Роль Sanqi Baiji San в смягчении повреждения эпителиальных клеток желудка, вызванного этанолом, с помощью сигнализации, связанной с PI3K/AKT

Краткое содержание

В данном исследовании описывается модель in vitro. для оценки защитного эффекта Sanqi Baiji San против повреждения эпителиальных клеток желудка, вызванного этанолом, и его участия в сигнализации, связанной с PI3K/AKT.

Аннотация

Целью этой работы было прояснить защитный механизм Sanqi Baiji San (SQBJ) против этанол-индуцированного эпителиального повреждения желудочной клетки и изучить его потенциальную значимость для язвы желудка (GU). Сетевая фармакология использовалась для скрининга активных компонентов SQBJ (База данных и анализа традиционных китайских медицинских систем фармакологии [TCMSP], пероральной биодоступности [OB] ≥ 20%, Drug-likeness [DL] ≥ 0.1), картирования их целей (Universal Protein Resource [UniProt]), сбора мишеней, связанных с GU (GeneCards/OMIM/DrugBank), а также анализа перекрывающихся мишень с помощью обогащения и молекулярного докирования Gene Ontology (GO)/Kyoto Encyclopedia of Ges and Genomes (KEGG). Клетки желудочной эпителиальной линии-1 (GES-1), повреждённые этанолом, были обработаны SQBJ или ингибитором PI3K LY294002. CCK-8 использовался для определения оптимальной концентрации SQBJ. Анализ сетевой фармакологии выявил 126 общих мишеней, обогащённых в каскадах, связанных с PI3K/AKT/MAPK, и предложил возможные взаимодействия между основными компонентами SQBJ и белками, связанными с PI3K/AKT. В клетках с проблемами этанола SQBJ облегчал повреждение клеток за счёт снижения высвобождения воспалительных медиаторов и окислительного стресса, что подтверждается снижением внутриклеточных реактивных форм кислорода и уровня малондиалдегида. SQBJ восстановил мембранный потенциал митохондрий и содержание АТФ, а также снизил связанные с апоптозом изменения уровня B-клеточной лимфомы-2, расщепленной каспазы-3 и Bcl-2-ассоциированного X белка. SQBJ также модулировал сигнальные маркеры, связанные с PI3K/AKT- и MAPK. Эти защитные эффекты были в значительной степени ослаблены LY294002, что свидетельствует о участии сигналов, связанных с PI3K/AKT, в цитопротекции, опосредованной SQBJ. Эти результаты предоставляют in vitro механистическую основу для потенциального применения SQBJ в GU, хотя требуется дальнейшая проверка язвы желудка, вызванной этанолом, на животных моделях.

Введение

Язва желудка (ГУ) — это широко распространённое заболевание желудочно-кишечного тракта во всём мире, характеризующееся локализованным воспалением, эрозией и язвенностью слизистой желудка. Согласно оценкам, полученным в результате анализа Global Burden of Disease (GBD 2021) 2021 года, болезнь язвы кишечника (PUD) продолжает оказывать значительную клиническую и экономическую нагрузку на миллионы пациентов по всему миру. Хотя общая распространённость ПД снизилась из-за широкой и обширной клинической зависимости от противоинфекционных схем и ингибиторов протонных помп (ИПП), эта нисходящая тенденция достигла плато, и в некоторых регионах наблюдается даже^{восстановление.} В частности, потребление алкоголя (этанола) является критически важным патогенным фактором, независимым от инфекции Helicobacter pylori (H. pylori) и использования нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВС). Длительное чрезмерное употребление алкоголя повреждает слизистое барьер желудка, ускоряет развитие язвы и даже повышает восприимчивость к желудочным злокачественным заболеваниям — что превращает это состояние в критическую международную медицинскую^{кризис 2.} В развивающихся странах частота повреждений слизисты желудка, связанной с алкоголем, увеличивается из-за множества факторов, включая увеличение потребления алкоголя и изменения образа жизни, что создаёт острую необходимость в эффективных и безопасных стратегиях профилактики и лечения.

Патологический механизм, лежащий в основе повреждения слизистой желудка, вызванного этанолом, является многофакторным и многослойным. При прямом контакте с слизистой желудка этанол быстро нарушает слизисто-бикарбонатный барьер и вызывает неконтролируемый всплеск внутриклеточных реактивных кислородных форм (ROS). Этот окислительный всплеск впоследствии вызывает перекисление липидов (характеризуется повышенным уровнем малондиальдегида, MDA), истощает эндогенные антиоксиданты в слизистой желудке, включая супероксиддисмутазу (SOD), а также глутатиону (GSH), и в конечном итоге вызывает дисфункцию митохондрий³. Накопленные данные указывают на то, что внутриклеточная ROS, вызванная этанолом, в основном происходит из митохондрий и тесно связана с коллапсом внутри митохондриального потенциала мембраны (Δψm) и ингибированием синтеза аденозинтрифосфата (^{АТФ) 4}. Тем временем окислительный стресс дополнительно активирует провоспалительные каскады под управлением ядерного фактора каппа B (NF-κB). Эта активация затем способствует массовому высвобождению воспалительных медиаторов, главным образом фактора некроза опухолей α (TNF-α), интерлейкина-6 (IL-6) и С-реактивного белка (CRP), образуя таким образом порочный круг «окислительного стресс-воспалительного ответа»⁵. На этой основе запускается внутренний апоптотический каскад, вызванный митохондриями, что подтверждается нарушенным соотношением Bcl-2 к Bax наряду с последовательным ферментативным протеолитическим расщеплением цистеиниласпартат-специфической протеиназы 3 (Caspaza-3), что в конечном итоге приводит к массовой гибели эпителиальных клеток желудка и образованию^{язвы 6}. Соответственно, одновременное воздействие трёх основных патологических связей — окислительного стресса, воспалительного ответа и апоптоза — является ключевой стратегией эффективного вмешательства при повреждении слизистые слизистые алкогольного желудка.

