Портативное устройство для предварительной обработки слюны для улучшения обнаружения кортизола

Краткое содержание

Этот протокол описывает быстрый метод предварительной обработки слюны для улучшения обнаружения кортизола. Ручное фильтрационное устройство используется для удаления муцинов и других мешающих веществ при сохранении целевого анализа. Предварительно обработанная слюна демонстрирует улучшенный капиллярный поток, что позволяет проводить более последовательные и воспроизводимые результаты анализа.

Аннотация

Обнаружение слюнного кортизола является неинвазивной альтернативой анализу на основе крови. Однако практическая реализация остаётся ограниченной внутренней вязкостью слюны и наличием мешающих компонентов. В частности, муцины и слюнные белки затрудняют капиллярный поток и снижают надежность последующих анализов бокового потока (LFA), что требует эффективных и доступных стратегий предварительной обработки. Здесь мы представляем портативное устройство для предварительной обработки слюны под названием SaliFilter для обнаружения кортизола на месте оказания помощи. Устройство использует фильтрационный механизм, который избирательно удаляет компоненты с высокой молекулярной массой, позволяя проходить малые молекулы, включая кортизол. Работая простым ручным давлением, он обеспечивает быструю обработку образцов (~2 мин) без необходимости внешнего оборудования, что делает его подходящим для децентрализованных установок. Производительность устройства оценивалась с помощью измерений мутности, количественного определения белков и SDS-PAGE, что подтвердило эффективное удаление слизистых и слюнных белков. Обработанные образцы демонстрировали усиленный капиллярный поток, что обеспечивало стабильную и надёжную работу LFA. Количественный анализ показал улучшенную воспроизводимость сигнала, а обнаружение кортизола достигло предела обнаружения 1,47 нг мл⁻¹ в клинически значимых концентрационных диапазонах. Этот протокол устанавливает эффективную стратегию предварительной обработки слюны, которая повышает аналитическую чувствительность и надёжность без ущерба целостности анализа. Предлагаемый подход предоставляет практичное, портативное решение для диагностики на основе слюны, с потенциальной применимостью для тестирования на месте оказания помощи и самоконтроля.

Введение

Кортизол, глюкокортикоидный гормон, выделяемый корой надпочечников, является ключевым биомаркером для оценки физиологического^{стресса 1,2}. Её можно измерять в различных биологических жидкостях, включая сыворотку, плазму, мочу, межобразную жидкость и слюну, при этом кровь и слюна являются наиболее распространёнными в клинической^{практике 3}. Хотя измерения на основе крови дают достоверную количественную информацию, они требуют инвазивной венипункции и обученного персонала, что ограничивает их пригодность для частого или продольного^{мониторинга 4,5,6}. В отличие от этого, измерение слюнного кортизола представляет собой неинвазивную и удобную альтернативу, позволяющую создавать приложения на месте оказания помощи и самомониторинг ^7,8. В частности, уровень кортизола слюны сильно коррелирует с концентрацией в крови, что поддерживает слюну как надёжный суррогатный^{образец 9}. Однако внутренняя вязкость слюны и наличие мешающих компонентов значительно затрудняют аналитическую работу, что требует эффективной предварительной обработки до анализа 10,11,12.

Были изучены различные стратегии предварительного лечения для решения этих проблем. Центрифугирование широко используется для удаления крупных компонентов, таких как муцины, белки и клеточный мусор. Однако для этого требуется громоздкое лабораторное оборудование и множество этапов обработки, что ограничивает его применимость в децентрализованных^{условиях 13,14}. Разбавление буферными растворами может снизить вязкость и улучшить поток^{образца 15}. Тем не менее, он одновременно снижает концентрацию анализируемых веществ, тем самым снижая аналитическую чувствительность. В результате существующие подходы остаются недостаточными для точечных применений, где необходимы быстрая обработка и сохранение целевых аналитов без оборудования.

Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали SaliFilter — портативное устройство для предварительной обработки слюны, адаптированное к обнаружению кортизола на месте оказания помощи. Устройство использует фильтрационный механизм, который избирательно удаляет вещества с высоким молекулярным весом, позволяя при этом пропускать мелкие молекулы, включая^{кортизол 16}. При ручном работе устройство обеспечивает быструю, удобную обработку без необходимости внешнего оборудования. Устраняя мешающие компоненты, этот подход улучшает капиллярный поток в анализах боковых потоков, тем самым повышая аналитическую надёжность. Этот протокол описывает изготовление устройства и его применение для быстрой предварительной обработки слюны перед обнаружением кортизола с помощью анализов бокового потока.

