Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метафаза ДНК-FISH распространяется, чтобы отличить экстрахромосомную ДНК от однородно окрашенных областей в клетках рака человека

399 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71970

⸱

4 августа 2026 г.

 ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Мы сообщаем о протоколе распространения метафазы ДНК-FISH, который визуально обнаруживает количество и расположение копий локуса внутри генома. Этот подход позволяет разрешать амплификационные состояния с помощью одной клетки, особенно в раковых линиях, содержащих экстрахромосомную ДНК и однородно окрашиваемые области.

Аннотация

Секвенирование целого генома выявляет фокальные амплификации ДНК с разрешением пар оснований, но не может определить, находятся ли амплифицированные последовательности на экстрахромосомной ДНК (экДНК, также известной как двойные минуты) или в хромосомно интегрированных однородно окрашенных областях (HSR). Метафазные спреды флуоресценции ДНК in situ (ДНК-FISH) остаются золотым стандартом для определения этих состояний амплификации при разрешении одной клетки. Здесь мы представляем подробный протокол распространения метафазы ДНК-FISH с использованием человеческих раковых клеточных линий, охватывающий культуру клеток, остановку метафазы, гипотоничное лечение, фиксацию, распространение хромосом, гибридизацию флуоресцентных зондов и флуоресцентную визуализацию. Протокол включает промежуточные этапы контроля качества для подтверждения успешной дисперсии хромосом и оптимизации качества метафазного распространения, делая рабочий процесс доступным для лабораторий без специализированной экспертизы в цитогенетике. Результаты демонстрируют чёткую визуализацию состояний амплификации ecDNA и HSR с помощью специфических локус-зондов и иллюстрируют распространённые технические артефакты, которые могут влиять на интерпретацию. Этот протокол обеспечивает надёжный и воспроизводимый подход к изучению структурной организации амплификации онкогенов в раковых клетках.

Введение

Человеческий геном организован не только по своей последовательности, но и по своей структуре, и изменения в любой последовательности или структуре могут привести краку 1,2,3,4. Амплификация онкогена присутствует примерно в 40% всех опухолей, где способствует её инициации, росту, метастазированию и лекарственнойустойчивости 5. В некоторых случаях амплифицированные онкогены переносятся на экстрахромосомных ДНК (экДНК, также называемых двойными минутами), которые представляют собой круговые самовоспроизводящиеся, двухцепочечные элементы ДНК, находящиеся вне линейныххромосом 6,7,8,9. экДНК — это сотни килобаз до мегабазразмером 10,11. Из-за отсутствия центромеров они асимметрично сегрегируют во время митоза, что приводит к 100+ копий в одном ядре 12,13,14,15,16,17,18. Эта неравномерная сегрегация создаёт вариабельность числа копий между дочерними клетками, что способствует быстрой эволюции опухолей и плохому исходу дляпациентов 17,19.

экДНК существуют в динамической связи с однородно окрашивающимися областями (HSR) (рисунок 1A)8,18. HSR — это фокальные, внутрихромосомные амплификации, которые могут возникать путём реинтеграции экДНК в один локусгенома 8,10,18,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Эти два состояния, ecDNA и HSR, могут взаимоконвертироваться, что показывает, что амплификация онкогенов структурнопластична 24,25,32,33. Это взаимное преобразование имеет терапевтическое значение, поскольку экДНК могут переходить в состояние HSR в присутствиипрепаратов 32,33,34,35,36,37,38. Клетки, проходившие этот переход в состояние HSR, становятся устойчивыми к препарату подтерапевтическим давлением 33. ГСР также, по-видимому, встречаются чаще при злокачественных опухоли, чем при доброкачественныхопухолях 39. Несмотря на клиническую значимость, ни одна из одобренных FDA стратегий не нацелена на состояние HSR, отчасти потому, что методы различия этих амплификационных структур остаются недостаточно используемыми.

