$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Это вычислительное исследование на базе данных не включает участников на людях, эксперименты на животных или клинические образцы. Согласно статье 32 Китайских мер по этическому обзору наук о жизни и медицинских исследований с участием людей, исследования, использующие законно полученные публично доступные данные, не причиняющие вреда человеческим испытуемым, не содержащие чувствительной личной информации и не имеющие коммерческих интересов, подлежат освобождению от этической проверки. Поэтому этическое одобрение для этого исследования не требуется.
Экспериментальное проектирование и аналитический конвейер этого исследования иллюстрированы на блок-схеме (рисунок 1).
Рисунок 1: Общий рабочий процесс исследования . Блок-схема иллюстрирует последовательный рабочий процесс анализов фармакологии и молекулярного докинга, включая получение активных компонентов и мишень Сисеньского декокта (SSD), сбор мишеней, связанных с подагрою, выявление перекрывающихся мишеней, построение сети препарат–компонент–мишень–болезнь и сети взаимодействия белков (PPI), анализ обогащения Генной онтологии (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG). а также молекулярные стыковочные симуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Получение активных компонентов и целевых белков SSD
2 января 2026 года активные химические компоненты пяти трав, составляющих SSD — Хуанци, Юаньчжи, Хуайнюси, Шиху и Цзиньиньхуа — были извлечены из базы данных21 по фармакологии традиционных китайских медицинских систем (TCMSP). Были применены критерии скрининга, основанные на фармакокинетических свойствах: пероральная биодоступность (OB) ≥30% и похожие на лекарственные средства (DL) ≥0,1822. Компоненты, соответствующие этим критериям, рассматривались как потенциальные активные компоненты. Затем собирались соответствующие мишени для каждого компонента. Поскольку у TCMSP не было полных данных по Юаньчжи и Шиху, химические компоненты этих двух трав были дополнительно извлечены из базы данных Herb 2.0 в тот же день. После получения имён компонентов в TCMSP был выполнен обратный поиск с использованием имён компонентов и соответствующих номеров CAS в качестве ключевых слов для получения целевой информации. Для соединений, полученных из базы данных Herb, сохранялись только те, которые успешно сопоставили с записями в TCMSP по названию компонента или номеру CAS. Затем сопоставленные соединения подвергались тем же критериям фармакокинетического скрининга (OB ≥ 30% и DL ≥ 0,18) с использованием данных TCMSP, а соединения, не имеющие полной информации о OB или DL, были исключены. Все сопоставленные и отфильтрованные соединения были ручно проверены по оригинальным записям Herb 2.0, чтобы избежать ошибки. Впоследствии информация о целях, полученная из базы данных Herb, была объединена с данными оставшихся трав для создания полного набора активных ингредиентов для SSD.
Все полученные целевые белки были стандартизированы по официальным символам генов с использованием базы данных UniProt. Была установлена индивидуальная корреспонденция путём сохранения только работ, проверенных человеком (Swiss-Prot), и исключения непроверенных (TrEMBL) записей. Когда несколько изоформ соответствовали одному и тому же символу гена, выбиралась каноническая изоформа. Стандартизированный целевой набор данных сохранялся для последующего анализа пересекающихся генов.
Коллекция мишень, связанных с подагрой
2 января 2026 года были проведены систематические поиски в базе данных GeneCards и OMIM с использованием ключевого слова «подагра» в качестве заболевания для получения целевых целей, связанных с подагрою. Цели, полученные из двух баз данных, экспортировались в WPS Spreadsheets (версия 12.1.0). Столбец Gene Symbol из OMIM располагался рядом со столбцем GeneSymbol из GeneCards, а дублирующиеся цели удалялись с помощью функции «Remove Duplicates» на основе точного совпадения официальных символов генов без регистра. Целевые показатели из двух баз данных были объединены для создания комплексного набора целей, связанных с подагрою.
