Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
В данном ретроспективном исследовании типа «случай-контроль» оценивались уровни сывороточных miR-146a, miR-642a, miR-2861 и метаболических маркеров у женщин с синдромом поликистозных яичников. Были отмечены скоординированные изменения уровней микроРНК, адипокинов, показателей инсулинорезистентности, маркеров воспаления и тестостерона, при этом комбинированная модель биомаркеров продемонстрировала более высокую дискриминационную способность по сравнению с отдельными маркерами.
Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) представляет собой распространенное эндокринное и метаболическое нарушение у женщин репродуктивного возраста, однако взаимосвязи между циркулирующими микроРНК (miRNAs) и белками, связанными с питанием, остаются изученными не полностью. В данном исследовании изучались ассоциации сывороточных miR-146a, miR-642a и miR-2861 с метаболическими и воспалительными маркерами при СПКЯ. В исследовании приняли участие 62 женщины с СПКЯ и 71 здоровый контроль. Уровни сывороточных miR-146a, miR-642a и miR-2861 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени, также оценивали уровни адипонектина (ADPN), лептина (LEP), ретинол-связывающего белка 4 (RBP4), индекса HOMA-IR (оценка инсулинорезистентности), интерлейкина-6 (IL-6) и тестостерона (T). В ходе методологической валидации оценивали условия обработки образцов, прецизионность анализа и согласованность аналитических методов. По сравнению с контрольной группой, у женщин с СПКЯ наблюдалось повышение экспрессии miR-146a и снижение экспрессии miR-642a и miR-2861. Уровни ADPN были снижены, тогда как уровни LEP, RBP4, HOMA-IR, IL-6 и T были повышены. miR-146a отрицательно коррелировала с ADPN и положительно коррелировала с LEP, RBP4, HOMA-IR, IL-6 и T. miR-642a отрицательно коррелировала с RBP4, HOMA-IR и IL-6, в то время как miR-2861 положительно коррелировала с ADPN. Методологическая валидация показала приемлемую стабильность анализа, прецизионность и согласованность методов. Модель, объединяющая три miRNAs с ADPN, LEP, RBP4, HOMA-IR, IL-6 и T, достигла значения площади под кривой 0,929 при чувствительности 82,26% и специфичности 94,37%. Эти результаты демонстрируют скоординированные изменения циркулирующих miRNAs и метаболических маркеров при СПКЯ и обосновывают дальнейшую оценку их комбинированного диагностического потенциала.
СПКЯ является наиболее распространенным эндокринным и метаболическим расстройством у женщин репродуктивного возраста. Его глобальная распространенность, по оценкам, составляет от 6% до 20%. Примерно у 70% женщин с этим заболеванием наблюдается инсулинорезистентность, и более половины имеют избыточную массу тела или ожирение1. СПКЯ может привести к овуляторной дисфункции, бесплодию, сахарному диабету 2 типа, сердечно-сосудистым заболеваниям и другим долгосрочным осложнениям, что серьезно влияет на репродуктивное здоровье и качество жизни2. Хотя патогенез заболевания до конца не выяснен, считается, что в развитии СПКЯ задействовано множество факторов, включая генетическую предрасположенность, хроническое вялотекущее воспаление, нарушения в путях передачи инсулиновых сигналов и нарушение локального микроокружения яичников. В этом контексте поиск специфических молекулярных маркеров, отражающих прогрессирование заболевания, имеет неоспоримую ценность для ранней диагностики и точного терапевтического вмешательства при СПКЯ3,4.
МикроРНК (миРНК) представляют собой класс некодирующих РНК длиной примерно 22 нуклеотида. Эти молекулы регулируют экспрессию генов после транскрипции, либо стимулируя расщепление мРНК, либо ингибируя трансляцию. Следовательно, данные молекулы имеют решающее значение для многих клеточных процессов, включая рост и дифференцировку клеток, ответы на воспаление и метаболическую регуляцию5,6. Предыдущие исследования показали характерную дисрегуляцию miR-146a, miR-642a и miR-2861 в сыворотке крови пациентов с СПКЯ. Повышение уровня miR-146a может опосредовать хронические воспалительные реакции посредством направленной регуляции пути TLR4/NF-κB7, тогда как снижение экспрессии miR-642a и miR-2861 тесно связано с инсулинорезистентностью и нарушением функции клеток гранулезы яичников8,9. ADPN, LEP и RBP4, которые являются белками, связанными с питанием, играют важную роль в регуляции метаболического баланса. Изменения их уровней могут напрямую влиять на обмен липидов, чувствительность организма к инсулину и состояние воспаления. Это считается ключевой частью молекулярной основы метаболических нарушений, наблюдаемых при СПКЯ10,11. Однако в большинстве опубликованных исследований миРНК или белки, связанные с питанием, изучались в отношении СПКЯ по отдельности12,13, и молекулярная связь между ними до сих пор не была выяснена систематически.