Сигнальный путь фосфоинозитида 3-киназы/протеинкиназы B (PI3K/AKT) представляет собой центральную регуляторную ось, регулирующую клеточную продолжительность, пролиферацию и запрограммированную смерть, выполняя жизненно важную функцию по сохранению гомеостаза слизистой желудка. После активации сигнальная передача PI3K/AKT фосфорилирует несколько субстратов ниже по потоку, ингибирует активность проапоптотического фактора Bad, тем самым затрудняя митохондриальный выход разрушающего клеток цитохрома c, поддерживая гомеостаз ΔΨm и способствуя выживанию клетки⁷. Кроме того, существует сложный антагонистический перекрёсток между каскадом PI3K/AKT и сетями протеинкиназ, активируемых митогеном (MAPK): повышенная активация PI3K/AKT может ослаблять воспалительные сигнальные трансдукции и апоптотические каскадные реакции, ингибируя активацию стресс-киназ, включая p38, c-Jun N-концовую киназу (JNK) и внеклеточно-регулируемые протеинкиназы (ERK)⁸. Многочисленные исследования показали, что снижение активности пути PI3K/AKT тесно связано с обострением воспаления и усилением апоптоза в моделях повреждений слизистой желудка, в то время как восстановление активности этого пути может значительно смягчить повреждения^{слизисты 9}. Однако в настоящее время отсутствует систематическая причинно-следственная экспериментальная проверка точного регуляторного механизма PI3K/AKT при этанол-индуцированном повреждении слизистой желудка, особенно в его синергетической связи с путём MAPK.

С точки зрения современной фармакотерапии ИПП являются первым вариантом клинического лечения ГУ, однако их длительное применение вызывает растущие опасения по вопросам безопасности. Накопленные исследования связывают хроническое использование ИПП с различными неблагоприятными последствиями, включая почечные заболевания, сердечно-сосудистые события, остеопоротические переломы, дефицит питательных веществ (железо, магний и витамин B12), Clostridioides difficile. инфекции и даже повышенный риск рака^{желудка 10}. Кроме того, явление рикошетной гиперсекреции желудочной кислоты после прекращения приёма ИПП было подтверждено крупномасштабными данными^{фармаконадзора 11}. Эти риски безопасности побудили как клинические, так и фундаментальные исследовательские сообщества активно изучать альтернативные терапии с многоцелевыми защитными механизмами, минимальными побочными эффектами и пригодностью для длительного использования. В частности, натуральные препараты из традиционной китайской медицины (ТКМ) привлекли широкое внимание благодаря своей целостной терапевтической концепции «многокомпонентного, многоцелевого и многопутного» действия¹².

Порошок Санци Байцзи (SQBJ) — это классическая формула соединения ТКМ, состоящая из нотогиншеня Panax и Bletilla striata с массовым соотношением 1:1. Нотогиншень Panax хорошо известен своим эффектом в улучшении кровообращения, остановке кровотечения, а также облегчением болезненного отёка. Его основные биоактивные компоненты, включая нотогинсенозид R1 вместе с гинсенозидами (Rg1, Rb1), оказывают значительное противовоспалительное, антиоксидантное и восстанавливающее слизистое воздействие. Bletilla striata характеризуется вяжущим эффектом, который останавливает кровотечение, уменьшает отёк и способствует регенерации повреждённых тканей. Одновременно Bletilla striata polysaccharide (BSP), выступающий в качестве основного активного экстракта, задокументировал эффективность в подавлении каскада JNK/p38 MAPK, тем самым снижая экспрессию интерлейкина-1β (IL-1β), TNF-α и IL-6, а также повышая антиоксидантную защитную способность слизистой^{желудочной слизистой 13}. Накопленные литературные данные подтвердили, что совместное введение сапонинов Panax notoginseng. (PNS) и BSP оказывает синергетический эффект при алкогольных язвах желудка^{моделей 14}, а препараты, связанные с SQBJ, продемонстрировали значительные защитные эффекты слизистой в доклинических исследованиях рефлюксного эзофагита и язвы^{желудка 15}. Однако в настоящее время отсутствует систематическая экспериментальная проверка механизма сигнального пути, лежащего в основе защитного эффекта желудочной слизисты SQBJ, особенно ключевой роли пути PI3K/AKT и его регуляторной связи с MAPK. Тем временем причинная связь между ключевыми химическими веществами и функциональными рецепторами SQBJ до сих пор не полностью прояснена.

