Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Модификация Rab27A на основе N6-метиладенозина способствует остеопорозу, влияя на дифференцировку остеокластов в модели овариэктомизированной мыши

88 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71964

⸱

11 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 2Department of Orthopedics, The People's Hospital of Pengzhou, 3Department of Clinical Skills Center, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 4Southwest Medical University, 5Stem Cell Immunity and Regeneration Key Laboratory of Luzhou, Affiliated Hospital of Southwest Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

YTHDC1 способствует цитоплазматическому экспорту M6A-модифицированного Rab27A, тогда как IGF2BP2 стабилизирует Rab27A в цитоплазме, тем самым усиливая дифференцировку остеокластов и способствуя остеопорозу.

Аннотация

Разработка новых методов лечения остеопороза привлекает всё большее внимание. Rab27A повышается во время дифференцировки остеокластов, и модификация N6-метиладенозина (m6A) стала важным эпигенетическим регулятором в ортопедических заболеваниях. Биоинформатические анализы предсказали, что Rab27A содержит несколько сайтов модификации m6A и взаимодействует с несколькими белками, ассоциированными с m6A. Были проведены эксперименты с нокдауном для оценки роли Rab27A в дифференциации остеокластов и остеопорозе с использованием овариэктомизированной (OVX) мышиной модели. Истощение Rab27A ослабило остеопороз и увеличило процент образования костей с 14,73% до 28,13% (P < 0,05) у мышей OVX. Вестерн блоттинг и количественное ПЦР показали, что нокдаун Rab27A снижает экспрессию белков и мРНК маркеров остеокластов TRAP, NFATc1 и c-FOS, тем самым подавляя дифференциацию остеокластов макрофагов, полученных из костного мозга (BMM), индуцированных макрофагами, стимулирующими колонии (M-CSF) и активатором рецепторов лиганда ядерного фактора κB (RANKL). Окрашивание TRAP также показало, что истощение Rab27A значительно снижало активность TRAP с 24,1% до 12,9% (P < 0,01) после индукции M-CSF и RANKL. Иммунопреципитационные анализы РНК подтвердили взаимодействия между Rab27A и белками-ридерами m6A YTHDC1 и IGF2BP2. Ядерное и цитоплазматическое фракционирование показало, что YTHDC1 способствует цитоплазматическому экспорту M6A-модифицированного Rab27A. Кроме того, анализы q-PCR и western blot показали, что снижение YTHDC1 или IGF2BP2 снижает экспрессию Rab27A и снижает экспрессию TRAP, NFATc1 и c-FOS, тем самым подавляя дифференцировку остеокластов, вызванную M-CSF и RANKL. В совокупности эти результаты показывают, что экспорт цитоплазматыки, опосредованный YTHDC1, и стабилизация IGF2BP2-опосредованной M6A-модифицированного Rab27A способствуют дифференцировки остеокластов и способствуют потере костной ткани в модели мышей OVX.

Введение

Остеопороз (ОП) — это распространённое скелетное заболевание, характеризующееся ухудшением микроархитектуры костей и снижением минеральной плотности костей, что приводит к повышенному риску переломов вовсём мире 1,2,3. Остеопоротические переломы чаще всего встречаются в предплечье, плечевой кости, бедре и позвоночнике и особенно распространены среди пожилых людей. Эти переломы существенно ухудшают качество жизни и накладывают значительные физические, психологические и социально-экономические нагрузки на пациентов, их семьи и системыздравоохранения 3. Таким образом, профилактика, лечение и лечение остеопороза остаются основными приоритетами в области клинической и общественной общественной сферы.

Разработано множество терапевтических стратегий для остеопороза, которые обычно можно классифицировать на две категории: костнообразующие средства и антиресорбционныетерапии 4,5. Традиционные антиресорбные препараты включают бисфосфонаты, ралоксифен и стронций ранелат, тогда как более новые препараты включают деносумаб, оданакатиб и саракатиниб. Терапии, формирующие кости, включают паратиреоидный гормон (PTH 1–84), а несколько дополнительных кандидатов, таких как MK-5442, AMG 785 и BHQ 880, находятся в стадии клиническойразработки 5. Хотя эти методы могут быть эффективными, многие из них связаны со значительными побочными эффектами, ограниченной долгосрочной эффективностью или ограничениями длительногоприменения 4,6,7,8,9. Например, длительное введение аминобисфосфонатов и деносумаба может ухудшить нормальное ремоделированиекостей 5. Поэтому выявление более безопасных и эффективных терапевтических целей остаётся важной задачей в исследованиях остеопороза.

