В данном исследовании интегрированы общедоступные наборы данных, валидация на парных образцах тканей, анализы миграции клеток, прогнозирование сетей мишеней и анализ иммунных сигнатур для оценки роли miR-192-5p при колоректальном раке. Результаты указывают на несоответствие между данными экспрессии TCGA/GDC и локальными результатами qRT-PCR, а также предостерегают от чрезмерной интерпретации диагностической, прогностической, функциональной и иммунологической значимости данного микроРНК.
Исследовательская статья
Клиническая значимость, ландшафт иммунной инфильтрации и анализ функциональных сетей miR-192-5p при колоректальном раке
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Колоректальный рак (КРР) представляет собой гетерогенное злокачественное новообразование, при котором микроРНК могут способствовать прогрессированию опухоли и поиску биомаркеров. В данном исследовании оценивалась клиническая значимость, иммунные ассоциации и функциональная сеть miR-192-5p при КРР путем интеграции биоинформатического анализа данных TCGA/GDC и GEO, валидации методом qRT-PCR в парных образцах тканей, прогнозирования мишеней, анализа иммунного профиля и экспериментов по заживлению ран на клетках HT29. Повторный анализ данных miRNA-seq из TCGA/GDC, включающий 616 опухолевых и 11 нормальных образцов COADREAD, показал более высокий уровень сигнала hsa-mir-192 в опухолевых образцах по сравнению с нормальными (критерий Манна-Уитни p = 9.96 x 10-8). Та же тенденция наблюдалась в 11 парных случаях TCGA (медианная разница между опухолью и нормой = 3.13 log2[RPM + 1], критерий Уилкоксона p = 0.0029), тогда как локальный анализ qRT-PCR в парных клинических тканях подтвердил более низкую экспрессию зрелой miR-192-5p в тканях КРР. ROC-анализ на основе данных TCGA продемонстрировал четкое разделение между опухолью и нормой, однако анализ сбалансированного ресэмплинга и метод исключения одного нормального образца (leave-one-normal-out) подтвердили, что этот результат следует интерпретировать с осторожностью из-за ограниченного количества нормальных образцов. Клинико-патологический анализ выявил связь со стадией N и возрастом в когорте TCGA, в то время как стадии T и M не были значимыми в сводной таблице, а анализ общей выживаемости не показал значимой прогностической связи. Анализ потенциальных центральных генов (hub-genes) с использованием RNA-seq TCGA предоставил предварительные данные об экспрессии, корреляции и выживаемости, но не установил прямого воздействия miR-192-5p. Анализ иммунного профиля выявил гетерогенные, преимущественно слабые корреляции. Функционально трансфекция мимика miR-192-5p замедлила закрытие раны в клетках HT29. Эти результаты указывают на то, что miR-192-5p биологически значима для КРР, однако направление её экспрессии и клиническая интерпретация зависят от используемой платформы и требуют дальнейшего экспериментального подтверждения.
Введение
Колоректальный рак (КРР) является одним из самых распространенных злокачественных новообразований во всем мире и остается ведущей причиной смертности от рака1,2. Несмотря на то, что колоноскопия, иммунохимический анализ кала, тест на метилирование SEPT9, циркулирующие опухолевые маркеры и молекулярное профилирование улучшили диагностику КРР и тактику клинического ведения пациентов3,4, сохраняется значительная гетерогенность биологии опухоли, ответа на лечение и исходов заболевания5,6,7. Таким образом, биомаркеры, помогающие охарактеризовать биологию КРР, могут способствовать стратификации рисков и разработке более индивидуализированных терапевтических стратегий8.
МикроРНК (мРНК) представляют собой короткие некодирующие РНК длиной примерно 19–24 нуклеотида, которые регулируют экспрессию генов преимущественно посредством посттранскрипционных механизмов9. Нарушение экспрессии мРНК может влиять на пролиферацию, миграцию, инвазию и апоптоз раковых клеток, а также на иммунные взаимодействия и ответ на лечение10. Было сообщено, что miR-192-5p действует контекстно-зависимым образом при различных заболеваниях и видах рака, проявляя либо онкогенные, либо опухолево-супрессивные свойства в зависимости от типа ткани, молекулярного фона и экспериментальной системы11,12,13,14,15,16. При КРР в предыдущих исследованиях сообщалось об измененных профилях мРНК в клинических образцах и функциональной регуляции злокачественных фенотипов в клетках рака толстой кишки12,14,15. Однако анализ общедоступных баз данных не всегда показывает одиначное направление экспрессии, поэтому клиническая значимость, сеть мишеней и иммунные ассоциации miR-192-5p при КРР требуют тщательной оценки.
В настоящем исследовании оценивалась роль miR-192-5p при колоректальном раке (КРР) путем интеграции биоинформатического анализа данных TCGA/GDC и GEO, валидации методом qRT-PCR в парных клинических образцах тканей, проведения тестов на миграцию in vitro, предсказания потенциальных генов-мишеней, анализа обогащения путей и анализа корреляции с иммунным профилем. Исследование основывалось на гипотезе о том, что экспрессия зрелой miR-192-5p может быть снижена в тканях КРР и что данная молекула может оказывать опухолесупрессивный эффект. Поскольку повторный анализ данных miRNA-seq из TCGA/GDC показал противоположное направление экспрессии, полученные результаты следует интерпретировать как предварительные и зависящие от используемой платформы, а не как единый окончательный паттерн экспрессии.
Протокол
Данное исследование было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией. Одобрение было получено от Комитета по этике Медицинского университета Внутренней Монголии 21 октября 2021 года. От всех участников, включенных в исследование, было получено письменное информированное согласие.
Сбор клинических образцов
Парные образцы тканей КРР и прилегающих нераковых тканей были собраны у 45 пациентов, перенесших радикальную резекцию в период с декабря 2017 по февраль 2020 года. Ни один из пациентов не получал предоперационную лучевую или химиотерапию; пациенты с другими злокачественными новообразованиями были исключены. Прилегающая нераковая ткань была отобрана на расстоянии не менее 5 cm от края опухоли. Образцы были немедленно заморожены после хирургического удаления и хранились в жидком азоте до экстракции RNA. В когорту вошли 27 мужчин и 18 женщин; 13 пациентов были моложе 60 лет, 32 пациента — в возрасте 60 лет и старше. Клинико-патологические переменные включали диаметр опухоли, стадию по системе TNM, степень дифференцировки, наличие опухолевого тромба в сосудах, метастазы в лимфатических узлах и предоперационный уровень CEA.