Хотя состояния ecDNA и HSR имеют разные клинические последствия, современные методы секвенирования не могут надёжно их различать. Секвенирование целого генома (WGS) теперь идентифицирует усиленные области с разрешением пароснований 40. WGS оказала ценную роль в определении последовательного состава ecDNA и HSR, но за счёт пространственного разрешения. В отличие от традиционных цитогенетических подходов, только WGS не может определить, находится ли амплифицированная последовательность на ecDNA или интегрирована в хромосому в видеHSR 41,42,43. В результате методы, сохраняющие пространственный контекст амплификации, остаются необходимыми для понимания биологии этих различных состояний.

В течение последних 40 лет метафазные спреды флуоресценции ДНК in situ (DNA-FISH) служат золотым стандартом для идентификации и различения состояний амплификации ecDNA иHSR 42,44,45,46. Фактически, ecDNA и HSR впервые были выявлены и охарактеризованы с помощью метафазных цитогенетических анализов 7,47. До широкого распространения флуоресцентных зондов гибридизация in situ проводилась с помощью радиометированных ДНК-зондов, которые также применялись для визуализации ecDNA и HSR48,49. По мере роста популярности WGS метафазные спреды ДНК-FISH стали менее распространёнными. Многие аспекты рабочего процесса разбросаны по цитогенетической литературе, а оптимизированные протоколы обычно сохраняются в отдельных исследовательских группах или цитогенетических лабораториях, которые рассматривают метод как проприетарный50,51. Здесь мы описываем протокол метафазы ДНК-FISH для визуального определения состояния амплификации на уровне одной клетки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры человеческой клеточной культуры проводились в соответствии с институциональными рекомендациями.

1. Остановка клеток в метафазе с помощью колцемида (N-метил-N-деацетил-колхицин)

  1. Начните с примерно 2,0 × 106–2,0 × 107 раковых клеток или других культивируемых клеток. Слишком мало клеток приводит к меньшему метафазному распространению, тогда как слишком много клеток может привести к недостаточной фиксации.
  2. Определить подходящее время инкубации колцемида для экспериментальной системы. Время инкубации влияет на количество полученных метафазных распространений и длину хромосом, а оптимальные условия различаются между типами клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более короткое время инкубации приводит к уменьшению числа клеток, задержанных в метафазе во время сбора. Более длительные инкубационные времена образуют более сконденсированные хромосомы с более короткими рукавами, что усложняет анализ. Для раковых клеточных линий с приблизительным временем удвоения 24 часа инкубационные периоды от 45 минут до ночной обеспечивают подходящие метафазные распространивания. Оптимизируйте время инкубации для клеток с медленным временем удвоения. Обычно достаточно двухчасовой инкубации для получения достаточного количества метафазных спредов с хромосомами, подходящими для анализа.
  3. Рассчитайте количество колцемида, необходимое для достижения конечной концентрации 10 мкл/мл в соответствующей среде клеточной культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте логарифмический рост клеток, проходя или засеивая их не менее чем за 24 часа до остановки метафазы. Обрабатывайте клетки колцемидом, когда культуры достигают слияния 70–90%.
  4. Разведите раствор колцемида 1:1 стерильной ультрачистой водой. Добавьте соответствующее количество в культуру и инкубируете 45 минут, а затем на ночь в инкубаторе клеточной культуры.