Для устранения этих пробелов в данном исследовании была принята интегрированная стратегия исследования, объединяющая сетевую фармакологию и in vitro экспериментальную верификацию, используя линию клеток GES-1 с этанолом в качестве экспериментальной платформы для изучения потенциального молекулярного механизма, лежащего в основе защитных эффектов желудочного эпителия SQBJ, с акцентом на окислительный стресс, воспалительные реакции, апоптотические процессы, сигнализацию, связанную с PI3K/AKT, и изменения, связанные с MAPK. Во-первых, мы использовали LY294002 ингибитора PI3K для предварительной оценки водействия сигналов PI3K/AKT и обнаружили, что ингибирование этого пути ослабляет защитное действие SQBJ, что свидетельствует о том, что сигнализация, связанная с PI3K/AKT, способствует цитопротекции, опосредованной SQBJ. Во-вторых, мы исследовали связь между изменениями, связанными с PI3K/AKT, и регуляцией путей MAPK, предоставив предварительные доказательства того, что изменения сигнализации MAPK могут быть связаны с модуляцией функционального ответа оси PI3K/AKT SQBJ. В совокупности данная работа устанавливает молекулярную основу inn vitro для оценки того, как SQBJ смягчает повреждения эпителия желудка, вызванное этанолом, и предоставляет предварительные доказательства для дальнейших исследований формул соединений ТКМ при повреждениях слизистой слизисты алкогольного желудка. Тем не менее, для подтверждения, можно ли перенести эти клеточные защитные эффекты in vivo. терапевтическая эффективность в экспериментальных моделях алкогольно-вызванной язвы желудка (дополнительный рисунок S1).

Протокол

В этом исследовании не участвовали люди, образцы человеческих тканей, клинические образцы или эксперименты на животных. Для анализа фармакологии сети использовались общедоступные и анонимизированные ресурсы баз данных, а коммерчески доступные клетки GES-1 применялись для экспериментов in vitro. Поэтому формальное этическое одобрение и информированное согласие не требовались. Подробная информация о основных реагентах, антителах, наборах для анализов, инструментах, производителях, каталожных номерах и идентификаторах исследовательских ресурсов (RRID), где это применимо, приведена в Таблице материалов.

Подготовка и контроль качества водного экстракта SQBJ

Травяные материалы
Сырьё Panax notoginseng (Burk.), F. H. Chen (корень и корневище) и Bletilla striata.(Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (клубень) были получены у коммерческого поставщика традиционной китайской медицины и впоследствии подтверждены старшим фармацевтом TCM после Китайской фармакопеи (издание 2025 года). Образцы ваучеров (No. SQBJ-20240301, No PN-20240301, No BS-20240301) были внесены в гербарий нашего учреждения. Две травы были измельчены и смешаны в массовом соотношении 1:1 для приготовления порошка SQBJ.

Подготовка водного экстракта SQBJ
Порошок SQBJ прошёл две последовательные экстракции рефлюкса с деионизированной водой в соотношении твердого к жидкости 1:10 (г/мл) в течение 1 часа за сеанс. Затем собранные экстракты комбинировались и провели через четыре слоя медицинской марли для удаления остаточного материала. Полученный фильтрат концентрировали под пониженным давлением при 60 °C до достижения относительной плотности 1,05–1,10, после чего проводили вакуумную сублимационную сушку для получения водного экстракта SQBJ с итоговым выходом 18,2 % ± 0,6 %. Порошок экстракта герметизировали и хранили при −20 °C, растворяли в безсывороточной среде DMEM, а затем проходили через мембранный фильтр диаметром 0,22 мкм для стерилизации перед экспериментами с клетками.

Контроль качества водного экстракта SQBJ
Для оценки согласованности между партиями и стандартизации водного экстракта SQBJ мы провели количественное определение вместе с высокоэффективным профилированием отпечатков пальцев с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Таблица материалов содержит комплексные технические параметры системы ВЭЖХ. Основываясь на химических профилях обеих составляющих трав, мы выбрали четыре представительных маркера: нотогинсенозид R1, гинсенозид Rg1, гинсенозид Rb1 и милитарин. Однако эта стратегия контроля качества на основе ВЭЖХ в основном отражала несколько репрезентативных компонентов и не предоставляла полного химического профиля всех активных соединений в SQBJ.

Хроматографическое разделение осуществлялось с помощью колонки C18 с обратной фазой (4,6 мм × 250 мм, 5 мкм). Работа поддерживалась при температуре колонки 30 °C, расходе 1,0 мл/мин, объёме впрыска 10 мкл и длине волны обнаружения 203 нм. Состав подвижной фазы состоял из ацетонитрила (А) и водного раствора фосфорной кислоты 0,1% (В), с использованием следующего градиентного разрядного процесса: 0–15 мин, 19% А; 15–35 мин, 19%–35% передачи; 35–55 мин, 35%–55% передачи; и 55–60 мин, 55–19% A. Подробная информация о приборах и колонках приведена в Таблице материалов.

Эталонная подготовка вещества
Для проведения количественного анализа мы приобрели коммерческие стандарты для нотогинсенозида R1, гинсенозида Rg1, гинсенозида Rb1 и милитарина, все с чистотой ≥ 98%. Отдельные эталонные химикаты были точно измерены и растворены в одном метаноловом составе для получения однородного смешанного эталонного раствора с конечной концентрацией 50 мкг/мл для каждого компонента.

Подготовка образцов:
Сухой порошок водного экстракта SQBJ (50 мг) был точно измерен, затем растворён с использованием 25 мл аналитического метанола. Эта смесь прошла ультразвуковую обработку в ванне в течение 30 минут при контролируемых параметрах приборов (мощность: 250 Вт; частота: 40 кГц). После уравновешения до комнатной температуры жидкость проходила через органическую фильтрующую мембрану диаметром 0,22 мкм для получения окончательного аналитического тестового раствора.