Белки Rab являются ключевыми регуляторами внутриклеточного движения везикул и клеточной сигнализации, участвуя в различных биологических процессах, включая вирусные инфекции, аутофагию и организациюцитоскелета 10. В последние годы всё больше внимания уделяется роли белков семейства Rab в метаболизме костей и остеопорозе. Сообщается, что Rab44 регулирует дифференциацию остеокластов, модулируя внутриклеточную сигнализацию Ca2⁺ и активируя ядерный фактор активированных Т-клеток 1 (NFATc1) в рецепторном активаторе макрофагов с ядерным фактором κB (RANKL), обработанного с помощьюмакрофагов 11. Остеокласты — это многоядерные клетки, происходящие из предшественников линии макрофагов, которые играют важную роль в резорбции костей и скелетном гомеостазе 12,13,14,15,16,17,18,19. Поэтому понимание молекулярных механизмов, управляющих дифференциацией остеокластов, крайне важно для разработки новых терапевтических подходов при остеопорозе.

Rab27A является важным представителем семейства Rab GTPase и широко экспрессируется в секреторных и иммунных клетках. Он играет ключевую роль в транспорте везикул, экзоцитозе и внутриклеточной сигнализации 20,21,22,23,24,25,26,27. Предыдущие исследования показали, что Rab27A регулирует дегрануляцию эозинофилов при воспалении дыхательных путей и контролирует везикулярную мобилизацию, связанную с активностью оксидазы NADPH у активированныхмакрофагов 20.23. Примечательно, что накопленные данные свидетельствуют о значительном повышении экспрессии Rab27A во время дифференцировки остеокластов. Шимада-Сугавара и др. сообщили, что экспрессия Rab27A увеличивается во время дифференцировки макрофагов, полученных из костного мозга (BMM), в остеокласты, что указывает на потенциальную роль востеокластогенезе 28. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что Rab27A может влиять на формирование и функцию остеокластов, регулируя везикулярную транспортировку и внутриклеточные сигнальныепути 28,29.

N6-метиладенозин (m6A) является самой распространённой внутренней модификацией РНК в эукариотических мессенджерных РНК и некодирующих РНК и служит важным регулятором метаболизма РНК и экспрессии генов. Будучи первой выявленной модификацией мРНК у млекопитающих, m6A участвовал во множестве биологических процессов, включая стабильность РНК, сплайсинг, транспорт и трансляцию. Ванг и др. показали, что модификации m6A, часто встречающиеся в консервативных последовательностях мотивов, распознаются белками, содержащими домен YTH, и способствуют регуляции стабильности и метаболизмамРНК 30. Кроме того, модификация m6A участвует в различных биологических функциях, включая стабильность генома, регуляцию транскрипции, организацию хроматина, прогрессирование рака и иммунныеответы 31. Недавние исследования также подчеркнули важную роль сигнализации m6A при костных заболеваниях иостеопорозе 32.

Среди белков, считывающих m6A, YTHDC1 выполняет функции ядерного считывателя, регулирующего обработку РНК и ядерный экспорт, тогда как инсулиноподобный фактор роста 2, мРНК-связывающий белок 2 (IGF2BP2), стабилизирует m6A-модифицированные транскрипты в цитоплазме. Чен и др. показали, что YTHDC1 способствует ядерному экспорту m6A-модифицированного circNSUN2, который затем взаимодействует с IGF2BP2 для стабилизации мРНК HMGA2 и стимулирования метастазирования колоректального рака33. Эти результаты свидетельствуют о том, что координированная регуляция YTHDC1 и IGF2BP2 может представлять собой общий механизм, контролирующий судьбу транскриптов, модифицированных m6A.

