Измерение влияния фармакологических соединений на морфологию митохондрий в моделях старения мышей

Краткое содержание

Этот протокол описывает методы измерения влияния препаратов, вводимых с помощью имплантируемых осмотических минипомпов, на морфологию митохондрий в моделях стареющих мышей. Проводится трёхмерная (3D) сверхразрешённая конфокальная визуализация печени мышей, а также разрабатывается конвейер для бесприкосённой сегментации, классификации и количественного анализа структур митохондрий.

Аннотация

Накопление молекулярных повреждений, связанных со старением, может способствовать изменениям в морфологии митохондрий и метаболической дисфункции, особенно в тканях с высокими энергозатратами. Фармакологические соединения, которые улучшают метаболические нарушения и восстанавливают здоровые, «молодые» митохондриальные морфологии, могут таким образом представлять собой эффективные методы продления продолжительности здоровья (то есть той части жизни, свободной от бремени хронических заболеваний, связанных с старением) у млекопитающих. Здесь описаны методы проведения подкожных осмотических насосов у пожилых мышей для стабильной доставки гидрофобных фармакологических соединений. Затем ткани фиксируются, криосецируются, окрашиваются и визуализируются с помощью сверхразрешающей конфокальной световой микроскопии. Наконец, представлен автоматизированный конвейер для трёхмерной сегментации, классификации и количественного измерения митохондриальных структур. Таким образом, эти методы могут быть полезны для количественной оценки изменений в трёхмерной структуре митохондрий в различных тканях на протяжении всей жизни мыши. Кроме того, эти методы могут помочь воспроизводить воспроизводимую идентификацию маломолекулярных препаратов, которые смягчают метаболические нарушения, связанные со старением.

Введение

Митохондрии — это органеллы, связанные с двойными мембранами, которые пространственно-временно организованы так, чтобы соответствовать текущим метаболическим потребностям клетки и ткани^{хозяина.} Инвагинации во внутренней мембране, называемые кристами, формируются и организуются посредством динамической координации между недвуслойными внутренними фосфолипидами, такими как кардиолипин и фосфатидилэтаноламин, рядами димеров АТФ-синтазы на кончиках крист, кардиолипино-связывающими олигомерами динаминиподобной оптической атрофии GTPase 1 (OPA1) на вершине крист, а также комплексами митохондриального контактного участка и системы организации крист (MICOS) на соединениях^{крестов 1}. Эти внутренние мембранные структуры подразделяют митохондрии на отдельные функциональные^{единицы 2} и обеспечивают увеличенную площадь поверхности, на которой могут собираться дыхательные комплексы, производящие митохондриальный трансмембранный^{потенциал. 1}. Как динамические органеллы с вторичными клетовыми функциями, связанными с апоптотической^{сигнальной передачей 3}, Ca²⁺ и реактивным гомеостазом видов^{кислорода 3}, а также биосинтезом^{липидов 4}, морфологические структуры митохондрий высокочувствительны к изменениям окружающей среды, таким как снижение доступности^{кислорода 5} и увеличение высвобождения^Ca2+ из эндоплазматического^{сетки 6,7}.

Накопление молекулярных повреждений способствует изменениям в структуре и функции митохондрий в^{возрасте 8} лет. Новаторские исследования криоэлектронной томографии (крио-ЭТ), проведённые группой Кюльбрандта на нескольких модельных организмах, показали чёткую корреляцию между плотностью кристалов и дыхательной ёмкостью, а также возрастное снижение плотности крист и связанное с этим снижение димеров АТФ-синтазы ^9,10. Кроме того, изменения объёма митохондрий могут быть вызваны нарушением деления и динамики слияния митохондрий¹¹, увеличенным накоплением^{липидов 12} и увеличенным^{отёком 13}. В скелетной мышце_{VO 2} max, который является сильным предиктором продолжительности жизни^14,15, можно точно предсказать на основе степени фрагментации митохондрий интермиофибрилляра и плотности^{кристов 16}.

Неудивительно, что структурные и функциональные изменения митохондрий, связанные со старением, могут способствовать патогенезу ряда хронических заболеваний^{17, 18, 19, 20}. Усиленная фрагментация митохондрий и изменения в биогенезе и морфологии митохондрий связаны как с болезнью Альцгеймера, так и с болезнью^{Паркинсона 20}. Эти изменения приводят к нарушениям работы окисляющих фосфорилирующих комплексов, что затрудняет генерацию протонной движущей силы и приводит к чрезмерному образованию реактивного кислорода 20,21,22. При нарушениях сердечной функции и сердечной недостаточности, связанных со старением, усиленная фрагментация митохондрий, отёк, вакуолизация и потеря плотности крестов способствуют снижению выработки^{АТФ 23,24}. Эти структурные изменения могут частично быть связаны с изменённой обработкой митохондрий Ca²⁺ и повышенной активностью переходной поры митохондриальной проницаемости 6,7,13,25. Как предполагаемый регулятор митофагии, чрезмерное открытие переходной поры проницаемости при старении может быть разрушительным и привести к неконтролируемой клеточной^{гибели 13}. Наконец, известно, что связанные с возрастом дефициты в метаболизме липидов митохондриальных и митофагии также могут способствовать развитию неалкогольной жировой болезни^{печени 26}. В частности, печёночный стеатоз сопровождается повышенным окислительным стрессом и увеличением образования пончикоподобных митохондриальных^{структур 3,27}.

В связи с этим существует значительный интерес к разработке терапевтических средств, направленных на снижение функции митохондрий с возрастом, чтобы улучшить качество жизни людей с определёнными хроническими заболеваниями. Forzinity (эламипретид), липидно-интерактивный пептид, который ослабляет потенциал поверхности внутренней^{мембраны 28} и увеличивает генерацию митохондриального^{АТФ на 29,30}, недавно стал первым одобренным FDA препаратом, направленным на митохондрии, для лечения синдрома Барта. Синдром Барта — это Х-связанное заболевание, при котором дефекты ремоделирования кардиолипина способствуют кардиомиопатии, слабости скелетных мышц и преждевременной^{смертности 31}. Хотя краткосрочное лечение не вызвало заметных изменений в биологическом возрасте мышек^{у пожилых мышей 32} лет, лечение эламипретидом показало неоднократные улучшения функциональных параметров старения, такие как фракция выброса сердца и глобальное продольная^{нагрузка 32,33}, мышечная усталость и генерация^{силы 33,34,35} и^{хрупкость 32}. Уролитин А, эллагитаннин, полученный из кишечника, вызывающий^{митофагию 36}, также показал клинические улучшения в выносливости и силе аэробных^{мышц 37,38}, а также положительный эффект на сердечные нарушения у пожилых мышей и моделей индуцированной сердечной^{недостаточности у крыс 39}. Метформин, противодиабетический препарат, который доказано взаимодействует с^{комплексом I 40}, также предполагается как частичный миметик калорийного ограничения^41,42. Однако, хотя лечение метформином в предыдущих эпидемиологических данных ассоциировалось со снижением риска рака и задержкой когнитивного снижения^43,44, его влияние на продолжительность здоровья и продолжительность жизни у пациентов без диабета остаётся открытым^{вопросом 45}. Наконец, лечение никотинамидом рибозидом, прекурсором NAD+, может усиливать митохондриальный биогенез и митохондриальный раскрытый белковый ответ для улучшения генерации энергии 46,47,48,49, но его длительное лечение у мышей с UM-HET3 не оказало значительного влияния на медиану или 90-й процентиль жизни^{мышей 50}.