2. Собирать клетки

  1. Приготовьте свежий фиксатор Carnoy (метанол 3:1: уксусная кислота). Держите фиксатор на льду на протяжении всего процесса фиксации.
  2. Приготовьте свежий раствор на 0,075 млн кКл и подогрейте его в водяной бане 37 °C.
  3. Соберите клетки в виде гранул и записывайте количество клеток. Используйте это значение для расчёта итогового объёма подвески.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отделяйте клеточные клетки трипсинизацией. Переносите суспензионные элементы непосредственно в центрифугные трубки объемом 15 мл. Утилизировать материалы с колцемидом и колцемидом в соответствии с институциональными рекомендациями по опасным отходам.
  4. Промой клетки PBS.
  5. Аккуратно подвесьте клетки в 10 мл тёплого 0,075 М KCl и аккуратно перемешайте. Такое гипотоническое лечение увеличивает опухлость клеток, позволяя им разрываться и рассеивать хромосомы во время подготовки слайда.
  6. Инкубировать клетки в водяной бане при температуре 37 °C в течение 30 минут.
  7. Медленно добавляйте 2 мл ледяного фиксатива Carnoy's, аккуратно смешивая подвеску инверсией.
  8. Дайте ячейкам постоять 5 минут.
  9. Центрифуга при 500 × г в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
  10. Аккуратно аспирируйте супернатант или удалите его пипеткой.
  11. Медленно добавляйте 10 мл ледяного фиксатива Carnoy's с шагами по 0,5 мл, аккуратно перемешивая после каждого добавления.
  12. Дайте ячейкам стоять 10 минут при RT.
  13. Центрифуга при 650 × г в течение 5 минут на RT.
  14. Повторите шаги 2.10–2.13 дважды
  15. Во время финальной промывки оставляйте клетки подвешенными в фиксаторе Карной.
    ПАУЗА: Сохраняйте фиксированное подвесное суспензирование при −20 °C или немедленно переходите к секции 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов, содержащих менее примерно 3 × 106 клеток, фиксация проводится в микроцентрифугных пробирках объёмом 1,5 мл вместо крупных конических трубок. Уменьшить объёмы 0,075 млн кКл и фиксатив Карноя в 10 раз, сохраняя все времена инкубации, температуры и условия центрифуга.

3. Падение на стол

  1. Возьмите образец при температуре −20 °C и разморозите его до RT.
  2. Центрифуга при 800 × г в течение 7 минут на RT.
  3. Маркируйте стеклянные слайды и положите их на лёд.
  4. Используя количество ячеек, полученное до фиксации, рассчитайте объём фиксатива Карноя, необходимого для повторного суспензирования гранулы при конечной концентрации примерно 5 ×10 6 клеток/мл. После центрифугирования аккуратно удалите супернатант пипеткой, оставляя рассчитанный объём фиксатива над гранулой.
  5. Подвесьте фиксированные клетки фиксатива Карной с помощью пипетки P1000.
  6. Перенесите примерно 300 мкл фиксированной ячеточной суспензии в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
  7. Тщательно повторно подвесьте образец с помощью пипетки P200, несколько раз поднимаясь и опускаем.
  8. Аспирировать 60 мкл ресуспендированных ячеек с помощью пипетки P200.
  9. Держите кончик пипетки примерно на 1 метр над стеклянной горкой на льду и целитесь в центр затвора.
  10. Медленно капите одну каплю подвески ячейки на затвор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отметьте место падения на краю затвора маркером, устойчивым к этанолу, чтобы облегчить идентификацию на последующих этапах.
  11. Дайте клеткам подсохнуть на льду в течение 10 минут.
  12. Поставьте слайды на инкубатор при 80 °C на 10 минут.
  13. Снимите слайды щипцами и дайте им остыть на ощупь.
  14. Осмотрите стекла с помощью фазово-контрастного микроскопа с объективом 10× или 20×. Подтвердить наличие нескольких хорошо распределённых метафазных сбросов без чрезмерного перекрытия.

4. Предварительно обработайте горку

  1. Подготовьте банки Coplin для этапов стирки
    1. Приготовьте каждый реагент свежим: 70% уксусной кислоты (40 мл), PBS (40 мл), PBS (45 мл), 70% этанола (40 мл), 85% этанола (40 мл) и 100% этанола (40 мл).
  2. Поместите стеклянные слайды в 70% уксусной кислоты на 2 минуты.
  3. Поместите стеклянные слайды в 40 мл PBS на 30 секунд.
  4. Поместите стеклянные стекли в 45 мл PBS на 5 минут.
  5. Обезвоживайте стекло последовательно с 70%, 85% и 100% этанолом по 1 минуте каждая.
  6. Сушите стекли на воздухе на RT в течение 10 минут.

5. Подготовьте зонд

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует коммерчески доступные локус-специфические зонды DNA-FISH, которые гибридизируются с интересующей геномной областью.