Сбор и предварительная обработка открытых данных
Данные открытого доступа miRNA-seq, RNA-seq и клинические данные для TCGA-COAD и TCGA-READ были получены с портала Genomic Data Commons. Образцы первичных опухолей и нормальных тканей были идентифицированы согласно типу образцов GDC. Образцы метастатических и рецидивирующих опухолей были исключены из анализа дифференциальной экспрессии опухолевой и нормальной тканей. Для файлов TCGA miRNA-seq запись на уровне базы данных, определенная для данного анализа, была hsa-mir-192; значения экспрессии анализировались как log2(RPM + 1), где RPM обозначает количество чтений на миллион картированных чтений miRNA. В случаях наличия соответствующих образцов проводился как непарный, так и парный анализ опухолевой и нормальной тканей. Наборы данных GEO GSE89076 и GSE156355 использовались для скрининга потенциальных генов-мишеней. Дифференциально экспрессируемые гены из GEO отбирались с использованием скорректированного p < 0.05 и абсолютного значения log2 fold-change ≥ 2. Названия наборов данных были проверены на согласованность во всем тексте рукописи.
Диагностический, клинико-патологический и анализ выживаемости
Для оценки предварительного разделения опухолевых и нормальных тканей в TCGA-COAD, TCGA-READ и объединенной когорте COADREAD использовался анализ рабочей характеристики приемника (ROC-анализ). Поскольку количество нормальных образцов было небольшим, были проведены дополнительные анализы чувствительности, включая сбалансированный ресемплинг опухолевых и нормальных тканей с 5000 итерациями и анализ с исключением одного нормального образца (leave-one-normal-out analysis). Для анализа клинико-патологических ассоциаций образцы первичных опухолей были разделены на группы с высоким и низким уровнем экспрессии по медианному уровню экспрессии miR-192 в TCGA. Анализы повторяли для объединенной когорты COADREAD, а также отдельно для COAD и READ, если позволял размер выборки. Общая выживаемость оценивалась с помощью анализа Каплана-Мейера с использованием лог-рангового критерия и одномерной регрессии Кокса. Результаты диагностического, клинико-патологического анализа и анализа выживаемости представлялись отдельно, чтобы избежать преувеличения прогностических выводов.
Анализ потенциальных генов-мишеней и хабовых генов
Гены-мишени кандидаты были определены путем интеграции предсказаний miRWalk с данными о дифференциально экспрессируемых генах из наборов GSE89076 и GSE156355. Пересечение этих трех источников было отобрано для последующего поискового анализа. С помощью STRING была построена сеть белок-белковых взаимодействий, а ключевые гены (hub genes) были выбраны на основе степени узла и связности модулей с помощью анализа cytoHubba и MCODE в программе Cytoscape. Отобранные ключевые гены (KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3 и KIF5C) были дополнительно проанализированы с использованием данных РНК-секвенирования TCGA. Различия в экспрессии между опухолевой и нормальной тканями, корреляция Спирмена с экспрессией miR-192 в TCGA и связь с общей выживаемостью были представлены в виде дополнительных поисковых анализов. Данные гены рассматривались только как потенциальные мишени; на основании биоинформатических данных не делались выводы о прямом связывании, эффекте спасения или регуляции на уровне белков ниже по каскаду.
Анализ обогащения GO и KEGG
Анализ обогащения по Gene Ontology (GO) и Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) был проведен для набора генов-кандидатов и значимых сетевых модулей. Термины GO были разделены на категории биологических процессов, клеточных компонентов и молекулярных функций. Результаты обогащения с p < 0.05 считались статистически значимыми и интерпретировались как сигналы путей для выдвижения гипотез, а не как экспериментально подтвержденные механизмы.
Экстракция РНК и анализ методом ОТ-ПЦР в реальном времени
Общую РНК экстрагировали из 45 пар образцов КРР и прилегающей нераковой ткани с использованием реагента TRIzol согласно протоколу производителя. Чистоту и концентрацию РНК оценивали спектрофотометрически; для обратной транскрипции использовали образцы со значениями A260/A280 от 1,8 до 2,1. qRT-PCR проводили с использованием системы обратной транскрипции miRNA и реагентов для miRNA qPCR на основе SYBR Green от TransGen Biotech. Обратную транскрипцию и амплификацию qPCR выполняли в соответствии с инструкциями производителя реагентов. Каждую реакцию qRT-PCR проводили в трех технических повторностях. В качестве внутреннего контроля использовали RNU6B. Праймеры для miR-192-5p были: 5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3' (прямой) и 5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3' (обратный). Праймеры для RNU6B были: 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' (прямой) и 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3' (обратный). Для оценки специфичности амплификации (при поддержке платформы qPCR) использовали анализ кривых плавления. Относительную экспрессию рассчитывали методом 2-ΔΔCt. Результаты анализа пар опухолевой и прилегающей тканей обрабатывали как парные клинические измерения.
Культивирование клеток и трансфекция
Линия клеток колоректального рака (КРР) человека HT29 была получена из коллекции клеток лаборатории авторов, прошла аутентификацию и проверку на отсутствие контаминации микоплазмой. Клетки HT29 культивировали в среде McCoy's 5A с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 U/mL пенициллина и 100 µg/mL стрептомицина при 37 oC в атмосфере 5% CO2. Пассирование клеток проводили при достижении ими примерно 80% конфлюэнтности. Мимики miR-192-5p и олигонуклеотид отрицательного контроля con238 были приобретены в компании Sangon Biotech (Шанхай, Китай) и использованы для транзиентной трансфекции. Клетки HT29 высевали в 6-луночные планшеты и трансфицировали при достижении плотности клеток примерно 20–30% с использованием конечной концентрации олигонуклеотидов 50 nM и протокола липидной трансфекции согласно инструкциям производителя реагента. Точное соотношение реагента к олигонуклеотиду и количество реагента соответствовали рекомендуемому протоколу производителя, зафиксированному в лабораторных записях авторов. Клетки инкубировали с трансфекционными комплексами в стандартных условиях культивирования; последующая визуализация трансфекции и анализ заживления ран проводили после трансфекции в соответствии с графиком эксперимента. В настоящее исследование были включены данные только по клеткам HT29.