Здесь описаны методы подготовки тканей пожилых мышей, обработанных фармакологическими соединениями, для сверхразрешающей конфокальной визуализации морфологии митохондрий. Демонстрируется успешная имплантация осмотических минипомп для устойчивой доставки лекарств мышам, а также анализируется печень на предмет влияния лечения на структуру наружной мембраны. Наконец, представлен аналитический конвейер для бескосвенного, воспроизводимого количественного измерения объёма митохондрий, площади поверхности и сферичности, а также классификации митохондрий по различным структурам. Таким образом, эти методы применимы как для изучения изменений в морфологии митохондрий на протяжении жизни млекопитающих, так и для выявления фармакологических соединений, способных смягчать ухудшение метаболического здоровья, связанное со старением.

Протокол

Все процедуры, связанные с исследовательскими животными, проводились в соответствии с институциональными рекомендациями по использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетами по уходу и использованию Brigham and Women's Hospital и Гарвардской медицинской школы в соответствии с Протоколом No 2016N000368. Исследователям, заинтересованным в применении этого протокола в других странах, следует консультироваться со своими местными институциональными и регулирующими органами для обеспечения соблюдения применимых нормативов по благополучию животных.

1. Имплантация подкожного осмотического насоса

ПРИМЕЧАНИЕ: Операции на животных должны выполняться только опытным и обученным персоналом, и необходимо уделять огромную осторожность для минимизации стресса и/или страданий животных. Выполняйте процедуры с участием исследовательских животных только так, как точно описано в утверждённых протоколах для животных. Все исследования, связанные с использованием животных, должны строго соответствовать 3R — Замена, Уменьшение и Совершенствование. Этот протокол подробно описывает имплантацию подкожного осмотического насоса, которая классифицируется как незначительная хирургическая процедура. Также могут быть проведены имплантации внутрибрюшного осмотического насоса, но это более сложная процедура, классифицируемая как крупная хирургическая процедура. Поэтому рекомендуется проводить подкожную процедуру, если нет веских научных обоснований в пользу внутрибрюшнической имплантации.

1. Заполнение осмотических насосов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка лекарственных растворов и наполнение осмотических насосов должны проводиться в шкафу для биобезопасности с использованием стерильной техники. Модели насосов следует выбирать исходя из желаемого объёма резервуара и продолжительности подачи обработки. Для этого исследования использовалась модель 2004 года (объём резервуара ~200 мкл, обработка в течение 4 недель).
   1. Подготовьте раствор препарата в растворителе, совместимом с осмотическими насосами. См. https://alzet.com/formulating-the-solution/. Используйте расход (мкл/ч), указанный на партии заказанных осмотических насосов, чтобы определить концентрацию препарата, необходимую для достижения целевой суточной дозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор 50% ДМСО и 50% PEG₃₀₀ стабильно растворяет гидрофобные соединения и совместим с осмотическими насосами. Все соединения и растворители должны быть фармацевтического качества, когда это возможно.
   2. Раствор препарата простерилизуйте фильтром через шприцовый фильтр толщиной 0,22 мкм и храните при комнатной температуре.
   3. Вставьте замедлятель потока в насос и нажимайте вниз, пока он не поместится в микрофужную трубку. Не нажимайте на модератор потока до конца.
   4. Поставьте аналитические весы на пустой трубке микрофуга, а затем запишите вес осмотического насоса.
   5. Подключите наполнительную трубку к шприцу объёмом 1 мл и наберите как минимум в 1,5 раза больше объёма резервуара насоса. Удалите пузырьки воздуха, потянув поршень вниз, щёлкнув шприцом и поднимая его до образования жидкости на верхней части трубки.
   6. Снимите регулятор потока, держа насос вертикально.
   7. Вставьте наполнительную трубку через отверстие в верхней части насоса, пока она не сможет идти дальше.
   8. Медленно нажимайте поршень вниз, удерживая насос вертикально. Продолжайте наполнять, пока раствор не появится на выходе. Затем снимите наполнительную трубку и протрите лишний раствор аккуратной салфеткой.
   9. Вставьте замедлятель потока до тех пор, пока крышка не придётся к верхней части насоса.
   10. Положите заполненный насос обратно в микрофужную трубку и взвесите. Определите вес раствора и убедитесь, что объём наполнения составляет не менее 90% от объёма резервуара (разница в миллиграммах ≈ объёме в микролитрах).
   11. Заполните коническую трубку объёмом 15 мл 5 мл стерильного 1× фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и добавьте предварительно заполненный насос. Герметизация парафиновой пленкой и грунтование насоса(ов) при инкубации при 37 °C в течение времени, необходимого модели осмотических насосов. Для модели 2004 это 40 ч.
2. Приготовление мелоксикама
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это следует выполнять в шкафу для биобезопасности с использованием стерильной техники. Мелоксикам, нестероидный противовоспалительный препарат (НПВС), не является контролируемым веществом, но может потребовать лицензии на контролируемое вещество для приобретения.
   1. Используя иглу на 27 г и шприц Luer-lok на 3 мл, разведите бульон мелоксикаму 5 мг/мл до 1 мг/мл стерильным PBS в стерильном стеклянном флаконе объёмом 5 мл. Приготовьте день и храните при комнатной температуре.
3. Подготовка операционного места
   ПРИМЕЧАНИЕ: Имплантация осмотического насоса внутри биобезопасного шкафа не обязательна, а также невозможно поддерживать стерильность во время хирургических процедур. Однако место операции должно соответствовать строгим стандартам чистоты и асептической практике. Место операции должно быть чистым, свободным от беспорядка и с минимальным потоком людей. В идеале есть как место подготовки (например, для бритья и чистки), так и место для операции (то есть для установки насоса).
   1. Полностью продезинфицируйте операционную зону 70% этанолом и вытерете бумажными полотенцами.
   2. Включите стерилизатор стеклянных шариков и установите температуру на 250 °C. Дайте согреться 15–30 минут.
   3. Включите вапорайзер и установите грелку на 65%. Установить массу тела животного и установить процент изофлурана на уровне 3,2%.
   4. Прикрепите один из датчиков температуры к поверхности грелки. Дайте грелке прогреться до 35–37 °C.
   5. Снимите шприц для испарителей. Введите зелёную вкладку до конца и наполните её изофлураном, подключив бутылку с изофлураном и оттянув поршень.
   6. Прикрепите шприц обратно к вапорайзеру и подготовьте его.
   7. Положите вторую грелку под чистую клетку для животных для восстановления. Поставьте клетку наполовину, наполовину с грелки.
4. Имплантация насоса
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты должны быть заранее очищены и автоклавированы. Для стерилизации хирургических инструментов между животными может использоваться стеклянный бусинный стерилизатор. Это можно использовать только для групп до 5 животных. Обязательно приложите индикаторную полоску автоклава, чтобы убедиться, что параметры стерилизации выполнены. Правильные средства индивидуальной защиты (СИЗ) включают чистый лабораторный халат, хирургическую маску, стерильные хирургические перчатки и маски для волос. Животные, проходящие операцию, не должны находиться на виду других животных.
   1. Возьмите мышь за основание хвоста и поместите её в анестезиологическую камеру. Отсоедините трубки и включите поток изофлурана (3,2%) в камеру. Положите две стерилизованные драпировочные простыни поверх грелки.
   2. Дождитесь, пока мышь повернётся на бок, и следите за её дыханием. Когда дыхание замедлилось и стало расслабленным, прекратите приток изофлурана в камеру. Прикрепите трубки к камере и отстегните трубки от носового конуса для использования. Начните поток изофлурана (2%) в носовой конус.
   3. Вытащите мышь из камеры и засунь её нос в носовой конус грелки. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза.
   4. Взвесьте мышь на весах, а затем верните к носовому конусу. Определите объём 1 мг/мл мелоксикама, который будет введён. Для дозировки 5 мг/кг умножьте вес мыши в граммах на 5, чтобы получить количество микролитров мелоксикама.
   5. Распылите крышку флакона с мелоксикамом 1 мг/мл этанолом 70% и высушите аккуратной салфеткой. Затем, используя шприц с инсулином на 0,3 мл, составьте правильный объём мелоксикама. Удалите все пузырьки воздуха из шприца.
   6. Сжимайте/фиксируйте мышь одной рукой, наклоняя голову вниз. Введите иглу под углом 30°–45° в нижнем правом квадранте живота с фаской вверх. Аспирируйте для подтверждения правильного расположения иглы.
   7. Если аспирация не наблюдается, плавно нажимайте на поршень и вводите мелоксикам внутрибрюшинно.
   8. Верните мышь в носовой конус и грелку. Полностью сбрийте 150% области вокруг места имплантации (от середины до верхней части спины) хирургическими машинками. После завершения аккуратно пропылесосите/счистите шерсть с животного и избавьтесь от первого листа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения асептической операции необходимо чистое бритье. Минимум, любой разрез должен быть полностью свободен от растительной шерсти.
   9. Поставьте мышь так, чтобы её голова была обращена к хирургу. Проводите чередующееся очищение с повидон-йодом и 70% этанолом, используя аппликаторы с хлопковыми наконечниками, всего три применения. Обязательно начинайте с середины запланированного разреза и спирали наружу с аппликаторами с хлопковыми наконечниками.
   10. Накройте животное стерильными хирургическими занавесками и используйте правильную асептическую технику, чтобы надеть хирургические перчатки.
   11. Перед любым разрезом тщательно проверьте рефлексы педалей, крепко зажав обе ноги тканевыми щипцами. Не продолжайте до нескольких нажатий — движения нет. Это подтверждает хирургическую плоскость анестезии.
   12. Поднять кожу в средней части лопатки щипцами тканями и сделать разрез диаметром 1 см, перпендикулярный позвоночнику, маленькими хирургическими ножницами для радужки. Чтобы сделать прямой разрез, режьте хирургическими ножницами Iris под углом 90° к мыши.
   13. Используйте небольшие гемостатические щипцы внутри разреза, чтобы расширить подкожную ткань и создать карман для насоса. Убедитесь, что карман для помпы находится в стороне от передней части животного и расположен чуть сбоку. Используйте гемостатические щипцы, чтобы ослабить кожу со всех сторон разреза.
   14. Откройте разрез тканевыми щипцами и введите насос с помощью гемостатических щипцов. Вставьте насос так, чтобы сначала подключился модератор потока.
       ВНИМАНИЕ: Насос должен быть установлен так, чтобы он был достаточно далеко от разреза, то есть чтобы кожа вокруг разреза не была под натяжением. Если неправильно расположить рану, это может привести к отслоению раны. Насос также может менять положение во время восстановления животного.
   15. Используя тканевые щипцы, аккуратно поднимите кожу и вытяните обе стороны разреза друг с другом. Начиная с одного конца разреза, используйте клипс-аплайдер, чтобы разместить зажимы диаметром 7 мм вдоль всего разреза (может потребоваться 2–4 зажимы).
   16. Для любых зазоров в разрезе, которые слишком малы, чтобы их можно было вместить другой зажим, нанесите небольшое количество клея для тканей с помощью стерильного аппликатора. Прижмите крепко тканевыми щипцами.
   17. Аккуратно потяните и растяните кожу вокруг разреза, чтобы убедиться, что рана закрыта. Затем перекройте поток изофлурана в носовой конус и зажжите соответствующие трубки. Поместите мышей в клетку для восстановления на грелке.
   18. Полностью следите за мышью, пока она не проснётся и не станет двигаться. Регулярно следите за животными на предмет признаков страдания или боли и держите их в изоляции от других мышей до их выздоровления.
   19. Через 24 часа повторно введите 5 мг/кг мелоксикама через внутрибрюшинную инъекцию. (По желанию) Для помощи в восстановлении животных обеспечьте электрогелевыми добавками и/или разместите корм на полу клетки.
   20. Через 10–14 дней снова анестезируйте животных изофлураном, нанесите офтальмологическую мазь и удалите клипсы средством для снятия клипс.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Заколки нужно удалить к этому времени, чтобы избежать повторного роста волос на заколках на ранах. Кроме того, у всех осмотических насосов есть определённый срок действия. Обязательно либо удаляйте насосы, либо усыпляйте животных к концу срока их действия. В течение более длительных периодов лечения можно выполнять несколько имплантаций помпы подряд одному и тому же животному.