Выявление пересекающихся целей между лекарством и болезнью
Набор таргетов для лекарств, полученный при скрининге активных компонентов, и набор мишеней, связанных с подагрою, были помещены в одну папку проекта (D:\Venn). Было запущено программное обеспечение R (версия 4.4.0), а пакет readxl использовался для импорта файлов Excel (.xlsx с целевой таблицей. Пакет dplyr использовался для обработки данных, включая фильтрацию и переименование столбцов перед анализом пересечений. Два целевых набора затем преобразовывались в векторы символов, а перекрывающиеся цели были выявлены с помощью функции calculate.overlap() из пакета VennDiagram. Пакет VennDiagram устанавливался из CRAN с помощью команды install.packages("VennDiagram") и хранился в стандартном пути библиотеки R. Если появлялось сообщение о том, что пакет уже установлен, установка считалась успешной. Рабочая папка настраивалась с помощью команды setwd("D:\\Venn"), которая обозначала папку с входными файлами и служила выходной директорией. Затем был выполнен скрипт R для вычисления пересечения между набором целевых препаратов и набором мишеней, связанных с подагрою. Полученные перекрывающиеся мишени были определены как потенциальные терапевтические цели SSD для лечения подагры.
Создание сети «Лекарственные компоненты-таргет-болезни»
Пересекающиеся гены, выявленные в результате перекрытия между целями SSD и целями, связанными с подагрою, сохранялись в файле overlapping_targets.txt , а информация о активных компонентах SSD — в файле drug_components.txt . Оба файла помещались в папку проекта (D:\Network), которая служила рабочей директорией для анализа. Для обеспечения воспроизводимости этот анализ проводился с использованием R. Операции чтения, фильтрации и слияния данных выполнялись с использованием комбинации базовых функций R, включая read.table(), write.table() и merge(), а также пакет dplyr для обработки кадров данных. Команда setwd("D:\Network") выполнялась для явного определения рабочего каталога.
Функция graph_from_data_frame() использовалась как основная функция интеграции. Каждая строка drug_components.txt связывала активный компонент с соответствующим целевым геном с помощью официальных символов гена. Сохранялись только цели, присутствовавшие в overlapping_targets.txt , и дополнительной фильтрации не применялись сверх требования к пересечению. Полученный сетевой набор данных экспортировался в виде network.txt в формате edge-list. Каждая строка содержала два столбца (node1 и node2), где node1 представлял либо формулу SSD, либо активный компонент, а node2 — либо активный компонент, либо целевой ген. Узел болезни («подагра») был соединён с формулой SSD как отдельный край. Веса рёбер не присваивались, и все рёбра рассматривались одинаково (ширина рёбер = 0,8).
Файл network.txt был импортирован в программное обеспечение для визуализации сети Cytoscape (версия 3.7.2). Встроенный инструмент NetworkAnalyzer был использован через Tools → Network Analysis → Analyze Network для получения базовой структуры сети, и в качестве аналитической структуры была выбрана «Degree Distribution». Формы и цвета узлов были распределены в зависимости от типов узлов: синие ромбы — формулу SSD, синие прямоугольники — активные компоненты, оранжевые эллипсы — гены, связанные с болезнью, а красные восьмиугольники — сущность болезни подагры. Размер узла был установлен пропорционально степени узла (размер узла = 30 + градус × 5, максимальный размер = 100).
Построение сети взаимодействия белков и белков (PPI)
Фильтрованный набор пересекающихся целевых генов был импортирован в базу данных STRING (версия 12.0) 2 января 2026 года. Вид был ограничен Homo sapiens, минимальный порог доверия к взаимодействию был установлен на высоком уровне (0,700), разрозненные белки были скрыты, источники взаимодействия включали все доступные источники доказательств, а все остальные параметры сохранялись на своих настройках по умолчанию для получения известных и предсказуемых белок-белковых взаимодействий. Полученные сетевые данные экспортировались в формате значений с разделёнными вкладками (TSV) с использованием стандартных вариантов экспорта.
Экспортируемая сеть импортировалась в программное обеспечение визуализации сети для визуализации и топологического анализа. Свойства сети рассчитывались с помощью встроенного инструмента NetworkAnalyzer (Tools → Network Analysis → Analyze Network). Рассчитанные метрики включали степень, центральность промежуточности и центральность близости. Размеры узлов отображались в значения степеней с помощью функции непрерывного отображения (размер узла = 20 + степень × 3, максимальный размер = 80).