В данном исследовании рассматривались предсказаемые участки модификации m6A в мРНК Rab27A и изучены их взаимодействия с YTHDC1 и IGF2BP2. Было установлено, что YTHDC1 способствует ядерному экспорту транскриптов Rab27A, модифицированных m6A, тогда как IGF2BP2 взаимодействует с Rab27A в цитоплазме и повышает его стабильность. Благодаря этому регуляторному механизму Rab27A способствовал дифференцированию остеокластов и способствовал прогрессированию остеопороза. В совокупности результаты выявляют ранее не распознанный m6A-зависимый регуляторный путь, включающий YTHDC1, IGF2BP2 и Rab27A в дифференциации остеокластов. Эти результаты дают новые знания о молекулярном патогенезе остеопороза и могут способствовать разработке новых терапевтических стратегий, направленных на регуляцию Rab27A, опосредованную m6A.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по защите и использованию животных аффилированной больницы Юго-Западного медицинского университета (Одобрение No 2024-Ethics-042). Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами ARRIVE, Законом Великобритании о животных (научные процедуры) 1986 года и соответствующими рекомендациями, Директивой ЕС 2010/63/EU и Руководством Национальных институтов здоровья по уходу и использованию лабораторных животных (публикация NIH No 8023, пересмотренная 1978 год). Мыши случайным образом распределялись по экспериментальным группам, а последовательность распределения была скрыта от исследователя. Все сборы и анализ данных, включая гистологическую оценку, микрокомпьютерную томографию (микро-КТ) и статистический анализ, проводились исследователями, не обращая внимания на распределение групп. Из анализа не было исключено ни животные, ни образцы. Все реагенты, оборудование, программное обеспечение и другие ресурсы, используемые в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов.

1. Построение модели овариэктомии (OVX)

Для создания модели остеопороза использовали двадцать четыре мыши дикого типа C57BL/6 в возрасте 8 недель. После 1-недельного периода акклиматизации мышей случайным образом распределяли либо в группу Sham, либо OVX. Модель OVX была установлена с помощью двусторонней овариэктомии, как описаноранее 34,35. Мыши, оперированные с имитацией, подверглись хирургическому воздействию яичников без удаления.

Для внутрибедренной доставки лентивирусных векторов, экспрессирующих sh-Rab27A или sh-NC, были введены через 7 дней после операции OVX, как ранеесообщалось 36,37. Кратко, концентрированные лентивирусные частицы (1 × 106 трансдукционных единиц/мл) вводились в бедренную кость через надколенник с помощью 22-гейджной иглы под анестезией. Каждая мышь получала 20 мкл лентивирусной суспензии. Затем разрез был зашит, а животные находились под наблюдением на протяжении всего восстановления.

Все эксперименты на животных проводились в определённых условиях, свободных от патогенов. Образцы бедренной кости были собраны через 8 недель после операции. Для гистологического анализа и экстракции РНК или белка использовалось не менее шести мышей в группе.

2. Микро-КТ в организме

Для оценки морфологии трабекулярной кости была проведена микрокомпьютерная томография (микро-КТ). Правая большеберцовая кость каждой мыши была сканирована in vivo перед операцией OVX в возрасте 14 недель. Повторные обследования проводились еженедельно до 22 недель. В микро-КТ-анализ было включено не менее шести мышей в группу.

Мышей анестезиировали внутрибрюшническим раствором пентобарбитала натрия (50 мг/кг массы тела). Адекватная анестезия подтверждалась отсутствием рефлекса сжатия пальцев и постоянным контролем частоты дыхания, которая сохранялась на протяжении всей процедуры визуализации. Все процедуры эвтаназии проводились в соответствии с утверждённым протоколом для животных, институциональными рекомендациями по благополучию животных и национальными правилами эвтаназии лабораторных животных.

В возрасте 24 недель мышей эвтаназировали путем вывиха шейки матки после глубокой анестезии, а обе большеберцовые кости были взяты для ex vivo сканирования с использованием того же протокола визуализации. Параметры сканирования включали размер вокселей 10,4 мкм, напряжение 55 кВ, ток 145 мА, поле зрения 32 мм, 1500/750 образцов на проекцию и время интеграции 100 мс.

Изображения обрабатывались с использованием алгоритма коррекции полимерного усиления пучка третьего порядка, калиброванного против фантома 1200 мг HA/см³ 3 . Фракция костного объёма (BV/TV), толщина трабекуляров (Tb.Th) и трабекулярное число (Tb.N) были количественно измерены в дистальной бедренной метафизе, расположенной в 1,0 мм проксимально от пластины роста.

3. Плазмидная трансфекция

Плазмиды sh-Rab27A и sh-NC были созданы и использованы для производства лентивирусов. Лентивирусные упаковочные плазмиды и шРНК-конструкции были котрансфектированы в HEK293T клетки согласно инструкциям производителя. Титры вируса определялись до внутрибедренного введения, как было описаноранее 36. Были проведены три независимые биологические реплики.