2. Фиксация, вложение и сечение тканей

1. Фиксация тканей
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных должны выполняться опытным персоналом, чтобы минимизировать стресс и страдания животных. Камеру эвтаназии следует очистить и физически выбросить между каждым животным, чтобы удалить остатки углекислого газа. Чтобы минимизировать стресс, животных следует эвтаназировать в домашних клетках, когда это возможно. Наконец, животных не следует усыплять в пространственной близости или на глазах у других мышей. Для процедур, не связанных с выживаемостью, необходимы чистые хирургические инструменты, но они не должны быть стерильными (то есть автоклавами).
   1. Поместите мышь в индукционную камеру и откройте регулятор, пока расходомер не достигнет запланированного расхода (~40%–70% от объёма камеры в минуту).
   2. Наблюдайте за мышью на протяжении всей процедуры, чтобы не было признаков беспокойства, например, прыжка. Следите за прекращением дыхательной активности и поддерживайте поток_CO2 не менее 2 минут после прекращения дыхательной активности. Убедитесь, что общее время воздействия_CO2 составляет не менее 5 минут.
   3. Доберите мышь и выполните вторичный метод эвтаназии, например, вывих шейки матки.
   4. Приколите конечности животного к кусочку пенополистирола, покрытому алюминиевой фольгой, с помощью игл 23G. Смачивайте шерсть, опрыскивая 70% этанола.
   5. Сделайте небольшой разрез у основания живота и разрежьте кожу до шеи. Пройдите по тому же разрезу, чтобы открыть полость тела и аккуратно разрезать грудную клетку.
   6. Сделайте U-образные разрезы, начиная с основания живота, и закрепляйте кожу спицами 23-G.
   7. Вскрытие соответствующего органа(ов) и поместице в коническую трубку объёмом 15 мл, предварительно заполненную 5 мл 4% параформальдегида (PFA). Фиксируйте 24 часа при 4 °C на гриле.
      ВНИМАНИЕ: Раствор PFA опасен. Избегайте контакта с кожей. Правильная СИЗ при обращении включает лабораторный халат, нитриловые перчатки и защитные очки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо провести кровь из тканей и/или при необходимости фиксации перфузии, выполните кардиологическую перфузию, как описано^{выше 51}. При фиксации погружения, как здесь, фиксатив может потребоваться время, чтобы диффундировать по ткани, особенно в крупных участках ткани. Это может изменять морфологию митохондрий; кроме того, фиксация на PFA также может привести к уменьшению^{тканей на 52}.
   8. Через 24 часа удалите раствор параформальдегида и прополосните ткани в 10 мл 1× PBS. Проведите его в общей сложности 3 раза по 10 минут при комнатной температуре на гриле.
   9. Удалите PBS и погрузите ткани в 10 мл сахарозы 30% на 48 часов при 4 °C на гриле. Инфильтрация сахарозы завершена, когда ткани опускаются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что растворитель был доставлен животному, измерьте количество, оставшееся в насосе.
2. Вложение тканей
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно следите за расположением и ориентацией тканей в формах.
   1. Наполните контейнер из пены из полистирола сухим льдом и положите на него плоский лист металла.
   2. Разместите формы поверх металлического листа и заполните 2/3–3/4 до верхней части составом оптимальной температуры резки (OCT) (материалом для вложения ткани). Выведите любые воздушные пузырьки либо на поверхность, либо к углам с помощью тонких щипцов. Чтобы ускорить замерзание, положите сухие ледяные гранулы прямо к формам.
   3. Положите немного среды для вграждания тканей в весовую лодку и смешайте ткани внутри. Старайтесь не переносить раствор сахарозы.
   4. Когда среда, встраивающая ткань, полностью замёрзнет на нижней части формы (она должна быть полностью непрозрачной), погрузите ткань внутрь формы так, чтобы она не касалась ни одной стороны формы или поверхности. Разместите место в нужном месте и в нужном месте.
   5. Подождите, пока среда для встраивания тканей полностью замёрзнет, прежде чем переносить формы в морозильник при температуре -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (Точка паузы) Встроенные ткани можно хранить не менее 3 месяцев.
3. Сечение тканей
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить вариацию толщины срезов от партии к партии, все ткани, которые анализируются вместе, следует секционировать за один сеанс.
   1. Достаньте встроенные ткани из морозильника при температуре -80 °C и поместите в контейнер из пенополистирола, наполненный сухим льдом.
   2. Предварительно охладите температуру камеры криостата и держателя образца до -24 °C и -25 °C соответственно.
   3. Вставьте новый клинок микротома в держатель и вставьте стабилизатор покрен. Для удобства уборки выстилайте камеру криостата бумажными полотенцами.
   4. Вынимите патрончик из камеры криостата и прогрейте до комнатной температуры.
   5. Используйте лезвие бритвы, чтобы аккуратно нарезать каждый уголок формы для ткани. Аккуратно разоружите его, чтобы удалить средний блок для вложения ткани.
   6. Плотно прижимайте блок ткани к патрону образца, поворачивая его взад-вперёд. Когда образец прочно приклеен, поместите образец в камеру криостата на несколько минут для заморозки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно разместите блок ткани на патроне в правильной ориентации так, чтобы ткань была рассечена в нужной ориентации.
   7. Когда блок ткани полностью заморожен на образце патрона, поместите патрон в держатель патрона и затяните на месте. Переместите криостатное лезвие так, чтобы оно было прямо перед блоком ткани, не касаясь его.
   8. Установите обрезку на 50 мкм и начните обрезать блок, пока не будет открыт полный поперечный срез ткани.
   9. Отключите параметр обрезки и установите толщину сечения на 20 мкм. Нарежьте несколько срезов этой толщины перед опусканием пластины с прокатом. Медленно и плавно прорезайте ~80%–90% участка, прежде чем остановиться.
   10. Подними стабилизатор. Достаньте заряженный стеклянный стекло и прижмите заряженную сторону к тканевой секции в нужном положении.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если после подъёма стабилизатора салфетка сворачивается, используйте тонкие щётки для разворачивания.