Анализ заживления ран
Трансфецированные клетки HT29 высевали в 6-луночные планшеты и культивировали до формирования сплошного монослоя. С помощью стерильного наконечника пипетки объемом 200 µL создавали линейную царапину, после чего отделившиеся клетки удаляли путем промывки PBS. Затем среду заменяли на безсывороточную среду, чтобы минимизировать влияние пролиферации при оценке миграции. Снимки зоны повреждения делали через 0 h, 24 h и 48 h. Тест на заживление ран проводили в трех независимых биологических повторностях, при этом для каждой группы и каждой временной точки измеряли несколько микроскопических полей. Ширину раны количественно определяли по микрофотографиям с помощью программного обеспечения для анализа изображений; точная версия ПО, использовавшегося для исходных измерений, в исходных записях отсутствовала. Скорость заживления ран рассчитывали по формуле: [(ширина раны в 0 h - ширина раны в указанный момент времени) / ширина раны в 0 h] x 100%. Поскольку доступные данные рукописи не содержат отдельного контрольного эксперимента на пролиферацию, результаты заживления ран интерпретировали как связанные с миграцией, однако не исключали полностью влияние пролиферационных эффектов.
Корреляционный анализ иммунного профиля
Связь между экспрессией miR-192 в данных TCGA и иммунными сигнатурами была переоценена с использованием данных RNA-seq первичных опухолей. В анализ корреляции показателей сигнатур были включены в общей сложности 425 образцов опухолей с соответствующими данными miRNA и RNA-seq. Экспрессия miR-192 продемонстрировала статистически значимую, но слабую отрицательную корреляцию с несколькими иммунными сигнатурами после коррекции на ложноположительный результат (FDR), включая Tfh-клетки (rho = -0.205, FDR = 0.00049), активированные дендритные клетки (rho = -0.186, FDR = 0.00098), Treg-клетки (rho = -0.185, FDR = 0.00098), плазмоцитоидные дендритные клетки (rho = -0.169, FDR = 0.0027) и макрофаги (rho = -0.149, FDR = 0.0092). Положительные корреляции наблюдались преимущественно для сигнатур эозинофилов (rho = 0.139, FDR = 0.0155) и Th17-клеток (rho = 0.121, FDR = 0.0296). Эти результаты указывают на гетерогенные и в целом слабые иммунные связи, а не на единообразный паттерн положительной иммунной инфильтрации.
Статистический анализ
Статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 9.0, SPSS 25.0 и R 3.6.3. Непрерывные переменные были представлены в виде среднего значения ± стандартного отклонения или медианы с межквартильным размахом, в зависимости от распределения. Для сравнения парных образцов тканей (опухоль и прилегающая ткань) использовали парные тесты. В случаях, когда допущения о нормальности распределения не соблюдались, применяли непараметрические тесты. Для предварительного анализа диагностической разделительной способности использовали ROC-кривые, сбалансированное ресемплирование и анализ с исключением одного нормального образца (leave-one-normal-out); для оценки взаимосвязей категориальных клинико-патологических признаков — критерий хи-квадрат; для анализа выживаемости — логарифмический ранговый критерий и модели Кокса; а для анализа иммунных показателей и хаб-генов — корреляцию Спирмена. Двустороннее значение p < 0.05 считалось статистически значимым; для корреляций иммунных сигнатур приводилась поправка на ложноположительный результат (FDR).
Результаты
Анализ экспрессии в общедоступных наборах данных и парных клинических образцах тканей
Профиль экспрессии miR-192 был повторно проанализирован с использованием данных miRNA-seq из баз TCGA-COAD и TCGA-READ, полученных из GDC (Рисунок 1). В этих файлах запись на уровне базы данных была аннотирована как hsa-mir-192, а не напрямую как зрелая форма hsa-miR-192-5p; следовательно, этот результат из общедоступной базы данных интерпретировался как сигнал TCGA miR-192. В объединенной когорте COADREAD было проанализировано 616 первичных опухолей и 11 образцов нормальной солидной ткани. В образцах опухолей наблюдалась более высокая экспрессия miR-192, чем в нормальных образцах (медиана 16,05 против 13,46 log2[RPM + 1], критерий Манна — Уитни p = 9,96 x 10-8). Аналогичная тенденция к повышению экспрессии в опухолях наблюдалась отдельно в COAD (455 опухолей и 8 нормальных образцов, p = 9,89 x 10-8) и отдельно в READ (161 опухоль и 3 нормальных образца, p = 1,94 x 10-5). Парный анализ TCGA также показал более высокую экспрессию в опухолях в 11 соответствующих парах (медиана разности опухоль-норма = 3,13 log2[RPM + 1], критерий Вилкоксона p = 0,0029). Эти результаты оставались противоречивыми по сравнению с локальными результатами парной qRT-PCR, которые подтвердили снижение экспрессии зрелой miR-192-5p в тканях CRC (Рисунок 2).
Диагностическая эффективность и клинико-патологические корреляции
ROC-анализ на основе данных TCGA был повторен с использованием описанного выше определения дифференциации между опухолевыми и нормальными образцами (Рисунок 3). AUC составил 0,968 для комбинированной когорты COADREAD, 0,947 только для COAD и 0,994 только для READ. Дополнительный сбалансированный ресемплинг дал медианные значения AUC 0,983 для COADREAD, 0,984 для COAD и 1,000 для READ; однако 95% доверительные интервалы были широкими для COADREAD (0,868–1,000) и COAD (0,781–1,000), а группа READ включала всего три нормальных образца. Анализ нормальных образцов методом исключения одного объекта (leave-one-out) также показал, что оценка ROC была чувствительна к малому размеру группы нормальных образцов. Следовательно, результат ROC был сохранен только как предварительное свидетельство разделения опухолевых и нормальных тканей, а не как достаточное доказательство для использования в качестве клинического диагностического биомаркера. Анализ клинико-патологических связей на основе медианной экспрессии miR-192 в TCGA выявил значимые ассоциации со стадией N (p = 0,019) и возрастом (p = 0,004), в то время как стадия T (p = 0,110) и стадия M (p = 0,932) не были значимыми (Таблица 1).