В данном исследовании мы измерили уровни экспрессии трех miRNA и шести основных биомаркеров у пациенток с СПКЯ, проанализировали корреляции между этими маркерами и их связь с клиническими биохимическими показателями, а также изучили, могут ли miRNA участвовать в патологическом процессе при СПКЯ через взаимодействие с белками, связанными с питанием. Результаты этого исследования могут расширить современное понимание молекулярных основ СПКЯ, определить потенциальные мишени для терапии, направленной на нутритивную и метаболическую регуляцию, и предоставить лабораторные данные для раннего скрининга, мониторинга эффективности и индивидуального ведения пациенток с СПКЯ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Заявление об этике
Исследование было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобрено Комитетом по медицинской этике больницы традиционной китайской медицины города Ганьчжоу (номер одобрения GZSZYYKYLL20240092, дата: 2024-12-20).
Все материалы, реагенты, наборы для анализа и оборудование, используемые в данном протоколе, перечислены в Таблице материалов.
Дизайн исследования
В данное ретроспективное исследование случай-контроль были включены 62 пациентки с СПКЯ, диагностированным в гинекологическом амбулаторном отделении больницы традиционной китайской медицины города Ганьчжоу в период с июня 2024 г. по август 2025 г., и 71 здоровая женщина репродуктивного возраста, проходившая обследование в центре управления здоровьем этой же больницы в тот же период. Контрольная группа подбиралась для достижения сопоставимости групп по возрасту; ИМТ не использовался в качестве переменной для сопоставления и оценивался как исходная характеристика.
Объекты исследования
Критерии включения: Критерии включения для группы с СПКЯ были следующими: (1) возраст >18 лет; (2) диагноз СПКЯ в соответствии с модифицированными Роттердамскими критериями, одобренными Международным руководством по доказательной медицине 2023 года, требующими наличия как минимум двух из следующих трех признаков после исключения связанных расстройств: олигоовуляция или ановуляция, определяемые как менструальные циклы продолжительностью более 35 дней или менее восьми циклов в год; клинический гиперандрогенизм и/или биохимический гиперандрогенизм, при этом биохимический гиперандрогенизм определялся как концентрация общего T в сыворотке крови выше верхнего референсного предела конкретного анализа; и поликистозная морфология яичников, определяемая как наличие не менее 20 фолликулов в одном яичнике или объем яичника не менее 10 mL, если полный подсчет фолликулов был невозможен14; (3) наличие полных электронных медицинских карт; (4) отсутствие заместительной гормональной терапии, применения гипогликемических средств или иммунодепрессантов в течение предшествующих 3 месяцев; и (5) наличие образца сыворотки крови, взятого натощак при включении в исследование и хранящегося в институциональном биобанке.
Критерии включения в контрольную группу были следующими: (1) прохождение медицинского осмотра в тот же период; (2) регулярный менструальный цикл; (3) нормальная морфология яичников при трансвагинальном ультразвуковом исследовании; (4) отсутствие в анамнезе эндокринных нарушений, гинекологических заболеваний, бесплодия, а также клинически значимой печеночной или почечной недостаточности; и (5) наличие образца сыворотки крови, взятого натощак в день обследования и хранящегося в биобанке учреждения.
Критерии исключения были следующими: (1) эндометриоз, миома матки, опухоли яичников, воспалительные заболевания органов малого таза или другие гинекологические расстройства; (2) дисфункция щитовидной железы, синдром Кушинга, гиперпролактинемия, врожденная гиперплазия надпочечников или иные эндокринные нарушения, которые могли бы объяснить овуляторную дисфункцию или гиперандрогению; (3) тяжелая сердечная, печеночная, почечная или легочная недостаточность, злокачественные опухоли, аутоиммунные заболевания или гематологические расстройства; (4) беременность, роды или аборт в течение предшествующих 6 месяцев; (5) применение глюкокортикоидов, оральных контрацептивов или других лекарственных средств, влияющих на метаболизм глюкозы или липидов, в течение предшествующих 3 месяцев; (6) психические расстройства или когнитивные нарушения; (7) отсутствие ключевой клинической информации; и (8) выраженный гемолиз сыворотки, определяемый как концентрация гемоглобина >2.0 g/L, липемия, желтуха, более одного цикла замораживания-оттаивания или нарушение условий хранения образцов. Дисфункция щитовидной железы, гиперпролактинемия и неклассическая врожденная гиперплазия надпочечников исключались на основании измерений тиреотропного гормона, пролактина сыворотки и 17-гидроксипрогестерона соответственно; при необходимости анализировался уровень фолликулостимулирующего гормона, а синдром Кушинга или опухоль надпочечников исследовались при наличии клинических показаний. Ко всем клиническим образцам применялась одна и та же преаналитическая процедура, и ни один образец, включенный в первичный анализ, не подвергался более чем одному циклу замораживания-оттаивания.