Результаты определения контента:
Среднее содержание характерных компонентов ядра в трёх последовательных партиях водного экстракта SQBJ было следующим: нотогинсенозид R1 3,12 ± 0,11 мг/г, гинсенозид Rg1 8,45 ± 0,23 мг/г, гинсенозид Rb1 5,26 ± 0,18 мг/г и милитарин 2,78 ± 0,09 мг/г, при этом RSD каждого компонента составлял < 5 % между партиями, что подтверждает хорошую консистенцию экстракта от партии к партии.

Заявление об этике и соблюдении требований
Ни испытания на животных, ни включение клинических образцов на людей, биопсий тканей и живых испытуемых не участвовали в ходе этого исследования. Анализ фармакологии сети проводился с использованием общедоступных баз данных, включая TCMSP, UniProt, GeneCards, OMIM, DrugBank, STRING, Metascape, PubChem и RCSB PDB. Все данные, полученные из этих баз данных, были общедоступны и анонимизированы; Таким образом, профилирование в биоинформатике было полностью освобождено от необходимости формального информированного согласия или дополнительного этического контроля.

Существующие эксперименты in vitro проводились с использованием коммерчески доступной человеческой слизистой слизистой эпителиальной клеточной линии GES-1. Первичные человеческие клетки или биологические материалы, полученные пациентами, не использовались. Клеточная линия была получена из аутентифицированного клеточного хранилища и обработана в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности и культуре клеток. Поскольку в этом исследовании использовались только установленные клеточные линии и общедоступные базы данных, оно было освобождено от официального одобрения институциональным этическим комитетом. Все экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с соответствующими требованиями институциональной безопасности лабораторий и соблюдения исследований.

Исследования сетевой фармакологии

Идентификация и скрининг активных компонентов
Активные компоненты Panax notoginseng и Bletilla striata., двух составных трав SQBJ, были получены из общедоступных баз данных. Вся информация, полученная из баз данных, использованная в этом исследовании, была общедоступна и не содержала идентифицируемой личной информации. Используя ботанические названия в качестве запросов, мы определили кандидаты на фитохимикаты из базы данных и аналитической платформы традиционных китайских медицинских систем фармакологии (TCMSP). Для выявления подходящих биоактивных молекул протокол скрининга применял пороговые значения пероральной биодоступности (OB) ≥ 20% и похожих на лекарственные средства (DL) ≥ 0,1. Далее мы выявили потенциальные генные мишени, связанные с этими кандидатными компонентами, опустив компоненты без соответствующих действительных генных мишеней. Все целевые гены были аннотированы и стандартизированы через Универсальный белковый ресурс (UniProt), ограничивая поиск в справочной базе данных исключительно Homo sapiens, тем самым создавая окончательный список целевых генов для функциональных активных компонентов SQBJ.

Извлечение мишеней, связанных с патологией
Чтобы собрать гены, связанные с этим заболеванием, мы запросили три публичные базы данных: GeneCards, Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) и DrugBank, где в качестве поискового запроса был «желудочная язва». Кроссплатформенный набор данных был впоследствии объединён, после чего были исключены дублирующие записи для создания стандартизированного списка генов-мишень, связанных с язвами желудка.

Построение сети для ингредиентов, целей и болезней
Мы определили перекрывающиеся целевые гены между активными компонентами SQBJ и язвой желудка. Впоследствии была построена многоуровневая сеть взаимодействия с использованием программного обеспечения для визуализации сети. Для оценки важности узла интегрированный топологический алгоритм вычислял топологические параметры каждого узла, включая степень и центральность между узлами. На основе этих рассчитанных значений мы определили активные компоненты и ключевые функциональные цели SQBJ при лечении язвы желудка.

Картирование сетей взаимодействия белков и белков (PPI)
Выявленные консенсусные цели, общие между SQBJ и язвой желудка, были сопоставлены с базой данных STRING. Наш запрос определил шаблон мультибелкового анализа, ограничив аналитический фон Homo sapiens. ИПП были отфильтрованы с минимальным порогом доверия к взаимодействию — средней уверенностью (> 0,4).

Полученные записи функциональной связности экспортировались в формате TSV-файла, который впоследствии интегрировался в специализированное программное обеспечение для визуализации сетей для анализа PPI. На основе рассчитанной топографии соединения мы оценили основные функциональные узлы сети, ранжировав конкретное значение степени каждого узла.

Функциональная аннотация и отображение путей вниз по потоку
Для разъяснения биологических ролей общих узлов пересечения мы провели анализ функционального обогащения генной онтологии (GO) и анализ обогащения путей Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) с использованием веб-доступного инструмента биоинформатической аннотации. Функциональная классификация разделяет гены на три классические категории: биологический процесс (BP), клеточный компонент (CC) и молекулярная функция (MF). Пузырьковые графики и столбочные диаграммы для результатов обогащения были созданы с помощью онлайн-платформы для биоинформатики для картирования основных биологических процессов и сигнальных путей, связанных с терапевтическим эффектом SQBJ на язву желудка.