  1. Выберите зонд, направленный на усиленный локус для исследования. Разморозьте зонд и буфер для гибридизации согласно инструкциям производителя. Позвольте зонду достичь RT перед использованием.
  2. Подготовьте смесь зонда, содержащая 1 мкл зонда и 4 мкл буфера для гибридизации для каждого стеклянного стекла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: оптимальная концентрация зонда может зависеть от производителя и самого датчика. Концентрация, указанная здесь, была оптимизирована в соответствии с использованными в этом исследовании зондами. Однако оптимизируйте концентрацию зонда для каждого нового локуса.
  3. Нанесите 5 мкл буферной смеси зонда/гибридизации в центр каждого места капли на стеклянном затворе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зонды чувствительны к свету. Минимизируйте освещение на протяжении всей оставшейся процедуры, храня слайды в тёмном ящике между этапами и во время обработки других слайдов.
  4. Аккуратно положите на образец накладку.
  5. Запечатайте края накладки резиновым цементом.
  6. Поместите стеклянные затворы в влажную камеру.
  7. Гибридизуйте зонд согласно протоколу производителя. Позволить гибридизации пройти ночью (12–18 часов).

6. Промывки после гибридизации, контрокрашивание, монтаж и визуализация

  1. Подготовьте банки Coplin для этапов стирки
    1. Подготовьте каждый реагент свежим: 2× SSC (40 мл), 0,4× SSC (40 мл), 70% этанол (40 мл), 85% этанол (40 мл), 100% этанол (40 мл) и PBS (45 мл).
    2. Подготовьте и храните SSC в виде раствора 20× запаса (3 млн NaCl, 0,3 млн цитрат натрия, pH 7,0). Для приготовления 1 л растворите 175,3 г NaCl и 88,2 г цитра натрия в 1 л сверхчистой воды. Разбавьте запас, чтобы подготовить рабочие решения 2× SSC и 0,4× SSC по мере необходимости.
  2. Подогрейте раствор 0,4× SSC до 72 °C в водяной бане.
  3. Вынимите стеклянные затворы из влажной камеры и аккуратно уберите резиновый цемент.
  4. Поставьте стеклянные стекли в 2× SSC на 2 минуты в RT. Аккуратно снимите защиты.
  5. Поставьте стеклянные стекли в предварительно подогреный 0,4× SSC при 72 °C на 2 минуты.
  6. Поставьте стеклянные стекли в 2× SSC на 1 минуту в RT.
  7. Обезвоживайте стекло последовательно с 70%, 85% и 100% этанолом по 1 минуте каждая.
  8. Сушите стекли на воздухе в RT в течение 10 минут в темноте.
  9. Разбавить 1 мг/мл DAPI 1:1000 в PBS до конечного объёма 1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот аликвот можно хранить при 4 °C до 1 недели.
  10. Пипетка 10 мкл разбавленной DAPI на каждый стеклянный слайд в отмеченном месте падения.
  11. Аккуратно нанесите накладку на образец, чтобы раствор DAPI равномерно распределялся.
  12. Инкубировать горки в темноте в течение 5–10 минут.
  13. Поставьте стеклянные слайды в PBS на 30 секунд.
  14. Снимите обложки.
  15. Поставьте стеклянные слайды в PBS на 2 минуты.
  16. Сушите стеклянные слайды, кратковременно окунув их в 70%, 85% и 100% этанол примерно по 10 секунд каждое.
  17. Сушите стекли на воздухе в RT в течение 10 минут в темноте.
  18. Добавьте 15 мкл крепящего материала к каждому стеклянному слайду, затем поставьте сверху накладку на накладку.
  19. Дайте монтажному материалу равномерно распределиться, затем аккуратно промокните лишки.
  20. Запечатайте края покрытия лаком для ногтей.
  21. Дайте лаку высохнуть 15 минут на RT в темноте.
    ПАУЗА: Храните слайды при 4 °C для длительного хранения.
  22. Представьте слайды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения были получены с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа с масляным погружением объективом 60×.
  23. Соберите несколько z-стеков для каждого флуоресцентного канала, чтобы захватить сигнал по всей глубине метафазного сброса.
  24. Деконволюция стеков изображений с помощью алгоритма оценки максимальной правдоподобности для повышения чёткости сигнала и уменьшения расфокусированной флуоресценции.
  25. Обработайте и проанализируйте финальные изображения в ImageJ и выберите оптимальную фокальную плоскость для каждого метафазного разбора перед следующим анализом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол (рисунок 1B) даёт чистые, хорошо распределённые, целостные метафазные хромосомы, пригодные для цитогенетического анализа, при этом хромосомы и сигналы ДНК-FISH хорошо видны при флуоресцентной микроскопии. Использование микроскопа с ярким полем/фазовым контрастом при низком увеличении (10× или 20×) является важным этапом контроля качества для подтверждения того, что ядра имеют вспышки и хромосомы рассеиваются (рисунок 2