Протокол

В этом исследовании использовалась коммерчески полученная деидентифицированная слюна с объединённой человеческой слюной. Человеческие участники не были привлечены, и одобрение институциональной этики не требовалось.

1. Подготовка образца слюны

1. Инструктировать участников воздерживаться от употребления пищи и питья не менее 30 минут до начала взятия образца.
2. Подготовьте образец слюны в соответствии с инструкциями поставщика.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовалась коммерчески доступная объединённая человеческая слюна для валидации на уровне протокола.
3. Аккуратно перемешайте образец слюны перед использованием, чтобы обеспечить однородность.
4. Храните образцы слюны при 4 °C и используйте их в рекомендованном сроке хранения.

2. Подготовка мембраны, покрытой эритроцитом (рисунок 1A)

1. Изолировать эритроцит из цельной крови согласно ранее опубликованному^{протоколу 16}.
   1. Используйте коммерчески полученную цельную кровь человека, антикоагулянную с K2EDTA в качестве источника эритроцитов.
   2. Центрифугуйте всю кровь при 800 × г в течение 5 минут и соберите долю эритроцитов после удаления плазмы и шерсти баффи.
   3. Промыйте изолированные гранулы эритроцитов три раза ледяным 1× фосфат-буферным физиологическим раствором (PBS) с помощью мягкого ручного смешивания.
   4. Суспензируйте промытую эритроцитаную гранулу в ледяной температуре 0,25× PBS на 30 минут, чтобы вызвать гемолиз.
   5. Отделяйте свободный гемоглобин, центрифугая лизированную суспензию при 20 000 × г в течение 30 минут и собирая пеллету RBCM.
   6. Промыйте собранную гранулу RBCM ещё три раза с 0,25× PBS и храните бледно-розовую гранулу RBCM при температуре −80 °C до дальнейшего использования.
2. Подготовьте мембрану из полиэфирсульфона (PES) с порой размером 30 нм и диаметром 13 мм.
3. Нанести 100 мкл раствора 2% (с в/в) эритроцин на одну сторону мембраны ПЭС. Аккуратно размазывайте раствор по каплям, пока вся поверхность мембраны не будет полностью смачивана.
4. Инкубировать мембрану при 50 °C в течение 30 минут, чтобы обеспечить равномерное покрытие и сушку.
5. Храните покрытую мембрану при комнатной температуре и используйте её в течение 15 дней после^{приготовления 17}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Детальная характеристика мембраны ПЭС, покрытой эритроцитом, была описана в нашем предыдущем^{исследовании 16}.

3. Изготовление устройства SaliFilter (рисунок 1B)

1. Поместите мембрану с покрытием эритроцитов в назначенный держатель фильтра.
2. Соберите устройство, надёжно соединив входные и выходные компоненты.
3. Подключите шприц объемом 1 мл к входу устройства.
   ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что все компоненты плотно герметичны, чтобы предотвратить протечки во время эксплуатации.

4. Предварительная обработка слюны

1. Загрузите 500 мкл слюны в шприц, подключённый к устройству SaliFilter.
2. Примените мягкое ручное давление, чтобы пропустить образец слюны через мембрану (~2 минуты).
3. Соберите заранее обработанную слюну из розетки.
4. Используйте предварительно обработанный образец немедленно или храните его при 4 °C до дальнейшего анализа.

5. SDS-PAGE анализ слюнных белков

1. Смешайте 15 мкл образца с 5 мкл буфера Леммли.
2. Загрузите смесь в отдельные скважины геля SDS-PAGE 8%.
3. Проведите электрофорез при 150 В в течение 40 минут.
4. Окрашивайте гель цветом Coomassie blue на 2 часа.
5. Очистите гель в дистиллированной воде на ночь.
6. Сделайте снимки геля с помощью смартфона или системы съёмки.

