакцию при 85°C на 5 минут.
   10. Охлаждайте образцы на льду.
   11. Сразу переходите к количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-qPCR) или храните кДНК при −30°C до использования.
       ПРИМЕЧАНИЕ: кДНК может храниться при −30°C до 6 месяцев в условиях без нуклеаз. Избегайте повторяющихся циклов заморозки и оттаивания.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этапы синтеза cDNA в термоциклере с нагреваемой крышкой, чтобы минимизировать испарение.
5. Приготовьте реакционную смесь RT-qPCR
   1. Приготовьте реакционную смесь RT-qPCR согласно таблице 3.
6. Загрузить пластину RT-qPCR
   1. Добавьте 9 мкл реакционной смеси RT-qPCR в каждую скважину пластины с 96 лунками.
   2. Добавьте 1 мкл кДНК-шаблон, соответствующий обратно-транскрибированному продукту, образованному из 5 нг входной общей РНК.
   3. Аккуратно перемешайте образцы и ненадолго центрифугайте.
7. Выполнить RT-qPCR
   1. Выполните RT-qPCR согласно инструкциям производителя, предоставленным в мастер-миксе SYBR Green.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте начальный этап денатурации 95°C в течение 2 минут, затем 40 циклов при 95°C в течение 5 с и 60°C в течение 30 секунд. Получайте флуоресценцию в конце каждого этапа расширения. Проведите анализ кривой расплава от 65°C до 95°C с шагом к 0,5°C для подтверждения усиления одного продукта.
8. Нормализация экспрессии Tshb
   1. Нормализуйте экспрессию Tshb в экспрессию циклофилина A (CyA) с помощью метода ΔCt.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте стабильность CyA перед анализом, подтвердив минимальную вариацию CT между экспериментальными группами.
9. Рассчитать относительную экспрессию генов
   1. Рассчитать относительную экспрессию Tshb в CD90-положительных клетках относительно CD90-отрицательных клеток с использованием метода 2^−ΔΔCt .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите RT-qPCR-анализ с использованием восьми биологических образцов, каждый из которых анализируется в технических дубликативных реакциях (рисунок 3G–I).

Реагент	Объём	Итоговое количество/концентрация
Общая РНК	Переменная	100 ng
Закреплённый грунт oligo(dT)18 (50 пмоль/мкл)	1 мкл	2,5 мкм
Вода с ПЦР-классом	Переменная	Отрегулировать до 13 мкл общего объёма
Total	13 мкл	—

Таблица 1: Подготовка смеси шаблон–грунтовка для комплементарного дезоксирибонуклеинового синтеза кислот. Реагенты, объёмы и конечные количества, используемые для подготовки смеси шаблон–праймер для синтеза комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК). Каждая реакция содержала 100 нг общего содержания рибонуклеиновой кислоты (РНК), закреплённый олиго(dT)18 праймер и воду полимеразной цепной реакции (ПЦР), отрегулированную до конечного объёма 13 мкл. Заявленная концентрация 2,5 мкм относится к концентрации праймера в 13 мкл шаблонно-праймерной смеси до добавления компонентов реакции обратной транскрипции.

Реагент	Объём	Итоговое количество/концентрация
Буфер реакции транскриптора с обратной транскриптазой (5×)	4 мкл	1×
Протекторный ингибитор РНазы (40 U/μL)	0,5 мкл	20 U
Смесь дезоксинуклеотида (по 10 мМ каждая)	2 мкл	1 мМ каждую
Транскрипторная обратная транскриптаза (20 U/μL)	0,5 мкл	10 U
Смесь шаблон–грунтовка (Таблица 1)	13 мкл	—
Total	20 мкл	—

Таблица 2: Смесь реакций обратной транскрипции для комплементарного дезоксирибонуклеинового синтеза кислот . Реагенты, объёмы и конечные концентрации, используемые для синтеза комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) первой цепочки. Итоговый объём реакции составлял 20 мкл. Указанные концентрации дезоксинуклеотидтрифосфата (по 1 мМ каждая) относятся к конечным концентрациям в полной реакционной смеси.

Реагент	Объём	Итоговое количество/концентрация
PowerTrack SYBR Green Master Mix (2×)	5 мкл	1×
Грунты Tshb вперёд и обратно олигонуклеотидные грунты (см. таблицу материалов)	0,5 мкл	400 нМ
Вода с ПЦР-классом	3,5 мкл	Отрегулировать реакционный объём до 9 мкл
Субобщий объём реакции	9 мкл	—
Шаблон cDNA	1 мкл	5 ng
Итоговый реактивный объём	10 мкл	—

Таблица 3: Обратная транскрипция, количественная полимеразная цепная реакция, приготовление смеси цепной реакции. Реагенты, объёмы и конечные концентрации, используемые для обратной транскрипционной количественной полимеразной цепной реакции (RT-qPCR) амплификации рибонуклеиновой кислоты Tshb (мРНК). Объём реакционной смеси до добавления шаблона составлял 9 мкл. Добавьте 1 мкл шаблона комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) непосредственно перед амплификацией, чтобы получить итоговый объём реакции 10 мкл.