Цели хаба определялись путём ранжирования всех узлов по значениям степеней в убывающем порядке. Узлы с более высокими значениями степени считались более центральными в сети. Изолированные узлы (степень = 0) были исключены из визуализации. Схема сети была организована концентрическими кругами от центра наружу в соответствии с связностью узлов, а цвета узлов отображались с помощью градиента синего в циан, соответствующего возрастающим значениям градусов. Получившаяся сеть использовалась для выявления основных целей хаба, участвующих в потенциальном терапевтическом эффекте SSD против подагры.
Анализ обогащения генной онтологии (GO)
На основе выявленных перекрывающихся целевых генов был проведен функциональный анализ обогащения GO с использованием R. Необходимые пакеты биопроводников устанавливались в стандартный путь библиотеки R и загружались в среду анализа. Пересекающийся генный файл хранился в каталоге проекта (D:\GO), а рабочий каталог определялся с помощью функции setwd().
Преобразование и аннотация идентификаторов гена выполнялись с помощью org пакета Bioconductor. Hs.eg.db (версия 3.20.0). Официальные генные символы были преобразованы в идентификаторы генов Entrez с помощью функции bitr() в пакете анализа обогащения clusterProfiler (версия 4.21.0). Для дальнейших анализов сохранялись только гены с уникальными отображениями один к одному, тогда как неоднозначные или некартированные записи были исключены.
Анализ обогащения GO проводился с использованием пакета анализа обогащения. Функция enrichGO() использовалась с онтологическими категориями: Биологический процесс (BP), Клеточный компонент (CC) и Молекулярная функция (MF). Статистическая значимость определялась с помощью метода коррекции с множественным тестированием Бенджамини–Хохберга, при этом скорректированное P-значение < 0,05 считалось значимым.
Для каждой категории онтологий значительно обогащённые термины ранжировались по коэффициенту обогащения:
EF = (количество генов / общее количество фоновых генов) ÷ (размер термина / общий геном генома)
Для детального анализа были выбраны топ-10 терминов. При идентичных коэффициентах обогащения термины с более низкими скорректированными P-значениями ранжировались выше.
Результаты обогащения визуализировались с помощью ggplot2 (версия 3.5.1) и enrichplot (версия 1.24.0). Пузырьковые графики и столбчатые диаграммы генерировались с помощью функций dotplot() и barplot(). Размер пузыря отражал количество обогащённых генов, тогда как цвет соответствовал значимости обогащения, выраженной как −log10 (скорректированное P-значение). Параметры по умолчанию использовались на протяжении всего процесса.
Анализ обогащения путей KEGG
Анализ обогащения путей KEGG пересекающихся целей SSD и подагры был проведён с использованием R и ранее описанного пакета анализа обогащения. Генные символы преобразовывались в идентификаторы, совместимые с KEGG, с помощью функции bitr(), предоставляемой в пакете анализа обогащения, при этом KEGG служила ресурсом аннотаций. Анализ обогащения путей проводился с использованием функции enrichKEGG() на основе гипергеометрического теста. Статистическая значимость была определена с помощью метода коррекции с множественным тестированием Бенджамини–Хохберга (BH), а пути с скорректированным P-значением < 0,05 считались значительно обогащёнными.
Результаты обогащения экспортировались в совместимые с Microsoft Excel рабочие книги с использованием пакета openxlsx (версия 4.2.8.1) и функции write.xlsx() для последующего рассмотрения и подготовки рисунков.
Впоследствии с использованием программного обеспечения для визуализации сети была построена многоуровневая сеть взаимодействия целевой и публики. Сетевые данные импортировались с помощью File → Import → Network from File. Узлы состояли из целевых генных узлов и значительно обогащённых узлов пути KEGG (скорректированное по BH P-значение < 0,05), тогда как края представляли собой задокументированные ассоциации между целевые гены и обогащёнными путями, выявленными в ходе анализа обогащения. Визуализация сети проводилась с помощью панели Style программного обеспечения для визуализации сети, при этом целевые гены отображались в виде серых эллипсов, а пути — в виде циановых прямоугольников. Дополнительные плагины не использовались. Сеть генерировалась вручную из таблицы выхода обогащения для визуализации взаимосвязей между основными целями и значительно обогащёнными путями.