Вычислительное молекулярное стыковочное моделирование
Файлы пространственной геометрии основных активных компонентов SQBJ скачивались из публичных составных баз данных и впоследствии сохранялись в виде MOL2 с помощью программного обеспечения для обработки файлов. Мы также получили трёхмерные кристаллические структуры основных целевых белков, запросив Protein Data Bank. Эти макромолекулярные структуры предварительно обрабатывались путём удаления оригинальных лигандов и молекул воды, а полученные чистые модели сохранялись в формате PDB. Для моделирования энергетики связывания рецептор-лиганд верификационная проверка с участием активных компонентов и белков-мишень проводилась с помощью стандартного вычислительного программного обеспечения для молекулярного стыковки. Результаты стыковки были оптимизированы и отрисованы с помощью программного обеспечения для молекулярной визуализации.

Культура клеток
Человеческие желудочные эпителиальные клетки GES-1 культивировались с использованием среды RPMI-1640, интегрированной с 10% сывороткой плода крупного рогатого скота и 1% пенициллин-стрептомицином при 37 °C под увлажнённой атмосферой, содержащей 5% CO₂. Мы определили исходную культуру как установленную клеточную линию, получив первоначальный запас из аутентифицированного хранилища клеток. При наблюдаемом слиянии 80–90% монослойки промывались дважды с помощью PBS, после чего следовало отслоение с применением 0,25% трипсина-ЭДТА в течение 2 минут при 37 °C. Для завершения ферментативной реакции расщепления мы ввели равный объём полной среды. Полученная клеточная суспензия центрифугировала при 1000 × г в течение 5 минут, после чего гранула снова суспензировала в свежей полной среде и засеяна с нужной плотностью. Культуры возвращались в идентичные условия инкубации. В течение всего периода размножения для оценки жизнеспособности, морфологии и состояния роста клетки использовался микроскоп с инвертированным фазовым контрастом, а клетки в логарифмической фазе роста регулярно собирались для дальнейших анализов.

Создание и лечение модели повреждения клеток GES-1, индуцированной этанолом,
Клетки логарифмической фазы GES-1 были засеяны на 5 × 10⁵ клеток/скважину в пластинах с 6 колодцями или на 1 ×^{10 4} ячейки на колодцу в пластинах с 96 лунками и инкубировали ночью для прилипания. Повреждение, вызванное этанолом, было установлено путем воздействия клеток с содержанием 500 ммоль/л этанола в недобавленном RPMI-1640 в течение 4 часов. Это состояние было выбрано на основе предварительных экспериментов с концентрацией и временной реакцией. В предварительном анализе этанол 250 ммоль/л в течение 4 часов вызвал лишь лёгкое повреждение, при этом жизнеспособность клеток оставалась примерно на уровне 78,6 ± 5,4%, тогда как 750 ммоль/л этанол снижал жизнеспособность до 32,8 ± 4,7%, указывая на чрезмерную цитотоксичность. Воздействие 500 ммоль/л этанола в течение 4 часов снижало жизнеспособность клеток до 54,7 ± 4,9%, что приводило к воспроизводимому умеренному и тяжёлому повреждению, сохраняя при этом достаточное количество жизнеспособных клеток для последующего вмешательства и механистических анализов. Поэтому для установки модели был выбран этанол 500 ммоль/л на 4 часа. Это состояние использовалось для моделирования острого эпителиального повреждения, вызванного этанолом, in vitro и не полностью воспроизводит физиологический образец воздействия слизистой желудка in vivo.

Для фармакологического вмешательства были выбраны три концентрации водного экстракта SQBJ (5, 10 и 50 мкг/мл) и введены сразу после вызова этанолом. В ингибирующей группе PI3K клетки предварительно инкубировали с 20 мкмоль/л LY294002 в течение 30 минут перед совместной обработкой с этанолом и оптимальной концентрацией SQBJ. Положительная контрольная когорта сразу после воздействия этанола получила омепразол 20 мкмоль/л. Омепразол использовался как эталонное гастропротекторное средство, а не как сравнительный эквивалент дозы. Концентрация была выбрана на основе предварительной оценки цитотоксичности и широко используемых диапазонов интервенций in vitro, и была предназначена для предоставления фармакологического ориентира для клеточной защиты. Контрольные клетки содержались в полной среде без этанола и дополнительных агентов. Все инкубации проводились в увлажнённой атмосфере с содержанием 5% CO₂ при 37 °C. Каждая экспериментальная группа состояла как минимум из трёх репликационных ямак, и весь протокол выполнялся независимо три раза.

Определение оптимальной концентрации SQBJ с помощью метода CCK-8
Элементы лог-фазы HGE/GES-1 были покрыты в векторы по 96 ям с плотностью 1 × 10⁴ ячеек/скважину и инкубированы ночью в полном среде RPMI-1640 при стандартных условиях (37 °C, 5% CO₂) для обеспечения прицепления. Культуры были рандомизированы на четыре группы: транспортный контроль (только полная среда), низкодозовое вмешательство SQBJ (5 мкг/мл), средняя доза SQBJ (10 мкг/мл) и вмешательство с высокими дозами SQBJ (50 мкг/мл); эти три концентрации использовались для терапевтического скрининга и подготовились путём растворения SQBJ в PBS. Все условия были проанализированы как минимум в трёх параллельных скважинах, и общий протокол повторялся в трёх отдельных экспериментальных партиях. После назначенного периода обработки каждая скважина получала 10 мкл реагента CCK-8, после чего следовал двухчасовой инкубационный период при 37 °C. Оптическая плотность (OD) при 450 нм измерялась с помощью считывателя микропластин. Процент жизнеспособности клеток был рассчитан как (absorbance_treatment / absorbance_control) × 100%, что позволило определить наиболее эффективную концентрацию SQBJ для последующих экспериментов.