4. Окрашивание гематоксилином и эозином (HE)

Бедренные образцы фиксировались в 4% параформальдегида в течение 24 часов, декальцифицированы в 10% ЭДТА в течение 4 недель, криопротектированы 30% сахарозой/PBS, вложены в парафин и секциированы толщиной 5 мкм. Срезы ткани были окрашены гематоксилином и эозином и исследованы под световым микроскопом. В каждой группе было проанализировано не менее шести мышей.

5. Окрашивание кислотной фосфатазы, устойчивой к тартратам (TRAP)

Окрашивание бедренных срезов с помощью TRAP проводилось согласно инструкции производителя38. Активность TRAP в макрофагах костного мозга (BMM) была оценена с помощью окрашивающего теста TRAP. Зрелые остеокласты были определены как TRAP-положительные многоядерные клетки, содержащие не менее трёх ядер. Были проведены три независимые биологические реплики, каждая с тремя техническими репликами.

6. q-PCR

Общая РНК была выделена с помощью реагента TRIzol согласно инструкциям производителя. Комплементарная ДНК была синтезирована с помощью обратной транскриптазы и подвергнута количественной ПЦР в реальном времени с использованием химии SYBR Green. Были проведены три независимые биологические реплики, каждая с тремя техническими репликами.

Последовательности праймеров были следующими:

Rab27A: F, TTCCTGCTTCTGTTCGACCT; R, GGCAGCACTGGTTTCAAAT

TRAP: F, TGTTGACAGCGGTCCATCTA; R, CCTCCTTCTTAACCCGAAGC

NFATc1: F, GGTGCTCTCTGGCCATAACT; R, GCGGAAAGGTGTGTATCTCAA

c-FOS: F, TACTACCATTCCCCAGCCGA; R, GCTGTCACCGTGGGGATAAA

YTHDC1: F, GAAGTGGAAGCTCTGCATCAG; R, TTGATCTTTTCGGACAGCACG

IGF2BP2: F, GACTACCCCGACCAGAACTG; R, GAGGCGGGGGGTTCCGAATC

β-актин: F, GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG; R, TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG

7. Вестерн-блоттинг

Клетки или ткани лизировали с помощью буфера RIPA с дополнением ингибиторов протеаз. Концентрации белка определялись с помощью брадфордского анализа. Равные количества белка (20 мкг) отделялись SDS-PAGE и переносились на мембраны поливинилиденфторида (PVDF) или нитроцеллюлозы. Мембраны блокировались 5% обезжиренным молоком в течение 1 часа при комнатной температуре и инкубировали ночью при 4 °C первичными антителами против TRAP, NFATc1, c-FOS, Rab27A, YTHDC1, IGF2BP2 или β-актина. После промывки мембраны инкубировали соответствующими вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре. Белковые диапазоны визуализировались с использованием стандартных процедур обнаружения. Были проведены три независимые биологические реплики.

8. Клеточная культура

Макрофаги, полученные из костного мозга (BMM), были выделены, как описаноранее 39. Клетки костного мозга, взятые с бедренных мышей, были выращены за ночь в α минимально необходимой среде с добавлением сыворотки плода с 10% плодовой сывороткой, 30 нг/мл макрофага, колонистимулирующего фактор (M-CSF) и 1% пенициллина/стрептомицина при 37 °C в увлажнённой атмосфере с содержанием 5% CO₂. Неадгерентные клетки были собраны и культивированы в стромально-свободной клеточной системе с содержанием 30 нг/мл M-CSF. Через 3 дня адгерирующие клетки были собраны в виде BMM и дополнительно культивировались в присутствии активатора рецепторов с концентрацией 30 нг/мл M-CSF и 50 нг/мл рецепторов ядерного фактора-κB лиганда (RANKL) в течение 72 часов для индуцирования дифференцировки остеокластов.

9. Интерференция РНК (РНКи)

Малые интерферирующие РНК (siRNA) синтезировались и трансфектировались с помощью липидного трансфекционного реагента согласно инструкциям производителя. Клетки засеивались с плотностью 2 × 104 клеток на каждую скважину в пластинах с шестью колодцями до трансфекции. Были проведены три независимые биологические реплики.

Целевые последовательности были следующими:

si-Rab27A: GGACUUAAUCAUCTAAGAAUGGAA

si-YTHDC1: GCAAGGAGUGUUAUAUCUUAATT

si-IGF2BP2: CCGUUAACCAACAAGCCAATT

10. Иммунофлуоресценция

Клетки фиксировались с помощью 4% параформальдегида в течение 20 минут и проницаемы с помощью 0,1% тритона X-100 в течение 10 минут. После блокировки 5% бычьей сывороткой альбумина в течение 30 минут клетки инкубировали с первичными антителами ночью при 4 °C.