Сбор и хранение образцов сыворотки
Венозную кровь из вены натощак (10 mL) собирали утром в пробирки без антикоагулянта, выдерживали для свертывания при комнатной температуре в течение 30 min и центрифугировали при 1,505 x g в течение 15 min при 4 °C. Сыворотку разделяли на аликвоты по 200 µL и хранили при −80 °C до проведения анализа. Та же преаналитическая процедура применялась ко всем клиническим образцам; ни один образец, включенный в первичный анализ, не подвергался более чем одному циклу замораживания-оттаивания.
Подготовка образцов для методологической валидации
Десять объединенных образцов сыворотки крови здоровых добровольцев были использованы для оценки влияния скорости центрифугирования (1,505, 3,000 и 4,000 x g в течение 15 min), частоты циклов замораживания-оттаивания (0, 1, 3 и 5 циклов), температуры хранения (4 °C, −20 °C и −80 °C в течение 7 дней), длительности хранения (1, 3, 6 и 12 месяцев при −80 °C) и степени гемолиза (<0.1, 0.1–0.5 и 0.5–2.0 g/L гемоглобина).
Лабораторные исследования
Все лабораторные анализы выполнялись одним и тем же квалифицированным техническим специалистом в стандартизированных условиях окружающей среды и в соответствии с заранее определенными рабочими процедурами. Количество miRNA в сыворотке определяли методом qRT-PCR; уровни ADPN, LEP и RBP4 измеряли методом сэндвич-ELISA; уровни T и IL-6 определяли с помощью иммунохимилюминесцентного анализа; показатели метаболизма глюкозы получали с использованием стандартных автоматизированных лабораторных методов.
Количественное определение miRNA в сыворотке методом qRT-PCR
Общую РНК экстрагировали из 200 µL сыворотки с использованием реагента TRIzol. Спектрофотометрические данные о концентрации РНК и чистоте A260/A280 для архивных препаратов РНК сыворотки отсутствовали. В связи с этим приемлемость анализа qRT-PCR оценивали по наличию одного специфического пика на кривой плавления и согласованности результатов трех технических повторностей. После разделения фаз хлороформом, осаждения изопропанолом и двух промывок 75% этанолом осадок РНК растворяли в воде без нуклеаз. Реакционная смесь объемом 20 µL содержала 4 µL 5x буфера, 1 µL обратной транскриптазы, 1 µL 10 µM стем-петлевого праймера и 5 µL матрицы РНК. Условия реакции: 16 °C в течение 30 мин, 42 °C в течение 30 мин и 85 °C в течение 5 с. Продукты обратной транскрипции хранили при −20 °C. Количественную ПЦР проводили с использованием набора TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II. Каждая реакция объемом 20 µL содержала 10 µL 2× SYBR смеси, по 0.8 µL прямого и обратного праймеров (10 µM) и 2 µL матрицы кДНК. Амплификацию проводили на системе ПЦР в реальном времени Applied Biosystems 7500 при следующих условиях: предварительная денатурация при 95 °C в течение 30 с; 40 циклов при 95 °C в течение 5 с и 60 °C в течение 30 с; затем проводили анализ кривой плавления для подтверждения специфичности амплификации. В качестве внутреннего референсного гена использовали U6 snRNA, а относительные уровни экспрессии miR-146a, miR-642a и miR-2861 рассчитывали с помощью метода 2-ΔΔCt. Каждый образец анализировали в трех повторностях. Последовательности всех праймеров, использованных в данном исследовании, приведены в Таблице 1.