Анализ выживаемости
Анализ общей выживаемости не подтвердил наличие значимой прогностической связи для экспрессии TCGA miR-192 при колоректальном раке (КРР) (Рисунок 3). В объединенной когорте COADREAD сравнение по методу Каплана-Мейера с использованием медианного разделения не было статистически значимым (log-rank p = 0,857), и одномерный регрессионный анализ Кокса также не выявил значимой связи (HR = 0,934 на единицу log2 экспрессии, p = 0,374). Тот же вывод был сделан для COAD (log-rank p = 0,889; Cox p = 0,493) и READ (log-rank p = 0,807; Cox p = 0,716). Таким образом, данные не подтверждают статус miR-192 как сильного прогностического биомаркера при КРР.
Гены-мишени кандидаты и функциональное обогащение
Анализ потенциальных генов-мишеней проводили путем интеграции данных прогнозирования miRWalk с дифференциально экспрессируемыми генами из наборов данных GEO GSE89076 и GSE156355. В результате данного скрининга было выявлено 93 гена-кандидата для последующего анализа сетей и анализа обогащения (Рисунок 4). Анализ белок-белковых взаимодействий позволил оставить KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3 и KIF5C в качестве исследуемых центральных (хабовых) генов (Рисунок 5). Анализ чувствительности данных RNA-seq из TCGA показал, что экспрессия KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1 и CDK1 была выше в опухолевой ткани, чем в нормальной, тогда как экспрессия PLP1, NRXN1, GRIK3 и KIF5C в опухолевой ткани была ниже. Корреляционный анализ с экспрессией miR-192 из TCGA дал смешанные результаты: CDCA5, CCNB1 и CDK1 продемонстрировали положительную корреляцию, тогда как PLP1, NRXN1 и KIF5C — отрицательную. Анализ обогащения выявил репрезентативные термины, связанные с метаболизмом лекарственных средств цитохромом P450, метаболизмом ксенобиотиков цитохромом P450, метаболизмом ретинола, терминами, относящимися к глутаматергическим синапсам, и организацией пресинапса (Рисунок 6). Эти результаты подтверждают биологическую значимость сети центральных генов, но не доказывают прямое воздействие miR-192-5p на мишени.
Анализ миграции клеток
Клетки HT29 были трансфецированы мимиками miR-192 для оценки функциональных эффектов апрегуляции miR-192. С помощью флуоресцентной микроскопии было подтверждено успешное проведение трансфекции в группах с мимиком miR-192-5p и в группе отрицательного контроля (Рисунок 7). В тесте на заживление ран (wound-healing assay) скорость миграции клеток HT29, трансфецированных miR-192, была ниже, чем у нетрансфецированных клеток HT29 и клеток, трансфецированных отрицательным контролем, как через 24 ч, так и через 48 ч (Рисунок 8). Через 24 ч скорость миграции составила 9,75 +/- 2,43% в группе с трансфекцией miR-192 по сравнению с 15,69 +/- 3,47% в нетрансфецированной группе и 15,45 +/- 3,92% в группе отрицательного контроля (P = 0,010). Через 48 ч скорость миграции составила 20,04 +/- 2,54% в группе с трансфекцией miR-192 по сравнению с 26,84 +/- 7,65% и 27,98 +/- 6,78% в двух контрольных группах соответственно (P = 0,021). Эти результаты свидетельствуют о том, что апрегуляция miR-192 подавляет миграцию клеток HT29 in vitro.
Корреляционный анализ иммунного профиля
Связь между экспрессией miR-192 в данных TCGA и иммуно-связанными сигнатурами была повторно проанализирована с использованием данных RNA-seq первичных опухолей (Рисунок 9). В анализ корреляции показателей сигнатур было включено в общей сложности 425 образцов опухолей с соответствующими данными miRNA и RNA-seq. Экспрессия miR-192 продемонстрировала слабые отрицательные корреляции с несколькими сигнатурами иммунных клеток, включая Tfh-клетки (rho = -0.205, p = 2.15e-05), активированные дендритные клетки (rho = -0.186, p = 0.00011), Treg-клетки (rho = -0.185, p = 0.00013), плазмоцитоидные дендритные клетки (rho = -0.169, p = 0.00046), макрофаги (rho = -0.149, p = 0.0020), Tcm-клетки (rho = -0.136, p = 0.0050), NK CD56bright-клетки (rho = -0.132, p = 0.0065) и Tem-клетки (rho = -0.129, p = 0.0078). Слабые положительные корреляции наблюдались для сигнатур эозинофилов (rho = 0.139, p = 0.0040) и Th17-клеток (rho = 0.121, p = 0.0129). Таким образом, иммунная связь miR-192 при колоректальном раке представляется гетерогенной и не должна описываться как единообразно положительная для всех иммунных инфильтратов.
Доступность данных
Общедоступные наборы данных, проанализированные в данном исследовании, доступны на портале GDC/TCGA и в базе данных Gene Expression Omnibus (GEO) под номерами доступа GSE89076 и GSE156355. Результаты биоинформатического анализа и повторного анализа, полученные в ходе данного исследования, представлены в Дополнительной таблице 1. Основные экспериментальные данные, подтверждающие результаты qRT-PCR и анализа заживления ран, включая исходные значения Ct qRT-PCR, измерения ширины раны, оригинальные микрофотографии и соответствующие экспериментальные данные, представлены в Дополнительной папке 1.