После стирки на 30 минут при комнатной температуре применялись вторичные антитела, конъюгированные с фторофором. Ядра были контрокрашены DAPI, а изображения получены с помощью конфокальной микроскопии. Были проведены три независимые биологические реплики.

11. Ядерное и цитоплазматическое разделение

Ядерные и цитоплазматические фракции были выделены согласно инструкциям производителя. Клетки лизировали на льду в течение 10 минут и центрифугировали при 500 × г в течение 3 минут при 4 °C. Супернатант, содержащий цитоплазматические компоненты, был собран, а ядра с гранулами промывались и обрабатывались отдельно.

12. Иммунопреципитация белков, связывающих РНК (RIP)

Иммунопреципитационные анализы РНК (RIP) проводились согласно инструкциям производителя. Кратковременно клетки находились на льду в течение 30 минут. После центрифугирования супернатанты инкубировали за ночь с помощью антител и агарозных шариков белка A/G. После промывания иммунопреципитанные белки анализировались методом западного блоттинга, а коиммунопреципитанная РНК — с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Были проведены три независимые биологические реплики.

13. Анализ стабильности мРНК Rab27A

Общая РНК была извлечена в указанные моменты времени после IGF2BP2 нокдауна. Впоследствии были проведены обратная транскрипция и количественная ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК Rab27A были нормализованы до соответствующей группы si-NC в 0 часа. Были проведены три независимые биологические реплики.

14. Статистический анализ

Все эксперименты проводились независимо с использованием как минимум трёх биологических репликат. Для q-PCR, РНК-интерференции, TRAP-окрашивания, западного блотинга и других клеточных анализов каждая биологическая реплика включала три технических реплики, если не указано иное. Данные представлены как среднее ± стандартного отклонения (SD).

Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 9.0 и SPSS. Сравнения между двумя группами проводились с помощью двухстороннего t-теста Student. Сравнения между несколькими группами анализировались с помощью двустороннего анализа дисперсии (ANOVA), а затем последовал пост-хок тест Тьюки с множественным сравнением для корректировки множественных сравнений. Значение P < 0,05 считалось статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Снижение Rab27A снизило остеопороз in vivo.

Для изучения роли Rab27A в остеопорозе был проведен knockdown Rab27A на овариэктомизированной (OVX) мышиной модели, установленной с использованием ранее описанныхметодов 34,40. Общий дизайн исследования изложен на рисунке 1. Микрокомпьютерная томография показала, что у мышей OVX минеральная плотность, об...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Дифференциация остеокластов играет важную роль в ремоделировании костей, резорбции костей, восстановлении переломов и гомеостазескелета 12˒15˒17˒18˒42˒43. Чрезмерная активность остеокластов является одним из основных факторов остеопороза, что делает выявление регуляторных путей, контролирующих дифференцировку остеокластов, важной целью исследован...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих финансовых интересах или конфликтах интересов.