Валидация молекулярного стыковки
3D-структурные файлы (формат MOL2) десяти активных компонентов, ранжированных по целевой связности в сети «лекарство–компонент–цель–заболевание», были скачаны из базы данных TCMSP. Целевая связность определялась как степень узла (то есть количество прямых связей между активным компонентом и целевой генами в сети). Активные компоненты ранжировались в порядке убывания по значениям градусов, а топ-10 компонентов были выбраны для анализа молекулярного стыковки.
Кристаллические структуры топ-10 белков-мишеней, выявленных из сети PPI, были получены из Банка данных белков RCSB (PDB) 23 января 2026 года. Вид был ограничен Homo sapiens. Для каждого целевого белка предпочтительно выбиралась структура с самым высоким кристаллографическим разрешением (наименьшее значение Å), без мутаций и кокристаллизировавшейся с нативным лигандом или ингитором. Если несколько структур соответствовали этим критериям, выбиралась структура с самым высоким разрешением и полным покрытием белковых последовательностей. Использовались следующие структуры PDB: 1GKC (MMP9), 5WHH (BCL2), 2P33 (JUN), 1RHJ (CASP3), 1WT5 (EGFR), 7APJ (AKT1), 1DU3 (TNF), 1T4Q (IL1B), 4NI9 (IL6) и 9CKJ (TP53).
Симуляции молекулярного стыковки проводились с использованием онлайн-сервера CB-Dock 2 (веб-версия, доступ 23 января 2026 года), который использует AutoDock Vina в качестве стыковочного движка. Белковые структуры автоматически предварительно обрабатывались сервером, включая удаление гетероатомов и подготовку рецепторных структур. Лиганды загружались в формате MOL2. Использовалось обнаружение резонаторов, независимых от шаблона, при этом для каждой структуры белка автоматически определялись пять потенциальных связующих полости. Расчёты стыковки выполнялись с использованием стандартных параметров стыковочного двигателя: исчерпывающая мощность = 8, энергетический диапазон = 4 и максимальное количество режимов связки = 9.
Для каждой пары мишень–соединение стыковка выполнялась независимо внутри каждой из пяти обнаруженных полости. Позы стыковки оценивались с помощью функции оценки стыковочного двигателя, и поза с наименьшей энергией связи в каждой полости сохранялась как представительная конформация для этой полости. Из пяти представительных конформаций была выбрана поза стыковки с глобально самой низкой энергией связывания в качестве итогового результата стыковки для этой пары мишень–соединение и использована для последующих анализов.
Минимальное значение энергии связывания, полученное для каждого результата стыковки, фиксировалось в таблице и импортировалось в онлайн-платформу Weishengxin (доступ 23 января 2026 года) для создания тепловой карты с использованием стандартных параметров. Тепловая карта использовала цветовой градиент от жёлтого к красному, иерархическую кластеризацию по полным связям и евклидово расстояние в качестве метрики кластеризации.
Взаимодействия водородных связей автоматически идентифицировались модулем анализа сервера стыковки на основе геометрических критериев. Водородная связь определялась как взаимодействие с расстоянием донор–акцептор ≤ 3,5 Å и углом донор–водород–акцептор ≥ 120°. Водородные связи отображались пунктирными линиями как в двумерных, так и в трёхмерных диаграммах взаимодействия. Для детального анализа взаимодействия была выбрана целевой пара белок — активный компонент с глобально самой низкой энергией связи среди всех комбинаций стыковки. Этот отбор основывался на одной паре мишень–соединение, а не на индивидуальной позе стыковки, и был предназначен для выявления наиболее сильного прогнозируемого взаимодействия внутри сети. Для визуализации и анализа взаимодействия использовалась окончательная представительная поза стыковки, соответствующая этой паре мишень–соединение.
Трёхмерные и двумерные диаграммы взаимодействия были сгенерированы с использованием версий ChimeraX 1.5 и версии LigPlot+ 2.2 соответственно. В ChimeraX белки отображались с использованием стандартного мультяшного изображения, лиганды — в режиме стика, водородные связи — пунктирными линиями, а цветовая схема по умолчанию применялась. В LigPlot+ идентификация водородной связи проводилась с помощью алгоритма HBPLUS с порогом расстояния донор–акцептор 3,9 Å и пороговым углом 90°. Все остальные параметры визуализации остались на стандартных настройках.