   11. Снимите патрон из держателя патрона. Выньте патрон из криостата и прогрейте его до комнатной температуры. Вытащите блок с тканями из патрона и положите его обратно в форму.
   12. Завернуть в фольгу, чтобы блок ткани не выпадал из формы, и верните в морозильник при температуре -80 °C.
   13. Разместите срезы тканей при -20 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: (Точка паузы) Срезы тканей можно безопасно хранить при -20 °C бесконечно.

3. Иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Достаньте криосекции и дайте им высохнуть 10 минут при 37 °C в инкубаторе.
2. Промыйте стекла, чтобы удалить избыточную тканевую среду.
   1. Приготовьте 1 л из 1× PBS с 0,1% v/v Triton X-100 (PBS-T)
   2. Наполните 3 банки для окрашивания PBS-T.
   3. Положите слайды в стойку для затворов. Погрузите слайды в банку для окрашивания на 10 минут. Повторите в общей сложности 3 раза.
3. Заблокируйте ткань для окрашивания.
   1. Аккуратно постучите по каждому слайду тонкую салфетку, чтобы высушиться. Положите слайды вниз, подвешенные в коробке для затвора, с помощью салфетки вверх.
   2. Приготовьте блокирующий раствор объемом 20 мл, включающий 1× PBS, 0,3% v/v Triton X-100 и 5% w/v сывороточного альбумина (BSA).
   3. Пипетка — 1 мл блокирующего раствора на каждое стекло, чтобы ткани полностью покрыты.
   4. Инкубировать при комнатной температуре 1 час.
4. Инкубировать ткани с первичным антителом.
   1. Аккуратно постучите по каждому слайду тонкую салфетку, чтобы высушиться. Используйте ещё одну аккуратную салфетку, чтобы аккуратно убрать оставшуюся жидкость между участками тканей.
   2. Приготовьте разбавление антитела Tom20 к кроличьим α мыши в блокирующем растворе (200 мкл на слайд)
   3. Внизу коробки с слайдами положите бумажные полотенца и полностью смочите их водой.
   4. Положите слайды, подвешенные в коробке для затвора, с помощью салфетки вверх. Пипетка — 200 мкл разбавленных первичных антител на каждое стекло, обеспечивая полное покрытие тканей.
   5. Вырежьте кусочки керофиновой пленки примерно размером с обложные шлейфы для использования. Вырежьте по одному кусочку керофиновой плёнки для каждого слайда.
   6. Поместите каждый кусок парафиновой пленки на каждое стекло, чтобы распределить разбавление антител по срезам ткани. Закройте коробку для затвора и инкубуйте при 4 °C ночью.
5. После инкубации промывайте препараты первичным антителом.
   1. Наполните 3 банки для окрашивания PBS-T. Достаньте слайды и удалите кусочки керофиновой плёнки.
   2. Положите слайды в стойку для затворов. Погрузите слайды в банку для окрашивания на 10 минут. Повторите в общей сложности 3 раза.
6. Инкубировать препараты во вторичном антителе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подтвердить специфическую маркировку митохондрий, подготовьте как минимум один слайд из каждой группы, окрашенный только вторичным антителом.
   1. Аккуратно постучите по каждому слайду тонкую салфетку, чтобы высушиться. Используйте ещё одну аккуратную салфетку, чтобы аккуратно убрать оставшуюся жидкость между участками тканей.
   2. Приготовьте разбавление антитела Alexa Fluor 568 α козьего кролика и 5 мкг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в блокирующем растворе (200 мкл на слайд).
   3. Положите слайды, подвешенные в коробке для затвора, с помощью салфетки вверх. Пипетта — 200 мкл разбавленных вторичных антител на каждое стекло, обеспечивая полное покрытие тканей.
   4. Вырежьте кусочки керофиновой пленки примерно размером с обложные шлейфы для использования. Вырежьте по одному кусочку керофиновой плёнки для каждого слайда.
   5. Положите кусок парапленки на каждое стекло, чтобы распределить разбавление антител по срезам ткани. Закройте коробку для затвора и инкубуйте при комнатной температуре 4 часа или при 4 °C ночью.
7. Постирайте покрывалки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пластиковые щипцы, чтобы поднимать и обращаться с накладками
   1. Помещайте накладки по одному в стакан с горячей водопроводной водой и моющим средством для стеклянной посуды, например, Contrad 70. Закройте кусочком парафиновой плёнки.
   2. Соник 30 минут в ванной-соникаторе.
   3. Прополосните несколько раз в горячей воде из-под крана. Затем промывайте ещё несколько раз в двойной дистиллированной воде. Соник в течение 15 минут в финальном двойном промывке с дистиллированной водой.
   4. Поместите укрытия в 70% этанола и храните в запасе. Когда будете готовы к установке накладок, снимите их из 70% этанола и дайте высохнуть на воздухе в вытяжной вытяжке.
8. После инкубации промывайте препараты вторичным антителом.
   1. Наполните 3 банки для окрашивания PBS-T. Достаньте слайды и удалите кусочки керофиновой плёнки.
   2. Положите слайды в стойку для затворов. Погрузите слайды в банку для окрашивания на 10 минут. Повторите в общей сложности 3 раза.
   3. Аккуратно постучите по каждому слайду тонкую салфетку, чтобы высушиться. Используйте ещё одну аккуратную салфетку, чтобы аккуратно убрать оставшуюся жидкость между участками тканей.
9. Закрепите прикрытия.
   1. Добавьте 2–3 равномерно распределённых капли антифейд-маунтанта на затвор.
   2. Чтобы избежать пузырьков воздуха, возьмите очищенный накладной слой #1.5 и держите его под углом 45° к затвору вдоль длинной оси. Аккуратно и медленно наклоните чехол на горку. Повторяйте для всех слайдов.
   3. Дайте слайдам застыть 18–60 часов при комнатной температуре, при этом защищённые от света.
   4. Храните горки при 4 °C, защищённых от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (Точка паузы) Слайды можно снимать либо сразу после периода затвердевания, либо до 1 месяца при хранении при 4 °C. Нет необходимости герметизировать края. Обязательно используйте накладные отсечки #1.5 или #1.5H, так как другие толщины могут привести к сферическим аберрациям и снижению качества изображения. Не используйте монтажные среды с DAPI, так как DAPI обладает широкими спектрами возбуждения и излучения. Время отверждения зависит от толщины образца; Вот, 48 часов.