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Несмотря на хорошо известные преимущества, метафазные спреды ДНК-FISH используются недостаточно в эпоху WGS. Физическая организация амплифицированной ДНК функционально значима, так как она может влиять на биологическое поведение и терапевтическийответ 61,62,63,64. Фокально амплифицированные онкогены могут существовать на экДНК или внутри HSR, и эти два амплифик...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH R00HG011467 и CPRIT RR23004 G.S.E. Визуализация для этого проекта была поддержана Интегрированным микроскопическим ядром в Медицинском колледже Бэйлора при финансировании NIH (P30 DK056338, P30 CA125123, S10OD030414). Авторы благодарят доктора Павла Станкевича за его советы с самого начала. Авторы также благодарят доктора Пола Мишеля (Стэнфордский университет) за предоставление клеточных линий GBM39ec и GBM39hsr.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
15-mL conical centrifugeлюбой источникН/ДЦентрифугирование. 
15-mL conical tubesлюбой источникН/ДСбор клеток.
200 proof ethanolлюбой источникН/ДШаги промывания. 
Acetic Acid, glacial, 99.7%Millipore Sigma695092Фиксирующее средство Карно и шаги промывания слайдов.
Antifade Mounting MediumFisherScientificNC9265087Монтаж слайдов после завершения подготовки слайда
Biological safety cabinet with vaccum outletлюбой источникН/ДХранение химикатов.
Colcemid (N-methyl-N-deacetyl-colchicine)Millipore Sigma10295892001Связывается с тубулином, останавливает клетки в метafaze.
Coplin jarsлюбой источникН/ДШаги промывания. 
DAPI (4’6-диамидино-2-фенилиндол)Milipore SigmaD8417-1MGФлуоресцентное окрашивание ДНК.
EGFR/CON7 FISH probe Empire GenomicsEGFR-CHR07Локусно-специфичная флуоресцентная зонда. 
Elmer’s rubber cementлюбой источникН/ДУдерживает крышку слайда на месте во время ночной гибридизации зонда.
Ethanol resistant permanent markerлюбой источникН/ДМаркировка слайдов.
Fluorescent microscopeлюбой источникН/ДВизуализация слайдов. 
Glass Cover Slip, 22 x 22mmThermoFisher50-143-780Гибридизация зонда на слайде.
Glass Slide, precleanedVWR48311-703Для выброса метафазных размазов и проведения ДНК-FISH.
Humidified CO2 Incubatorлюбой источникН/ДИнкубация живых клеток.
Hybridization BufferEmpire GenomicsHyb-BufferБуфер, используемый с зондом. 
Ice bucketлюбой источникН/ДСохранение фиксирующего средства Карно в холоде. 
KCl (2M)ThermoFisherAM9640GНабухание клеток перед фиксацией. 
Methanol, 99.9%, HPLC gradeMillipore Sigma1060351000Для фиксирующего средства Карно. 
Microcentrifugeлюбой источникН/ДЦентрифугирование. 
Microcentrifuge tubesлюбой источникН/ДДля клеток во время фиксации и для подготовки зонда. 
MYC / SE 8 ProbeLeicaKI-10106Локусно-специфичная флуоресцентная зонда. 
PBS, pH 7.4Gibco10010-023Шаги промывания. 
Phase contrast microscopeлюбой источникН/ДВизуализация метафазных размазов сразу после выброса
Pipette tipsлюбой источникН/ДПипетирование.
Sodium chlorideMillipore SigmaS9888Для буфера SSC.
Sodium citrateMillipore Sigma567446Для буфера SSC.
Sterile ultrapure waterлюбой источникН/ДШаги промывания. 
ThermoBrite programmable slide incubatorлюбой источникН/ДИнкубация слайдов.
Tongsлюбой источникН/ДДля шагов промывания слайдов. 
Water bathлюбой источникН/ДДля инкубации в KCl. 