6. Обнаружение кортизола с помощью Lateral Flow Assay (LFA)

1. Нанесите 150 мкл предварительно обработанной слюны на пробную подушечку полоски LFA.
2. Дайте образцу мигрировать по полосе в течение 10 минут.
3. Сделайте снимки результатов теста с помощью смартфона или системы съёмки.
4. Откройте изображение LFA в ImageJ и используйте Image > Color > Split Channels для разделения RGB-каналов.
5. Используйте изображение зелёного канала для анализа интенсивности тестовой линии.
6. Выберите прямоугольную область интереса (ROI) размером 100 × 10 пикселей, покрывающую тестовую линию, и примените одинаковый размер ROI ко всем полосным изображениям.
7. Измерьте среднее значение интенсивности ROI тестовой линии. Выберите соседнюю область пустой мембраны с одинаковым размером ROI и измерьте фоновую интенсивность.
8. Вычислим нормированную интенсивность тестовой линии следующим образом: нормализованная интенсивность = интенсивность тестовой линии − фоновая интенсивность.

7. Статистический анализ

1. Представить количественные данные как среднее ± стандартное отклонение (SD), если не указано иное. Определите полоски ошибок как SD.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании все сообщаемые значения N представляют собой технические повторения, выполненные с использованием аликвотов коммерчески полученной слюны в совокупной человеческой жидкости.
2. Проведите линейный регрессионный анализ с использованием нормализованных значений интенсивности тестовой линии, полученных из концентраций кортизола 0–8 нг мл⁻¹ , и вычислите коэффициент определения (^{R 2}) по подгонной кривой.
3. Вычислите предел обнаружения (LOD) с помощью следующего уравнения: LOD = 3,3 × SE / |slope|, где SE — стандартная ошибка y-пересечения и |slope| — абсолютное значение наклона, полученное из линейного регрессионного уравнения. Используйте абсолютное значение уклона, потому что конкурентный LFA даёт отрицательный наклон.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании не проводились выводные статистические тесты, и критерии значимости не применялись.

Результаты

Эффективная предварительная обработка слюны требует удаления мешающих компонентов, включая муцины и белки, которые снижают аналитическую эффективность в дальнейшем процессе. Фильтрационная способность SaliFilter была впервые оценена путём сравнения мутных изменений с теми, что были получены с помощью коммерческих наборов для сбора слюны (рисунок 2A). Необработанная слюна демонстрировала высокую мутность, тогда как образцы, обработанные SaliFilter, были замет...

Обсуждение

Диагностика на основе слюны предлагает неинвазивную альтернативу анализу крови. Однако их более широкое распространение было ограничено внутренней вязкостью слюны и наличием мешающих компонентов, таких как муцины и белки. Эти факторы нарушают капиллярный поток и снижают производительность простых аналитических платформ, включая LFA, что требует эффективной предварительной обработки образцов.

В этом исследовании мы демонстрируем, что предлагаемое портативное фи...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Искусственная слюна	Solarbio, China	A7990
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent	Bio-Rad, USA	5000006	Для определения по Бредфорду
Синяя КооMASSI	Abcam, UK	ab119211	Для визуализации белковых полос
Кит ELISA для определения кортизола	Abcam, UK	ab154996
LFA для кортизола	In-house
Горячая плита	Daihan Scientific, Republic of Korea)
Гидрокортизон (кортизол)	Sigma-Aldrich, USA	PHR1014
Буфер Лаемли	GenDEPOT, USA	L1200-001	Для денатурации белков перед SDS-PAGE
Держатель мембраны	GVS Filter Technology	1220950	Держатель диаметром 13 мм
Mini-PROTEAN® Tetra Cell для гелевых пластин толщиной 0,75 мм	Bio-Rad, USA	1658000	Для гель-электрофореза
Муцин	Sigma-Aldrich, USA	M2378
Спектрофотометр NanoDrop 2000	Thermo Fisher Scientific, USA		Для определения белков
PES мембраны	STERLITECH, USA	PES00313100	PES мембраны 0,03 микрон, 13 мм
Фосфатно-буферный раствор (PBS)	DUKSAN, Republic of Korea	LB004
Объединенная человеческая слюна	Innovative Research Inc., USA	IRHUSL5ML
RBCM	In-house
Разделительный буфер для PAGE	Bio-Rad, USA	1610798	Для приготовления разделительного геля
Salivette Cortisol	SARSTEDT, Germany	51.1534.500	Набор для сбора слюны
Стекательный буфер для PAGE	Bio-Rad, USA	1610799	Для приготовления стекательного геля
Super•SAL™	Oasis Diagnostics, USA	SSAL-601	Набор для сбора слюны
Шприц	koreavaccine, Republic of Korea)		Объем 1 мл
TEMED	Bio-Rad, USA	1610800	Для полимеризации акриламида