qPCR
Элементы лог-фазы GES-1 культивировались в пластинах с 6 лунками (5 × 10⁵ клеток на скважину) и содержались ночью при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с содержанием 5% CO₂ для обеспечения прикрепления. После этого клетки подвергались воздействию заранее определённой оптимальной концентрации SQBJ и собирались на исходном уровне (0 часов) и через 6, 12, 24 и 48 часов после обработки для определения динамического ответа сигнальных молекул. Исходя из результатов временного цикла, для последующих механистических тестов был выбран 24-часовой интервал, поскольку он демонстрировал самый сильный сигнальный отклик при сохранении стабильной жизнеспособности клетки. Каждая временная точка была представлена тремя трёхкратными ямы, и весь эксперимент повторялся независимо три раза.

Мы выделили полную РНК с помощью специализированного реагента для экстракции, оценивая концентрацию и качество выхода с помощью спектрофотометра. Все образцы показали коэффициент поглощения A₂₆₀/A₂₈₀ в диапазоне от 1,8 до 2,0. Для обратной транскрипции cDNA из 1 мкг общей РНК использовался набор для обратной транскрипции с gDNA-wiper. ПЦР-анализ в реальном времени проводился с помощью количественной системы ПЦР с праймерами для PI3K, AKT, p38, JNK, ERK и эталонного гена GAPDH. Детали системы ПЦР, реагентов и сервиса синтеза праймеров приведены в Таблице материалов. Праймеры были разработаны для определённых областей соответствующих человеческих генов. Протокол qPCR: активация при горячем запуске при 95 °C в течение 30 секунд, затем 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 5 секунд и отжиг/расширение при 60 °C в течение 30 секунд. Расчёт экспрессии мРНК целевых генов основывался на относительном количественном методе ПЦР с методом ^2-ΔΔCt .

ЭЛИЗА
Супернатанты были собраны и очищены центрифугой при 1 200 × г в течение 10 минут при 4 °C для удаления клеточного мусора. Уровни воспалительных медиаторов (CRP, IL-6, TNF-α) и индексов окислительного стресса (SOD, MDA, GSH) оценивались с помощью коммерческих наборов ELISA с указанием производителей. Концентрационные профили этих мишень были проверены с помощью коммерческих тестовых формул согласно инструкциям поставщиков. Каждая экспериментальная группа состояла из трёх репликационных колодцев, и процедура проводилась на трёх отдельных партиях клеточных культур для подтверждения воспроизводимости экспериментальных данных. Кратко, 100 мкл стандартных или очищенных супернатантов подавали в предварительно покрытые реакционные пластины и инкубировали при 37 °C в течение 90 минут. После трёх последовательных циклов промывания каждая полость получала 100 мкл антитела специфического обнаружения для 60-минутной инкубации при 37 °C, за которым следовали ещё три цикла промывки. Затем был введён субстратный раствор (100 мкл), и образцы были защищены от света в течение 15 минут, после чего ферментативная реакция была заблокирована 50 мкл стоп-раствора. Оптическая плотность на 450 нм фиксировалась с помощью считывателя микропластин. Концентрации интерполяцировались из соответствующих стандартных кривых. Чтобы минимизировать смещение, вызванное различиями в количестве клеток или изменениями жизнеспособности, вызванной лечением, профили MDA, SOD, GSH, CRP, TNF-α и IL-6 были откалиброваны с содержимостью белков каждого аналитического образца, определёнными анализом BCA, и экспрессированы в виде относительных значений по сравнению с контрольной группой.

Обнаружение внутриклеточного ROS в клетках GES-1 с помощью флуоресцентного зонда DCFH-DA
Для количественного определения уровней внутриклеточных реактивных кислородных форм (ROS) мы использовали мембранно проницаемый фторогенный индикатор DCFH-DA. Собранные клетки были вновь суспендированы в недобавлённом RPMI-1640 с содержанием 10 мкмоль/л DCFH-DA и поддерживались в течение 20 минут в стандартных условиях культуры (37 °C, 5% CO₂) в темноте. После трёх последовательных промывок с использованием безсывороточной среды для очистки несвязанного зонда интенсивность флуоресценции была измерена с помощью потоковой цитометрии с возбуждением 488 нм и излучением 525 нм. Относительные уровни ROS были представлены как средняя интенсивность флуоресценции для каждой группы лечения, нормализованная к жизнеспособному числу клеток, определяемому в параллельных скважинах с помощью анализа CCK-8, и выраженной относительно соответствующей контрольной группы.

Определение потенциала мембраны митохондрий (ΔΨm)
Мы оценили изменения потенциала мембраны митохондрий (ΔΨm) с помощью коммерческого набора JC-1. Кратко: собранные клетки были вновь суспендированы в свежеприготовленном рабочем растворе JC-1 — равной смеси красителя JC-1 и буфера для окрашивания, предоставляемой набором — до конечной концентрации ячеек 1 × 10⁶ клеток/мл. После инкубации в течение 20 минут при 37 °C в увлажнённой среде с 5% CO₂, защищённой от света для предотвращения отбеливания, образец был собран центрифугированием (800 × г., 5 мин) и промыт один раз 1 мл ледяным буфером JC-1 для окрашивания. Впоследствии флуоресценция была обнаружена с помощью потоковой цитометрии.