Ссылки

  1. Albertson DG. Gene amplification in cancer. Trends Genet. 2006;22:447-455.
  2. Bagci O, Kurtgöz S. Amplification of cellular oncogenes in solid tumors. N Am J Med Sci. 2015;7:341-346.
  3. Schimke RT, et al. Gene amplification and drug resistance in cultured animal cells. Cancer Treat Rev. 1984;11:9-17.
  4. Baker TM, Waise S, Tarabichi M, Van Loo P. Aneuploidy and complex genomic rearrangements in cancer evolution. Nat Cancer. 2024;5:228-239.
  5. Ohshima K, et al. Integrated analysis of gene expression and copy number identified potential cancer driver genes with amplification-dependent overexpression in 1,454 solid tumors. Sci Rep. 2017;7:641.
  6. Pecorino LT, Verhaak RGW, Henssen A, Mischel PS. Extrachromosomal DNA (ecDNA): An origin of tumor heterogeneity, genomic remodeling, and drug resistance. Biochem Soc Trans. 2022;50:1911-1920.
  7. Cox D, Yuncken C, Spriggs AI. Minute chromatin bodies in malignant tumours of childhood. Lancet. 1965;286:55-58.
  8. Kohl NE, et al. Transposition and amplification of oncogene-related sequences in human neuroblastomas. Cell. 1983;35:359-367.
  9. Giollant M, et al. Characterization of double minute chromosomes' DNA content in a human high-grade astrocytoma cell line using comparative genomic hybridization and fluorescence in situ hybridization. Hum Genet. 1996;98:265-270.
  10. Stephens PJ, et al. Massive genomic rearrangement acquired in a single catastrophic event during cancer development. Cell. 2011;144:27-40.
  11. Zhang CZ, et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 2015;522:179-184.
  12. Lange JT, et al. The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers. Nat Genet. 2022;54:1527-1533.
  13. Turner KM, et al. Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity. Nature. 2017;543:122-125.
  14. Wu S, et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature. 2019;575:699-703.
  15. Deshpande V, et al. Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect. Nat Commun. 2019;10:392.
  16. Levan A, Levan G. Have double minutes functioning centromeres? Hereditas. 1978;88:81-92.
  17. Stöber MC, et al. Intercellular extrachromosomal DNA copy-number heterogeneity drives neuroblastoma cell state diversity. Cell Rep. 2024;43:114711.
  18. Kaufman RJ, Brown PC, Schimke RT. Amplified dihydrofolate reductase genes in unstably methotrexate-resistant cells are associated with double minute chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:5669-5673.
  19. Kim H, et al. Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers. Nat Genet. 2020;52:891-897.
  20. Schlesinger HR, et al. Establishment and characterization of human neuroblastoma cell lines. Cancer Res. 1976;36:3094-3100.
  21. Balaban-Malenbaum G, Gilbert F. Double minute chromosomes and the homogeneously staining regions in chromosomes of a human neuroblastoma cell line. Science. 1977;198:739-741.
  22. Gilbert F, et al. Homogeneously staining region in a retinoblastoma cell line: Relevance to tumor initiation and progression. J Natl Cancer Inst. 1981;67:301-306.
  23. Quinn LA, Moore GE, Morgan RT, Woods LK. Cell lines from human colon carcinoma with unusual cell products, double minutes, and homogeneously staining regions. Cancer Res. 1979;39:4914-4924.
  24. Montgomery KT, Biedler JL, Spengler BA, Melera PW. Specific DNA sequence amplification in human neuroblastoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983;80:5724-5728.
  25. Singer MJ, et al. Amplification of the human dihydrofolate reductase gene via double minutes is initiated by chromosome breaks. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97:7921-7926.
  26. Shimizu N. Gene amplification and the extrachromosomal circular DNA. Genes (Basel). 2021;12:1533.
  27. Carroll SM, et al. Double minute chromosomes can be produced from precursors derived from a chromosomal deletion. Mol Cell Biol. 1988;8:1525-1533.