Рисунок 1: Обзор экспрессии miR-192 в различных типах рака согласно данным TCGA. На оси X указаны сокращенные названия опухолей, на оси Y — относительная экспрессия miR-192. Синий цвет соответствует нормальной ткани, красный — опухолевой ткани. Статистическая значимость indicated следующим образом: * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001; NS = статистически не значимо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Экспрессия miR-192/miR-192-5p в наборах данных КРР и парных образцах тканей. (A) Анализ miRNA-seq из TCGA/GDC, демонстрирующий более высокий уровень сигнала hsa-mir-192 в базе данных для образцов опухолей КРР по сравнению с нормальными образцами. (B) Анализ методом qRT-PCR парных локальных образцов тканей, демонстрирующий более низкую экспрессию зрелой miR-192-5p в тканях КРР по сравнению с прилежащими неопухолевыми тканями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Поисковый диагностический анализ и анализ выживаемости на основе экспрессии hsa-mir-192 в TCGA. (A–C) Кривые выживаемости Каплана-Мейера. Анализ выживаемости не подтвердил значимой прогностической связи. (D) ROC-кривая для дифференциации опухолевых и нормальных тканей в когорте TCGA. Интерпретацию AUC следует проводить с осторожностью из-за малого количества нормальных образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Скрининг генов-мишеней-кандидатов и анализ белковых взаимодействий. (A) Диаграмма Венна, показывающая перекрытие между результатами предсказания мишеней miRNA и дифференциально экспрессируемыми генами из GSE89076 и GSE156355. (B) Сеть белок-белковых взаимодействий для 93 генов-кандидатов. Узлы представляют гены, а ребра — предсказанные или курируемые ассоциации генов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Скрининг хаб-генов по сети потенциальных мишеней. (A,B) Сетевые модули, выявленные в ходе модульного скрининга. (C) Ранжирование хаб-генов на основе связности сети. (D) Потенциальные хаб-мишени, отобранные после интеграции модульного скрининга и анализа степени связности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Избранные термины обогащения GO и KEGG для генов-кандидатов и значимых сетевых модулей. Пузырьковая диаграмма обобщает репрезентативные обогащенные биологические функции и пути. Результаты обогащения носят поисковый характер и требуют экспериментального подтверждения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Изображения трансфекции клеток HT29. (A) Репрезентативные клетки HT29. (B) Флуоресцентное изображение клеток HT29, трансфицированных мимиком miR-192-5p. (C) Флуоресцентное изображение клеток HT29, трансфицированных негативным контролем con238. Масштабная линейка = 100 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Тест на заживление ран в клетках HT29. (A) Репрезентативные изображения «царапин» через 0 ч, 24 ч и 48 ч в нетрансфицированных клетках HT29, клетках HT29, трансфицированных имитатором miR-192-5p, и клетках HT29, трансфицированных con238. (B) Количественная оценка скорости заживления ран через 24 ч и 48 ч, представленная в процентах. Масштабная линейка = 100 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Корреляция между экспрессией miR-192 по данным TCGA и показателями иммунных профилей в образцах опухолей КРР. Анализ выявил гетерогенные иммунные ассоциации с несколькими слабыми отрицательными корреляциями и, главным образом для профилей эозинофилов и Th17-клеток, положительными корреляциями. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Характеристики | Низкая экспрессия miR-192 согласно данным TCGA | Высокая экспрессия miR-192 согласно данным TCGA | значение p | Метод |
| n | 308 | 308 | ||
| Стадия T, n (%) | 0.11 | Критерий хи-квадрат (Chi-squared test) | ||
| T1 | 9 (1.5%) | 11 (1.8%) | ||
| T2 | 44 (7.2%) | 59 (9.6%) | ||
| T3 | 209 (34.1%) | 211 (34.4%) | ||
| T4 | 43 (7%) | 27 (4.4%) | ||
| Стадия N, n (%) | 0.019 | Критерий хи-квадрат | ||
| N0 | 156 (25.5%) | 190 (31%) | ||
| N1 | 88 (14.4%) | 63 (10.3%) | ||
| N2 | 61 (10%) | 54 (8.8%) | ||
| Стадия M, n (%) | 0.932 | Критерий хи-квадрат | ||
| M0 | 214 (39.9%) | 234 (43.7%) | ||
| M1 | 41 (7.6%) | 47 (8.8%) | ||
| Возраст, медиана (МКИ) | 66 (56, 75) | 69 (60, 77) | 0.004 | Уилкоксона |
Таблица 1: Связь между группами экспрессии miR-192 в TCGA и клинико-патологическими характеристиками при CRC. Группы с высокой и низкой экспрессией были определены по медианному уровню экспрессии miR-192 в TCGA. В сводной таблице стадия N и возраст были значимыми, тогда как стадия T и стадия M не были значимыми.
Дополнительная таблица 1: Результаты повторного анализа данных (dry-lab reanalysis), полученные в ходе данного исследования. Рабочая книга включает сравнения экспрессии TCGA/GDC, сбалансированные ROC-анализы чувствительности, анализы с исключением одного нормального образца (leave-one-normal-out), анализы клинико-патологических ассоциаций, анализ выживаемости, сводные данные по экспрессии и корреляции хаб-генов, а также результаты корреляции иммунных сигнатур.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная папка 1: Исходные экспериментальные данные, подтверждающие результаты qRT-PCR, трансфекции клеток и экспериментов по заживлению ран. Эти файлы включают исходные значения Ct для qRT-PCR, данные проточной цитометрии/трансфекции, измерения ширины раны и репрезентативные микрофотографии, использованные для анализов, представленных в рукописи.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Обсуждение
В данном исследовании оценивалась клиническая и биологическая значимость miR-192-5p при колоректальном раке (КРР) путем сочетания анализа общедоступных наборов данных, локальной валидации на тканях, прогнозирования сети мишеней, анализа иммунного профиля и экспериментов по миграции in vitro. В ходе анализа использовались верифицированные определения образцов TCGA, по возможности проводилось разделение COAD и READ, применялись значения miRNA в формате log2(RPM + 1), разграничивались парные и непарные сравнения, проверялась устойчивость ROC-кривых, а также были добавлены анализы чувствительности РНК-секвенирования (RNA-seq) для узловых генов. Основным результатом стало то, что сигнал miR-192 из общедоступных баз TCGA/GDC и локальный результат qRT-PCR для зрелой miR-192-5p указывают на противоположные направления экспрессии, что подчеркивает необходимость разграничения аннотаций предшественников на уровне баз данных и измерений зрелых miRNA9,11.