Агрегаты JC-1 (указывающие на целостность ΔΨm) отслеживались через канал FL2 с использованием длин волн 488 нм и 590 нм излучения, тогда как мономеры JC-1 (указывающие на рассеивание ΔΨm) отслеживались через канал FL1 с использованием возбуждения 488 нм и настроек излучения 525 нм. ΔΨm выражался как пропорция флуоресцентного сигнала от красного к зелёному; снижение значений указывает на деполяризацию митохондрий.

Определение внутриклеточного уровня АТФ
Функциональность митохондрий оценивалась с помощью внутриклеточного количественного АТФ с помощью набора для анализа АТФ. Для определения содержания АТФ была использована биолюминесцентная реакция люциферин–люцифераза, которая прямо пропорциональна активности митохондрий. Кратковременно собранные клетки вновь подвешивали в ледяной буфере с АТФ-лизисом и хранили на льду в течение 5 минут лизиса. Затем центрифугирование проводилось при 12 000 × г в течение 5 минут при 4 °C, после чего 20 мкл полученного очищенного супернатанта было передано на 96-колодные белоснежные непрозрачные микропластины. Впоследствии в каждую полость вводилось 100 мкл свежеприготовленного рабочего раствора для обнаружения АТФ — смеси реагента люциферазы и субстрата люциферина, приготовленного по предоставленному протоколу. Полученный сигнал люминесценции быстро фиксировался с помощью люминесцентного микропластинного считывателя. Для получения относительных уровней АТФ значения сырой люминесценции были нормализованы до отдельных супернатантных общих концентраций белка, количественно измеренных с помощью коммерческого теста BCA, тем самым корректируя изменения в количестве клеток.

Обнаружение клеточного апоптоза с помощью двойного окрашивания Annexin V/PI
Обнаружение апоптотических клеток проводилось с помощью коммерческой конфигурации анализа клеточной гибели Annexin V-FITC/PI, описанной производителем. После промывки гранулы возвращались в буфер связывания Annexin V-FITC до плотности ячеек 1 × 10⁶ клеток/мл (195 мкл на образец). Впоследствии каждая независимая трубка получала 5 мкл Annexin V-FTC, а затем 10 мкл раствора для окрашивания PI. Образец был аккуратно вихрем и инкубирован в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. После этого процесса апоптотические клетки контролировались с помощью потокового цитометра. Соответствующие флуоресцентные каналы способствовали дифференциации жизнеспособных клеток (Annexin V⁻/PI⁻), ранних апоптотических клеток (Annexin V⁺/PI⁻) и поздних апоптотических/некротических клеток (Annexin V⁺/PI⁺). Процент апоптотических клеток в каждой группе количественно определялся согласно этим параметрам гейтинга.

Вестерн блот
Мембраны инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами против Bcl-2, Bax, расщепленных Caspase-3, AKT, p38 MAPK, JNK, ERK1/2 и GAPDH. Антитела были отобраны на основе данных валидации для человеческих образцов и применения western blot. RRID были добавлены для всех антител с доступными записями в Реестре антител или RRID Portal. Целевые уровни белка были нормализованы до GAPDH. После стандартных протоколов промывания пятна подвергались воздействию вторичных антител, конъюгированных с HRP, в течение 1 часа при комнатной температуре. Диапазоны были обнаружены с помощью раствора подложки ECL. Значения серых полос вестерн-блот оценивались с помощью программного обеспечения для цифрового анализа изображений.

Иммунофлуоресцентное окрашивание
Монослои GES-1 устанавливались на стеклянных накладках внутри пластин с 24 лунками до назначенных обработок. После обработки была проведена фиксация с использованием 4% параформальдегида в течение 15 минут при комнатной температуре, затем мембранная проницаемость с использованием 0,3% Triton X-100 в PBS в течение 10 минут и блокировка с помощью 5% сыворотки бычьей сыворотки альбумина в течение 30 минут при 37 °C. Затем коверслипы были перенесены для ночной инкубации при 4 °C с первичными антителами, направленными на AKT, p38, JNK и ERK. После трёх последовательных промываний PBS образцы инкубировали 1 час при комнатной температуре с флуоресцентно-конъюгированным вторичным антителом против кроликов, защищённым от света. Контрокрашивание DAPI применялось в течение 5 минут для визуализации ядер. Впоследствии накладки были установлены реагентом против фейда, а сбор данных осуществлялся с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа для определения субклеточного распределения целевых белков. Все иммунофлуоресцентные изображения были получены под одними и теми же параметрами изображения с помощью объектива 20× объектива. Полосы масштаба, соответствующие 50 мкм, были добавлены ко всем репрезентативным иммунофлуоресцентным изображениям.

Статистический анализ
Количественные значения иллюстрируются как среднее ± стандартного отклонения (SD), полученное как минимум из трёх независимых экспериментальных забегов, при этом каждый выборка верифицирован в тройном экземпляре. Статистический анализ проводился с помощью специализированных инструментов численного анализа. Для определения различных вариаций между несколькими когортами мы использовали односторонний анализ дисперсии (ANOVA) вместе с пост-хок тестом Тьюки для межгрупповых сравнений. Двухсторонний порог P < 0,05 обозначал статистическую значимость.