4. Сверхразрешённая визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует ZEISS Airyscan2 с точечным сканированием LSM 980, построенный вокруг ZEISS Axio Observer Z1 и оснащённый двумя многощелочными фотоумножительными трубками (PMT) и спектральным детектором GaASP 32 канала, экологическим корпусом и объективом Plan Apo 63×/1.4 с дифференциальным интерференционным контрастом масла (DIC) III.

1. Организуйте приобретение.
   1. Добавьте одну дорожку Airyscan SR и выберите соответствующий флуорофор.
   2. Выберите 10-дюймовую пластину и соответствующие пропускные фильтры для эмиссии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 10-дюймовая пластина специфична для этого микроскопа, так как она оснащена инфракрасными (ИК) детекторами.
   3. Выберите подходящий лазер(ы). Установите критерии дискретизации Найквиста на 2 , нажав SR (размер пикселя следует отрегулировать до 0,05 мкм).
   4. Нажмите «живой » и выровняйте детектор Airyscan (выберите функцию живого выравнивания). Нажмите стоп , когда интенсивность локализована в центре значка детектора и когда детектор станет зелёным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если всё настроено правильно, слева в программе должно появиться сообщение «Настройки Airyscan успешно оптимизированы».
   5. Снова включите в эфир и отрегулируйте интенсивность лазера так, чтобы сигнал был приличным, но не было насыщенных пикселей (нажмите на индикатор дальности). Нажмите стоп после оптимизации.
      1. (По желанию) Чтобы увеличить сигнал без регулировки мощности лазера, увеличьте усиление.
2. Выполняйте сбор данных.
   1. Нажмите z-стек и убедитесь, что размер шага установлен на 0,1 мкм (если нет, отрегулировать).
   2. Нажмите в реальном времени и установите нижнюю и верхнюю границы z-стека.
   3. Нажми начать эксперимент.
   4. После того как z-стек будет собран, перейдите на вкладку Airyscan под изображением и нажмите « Процесс 3D». Сохраняйте параметры фильтра Вайнера для снятия шума в разных репликах и группах обработки.
   5. Сохраните обработанный Z-стек Airyscan.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если используются две дорожки Airyscan SR, обязательно используйте переключатель микроскопа каждый кадр.

5. Создание автоматизированного конвейера для количественной оценки морфологии митохондрий

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает разработку автоматизированного конвейера анализа изображений для 3D-количественной оценки морфологии митохондрий с использованием ZEISS arivis Pro Software 4.1.2.

1. Конвертируйте .czi-файлы, обработанные Airyscan, в формат .sis с помощью инструмента преобразования arivis.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если полное изображение большое, а время обработки слишком долго во время оптимизации параметров, обрежьте небольшую, репрезентативную подобласть изображения для использования в качестве рабочей опоры для оптимизации настроек. Это обрезанное изображение должно включать как хорошо изолированные митохондрии, так и области с более высокой плотностью, чтобы точно отражать полное поле изображения. После достижения удовлетворительной сегментации обрезанного изображения оптимизированный конвейер можно применить к полному набору изображений. Такой подход значительно сэкономит время и облегчит корректировку всех параметров без ущерба для качества конвейера.
2. Настройте и оптимизируйте конвейер.
   1. Откройте репрезентативный образ (например, из контрольной группы) в программном обеспечении.
   2. Выберите иммунофлуоресцентный канал Tom20 в качестве входа для анализа.
   3. Перед сегментацией применяйте шаг снятия шума. Здесь использовался алгоритм усиления частиц с диаметром 5,42 и силой 0,5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр усиления частиц — это алгоритм дешума, сохраняющий структуру, предназначенный для усиления компактных, грубо сферических или вытянутых объектов при одновременном подавлении фонового шума. Он работает за счёт усиления локальной интенсивности на заданном пространственном масштабе (диаметре), что делает его особенно подходящим для митохондрий, которые проявляются как яркие, изолированные частицы или трубочки на тёмном фоне. Если значение параметра диаметра установлено слишком маленьким, шум усилён, а слишком большое значение — сблизит соседние объекты. Параметр силы определяет степень усиления, при которой высокие значения увеличивают усиление сигнала, но при слишком высокой установке могут появиться артефакты. Начните с стандартных значений и корректируйте при визуальном осмотре результата в представляющей области интереса. В arivis Pro доступно несколько методов удаления шума. Гауссовское сглаживание — это простой и быстрый вариант, который равномерно снижает высокочастотный шум, но может размывать мелкие конструктивные детали. Медианная фильтрация лучше сохраняет острые края и убирает шум «соль и перец». Усиление частиц (используется здесь) предпочтительнее, когда цель — обнаружить дискретные флуоресцентные объекты, так как оно избирательно усиливает сигнал от структур, соответствующих заданному размерному диапазону. Для изображений с низким соотношением сигнал/шум или значительной гетерогенностью фона может потребоваться более сильный проход дешума. Рекомендуется протестировать два или три метода на одном и том же репрезентативном изображении и сравнить качество сегментации на последующих этапах.
   4. Сегментируйте отдельные митохондрии с помощью алгоритма Blob Finder, который обнаруживает объекты в 3D-пространстве.
   5. Регулировать параметры сегментации, включая размер объекта и порог чувствительности, а также визуально проверить перекрытие между обнаруженными объектами и безшумным изображением для обеспечения точной сегментации. Здесь использовались следующие параметры: диаметр 0,244 мкм, порог вероятности 25% и чувствительность к разделению 22,22%, нормализация установлена на первую начальную точку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры сегментации зависят от разрешения изображения и размера вокселя. В этом исследовании размеры изображения составляли 1354 × 1354 пикселя с размером XY пикселя 0,049 мкм и размером вокселей 0,049 × 0,049 × 0,100^{мкм 3}.
3. Проведите выделение признаков и контроль качества.
   1. Извлеките морфологические параметры для каждого обнаруженного объекта, включая объём (мкм³), площадь поверхности (мкм²) и сферичность (площадь поверхности сферы с тем же объёмом/площадью поверхности, что и митохондрии).
   2. Экспортируйте сегментированные объекты в TIFF-файлы для визуальной проверки.
   3. Откройте экспортированные файлы в FIJI или arivis и наложите их на оригинальное изображение для визуального контроля точности сегментации.
   4. Экспортировать количественные измерения в виде отдельных таблиц для каждого образца.
4. Примените конвейер.
   1. Сохраните оптимизированный конвейер. Пример конвейера можно найти в дополнительном файле 1.
   2. Примените конвейер к дополнительным изображениям всех экспериментальных групп из исследования.
   3. Итеративно уточняйте параметры сегментации, если это необходимо, чтобы обеспечить единообразную производительность во всех экспериментальных группах.
   4. После завершения работы примените конвейер в пакетном режиме ко всем изображениям в исследовании.
5. Проведение анализа данных
   1. Импортировать экспортированные данные в RStudio (версия 4.3.2) для статистического анализа.
   2. Если не установлен, установите пакеты: readxl, dplyr, tidyr, purrr, ggplot2, ggpubr, patchwork, scales, randomForest, caret, umap, factoextra, RColorBrewer, mclust, outliers и tidyverse.
   3. Загрузите скрипт (Дополнительный файл 2) для объединения всех наборов данных, фильтрации данных (см. ниже), графика объёма, площади поверхности и сферичности, а также анализа сегментированных митохондрий для пропорций по подтипам выборки.
   4. (По желанию) Отфильтруйте сегментированные митохондрии по объёму, чтобы исключить артефакты сегментации и шум.
      1. Для определения подходящих фильтров визуально проверьте распределение объёмов.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы показали выраженный скачок при очень малых объёмах (ниже 0,0003^{мкм 3}), что соответствует сегментационному шуму, а не реальных митохондриям.
      2. Для определения нижней границы оцените удержание частиц через кандидатные пороги (0,0009, 0,003, 0,005, 0,007 и 0,01 мкм³). Самое резкое снижение количества частиц произошло ниже 0,003^{мкм 3}, что указывает на то, что большинство шумовых частиц находятся в этом диапазоне. Визуальный осмотр подтвердил, что 0,003^{мкм 3} соответствует правому краю пика шума.
      3. Для верхней границы распределения естественным образом сужались значительно ниже 10 мкм³; Установите этот предел, исключая крупные артефактные объекты, такие как чрезмерно сегментированные митохондриальные сети. Окончательная фильтрация удерживала частицы с объёмом от 0,003 до 10 мкм³.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот скрипт вычисляет медианные значения на выборку по всем обнаруженным митохондриям и использует их как единицу анализа. Этот подход учитывает ненезависимость отдельных митохондрий в одном биологическом образце.