Это несоответствие не должно объясняться исключительно неодинаковыми размерами выборок. Группа нормальных тканей в TCGA была небольшой, однако анализы непарных, парных образцов, а также анализы только по COAD и только по READ в TCGA/GDC показали одно и то же направление — более высокий уровень экспрессии в опухоли. Могут иметь значение несколько факторов, включая различия в источнике образцов, использование платформ секвенирования в противовес qRT-PCR, аннотацию hsa-mir-192 на уровне базы данных в сравнении с измерением зрелой hsa-miR-192-5p, обработку РНК, чистоту опухоли, определение прилегающей ткани и популяционные характеристики. Аналогичные проблемы с интерпретацией биомаркеров и гетерогенностью опухолей подчеркивались в исследованиях CRC5,6,7,8. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу интерпретации miR-192-5p в CRC как зависящей от контекста и платформы, а не о наличии единого универсального направления экспрессии.
Результаты диагностического анализа также следует интерпретировать с осторожностью. Хотя ROC-анализ на основе данных TCGA показал высокое значение AUC, в сравнение было включено гораздо больше образцов опухоли, чем нормальных тканей (всего 11 нормальных образцов в объединенной когорте COADREAD). Сбалансированная повторная выборка по-прежнему демонстрировала высокие медианные значения AUC, однако интервалы были широкими, поскольку каждое сбалансированное сравнение было ограничено малой группой контроля (нормы). Таким образом, результат ROC-анализа подтверждает возможность эксплораторного разделения опухолевых и нормальных тканей в базе TCGA/GDC, но его недостаточно для установления miR-192-5p в качестве клинического диагностического биомаркера. Такая интерпретация согласуется с общим разграничением между эксплораторными сигналами биомаркеров и клинически валидированными диагностическими или прогностическими биомаркерами4,8.
Анализ выживаемости не показал значимой связи между экспрессией miR-192 и общей выживаемостью при COADREAD, COAD или READ. В текущем анализе miR-192 может быть связана с отдельными клинико-патологическими переменными, однако имеющиеся данные не позволяют сделать однозначный вывод о ее значимости в качестве прогностического биомаркера. Это различие важно, поскольку прогностические биомаркеры требуют доказательств того, что статус маркера связан с исходом независимо и воспроизводимо в клинически значимых контекстах8.
Анализ заживления ран in vitro предоставляет функциональные доказательства того, что повышение экспрессии miR-192 может снизить миграцию клеток HT29. Этот результат согласуется с потенциальной опухоле-супрессорной функцией в клетках CRC и направлением экспрессии, выявленным в ходе локального qRT-PCR. Предыдущие работы также подтверждали роль микроРНК, включая пути, связанные с miR-192, в регуляции эпителиально-мезенхимального перехода, судьбы клеток и фенотипов, связанных с миграцией15,16,17. Однако функциональные данные остаются неполными. Для подтверждения механистической модели опухолевой супрессии потребуется дополнительная лабораторная валидация, включая повторные трансфекции по крайней мере в одной дополнительной клеточной линии CRC, контроль пролиферации для анализов заживления ран, анализы миграции/инвазии в системе Transwell, двухлюциферазную валидацию выбранных мишеней, измерения уровней мРНК и белков-мишеней, а также эксперименты по спасению (rescue experiments).
Анализ центральных генов (hub-genes) следует рассматривать как этап выдвижения гипотез. Дополнительный анализ данных РНК-секвенирования TCGA показал выраженные различия в экспрессии между опухолевой и нормальной тканями для отобранных центральных генов, однако их корреляция с miR-192 была неоднозначной. Несколько генов клеточного цикла, включая CDCA5, CCNB1 и CDK1, коррелировали с miR-192 положительно, а не отрицательно, что не вписывается в простую модель прямого подавления мишени микроРНК. Напротив, PLP1, NRXN1 и KIF5C продемонстрировали отрицательную корреляцию. Эти результаты подтверждают биологическую значимость сети, но указывают на то, что вывод о прямом воздействии не может быть сделан без проведения люциферазного теста, анализа уровня белка и экспериментов по восстановлению функции (rescue). Такая осторожная интерпретация соответствует исследовательскому характеру in silico анализа сетей мишеней10,11.
Иммунный анализ дополнительно указывает на необходимость осторожной интерпретации. Показатели иммунной сигнатуры по данным RNA-seq опухоли продемонстрировали, что экспрессия miR-192 отрицательно коррелировала с несколькими иммунными сигнатурами и положительно коррелировала преимущественно с сигнатурами эозинофилов и Th17-клеток. Большинство корреляций были слабыми даже после коррекции по ложноположительным результатам (FDR). Поскольку методы анализа иммунных сигнатур позволяют сделать вывод об обогащении путей или состояний клеток на основе данных о совокупной экспрессии, эти результаты следует считать предварительными; они требуют подтверждения с помощью ортогональных подходов к иммунному профилированию13.
Данное исследование имеет несколько ограничений. Во-первых, локальная валидационная когорта была относительно небольшой и представляла один центр. Во-вторых, анализ общедоступных наборов данных и локальная валидация методом qRT-PCR проводились на разных платформах и уровнях измерения. В-третьих, количество нормальных образцов miRNA-seq из базы данных TCGA было небольшим, что ограничивало диагностические выводы. В-четвертых, анализ ключевых генов и иммунного профиля был вычислительным и требует экспериментального подтверждения. В-пятых, доступные функциональные эксперименты были ограничены данными по заживлению ран на клетках HT29. Эти ограничения обосновывают представление данной работы как комплексного поискового анализа, а не как окончательного доказательства того, что miR-192-5p является валидированным диагностическим, прогностическим или механистическим биомаркером при CRC6,8.