Определение маркеров сывороточных белков
Концентрации ADPN, LEP и RBP4 в сыворотке определяли методом двухслойного сэндвич-ИФА с использованием наборов Human Total ADPN/Acrp30 Quantikine ELISA Kit (аналитическая чувствительность 0.891 ng/mL; диапазон анализа 3.9–250 ng/mL), Human Leptin Quantikine ELISA Kit (аналитическая чувствительность 7.8 pg/mL; диапазон анализа 15.6–1,000 pg/mL) и Human RBP4 Quantikine ELISA Kit (аналитическая чувствительность 0.628 ng/mL; диапазон анализа 1.56–100 ng/mL) соответственно. Каждый анализ был специфичен для соответствующего аналита человека; образцы сыворотки разводили согласно инструкциям производителя. Оптическую плотность измеряли при 450 nm, а концентрации рассчитывали с помощью четырехпараметрических логистических стандартных кривых. Коэффициенты вариации (CV) внутри серии или между сериями составили 2.5% или 3.2% для ADPN, 2.7% или 3.4% для LEP и 2.6% или 3.3% для RBP4.
Измерение уровня T
Уровень T в сыворотке крови измеряли методом электрохемилюминесцентного иммуноанализа с использованием автоматического анализатора для иммуноанализа Roche Cobas e601.
Измерение показателей метаболизма глюкозы и маркеров воспаления
Значения глюкозы в плазме натощак, инсулина натощак и HbA1c были получены из результатов стандартных клинических лабораторных анализов, проведенных в тот же день, а не из архивных аликвот сыворотки, использованных для анализа miRNA и метаболических белков. Глюкозу в плазме натощак измеряли глюкозооксидазным методом, инсулин натощак — методом иммунотурбидиметрии, а HbA1c — методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Индекс HOMA-IR рассчитывали по формуле: [глюкоза в плазме натощак (mmol/L) × инсулин натощак (mIU/L)]/22.5. Уровень IL-6 в сыворотке определяли методом хемилюминесцентного иммуноанализа.
Методологическая валидация
Сравнения с альтернативными методами проводились для определения устойчивости первичных измерений к платформе анализа и не использовались для получения основных межгрупповых результатов. Уровни экспрессии трех miRNA и пяти биохимических маркеров измерялись при различных условиях обработки, описанных выше, а коэффициент вариации для каждого показателя рассчитывался как CV = (стандартное отклонение/среднее значение) x 100%. CV <15% считался приемлемым для оценки стабильности результатов анализа при различных условиях обработки и хранения образцов. Внутридневная прецизионность оценивалась путем десятикратного повторного измерения одного и того же объединенного образца сыворотки в течение одного дня, тогда как междневная прецизионность определялась по результатам измерений, проводимых один раз в день в течение пяти дней подряд. Для каждого показателя рассчитывались среднее значение, стандартное отклонение и соответствующий CV. Для проверки аналитической согласованности пять биохимических аналитов — ADPN, LEP, RBP4, IL-6 и T — измерялись в валидационных образцах с использованием основного метода анализа и платформы иммуноанализа на основе хемилюминесценции Roche. Для расчета 95% пределов согласования использовался анализ Бланда–Альтмана. Основной метод qRT-PCR использовался для всех клинических измерений miRNA, тогда как набор miScript SYBR Green PCR Kit использовался только в качестве ортогонального метода в эксперименте по аналитической согласованности; между двумя системами qRT-PCR рассчитывались коэффициенты корреляции Пирсона.
Статистический анализ
Анализ данных проводили с использованием статистического программного обеспечения. Все непрерывные переменные предварительно проверяли на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. Данные с нормальным распределением представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Сравнения между двумя группами проводили с помощью t-критерия для независимых выборок, а сравнения между несколькими группами — с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим применением t-критерия LSD для попарных сравнений. Данные, не имеющие нормального распределения, представлены в виде медианы (межквартильный размах) [M (P25, P75)]. В таких случаях сравнения между двумя группами проводили с помощью U-критерия Манна-Уитни, а сравнения между несколькими группами — с помощью H-критерия Краскела-Уоллиса. Категориальные данные представлены в виде частот и процентов. Мы использовали χ2 тест или точный критерий Фишера для сравнения групп. Корреляции между переменными оценивали с помощью корреляционного анализа Пирсона или рангового корреляционного анализа Спирмена в зависимости от распределения данных. В качестве эксплораторного анализа корреляции Пирсона между каждой мРНК и шестью метаболическими маркерами были повторно рассчитаны в группе лиц без ожирения (ИМТ <28 кг/м2) и с ожирением (ИМТ ≥28 кг/м2) подгруппы СПКЯ. Коэффициенты корреляции сравнивали с помощью z-преобразования Фишера, и полученные межгрупповые p значения были скорректированы с использованием процедуры контроля ложноположительных результатов Бенджамини — Хохберга. Диагностическая эффективность оценивалась с помощью рабочих характеристик приемника (ROC-кривых) и площади под кривой (AUC). Кроме того, с помощью модели логистической регрессии был проведен анализ комбинированного выявления. Все тесты были двусторонними, и p < Значение 0,05 считалось статистически значимым.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Исходные характеристики исследуемой популяции