Результаты

Описанный выше протокол был проведён (рисунок 1) на 20-месячных самцах мышей с UM-HET3. Мышам вводили либо в транспортное средство (Control), либо в химическом коктейле перепрограммирования (Treated) с использованием осмотических мининасосов модели 2004^{года 53}. Затем печени были разрезаны и снимены на конфокальном микроскопе Airyscan2 перед обработкой z-стеков с помощью анализирующего конвейера.

3D-флуоресцентные изображения были обработаны и проанализированы с помощью ZEISS arivis Pro Software 4.1.2. До сегментации митохондрий применялся алгоритм усиления частиц для устранения шума изображений и удаления фона, нефокусированного света, автофлуоресценции и/или флуоресценции, возникающих из-за неспецифического связывания. Усиление частиц избирательно усиливает сигнал от заданного диаметра. После снятия шума отдельные митохондрии были сегментированы в 3D с помощью алгоритма Blob Finder, который обнаруживает объекты на основе локальных максимумов интенсивности в определённом размерном диапазоне. Наконец, сегментация объектов сводит каждый 2D-срез к бинарному образу.

Для иллюстрации процесса сегментации на рисунке 2 представлены репрезентативные оптические срезы на каждом этапе конвейера обработки для контрольных и обработанных образцов. Исходное флуоресцентное изображение показывает необработанный сигнал Tom20, который содержит смесь специфической митохондриальной флуоресценции и нежелательного фона, расфокусированного света и автофлуоресценции. После применения эффекта усиления частиц фоновой сигнал значительно уменьшался, а оставшаяся флуоресценция ограничивалась дискретными, чётко очерченными структурами (см. рисунок 2). Это приводит к более чистому представлению границ митохондрий, что облегчает точную сегментацию.

Выход сегментации Blob Finder показан зелёным цветом. Для подтверждения точного сегментирования z-стеков были наложены шумовозные двумерные срезы с соответствующими сегментированными бинарными изображениями (рисунок 2). Если процесс сегментации достаточно оптимизирован, следует наблюдать сильную и последовательную колокализацию митохондриальной флуоресценции с бинарными объектами. Если процесс сегментации связан с чрезмерной сегментацией (то есть разделением отдельных митохондрий на несколько объектов) или недостаточно сегментированным (то есть объединением нескольких митохондрий в одну), корректируйте параметры сегментации. Визуальный осмотр вставок подтверждает высокое качество сегментации: обнаруженные объекты точно солокализуются с шумомяным флуоресцентным сигналом Tom20, без признаков пересегментации, увеличения размера объектов, неправильного слияния пространственно соседних митохондрий в отдельные объекты или образования ложных объектов в областях без сигнала Tom20. Такой уровень точности сегментации был стабильно достигнут как в контрольных, так и в обработанных образцах, демонстрируя, что параметры конвейера, оптимизированные в программном обеспечении ZEISS arivis, надёжны и обобщаемы для всех экспериментальных групп. Вместе эти результаты подтверждают подход сегментации и подтверждают надёжность морфологических измерений, полученных из него.

Сегментированные объекты можно измерять по параметрам митохондрий, таких как объём, сферичность и площадь поверхности (рисунок 3). Чтобы учесть большое количество митохондрий, обнаруженных на биологический образец, и ненезависимость отдельных органелл внутри клетки, медианные значения на образец были рассчитаны и использованы в качестве единицы статистического сравнения. Различия в группах оценивались с помощью теста Уилкоксона. Обработанные образцы демонстрировали значительно больший объём митохондрий и площадь поверхности по сравнению с контрольными моделями, что указывает на значительное перепрограммирование морфологии митохондрий.

Наконец, сегментированные митохондрии можно классифицировать на различные^{подтипы 54,55} (рисунок 4). Метод^{локтя 56} был использован для определения оптимального количества кластеров для кластеризации k-средних ^57,58 (рисунок 4A). Затем, используя кластеры k = 4, случайные подвыборки митохондрий для контрольных и обработанных групп были нанесены с помощью равномерного приближения многообразия и уменьшения размерности (UMAP) (рисунок 4B), окрашенного как митохондриальными подтипами (слева), так и группой обработки (справа). Наконец, были нанесены пропорции каждого подтипа митохондрий (рисунок 4C) для контрольной и обработанной групп. В группе лечения было меньше фрагментированных митохондрий, но существенных изменений в доле сетевых или вытянутых митохондрий не было.