Подводя итог, можно сказать, что miR-192-5p представляется биологически значимой для CRC, однако характер ее экспрессии и клиническая интерпретация сложны. Анализ TCGA/GDC показал более высокий сигнал miR-192 в образцах опухолей CRC, тогда как qRT-PCR в локальной когорте парных тканей выявил более низкую экспрессию зрелой miR-192-5p. ROC-анализ указал на возможность разделения опухолевых и нормальных тканей, но был ограничен малым числом образцов нормальной ткани в группе TCGA. Значимой связи с общей выживаемостью обнаружено не было. Анализ хабовых генов и иммунного профиля дает основания для выдвижения гипотез, а данные по заживлению ран в клетках HT29 позволяют предположить, что повышение уровня miR-192-5p может снижать миграцию клеток. Прежде чем miR-192-5p сможет быть признана валидированным диагностическим, прогностическим или механистическим биомаркером при CRC, необходимы исследования на дополнительных независимых когортах и проведение таргетных лабораторных экспериментов.
Раскрытие информации
Авторы не заявляют о наличии конфликта интересов.
Благодарности
Авторы благодарят Лабораторию молекулярной диагностики опухолей Медицинского университета Внутренней Монголии за техническую поддержку. Работа была выполнена при поддержке Научно-исследовательского проекта Комиссии по здравоохранению города Яньчэн (грант № YK2023101), который также оплатил сбор за обработку статьи.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,25%+2:60 трипсин-ЭДТА | Biological Industries | 03-054-1 | Переваривание/пассаж клеток |
| 10% персульфат аммония | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | A8090 | Реагент для SDS-PAGE |
| 10% додецилсульфат натрия | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | SIS1070 | Реагент для SDS-PAGE |
| 4x буфер для нанесения белков | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | P1016 | Подготовка белковых образцов |
| Ультранизкотемпературный морозильник -80 °C | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | Хранение образцов |
| Реагент Anti-Myc для удаления микоплазм | Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | P-CMR-001 | Деконтаминация микоплазм |
| Наборы праймеров для ARL2, BATF2, MEN1 и бета-актина | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | Синтезировано на заказ | Праймеры для qPCR мРНК |
| Автоматический ридер микропланшетов | PerkinElmer, USA | VICTOR Nivo | Измерение абсорбции |
| Набор для анализа белка BCA | Thermo Fisher Scientific | 23225 | Количественное определение белка |
| Бокс биологической безопасности / ламинарный шкаф | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | Асептическое культивирование клеток |
| Камера для подсчета клеток / гемоцитометр | Shanghai Qiujing Biochemical Reagent Instrument Co., Ltd. | http://www.shqiujing.net/ | Подсчет клеток |
| Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8) | Biosharp | BS350B | Анализ пролиферации/цитотоксичности клеток |
| Флаконы для культивирования клеток, культуральные планшеты, центрифужные пробирки и наконечники для пипеток | Corning | https://www.corning.com/in/en.html | Общие расходные материалы для культивирования клеток |
| Набор для анализа клеточного цикла и апоптоза | Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China | https://www.chemicalbook.com/ShowSupplierProductsList13366/0_EN.htm | Проточная цитометрическая анализ клеточного цикла/апоптоза |
| CO2-инкубатор для клеток | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | Культивирование клеток |
| Олигонуклеотид con238 (отрицательный контроль) | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | Синтезировано на заказ | Контроль трансфекции |
| Программное обеспечение Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | Визуализация сетевых модулей и хаб-генов |
| Цифровой термостатический магнитный перемешиватель | Changzhou Saipu Experimental Instrument Factory | https://czxtyq.en.alibaba.com/ | Приготовление растворов |
| Электрический термостатический сушильный шкаф | Nanjing Wohuan Technology Industry Co., Ltd. | https://www.wtsensor.com/about-wt/aboutwt/ | Сушка/стерилизация |
| Система электрофореза | Bio-Rad Laboratories | Mini-PROTEAN 3 Cell | Гелевый электрофорез |
| Система электропереноса | Hoefer | TE77XP | Перенос белков |
| Фетальная бычья сыворотка | Biological Industries | 04-001-1ACS | Добавка для культивирования клеток |
| Проточный цитометр | ACEA Biosciences | NovoCyte | Проточная цитометрия |
| Флуоресцентный инвертированный микроскоп | Ningbo Sunny Instruments Co., Ltd. | https://www.sunny-instrument.com/en | Визуализация клеток и заживления ран |
| Портал GDC/TCGA | National Cancer Institute | База данных открытого доступа | Общедоступные данные miRNA-seq, RNA-seq и клинические данные |
| База данных GEO | National Center for Biotechnology Information | GSE89076 и GSE156355 | Общедоступные наборы данных экспрессии генов |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Версия 9 | Статистический анализ и построение графиков |
| Высокоскоростная охлаждаемая центрифуга | Shanghai Huxiangyi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | https://www.bioridgecentrifuge.com/ | Подготовка образцов |
| Клетки HT29 | Сток клеток из лаборатории авторов | Не применимо | Линия клеток рака толстой кишки человека |
| Программное обеспечение для анализа изображений | ImageJ | Не применимо | Количественное определение ширины раны |
| Система визуализации | Tanon Science & Technology Co., Ltd. | Tanon-5200 | Визуализация гелей/блоттинга |
| Система динамического наблюдения за клетками и функционального анализа IncuCyte S3 | Beijing Sensi Wantong Technology Co., Ltd. | IncuCyte S3 | Визуализация живых клеток/функциональный анализ |
| Интеллектуальная термостатическая водяная баня | Leica | HI1210 | Инкубация с контролем температуры |
| Лентивирус и реагент для инфекции | Shanghai GeneChem Co., Ltd. | https://synapse.patsnap.com/organization/04ffbf33ff2a6311226a8fa05498cec4 | Стабильная трансдукция клеток |
| Ручные пипетки | Gilson | PIPETMAN P | Работа с жидкостями |
| Базовая среда McCoy's 5A | Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | PM150710 | Среда для культивирования клеток HT29 |
| Медицинская центрифуга | Производитель из Чжухая не указан | 3200 | Подготовка образцов |