В данное исследование было включено в общей сложности 62 пациента с СПКЯ и 71 здоровый доброволец из контрольной группы. Две группы были сопоставимы по возрасту, этническому составу и другим исходным характеристикам (p > 0.05). Напротив, менструальные циклы в группе СПКЯ были значительно длиннее, чем в контрольной группе (p < 0.001), что соответствует типичной клинической картине СПКЯ (Таблица 2).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
С использованием стандартизированных биохимических анализов сыворотки и qRT-PCR в данном исследовании были проанализированы образцы сыворотки 62 пациентов с СПКЯ и 71 здорового добровольца из контрольной группы. Мы выявили характерный паттерн нарушения экспрессии miRNA и белков, связанных с питанием, при СПКЯ, а также значимые посттранскрипционные взаимосвязи между ними. Все эксперименты прошли строгую методологическую валидацию. Прецизионность, стабильность и согласованность методов системы детектирования соответствовал...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Отсутствует.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ультранизкотемпературный морозильник -80 °C | Thermo Fisher (USA) | Forma 900 | Длительное низкотемпературное хранение образцов сыворотки |
| Набор ELISA для определения адипонектина (ADPN) | R&D Systems (USA) | DY1065 | Количественное определение концентрации ADPN в сыворотке |
| Автоматический биохимический анализатор | Beckman Coulter (USA) | AU5800 | Определение уровня глюкозы в крови натощак, инсулина и гликированного гемоглобина |
| Автоматический планшетный ридер | Tecan (Switzerland) | Infinite M200 Pro | Измерение оптической плотности при 450 nm для экспериментов ELISA |
| Набор для определения глюкозы в крови | Beckman Coulter (USA) | A11A01 | Определение уровня глюкозы в сыворотке натощак глюкозооксидазным методом |
| Анализатор для хемилюминесцентного иммуноанализа Cobas e601 | Roche (Germany) | Cobas e601 | Электрохемилюминесцентное определение тестостерона и IL-6 в сыворотке |
| Криопробирка без ферментов | Axygen (USA) | MCT-150-C | Аликвотирование образцов сыворотки, ультранизкотемпературное хранение при -80 °C |
| Дозатор Eppendorf Research plus | Eppendorf (Germany) | Research plus 0.5-1,000 μL | Аспирация сыворотки, пипетирование РНК/реагентов, аликвотирование образцов |
| Набор для определения гликированного гемоглобина (HbA1c) | Beckman Coulter (USA) | A11A03 | Определение HbA1c в сыворотке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии |
| Набор для определения IL-6 | Roche (Germany) | 5200057190 | Количественное определение интерлейкина-6 в сыворотке |
| Набор для определения инсулина | Beckman Coulter (USA) | A11A02 | Определение уровня инсулина в сыворотке натощак методом иммунотурбидиметрии |
| Набор ELISA для определения лептина (LEP) | R&D Systems (USA) | DY398 | Количественное определение концентрации LEP в сыворотке |
| Низкотемпературная высокоскоростная центрифуга | Xiangyi Instrument (China) | TDZ5-WS | Центрифугирование образцов при заданных центробежных силах |
| Набор miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen (Germany) | 218073 | Проверка методологической согласованности при определении miRNA |
| Набор для обратной транскрипции PrimeScript RT Reverse Transcription Kit | TaKaRa (Japan) | RR036A | Обратная транскрипция miRNA для синтеза cDNA |
| Система для количественной ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией | Applied Biosystems (USA) | 7500 | Амплификация miRNA методом qRT-PCR и флуоресцентная детекция |
| Набор ELISA для определения ретинол-связывающего белка 4 (RBP4) | R&D Systems (USA) | DY6005 | Количественное определение концентрации RBP4 в сыворотке |
| Статистическое программное обеспечение SPSS | IBM (USA) | 25 | Тест на нормальность распределения данных, межгрупповое сравнение, корреляционный и ROC-анализ |
| Набор SYBR Premix Ex Taq II Kit | TaKaRa (Japan) | RR420A | Флуоресцентная количественная ПЦР-амплификация miRNA |
| Набор для определения тестостерона (T) | Roche (Germany) | 5200067190 | Количественное определение уровней тестостерона в сыворотке |
| Реагент для экстракции общей РНК TRIzol | Invitrogen (USA) | 15596026 | Экстракция общей РНК из образцов сыворотки |
| Вакуумная пробирка для забора крови без антикоагулянта | BD Biosciences (USA) | 367812 | Забор крови из локтевой вены натощак для отделения сыворотки |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.