Благодарности

Эта работа была финансово поддержана Научно-технологическим стратегическим проектом сотрудничества между Пэнчжоуской народной больницей и Юго-Западным медицинским университетом (грант No 2023PZXNYD01) Лян Тан.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4% ParaformaldehydeThermo Fisher ScientificA5818101Tissue and cell fixation
Alexa Fluor 488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11001Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534069
Alexa Fluor 546 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11035Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534093
Bovine serum albumin (BSA)MerckA2153Blocking reagent
Bradford Protein AssayMerckB6916Protein quantification
C57BL/6JSlac miceShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.—Female, 8 weeks old; RRID: MGI:2159769
c-FOS antibodyAbcamab222699Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2891049
Confocal laser scanning microscope (SP8)Leica MicrosystemsSP8Immunofluorescence image acquisition; RRID: SCR_018169
DAPIThermo Fisher ScientificD3571Nuclear counterstain for immunofluorescence; RRID: AB_2307445
EDTAMerckV900081-500GTissue decalcification reagent
EosinSolarbioG1100Histological cytoplasmic stain
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5669701Cell culture supplement
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0Statistical analysis software; RRID: SCR_002798
HematoxylinCell Signaling Technology#14166Histological nuclear stain
IBM SPSS StatisticsIBMWindows versionStatistical analysis software; RRID: SCR_016479
IGF2BP2 antibodyProteintech11601-1-APPrimary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_2122672
Inverted light microscope (DMi8)Leica MicrosystemsDMi8Histological image acquisition; RRID: SCR_026672
Lentiviral titer quantification kitTakara Bio631235Lentiviral titer determination
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Plasmid transfection reagent
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150siRNA transfection reagent
M-CSFMedChemExpressHY-P7085Osteoclast differentiation factor
Micro-computed tomography systemScanco MedicalVivaCT80Bone morphometric analysis
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1701cDNA synthesis
NFATc1 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7294Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2152503
PARIS KitThermo Fisher ScientificAM1556Nuclear and cytoplasmic fractionation
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Antibiotic supplement for cell culture
Power SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4367659Quantitative real-time PCR
Protease inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific78429Prevention of protein degradation
Protein A/G agarose beadsMerckIP05Immunoprecipitation
PVDF membraneThermo Fisher Scientific88520Protein transfer membrane for western blotting
Rab27A antibodyAbcamab55667Primary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_945112
RANKLMedChemExpressHY-P7425Osteoclast differentiation factor
Real-time PCR systemApplied BiosystemsABI7900HTQuantitative real-time PCR instrument
RIPA bufferThermo Fisher Scientific78501Protein extraction buffer
RNA Immunoprecipitation (RIP) KitMilliporeRIP-12RXNRNA immunoprecipitation assay
SDS-PAGE reagentsThermo Fisher ScientificBT041210BOXProtein electrophoresis
shRNA plasmidsRiboBio—Gene silencing by RNA interference
Small interfering RNAs (siRNAs)GenePharma—Gene silencing by RNA interference
SRAMPOnline resource—Prediction of m6A modification sites; RRID: SCR_024500
StarBase (ENCORI)Online resource—RNA interaction prediction database; RRID: SCR_016303
TRAP antibodyAbcamab2391Primary antibody for western blotting; RRID: AB_303034
TRAP staining kitMerck387ADetection of osteoclast activity
Triton X-100Thermo Fisher Scientific85111Cell permeabilization reagent
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026CNTotal RNA isolation
YTHDC1 antibodyAbcamab122340Primary antibody for western blotting; RRID: AB_11128253
α-MEMFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation139-15651Cell culture medium
β-Actin antibodyMerckA5441Loading control for western blotting; RRID: AB_476744