  28. Alitalo K, et al. Homogeneously staining chromosomal regions contain amplified copies of an abundantly expressed cellular oncogene (c-myc) in malignant neuroendocrine cells from a human colon carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983;80:1707-1711.
  29. George DL, Powers VE. Amplified DNA sequences in Y1 mouse adrenal tumor cells: Association with double minutes and localization to a homogeneously staining chromosomal region. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982;79:1597-1601.
  30. Storlazzi CT, et al. Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: Origin and structure. Genome Res. 2010;20:1198-1206.
  31. Biedler JL, Meyers MB, Spengler BA. Homogeneously staining regions and double minute chromosomes, prevalent cytogenetic abnormalities of human neuroblastoma cells. In: Fedoroff S, Hertz L, editors. Advances in Cellular Neurobiology. Academic Press; New York, NY; 1983. p. 267-307.
  32. Shoshani O, et al. Chromothripsis drives the evolution of gene amplification in cancer. Nature. 2021;591:137-141.
  33. Nathanson DA, et al. Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA. Science. 2014;343:72-76.
  34. Song K, et al. Plasticity of extrachromosomal and intrachromosomal BRAF amplifications in overcoming targeted therapy dosage challenges. Cancer Discov. 2022;12:1046-1069.
  35. Kang X, et al. Extrachromosomal DNA replication and maintenance couple with the DNA damage pathway in tumors. Cell. 2025;188:3405-3421.e27.
  36. Pommier Y, Nussenzweig A, Takeda S, Austin C. Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization. Nat Rev Mol Cell Biol. 2022;23:407-427.
  37. Coquelle A, et al. Expression of fragile sites triggers intrachromosomal mammalian gene amplification and sets boundaries to early amplicons. Cell. 1997;89:215-225.
  38. Coquelle A, et al. A new role for hypoxia in tumor progression: Induction of fragile site triggering genomic rearrangements and formation of complex double minutes and homogeneously staining regions. Mol Cell. 1998;2:259-265.
  39. Mandahl N, Mertens F, Mitelman F. Gene amplification in neoplasia: A cytogenetic survey of 80,131 cases. Genes Chromosomes Cancer. 2024;63:e23214.
  40. Roepman P, et al. Clinical validation of whole genome sequencing for cancer diagnostics. J Mol Diagn. 2021;23:816-833.
  41. Ho SS, Urban AE, Mills RE. Structural variation in the sequencing era. Nat Rev Genet. 2020;21:171-189.
  42. Rajkumar U, et al. EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA. iScience. 2019;21:428-435.
  43. Purshouse K, Pollard SM, Bickmore WA. Imaging extrachromosomal DNA (ecDNA) in cancer. Histochem Cell Biol. 2024;162:53-64.
  44. Shapiro DN, et al. Detection of N-myc gene amplification by fluorescence in situ hybridization: Diagnostic utility for neuroblastoma. Am J Pathol. 1993;142:1339-1346.
  45. Krupina K, et al. Chromothripsis and ecDNA initiated by N4BP2 nuclease fragmentation of cytoplasm-exposed chromosomes. Science. 2025;390:1156-1163.
  46. Trask BJ, Hamlin JL. Early dihydrofolate reductase gene amplification events in CHO cells usually occur on the same chromosome arm as the original locus. Genes Dev. 1989;3:1913-1925.
  47. Biedler JL, Spengler BA. A novel chromosome abnormality in human neuroblastoma and antifolate-resistant Chinese hamster cell lines in culture. J Natl Cancer Inst. 1976;57:683-695.
  48. Nunberg JH, Kaufman RJ, Schimke RT, Urlaub G. Amplified dihydrofolate reductase genes are localized to a homogeneously staining region of a single chromosome in a methotrexate-resistant Chinese hamster ovary cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1978;75:5553-5556.
  49. Gapski GR, et al. Synthesis of a fluorescent derivative of amethopterin. J Med Chem. 1975;18:526-528.
  50. Verma RS, Babu A. Tissue culture techniques and chromosome preparation. In: Human Chromosomes: Manual of Basic Techniques. Pergamon Press; 1989. p. 4-45.