Рисунок 1: Обзор протокола. Мышей лечат с помощью лекарств или транспортных средств до 6 недель с помощью подкожной осмотической имплантации минипомпы (1). После лечения ткани мыши фиксируются, инфильтрируются сахарозой, встраиваются в ОКТ-соединение и криосечение (2). Срезы ткани затем окрашивают антителами против Tom20 и вторичными антителами, маркированными Alexa Fluor 568 (3). Супер-разрешённые z-стеки собираются на конфокальном микроскопе Airyscan2 (4), а обработанные z-стеки с шумом сегментируются в arivis для количественной оценки морфологии митохондрий (5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Автоматизированный конвейер для сегментации митохондрий и анализа морфологии.
Репрезентативные одиночные оптические срезы из контрольных (верхние панели) и обработанных (нижние панели) образцов. Иммунофлуоресцентный сигнал Tom20 показан серым (слева). То же изображение после снятия шума отображается серым цветом, за которым следует сегментационный выход, выделяющий обнаруженные митохондриальные объекты зелёным цветом. Объединённое изображение показывает перекрытие между безшумным сигналом и сегментированными объектами. Вставки показывают изображение с увеличением указанных областей, что иллюстрирует эффекты шумозаиздания и точность сегментации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Морфология митохондрий в контрольной и обработанной группах. Коробочные диаграммы показывают медианный ± межквартильный диапазон медианных значений на выборку (n = 10 на группу). Каждая точка представляет один биологический образец, суммируемый как медиана по всем митохондриям, обнаруженным в этом образце. Объём и площадь поверхности отображаются в шкале log₁₀ . Группы сравнивались с помощью тестов на сумму ранга Уилкоксона. Уровни значимости: ns p ≥ 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Неконтролируемая морфометрическая классификация подтипов митохондрий. (A) Диаграмма Локтя, показывающая общую сумму квадратов внутри кластера (WSS) в зависимости от количества кластеров (k), рассчитанная на случайной подвыборке из 10 000 митохондрий. Точка перегина в k = 4 была выбрана как оптимальное количество кластеров для дальнейшего анализа. (B) (Слева) редукция размерности UMAP морфометрических признаков митохондрий (n = 20 000 случайно отобранных митохондрий), окрашенные по назначенному подтипу. Были выделены четыре морфологически различных подтипа: фрагментированные (маленькие, с высокой сферичностью), вытянутые (длинные, с низкой сферичностью), сетчатые (крупные, неправильные) и промежуточные (промежуточные. (Справа) UMAP проекция, окрашенная по экспериментальной группе (Control vs. Treated), показывающая распределение каждой группы по морфологическому пространству. (C) Пропорции на выборку каждого подтипа митохондрий в каждой экспериментальной группе. Каждая точка данных представляет один биологический образец (n = 10 на группу). Коробочные диаграммы показывают межквартильный диапазон и медиану, при этом усы расширяются до 1,5 раза больше межквартильного диапазона. Пропорции подтипов сравнивались между группами с помощью теста ранговой суммы Уилкоксона, а p-значения скорректировались для множественных сравнений с помощью метода Бенджамини-Хохберга. ns p ≥ 0.05, ****p < 0.0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1: Пример пайплайна arivis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: скрипт R для количественной оценки морфологии митохондрий и популяций подтипов.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Два самых важных шага для успешного выполнения этого протокола — (i) закрытие разреза при имплантации осмотического насоса и (ii) точная сегментация. Для первого случая особое внимание уделяйте созданию подкожного кармана, который будет достаточно большим для насоса, но не слишком большим, чтобы насос мог сползать по боку животного. Когда разрез закрыт, насос следует размещать достаточно далеко, чтобы не создавать напряжения на окружающей коже, что может привести к рассеянию. Обязательно потяните за кожу вокруг закрытого разреза во всех направлениях, чтобы убедиться, что рана достаточно закрыта, прежде чем начинать восстановление животного. Зажимы для ран полезны, так как их быстро накладывают и снимают. Однако, если возникают проблемы из-за невозможности правильно закрыть разрезы, могут использоваться прерванные швы. Для последнего точная сегментация требует постоянного сравнения результатов сегментации с изображениями без шума, пока не появится достаточное сходство изображения. Z-стеки от контрольных и обработанных животных должны собираться с использованием одних и тех же параметров и желательно во время одной и той же сессии визуализации. Аналогично, все этапы обработки должны применяться ко всем изображениям с абсолютно одними и теми же параметрами. Параметр сегментации диаметра определяет ожидаемый размер объектов, подлежащих обнаружению. Хорошей отправной точкой является измеренная средняя ширина митохондрий от нескольких вручную осмотренных объектов с помощью одного оптического среза. Порог вероятности определяет минимальную доверительность обнаружения, необходимую для принятия объекта. Более низкие значения повышают чувствительность и обнаруживают больше объектов, но некоторые из этих объектов могут быть ложными. Наоборот, более высокие значения улучшают специфичность, но могут привести к потере объектов с низким сигналом. Рекомендуемый стартовый диапазон составляет 25–30%. Наконец, разделённая чувствительность определяет, насколько агрессивно касающиеся или перекрывающиеся объекты разделены на отдельные объекты. Низкая чувствительность к расщеплению приводит к тому, что митохондрии становятся сгруппированными объектами. С другой стороны, высокая чувствительность к расщеплению может привести к чрезмерному расщеплению удлинённых или разветвленных митохондрий на фрагменты. Значения от 15% до 30% подходят для типичных морфологических исследований митохондрий. Если точная сегментация всё ещё окажется сложной, сегментацию можно выполнить с помощью анализатора митохондрий⁵⁹ в^{FIJI 60}. Недавно был описан полуавтоматический конвейер для количественной оценки морфологий митохондрий как в клетках, так и в тканях с использованием программного обеспечения Huygens Professional и кастомного скрипта на Python⁶¹.

Одним из ограничений является предел разрешения конфокального микроскопа Airyscan2, который составляет ~150 нм в XY и ~350 нм в Z-плоскости. Это предотвращает высокоразрешающую визуализацию митохондриальных кристей, поскольку расстояния между отдельными кристами составляют ~40–120^нм 62,63,64. В отличие от этого, истощение стимулированного излучения (STED) может достигать пределов разрешения в ~20–50 нм по горизонту и чётко различать отдельные митохондриальные^кристы 62,63,64. Недавно были разработаны несколько красителей STED, которые позволяют эффективно окрашивать и визуализировать внутреннюю мембрану митохондрий как в живых, так и у фиксированных^клеток 63,64,65. Учитывая, что анализ морфологий кристов может дать представление о биоэнергетическом состоянии^{митохондрий 10}, такие данные поэтому желательны. Однако морфология митохондрий сильно различается между тканями млекопитающих и клеточной культурой (подробно обсуждается ниже), и в настоящее время нет методологии окрашивания внутренней мембраны тканей для визуализации с помощью ЗППП и анализа структур кристаллов.