Ссылки

  1. Kanis JA. Assessment of fracture risk and its application to screening for postmenopausal osteoporosis: synopsis of a WHO report. WHO Study Group. Osteoporos Int. 1994;4(6):368-81.
  2. Leslie WD, Morin SN. Osteoporosis epidemiology 2013: implications for diagnosis, risk assessment, and treatment. Curr Opin Rheumatol. 2014;26(4):440-6.
  3. Chen P, Li Z, Hu Y. Prevalence of osteoporosis in China: a meta-analysis and systematic review. BMC Public Health. 2016;16(1):1039. doi: 10.1186/s12889-016-3712-7.
  4. Sambrook P, Cooper C. Osteoporosis. Lancet. 2006;367(9527):2010-8.
  5. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC. Osteoporosis: now and the future. Lancet. 2011;377(9773):1276-87.
  6. Bone HG, et al. 10 years of denosumab treatment in postmenopausal women with osteoporosis: results from the phase 3 randomised FREEDOM trial and open-label extension. Lancet Diabetes Endocrinol. 2017;5(7):513-23.
  7. Siris ES, et al. Impact of osteoporosis treatment adherence on fracture rates in North America and Europe. Am J Med. 2009;122(2 Suppl):S3-13.
  8. Cheung EYN, Tan KCB, Cheung CL, Kung AWC. Osteoporosis in East Asia: Current issues in assessment and management. Osteoporos Sarcopenia. 2016;2(3):118-33.
  9. Kohno N, et al. Zoledronic acid significantly reduces skeletal complications compared with placebo in Japanese women with bone metastases from breast cancer: a randomized, placebo-controlled trial. J Clin Oncol. 2005;23(15):3314-21.
  10. Stenmark H. Rab GTPases as coordinators of vesicle traffic. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009;10(8):513-25.
  11. Yamaguchi Y, et al. Rab44, a novel large Rab GTPase, negatively regulates osteoclast differentiation by modulating intracellular calcium levels followed by NFATc1 activation. Cell Mol Life Sci. 2018;75(1):33-48.
  12. Xiang Q, et al. Beyond resorption: osteoclasts as drivers of bone formation. Cell Regen. 2024;13(1):22. doi: 10.1186/s13619-024-00205-0.
  13. Teitelbaum SL. Bone resorption by osteoclasts. Science. 2000;289(5484):1504-8.
  14. Suda T, Takahashi N, Martin TJ. Modulation of osteoclast differentiation. Endocr Rev. 1992;13(1):66-80.
  15. Durdan MM, Azaria RD, Weivoda MM. Novel insights into the coupling of osteoclasts and resorption to bone formation. Semin Cell Dev Biol. 2022;123:4-13.
  16. Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 2003;423(6937):337-42.
  17. Tosun B, et al. Osteoclasts and Macrophages-Their Role in Bone Marrow Cavity Formation During Mouse Embryonic Development. J Bone Miner Res. 2022;37(9):1761-74.
  18. Xie H, et al. PDGF-BB secreted by preosteoclasts induces angiogenesis during coupling with osteogenesis. Nat Med. 2014;20(11):1270-8.
  19. Hattner R, Epker BN, Frost HM. Suggested sequential mode of control of changes in cell behaviour in adult bone remodelling. Nature. 1965;206(983):489-90.
  20. Kim JD, et al. An essential role for Rab27a GTPase in eosinophil exocytosis. J Leukoc Biol. 2013;94(6):1265-74.
  21. Goishi K, Mizuno K, Nakanishi H, Sasaki T. Involvement of Rab27 in antigen-induced histamine release from rat basophilic leukemia 2H3 cells. Biochem Biophys Res Commun. 2004;324(1):294-301.
  22. Johnson JL, et al. Munc13-4 restricts motility of Rab27a-expressing vesicles to facilitate lipopolysaccharide-induced priming of exocytosis in neutrophils. J Biol Chem. 2011;286(7):5647-56.
  23. Ejlerskov P, et al. NADPH oxidase is internalized by clathrin-coated pits and localizes to a Rab27A/B GTPase-regulated secretory compartment in activated macrophages. J Biol Chem. 2012;287(7):4835-52.
  24. Kariya Y, et al. Rab27a and Rab27b are involved in stimulation-dependent RANKL release from secretory lysosomes in osteoblastic cells. J Bone Miner Res. 2011;26(4):689-703.
  25. Johnson JL, et al. Rab27a and Rab27b regulate neutrophil azurophilic granule exocytosis and NADPH oxidase activity by independent mechanisms. Traffic. 2010;11(4):533-47.
  26. Yokoyama K, et al. Rab27a negatively regulates phagocytosis by prolongation of the actin-coating stage around phagosomes. J Biol Chem. 2011;286(7):5375-82.
  27. Jancic C, et al. Rab27a regulates phagosomal pH and NADPH oxidase recruitment to dendritic cell phagosomes. Nat Cell Biol. 2007;9(4):367-78.
  28. Shimada-Sugawara M, et al. Rab27A regulates transport of cell surface receptors modulating multinucleation and lysosome-related organelles in osteoclasts. Sci Rep. 2015;5:9620. doi: 10.1038/srep09620.
  29. Johnson JL, et al. Vesicular trafficking through cortical actin during exocytosis is regulated by the Rab27a effector JFC1/Slp1 and the RhoA-GTPase-activating protein Gem-interacting protein. Mol Biol Cell. 2012;23(10):1902-16.
  30. Wang X, et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 2014;505(7481):117-20.