Результаты

Двенадцать 8-недельных мышей C57BL/6 (6 самцов и 6 самок) были обработаны MMI и KClO₄ в питьевой воде вместе с йододефицитной диетой в течение 1 недели для индуцирования гипотиреоза (рисунок 1A). Экспрессия дио1 мРНК печени типа 1 была количественно измерена у эутиреоидных и гипотиреоидных мышей для подтверждения успешной индукции гипотиреоза²⁹. Гипотиреоидные мыши показали примерно 60% снижение экспрессии дио1 мРНК ...

Обсуждение

Протокол FACS на основе CD90, описанный здесь, предлагает воспроизводимый метод обогащения первичных тиротропов из ткани гипофиза взрослых мышей при сохранении гормональной реакции. Этот метод решает давнее техническое ограничение в изучении биологии тиротропов и регуляции осей ГПТ. Исторически исследования регуляции тиротропов в значительной степени опирались на клеточную линию TαT1; однако клетки TαT1 демонстрируют очень низкую базальную экспрессию Tshb и не всегда демонстриру...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0.22 µm фильтр	Corning	430769	Для стерилизации среды для сбора
0.22 µm фильтр для шприца	Pall Life Sciences	PN4602	Для стерилизации коллагеназы
0.5% трипсин-ЭДТА	Gibco	15400-054	Для диссоциации клеток
1.5 мл микроцентрифужные пробирки с низким сцеплением	Invitrogen	AM12450	Для окрашивания FACS
15 мл полипропиленовые пробирки	Falcon	352097	Для сбора переднего дольки и диссоциации клеток
23-игольная игла	BD Vacutainer Safety-Lok	367283	Для сердечной перфузии
8-камерная стеклянная камера-камера	Millipore	PEZGS0816	Для культуры после FACS
Шарики Accudrop	BD Biosciences	345249	Для калибровки задержки капли во время FACS
Периферический анти-мышиный антиген PE-Cy7-анти-CD90.2	Invitrogen	25-0902-82	Для окрашивания FACS
Автоматизированный счетчик клеток	DeNovix	s-10700	Для подсчета клеток
Сыворотка бычьей плодовитости, обработанная десорбцией	Gibco	12676029	Для культуры тиротропов после FACS
Коллагеназ из Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9263	Для диссоциации клеток
Панель для сбора	Стандартный лабораторный рассекающий лоток	N/A	Для сердечной перфузии
Настраиваемый буферный раствор HEPES без Ca2+ и Mg2+	N/A	N/A	Для перфузии и диссоциации клеток
Прямой праймер олигонуклеотида А циклофилин А (CyA)	Integrated DNA Technologies	5’-GCC GAT GAC GAG CCC TTG-3’	Для RT-qPCR
Обратный праймер олигонуклеотида А циклофилин А (CyA)	Integrated DNA Technologies	5’-TGC CGC CAG TCG CAT TAT-3’	Для RT-qPCR
DMEM, 1×	Gibco	11965-092	Для среды для сбора
Раствор DNase I	Promega	M6101	Для диссоциации клеток
Инъекция натрия эноксапарина	Sandoz	0781-3119-64	Для перфузии
Бычья плодовитая сыворотка (FBS)	Cytiva HyClone	SH30088.02HI	Для среды для сбора
Буфер для окрашивания в цитометрии потока	Invitrogen	00-4222-26	Для окрашивания FACS
Гемостат	Fine Science Tools	13008-12	Для стабилизации грудной полости
HEPES, 1 М	Gibco	15630-080	Для среды для сбора
HEPES, 1 М	Teknova	H1035	Для приготовления HBSS
Диетологическая пища без йода	Envigo	TD.95007	Для внутриорганизменной индукции гипотиреоза
Ирисовые форцепсы	Fine Science Tools	11065-07	Для диссекции гипофиза
Изофлуран	Piramal Critical Care	66794-017-25	Для анестезии
L-глютамин	Gibco	35050-061	Для среды для сбора
Среда 199	Gibco	11150-059	Для культуры после FACS
Метимазол (MMI)	Sigma-Aldrich	M8506-100G	Для внутриорганизменной индукции гипотиреоза
Микроамперная быстрая 96-лунковая реакционная пластинка	Applied Biosystems	4346907	Для RT-qPCR
Пенicillin-стрептомицин	Gibco	15140122	Для культуры после FACS
Перистальтический насос	Fisher Scientific	GP1000	Для сердечной перфузии
Перхлорат калия (KClO4)	Sigma-Aldrich	241830-500G	Для внутриорганизменной индукции гипотиреоза
PowerTrack SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A46109	Для RT-qPCR
Пропидий иодида	eBioscience	00-6990-50	Для окрашивания жизнеспособности во время FACS
Реагент лизиса QIAzol	Qiagen	79306	Для извлечения РНК
Силиконовая труба	Cole-Parmer	EW-96410-13	Для сердечной перфузии
Стереомикроскоп	Nikon	SMZ-745T	Для диссекции передней дольки
Система реального времени StepOnePlus Real-Time PCR	Applied Biosystems	4376600	Для RT-qPCR
Хирургическая ложка	Fine Science Tools	10090-13	Для поднятия мозга во время вскрытия гипофиза
Набор для синтеза первой цепи cDNA Transcriptor	Roche	4379012001	Для приготовления комплементарной ДНК
Трипан-синий	Thermo Fisher Scientific	T10282	Для подсчета клеток
Прямой праймер олигонуклеотида Тshb	Integrated DNA Technologies	5’-TCT GTG CTG GGT ATT GTA TGA C-3’