Результаты

Биоинформатическая диссекция механизмов, опосредованных SQBJ, при язве желудка
Чтобы изучить, как SQBJ может оказывать фармакологическое действие на GU, мы изначально предсказали мишени, соответствующие его основным биоактивным компонентам. Используя программирование R, мы извлекли и очистили избыточные записи среди этих биоактивных компонентов, в итоге получив 411 кандидатов на мишени. Впоследствии патологические мишени, связанные с GU, были собраны с помощью запросо...

Обсуждение

Основной целью этого исследования было оценить, обладает ли SQBJ — классической формулой соединения ТКМ, состоящей из Panax notoginseng и Bletilla striata., — цитопротекторной активностью против повреждения слизистой желудка в модели клетки GES-1, с участием сигнализации, связанной с PI3K/AKT, и сопутствующего снижения воспалительных медиаторов, индикаторов окислительного стресса, нарушения функции митохондрий и апоптотических событий. Основные выводы настоящей работы с...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Тест на апоптоз	Набор для обнаружения апоптоза аннексин V-FITC/PI	Beyotime	C1062L
Тест на АТФ	Повышенный набор для определения АТФ	Beyotime	S0027
Буфер	ПБС	Solarbio	—
Реагент для расщепления клеток	0,25% трипсин-ЭДТА	Gibco	25200072
Клеточная линия	GES-1 человеческие клетки слизистой оболочки желудка	Клеточный банк Китайской академии наук	SCSP-533
Тест на жизнеспособность клеток	Реагент CCK-8	—	—
Конфокальный микроскоп	Конфокальный микроскоп LSM 880	Zeiss	LSM 880
Среда для культивирования	RPMI-1640	Gibco	—
Набор для ЭЛИСА	Набор для ЭЛИСА для определения CRP человека	R&D Systems	DCPR00
Набор для ЭЛИСА	Набор для ЭЛИСА для определения IL-6 человека	R&D Systems	DTAM00D
Набор для ЭЛИСА	Набор для ЭЛИСА для определения TNF-α человека	R&D Systems	—
Флоу-цитометр	FACS Calibur / FACSCanto II	BD Biosciences	—
Растительный материал	Bletilla striata (Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (клубень)	Ангуо Традиционный китайский рынок лекарственных средств	Voucher No. BS-20240301
Растительный материал	Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen (корень и корневище)	Ангуо Традиционный китайский рынок лекарственных средств	Voucher No. PN-20240301
Растительный материал	Санци Байджи Сан порошок	Собственное изготовление	Voucher No. SQBJ-20240301
Колонка для HPLC	Колонка ZORBAX SB-C18	Agilent Technologies	4.6 мм × 250 мм, 5 μm
Система HPLC	Система HPLC 1260 Infinity II	Agilent Technologies	1260 Infinity II
Вторичное антитело для ИФ	Alexa Fluor 594–конъюгат с антителами против кролика IgG	Invitrogen	A11012
Инвертированный микроскоп	Инвертированный фазоконтрастный микроскоп CKX41	Olympus	CKX41
Люминесцентный анализатор	Микроскопический анализатор микроплат с бесконечной емкостью	Tecan	Infinite 200 PRO
Мембрана	ПВДФ-мембран	Millipore	IPVH00010
Микроскопический анализатор	Микроскопический анализатор iMark	Bio-Rad	iMark
Набор для измерения потенциала митохондриальных мембран	Набор для измерения JC-1	Beyotime	C2006
Ядерная окраска	DAPI	Beyotime	C1002
Онлайн-платформа	Онлайн-платформа для построения биоинформатики	Онлайн-платформа для анализа биоинформатики	Онлайн-платформа
Онлайн-платформа	Веб-платформа для анализа обогащения	Metascape	Онлайн-платформа
Тест на оксидативный стресс	Набор для определения GSH	Beyotime	S0052
Тест на оксидативный стресс	Набор для определения MDA	Beyotime	S0131
Тест на оксидативный стресс	Набор для определения SOD	Beyotime	S0109
Ингибитор PI3K	LY294002	MCE	S1105
Положительный контрольный препарат	Омепразол	MCE	HY-B0053
Первичное антитело	AKT	Cell Signaling Technology	4691
Первичное антитело	Bax	Cell Signaling Technology	5023
Первичное антитело	Bcl-2	Cell Signaling Technology	15071
Первичное антитело	Cleaved Caspase-3 Asp175	Cell Signaling Technology	9664
Первичное антитело	ERK1/2	Cell Signaling Technology	4695
Первичное антитело	GAPDH	Abcam	ab8245
Первичное антитело	JNK / SAPK-JNK	Cell Signaling Technology	9252
Первичное антитело	p-AKT Ser473	Cell Signaling Technology	4060
Первичное антитело	p-ERK1/2 Thr202/Tyr204	Cell Signaling Technology	4370
Первичное антитело	p-JNK Thr183/Tyr185	Cell Signaling Technology	4668
Первичное антитело	p-p38 MAPK Thr180/Tyr182	Cell Signaling Technology	4511
Первичное антитело	p-PI3K p85 Tyr458 / p55 Tyr199	Cell Signaling Technology	4228
Первичное антитело	p38 MAPK	Cell Signaling Technology	8690
Первичное антитело	PI3K p85	Cell Signaling Technology	4257
Праймер	AKT вперед	—	—
Праймер	AKT назад	—	—
Праймер	ERK вперед	—	—
Праймер	ERK назад	—	—
Праймер	GAPDH вперед	—	—
Праймер	GAPDH назад