  31. Boulias K, Greer EL. Biological roles of adenine methylation in RNA. Nat Rev Genet. 2023;24(3):143-60.
  32. Wu Y, et al. Mettl3-mediated m(6)A RNA methylation regulates the fate of bone marrow mesenchymal stem cells and osteoporosis. Nat Commun. 2018;9(1):4772. doi: 10.1038/s41467-018-06898-4.
  33. Chen RX, et al. N(6)-methyladenosine modification of circNSUN2 facilitates cytoplasmic export and stabilizes HMGA2 to promote colorectal liver metastasis. Nat Commun. 2019;10(1):4695. doi: 10.1038/s41467-019-12651-2.
  34. Wu X, et al. Caffeic acid 3,4-dihydroxy-phenethyl ester suppresses receptor activator of NF-kappaB ligand-induced osteoclastogenesis and prevents ovariectomy-induced bone loss through inhibition of mitogen-activated protein kinase/activator protein 1 and Ca2+-nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1 signaling pathways. J Bone Miner Res. 2012;27(6):1298-308.
  35. Luo J, et al. Regulation of bone formation and remodeling by G-protein-coupled receptor 48. Development. 2009;136(16):2747-56.
  36. Jing H, et al. Epigenetic inhibition of Wnt pathway suppresses osteogenic differentiation of BMSCs during osteoporosis. Cell Death Dis. 2018;9(2):176. doi: 10.1038/s41419-017-0231-0.
  37. Yang C, et al. TET2 regulates osteoclastogenesis by modulating autophagy in OVX-induced bone loss. Autophagy. 2022;18(12):2817-29.
  38. Blumer MJ, et al. Role of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) in long bone development. Mech Dev. 2012;129(5-8):162-76.
  39. Sakai E, et al. Suppression of RANKL-dependent heme oxygenase-1 is required for high mobility group box 1 release and osteoclastogenesis. J Cell Biochem. 2012;113(2):486-98.
  40. Roberts BC, et al. PTH(1-34) treatment and/or mechanical loading have different osteogenic effects on the trabecular and cortical bone in the ovariectomized C57BL/6 mouse. Sci Rep. 2020;10(1):8889. doi: 10.1038/s41598-020-65921-1.
  41. Roundtree IA, et al. YTHDC1 mediates nuclear export of N(6)-methyladenosine methylated mRNAs. Elife. 2017;6. doi: 10.7554/eLife.31311.
  42. Flick LM, et al. Effects of receptor activator of NFkappaB (RANK) signaling blockade on fracture healing. J Orthop Res. 2003;21(4):676-84.
  43. Takeyama K, Chatani M, Takano Y, Kudo A. In-vivo. imaging of the fracture healing in medaka revealed two types of osteoclasts before and after the callus formation by osteoblasts. Dev Biol. 2014;394(2):292-304.
  44. Yamada H, et al. Effects of 16-month treatment with the cathepsin K inhibitor ONO-5334 on bone markers, mineral density, strength and histomorphometry in ovariectomized cynomolgus monkeys. Bone. 2016;86:43-52.
  45. McClung MR, et al. Odanacatib for the treatment of postmenopausal osteoporosis: results of the LOFT multicentre, randomised, double-blind, placebo-controlled trial and LOFT Extension study. Lancet Diabetes Endocrinol. 2019;7(12):899-911.
  46. Tao R, et al. Advances in immune mechanisms and developing immune-targeted therapies for osteoporosis: A systematic review. Pharmacol Res. 2025;218:107835. doi: 10.1016/j.phrs.2025.107835.
  47. Qi Z, Luo J, Xiao Z, Yang D. Functional roles of immune cells in osteoporosis. Front Immunol. 2025;16:1698283. doi: 10.3389/fimmu.2025.1698283.
  48. Krzewski K, Cullinane AR. Evidence for defective Rab GTPase-dependent cargo traffic in immune disorders. Exp Cell Res. 2013;319(15):2360-7.
  49. Adnani L, et al. Immune cell infiltration into brain tumor microenvironment is mediated by Rab27-regulated vascular wall integrity. Sci Adv. 2025;11(21):eadr6940. doi: 10.1126/sciadv.adr6940.
  50. Brauer N, et al. Immunodeficiency with susceptibility to lymphoma with complex genotype affecting energy metabolism (FBP1, ACAD9) and vesicle trafficking (RAB27A). Front Immunol. 2023;14:1151166. doi: 10.3389/fimmu.2023.1151166.
  51. Ramadass M, Catz SD. Molecular mechanisms regulating secretory organelles and endosomes in neutrophils and their implications for inflammation. Immunol Rev. 2016;273(1):249-65.
  52. Menasche G, et al. Mutations in RAB27A cause Griscelli syndrome associated with haemophagocytic syndrome. Nat Genet. 2000;25(2):173-6.
  53. Prashar A, Schnettger L, Bernard EM, Gutierrez MG. Rab GTPases in Immunity and Inflammation. Front Cell Infect Microbiol. 2017;7:435. doi: 10.3389/fcimb.2017.00435.
  54. Stinchcombe JC, et al. Rab27a is required for regulated secretion in cytotoxic T lymphocytes. J Cell Biol. 2001;152(4):825-34.
  55. Catz SD. The role of Rab27a in the regulation of neutrophil function. Cell Microbiol. 2014;16(9):1301-10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Макрофаги костного мозгаокрашивание на TRAPвестерн-блоттингYTHDC1IGF2BP2
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.