  51. Moorhead PS, et al. Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Exp Cell Res. 1960;20:613-616.
  52. Ohara H, Terasima T. Colcemid effects on mitotic synchrony and synchronized cells. Cell Struct Funct. 1976;1:187-195.
  53. Kaufman RJ, Brown PC, Schimke RT. Loss and stabilization of amplified dihydrofolate reductase genes in mouse sarcoma S-180 cell lines. Mol Cell Biol. 1981;1:1084-1093.
  54. Marsden CG, Dragon JA, Wallace SS, Sweasy JB. Base excision repair variants in cancer. Methods Enzymol. 2017;591:119-157.
  55. Nichols A, et al. Chromosomal tethering and mitotic transcription promote ecDNA nuclear inheritance. Mol Cell. 2025;85:2839-2853.e8.
  56. Henegariu O, et al. Improvements in cytogenetic slide preparation: Controlled chromosome spreading, chemical aging, and gradual denaturing. Cytometry. 2001;43:101-109.
  57. Lichter P, et al. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries. Hum Genet. 1988;80:224-234.
  58. Pinkel D, et al. Fluorescence in situ hybridization with human chromosome-specific libraries: Detection of trisomy 21 and translocations of chromosome 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988;85:9138-9142.
  59. Sumner AT, Evans HJ, Buckland RA. New technique for distinguishing between human chromosomes. Nature New Biol. 1971;232:31-32.
  60. Howe B, Umrigar A, Tsien F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. 2014;e50203.
  61. Cavalli G, Misteli T. Functional implications of genome topology. Nat Struct Mol Biol. 2013;20:290-299.
  62. Kosak ST, Groudine M. Form follows function: The genomic organization of cellular differentiation. Genes Dev. 2004;18:1371-1384.
  63. Sehgal P, Chaturvedi P. Chromatin and cancer: Implications of disrupted chromatin organization in tumorigenesis and its diversification. Cancers (Basel). 2023;15:466.
  64. Misteli T. Beyond the sequence: Cellular organization of genome function. Cell. 2007;128:787-800.
  65. Zhu Y, et al. Oncogenic extrachromosomal DNA functions as mobile enhancers to globally amplify chromosomal transcription. Cancer Cell. 2021;39:694-707.
  66. Hung KL, et al. ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression. Nature. 2021;600:731-736.
  67. Taghbalout A, et al. Extrachromosomal DNA associates with nuclear condensates and reorganizes chromatin structures to enhance oncogenic transcription. Cancer Cell. 2025;43:2191-2205.e6.
  68. Hsu TC, Pomerat CM. Mammalian chromosomes in vitro: II. A method for spreading the chromosomes of cells in tissue culture. J Hered. 1953;44:23-30.
  69. Erwin GS, Bhimsaria D, Eguchi A, Ansari AZ. Mapping polyamide-DNA interactions in human cells reveals a new design strategy for effective targeting of genomic sites. Angew Chem. 2014;126:10288-10292.
  70. Erwin GS, et al. Synthetic genome readers target clustered binding sites across diverse chromatin states. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113:E7418-7427.
  71. Erwin GS, et al. Synthetic transcription elongation factors license transcription across repressive chromatin. Science. 2017;358:1617-1622.
  72. Erwin GS, et al. Recurrent repeat expansions in human cancer genomes. Nature. 2023;613:96-102.
  73. Shimizu N, Kanda T, Wahl GM. Selective capture of acentric fragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat Genet. 1996;12:65-71.
  74. Jaworski JJ, et al. ecDNA replication is disorganized and vulnerable to replication stress. Nucleic Acids Res. 2025;53:gkaf711.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Биологиявыпуск 234выпуск 234Пустое значениевыпускфлуоресцентная гибридизация in situметафазная пластинкахромосомаэкстрахромосомная ДНКecDNAгомогенно окрашивающийся регионHSRкариотипамплификация генов
Метафаза ДНК-FISH распространяется, чтобы отличить экстрахромосомную ДНК от однородно окрашенных областей в клетках рака человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.