| Медицинский холодильник-морозильник | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | Хранение реагентов/образцов |
| Суперчувствительный химилюминесцентный субстрат ECL Meilunbio Fixer | Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China | MA0186 | Детекция иммуноблоттинга |
| Микроцентрифуга | Beijing DLAB Scientific Co., Ltd. | https://www.dlabsci.com/ | Подготовка образцов |
| Наборы праймеров для miR-192-5p и U6 | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China | Синтезировано на заказ | Праймеры для qPCR miRNA |
| Мимик miR-192-5p | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | Синтезировано на заказ | Олигонуклеотид для транзиторной трансфекции |
| Набор для синтеза первой цепи кДНК miRNA miRcute Enhanced | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China | KR211 | Обратная транскрипция miRNA |
| Набор для флуоресцентного количественного определения miRNA miRcute Enhanced (SYBR Green FP) | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China | FP411 | qPCR miRNA |
| miRWalk | Публичная база данных | Веб-база данных | База данных для предсказания мишеней miRNA |
| Нитроцеллюлозная мембрана | Millipore | HATF00010 | Мембрана для переноса белков |
| Обезжиренное сухое молоко | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | D8340 | Блокирующий реагент для иммуноблоттинга |
| Парные ткани рака толстой кишки и прилегающие нераковые ткани | Учреждение авторов | Не применимо | Клинические образцы |
| ПЦР-пробирки | Corning | PCR-02-C | Подготовка к ПЦР/qRT-ПЦР |
| Раствор пенициллина-стрептомицина | Biological Industries | 03-031-1B | Антибиотик для культивирования клеток |
| Набор PerfectStart Uni RT&qPCR | TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China | AUQ-01 | Обратная транскрипция мРНК и qPCR |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | Буфер для промывки клеток |
| Преокрашенный белковый маркер | Fermentas | 26619 | Маркер молекулярной массы белка |
| Система приготовления чистой воды | China Moer | Нет данных | Приготовление чистой воды |
| Пуромицин | Phygene | PH1143 | Селекция трансдуцированных клеток |
| Программное обеспечение R | R Foundation for Statistical Computing | Версия 3.6.3 | Статистический анализ и биоинформатика |
| Буфер для быстрого переноса | Crisbio | Не применимо | Электроперенос белков |
| Система ПЦР в реальном времени с флуоресцентным количественным определением | Applied Biosystems (ABI), USA | Нет данных | Детекция qRT-ПЦР |
| Лизирующий буфер RIPA | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | R0020 | Экстракция белков |
| Микроцентрифужные пробирки, свободные от РНКазы | Corning | 3208 | Работа с РНК |
| Среда для криоконсервации клеток без сыворотки | New Cell & Molecular Biotech Co., Ltd. | C40100 | Криоконсервация клеток |
| SPSS Statistics | IBM | Версия 25 | Статистический анализ |
| Стабилизированный разбавитель антител | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | Не применимо | Разведение первичных/вторичных антител |
| Стерильные наконечники для пипеток | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | TP-10-C | Инструмент для создания царапин (рана) |
| База данных STRING | STRING Consortium | Веб-база данных | Анализ сетей белок-белковых взаимодействий |
| TEMED | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T8090 | Реагент для SDS-PAGE |
| TransZol Up | TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China | ET111-01 | Экстракция РНК |
| Буфер Tris-HCl, pH 6,8 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1020 | Буфер для разделяющего геля SDS-PAGE |
| Буфер Tris-HCl, pH 8,8 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1010 | Буфер для концентрирующего геля SDS-PAGE |
| Tween-20 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T8220 | Реагент для промывки иммуноблотта |
| Вертикальный паровой стерилизатор | Shanghai Boxun Medical Biological Instrument Corp. | BXM-30R | Стерилизация |
Ссылки
- Sung, H. et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 69 (1), 7-34 (2019).
- Issa, I. A., Noureddine, M. Colorectal cancer screening: an updated review of the available options. World J Gastroenterol. 23 (28), 5086-5096 (2017).
- Song, L., Jia, J., Peng, X., Xiao, W., Li, Y. The performance of the SEPT9 gene methylation assay and a comparison with other CRC screening tests: a meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 3032 (2017).
- Linnekamp, J. F., Wang, X., Medema, J. P., Vermeulen, L. Colorectal cancer heterogeneity and targeted therapy: a case for molecular disease subtypes. Cancer Res. 75 (2), 245-249 (2015).
- Sveen, A., Kopetz, S., Lothe, R. A. Biomarker-guided therapy for colorectal cancer: strength in complexity. Nat Rev Clin Oncol. 17 (1), 11-32 (2020).
- Whiffin, N. et al. Identification of susceptibility loci for colorectal cancer in a genome-wide meta-analysis. Hum Mol Genet. 23 (17), 4729-4737 (2014).
- Ballman, K. V. Biomarker: predictive or prognostic? J Clin Oncol. 33 (33), 3968-3971 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Forterre, A., Komuro, H., Aminova, S., Harada, M. A comprehensive review of cancer microRNA therapeutic delivery strategies. Cancers (Basel). 12 (7), 1852 (2020).
- Ren, F. J., Yao, Y., Cai, X. Y., Fang, G. Y. Emerging role of miR-192-5p in human diseases. Front Pharmacol. 12, 614068 (2021).
- Nagy, Z. B. et al. Colorectal adenoma and carcinoma specific miRNA profiles in biopsy and their expression in plasma specimens. Clin Epigenetics. 9, 22 (2017).
- Hanzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 14 (1), 7 (2013).
- Staiteieh, S. A. et al. Study of microRNA expression profiling as biomarkers for colorectal cancer patients in Lebanon. Mol Clin Oncol. 16 (2), 39 (2022).
- Przygodzka, P. et al. Regulation of miRNAs by Snail during epithelial-to-mesenchymal transition in HT29 colon cancer cells. Sci Rep. 9 (1), 2165 (2019).
- Sun, C. Y., Zhang, X. P., Wang, W. Coordination of miR-192 and miR-22 in p53-mediated cell fate decision. Int J Mol Sci. 20 (19), 4768 (2019).
- Zhao, L., Wang, B., Sun, L., Sun, B., Li, Y. Association of miR-192-5p with atherosclerosis and its effect on proliferation and migration of vascular smooth muscle cells. Mol Biotechnol. 63 (12), 1244-1251 (2021).