Количественная оценка морфологии митохондрий в целостных тканях представляет собой уникальные задачи по сравнению с системами культивирования клеток. В культивируемых клетках митохондрии обычно распределены по цитоплазме в хорошо разделённых сетях с минимальным перекрытием между клетками. Однако в тканевых срезах или целых препаратах клетки плотно упакованы, и их границы не чётко очерчены. Если требуется анализ на уровне клеток, следует включить дополнительную флуоресцентную метку, направленную на плазматическую мембрану, или маркер, специфичный для типа клеток, а также соответствующий этап сегментации в конвейере анализа изображений для определения границ отдельных клеток перед количественной оценкой морфологии митохондрий. Второе важное отличие заключается в том, что в культивируемых клетках митохондрии часто образуют непрерывные, взаимосвязанные сетки ретикулярных сетей, которые легко визуализировать и интерпретировать. В тканях этот паттерн наблюдается редко. Например, митохондрии из срезов печени демонстрируют пунктатный, палочный и пучоковый узор, занимающий весь^{цитозоль 66}. Однако гепатоциты в культуре демонстрируют трубчатые морфологии с чёткими сетями⁶⁶. Аналогично, при сравнении митохондрий из гладких тканей с митохондрий из гладкомышечных клеток в культуре наблюдаются явные различия в их морфологии и сетевых^{паттернах 67}. Трёхмерная архитектура, в сочетании с специфическими к типу клеток различиями в распределении митохондрий, приводит к тому, что митохондрии в этих тканях выглядят как дискретные, плотно упакованные пункты или короткие фрагменты, а не вытянутые сети. Поэтому при сравнении морфологических признаков тканей и культуры клеток необходима осторожная интерпретация, поскольку различия между ними могут быть частично обусловлены контекстом визуализации, а не истинной биологической вариативностью.

Одним из ярких моментов этого протокола является возможность количественно измерять структуры митохондрий в тканях с помощью световой микроскопии. Хотя существуют и другие методы количественной оценки морфологии митохондрий на основе сверхразрешённых световых микроскопических изображений, многие из них подходят только для клеток в культуре. Кроме того, в отличие от других методов анализа, представленный здесь конвейер полностью автоматизирован, количественно определяет как митохондриальные размеры, так и пропорции подтипов, и требует небольшого опыта кодирования для успешной работы. Сканирующая/трансмиссионная электронная микроскопия (SEM/TEM) и крио-ЭТ ранее использовались для изображения митохондриальных структур тканей в 2D и^3D 10,68,69. Однако для первых вызывают опасения по поводу сохранения естественных структур после фиксации образцов, обезвоживания и вложения^70,71. Кроме того, ручное измерение параметров митохондрий в FIJI⁶⁰ иногда является предпочтительным методом анализа изображений TEM⁷², что требует значительной работы и может привести к смещению выборки. Однако методы глубокого обучения для автоматизированной количественной оценки морфологий митохондрий по изображениям TEM были недавно^{описаны 73,74}. Преимущество представленного подхода заключается в том, что после создания аналитического конвейера он может пакетно обрабатывать изображения практически без участия пользователя. Для последних высоконапорное замораживание может сохранять тканевые структуры в близких к натуральных^{условиях 75}. Однако замораживание образцов крио-ЭТ, разрез, фрезерование, сбор и обработка образцов с крио-ЭТ требуют обширного обучения и высокопродвинутого оборудования. В отличие от этого, конфокальная микроскопия с сверхразрешением относительно доступна и требует меньше обучения и ресурсов для успешного выполнения.

Имплантация осмотических помп можно безопасно выполнять у пожилых мышей для оценки влияния различных фармакологических соединений на снижение физиологической функции, связанное со старением. Кроме того, описанные здесь методы обобщаются на многие различные органы. Хорошо известно, что снижение метаболической функции, связанное со старением, способствует развитию заболеваний и возникает из-за дисфункции митохондрий — одной из разговорных признаков^{возраста 76} лет. Кроме того, считается, что митохондриальные структуры определяют биоэнергетическую способность митохондрий и метаболический^{статус 77,78}. Таким образом, количественная оценка соединений на предмет их влияния на структуру митохондрий во время старения мышей с использованием описанных здесь методов может помочь в выявлении терапевтических средств, способных продлить продолжительность здоровья человека.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Конфокальный микроскоп с точечным сканированием Airyscan2	ZEISS	LSM 980 с Airyscan2	Конфокальный микроскоп ZEISS с точечным сканированием LSM 980, созданный на основе ZEISS Axio Observer Z1 и оснащенный двумя многощелочными ПФТ и спектрального детектора GaASP с 32 каналами, средой для окружающей среды и объективом Plan Apo 63×/1.4 Oil DIC III. Микроскоп, используемый в этом исследовании, также оснащен двумя внешними НИК-детекторами, а также следующими лазерными линиями: 405, 458, 488, 514, 561, 594, 639 и 730 нм.
Алюминиевая фольга	Essendant	BWK7112
Аналитическая весовая коробка	Mettler Toledo	MR204
Стекло противооткосное	Gel Company	LGI70
Программное обеспечение Arivis Pro	ZEISS	Версия 4.1.2
Ультразвуковой аппарат	Branson Ultrasonics	71020-MT
Белок сыворотки говяжьей крови	Research Products International	A30075
Центрифужные пробирки, 15 мл	CELLTREAT	229411
Заряженные микроскопические предметные стёкла	Globe Scientific	1358W
Клип-сняток	Alzet	0009976
CO2	Airgas	CD 50
Contrad 70	Decon Labs	1003
Ватные палочки	Puritan Medical	25-8061WC
Криостат	Leica Biosystems	CM3050 S
Лезвия криостата	Sakura Finetek USA Inc	4689
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Приготовьте до 5 мг/мл в ddH2O, разделите на порции и храните при -20 °C защищенным от света
Диметиловый сульфоксид	Sigma-Aldrich	D2650
Система окрашивания слайдов EasyDip	Electron Microscopy Services	71388-01
Электро-гель	Bio-Serv	EGS-1
Формы для встраивания, 22 мм × 22 мм × 20 мм	Polysciences	18646A-1
Этанол, 200 доказательств	Decon Labs	V1001
Фенестрированные стерильные простыни	Dukal	20001
Тонкие щипцы	Fine Science Tools	11445-12
Стерилизатор стеклянных шаров	VWR	75999-324
Коза анти-кролику Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11036
Огревательная подушка	CVS	215313
Гемостатические щипцы	World Precision Instruments	501705
Иммерсионное масло Immersol 518 F	ZEISS	433802-9010-000
Индукционная камера	World Precision Instruments	EZ178
Инсулиновые шприцы, 0,3 мл	BD	328431
Ирисовые хирургические ножницы	Sklar Surgical Instruments	47-1135
Изофлуран	Patterson Veterinary	07-890-8115
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
Шприцы Luer-Lok 1 мл	BD	309628
Шприцы Luer-Lok 3 мл	BD	309657
Шприцы Luer-Lok 50 мл	BD	309653
Meloxivet (мелоксикам)	Patterson Veterinary	07-894-8524
Микроцентрифужные пробирки, 1,5 мл	CELLTREAT	229443
Коробка для микроскопических предметных стёкол	Heathrow Scientific	15994E
Стекло для крышки слайда микроскопа, #1.5, 22 мм × 50 мм	Electron Microscopy Services	72204-04
Инкубатор без CO2	Benchmark Scientific	H2200-H
Не перфорированные стерильные простыни	Dukal	20-002
OCT Compound	Sakura Finetek USA Inc	4583
Офтальмическая мазь	Patterson Veterinary	07-888-2572
Осмотическая мини-помпа	Alzet	2004
Парафильм	Bemis	PM999
Параформальдегид, 4% м/о	Santa-Cruz Biotechnology	sc-281692
PBS, 1×	Thermo Scientific	10010023
PEG300	Sigma-Aldrich	90878
ПЭС-шприцы с фильтром, 0,22 мкм	CELLTREAT	229747
Повидон-йод 10% USP свабы	Medline	MDS093901ZZ
ProLong Glass Antifade	Invitrogen	P36980
Кролику анти-Tom20 антитело	Novus Biologicals	NBP2-67501
Лезвия бритвы, 0,22 мм	VWR	55411-050
Ротатор/ротиссери	Labnet	H5500