Быстрый отчет

Забор крови из хвоставой артерии у крыс, находящихся под изофлурановой анестезией, снижает уровень стресса и повышает достоверность результатов

84 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71978

⸱

14 августа 2026 г.

1Core Facility Laboratory Animal Breeding and Husbandry, Medical University of Vienna

В этой статье

Краткое содержание

Отбор проб крови из хвостовой артерии крыс под изофлурановой анестезией позволяет осуществлять контролируемый забор сравнительно больших объемов крови при низком уровне стресса. Быстрое восстановление и возможность повторного забора делают этот метод идеальным для лонгитюдных исследований, требующих получения надежных физиологических параметров.

Аннотация

В данном методе описывается процедура забора крови из хвостовой артерии крыс, находящихся под изофлурановой анестезией. Использование изофлурана сводит к минимуму защитные реакции животных, что обеспечивает контролируемый и низкострессовый процесс как для животного, так и для исследователя. Дополнительные преимущества включают быстрое восстановление животных после забора крови благодаря короткому действию изофлурана, возможность сбора сравнительно больших объемов крови из одного места пункции, а также применимость данной методики для повторного забора крови. Кроме того, быстрый артериальный кровоток может снизить вероятность возникновения артефактов коагуляции, хотя в настоящем исследовании это специально не оценивалось. Результаты были получены в рамках фармакокинетического исследования. Забор крови прошел успешно у всех животных, что обеспечило 100% эффективность процедуры. Через 24 ч после забора крови значимого снижения массы тела не наблюдалось, животные быстро восстанавливались без видимых признаков дистресса или осложнений, связанных с процедурой. В целом, данный подход весьма эффективен для экспериментальных условий, требующих надежного и воспроизводимого сбора крови с минимальным стрессом при манипуляциях. После короткого периода обучения процедура оказалась надежной для рутинного использования в экспериментах. Однако при планировании экспериментов и интерпретации результатов следует учитывать потенциальное влияние изофлурановой анестезии на показатели газов крови, метаболические и эндокринные параметры.

Введение

Отбор проб крови является ключевым методом в экспериментальных исследованиях на крысах для оценки физиологических и фармакокинетических параметров. К рекомендуемым методам относятся разрез хвоста, забор крови из латеральной хвостовой вены, сафенальной вены, подъязычной вены, яремной вены и ретроорбитального синуса, а также катетеризация1,2,3,4,5,6,7. Однако выбор метода зависит от желаемых результатов, и каждый из них имеет свои ограничения.

Забор крови из латеральной хвостовой вены и надрез хвоста позволяют получить ограниченный объем образцов, в то время как ретроорбитальный забор, несмотря на свою эффективность, является более инвазивным, влияет на восстановление1 и сопряжен с риском повреждения тканей4,8, а также вызывает этические вопросы. Забор крови из подкожной вены голени требует фиксации животного и выбривания места пункции2, что может вызвать стресс и повлиять на результаты эксперимента. Повторные заборы крови из подкожной вены голени также могут быть затруднены из-за малой длины вены и гемостаза. То же самое относится и к подязычной вене. Хотя путем пункции яремной вены можно быстро получить большие объемы крови, существует риск повреждения легкого, приводящий к пневмотораксу. Кроме того, поскольку вена не видна, пункция должна выполняться вслепую6.

В данном контексте все более важными становятся усовершенствованные методы, которые сводят к минимуму страдания животных, обеспечивая при этом высокое качество образцов. Одним из таких подходов является забор крови из хвостовой артерии под изофлурановой анестезией. Использование короткодействующей ингаляционной анестезии снижает стресс при манипуляциях и способствует проведению контролируемой процедуры. Кроме того, ожидается, что забор артериальной крови позволит получить высококачественные образцы с пониженным риском появления артефактов коагуляции благодаря быстрому кровотоку. Данная методика особенно подходит для повторного забора крови и лонгитюдных исследований, так как животные быстро восстанавливаются, а физиологические нарушения минимизируются. В целом, этот метод сочетает в себе техническую надежность с улучшением благополучия животных и, следовательно, хорошо подходит для экспериментальных условий, требующих точных и воспроизводимых измерений показателей крови.

Протокол

Все эксперименты с использованием представленного метода были одобрены комитетом по этике Медицинского университета Вены и Министерством образования, науки и исследований Австрии.

1. Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все необходимые материалы перед проведением анестезии, чтобы обеспечить плавное и эффективное выполнение процедуры.

  1. Заполните шприц 3,2% цитратом (количество зависит от требуемых параметров) для предотвращения свертывания крови.
  2. Установите поток кислорода на уровень 0,5 L/min, направляя его в индукционную камеру и маску.
  3. Перекройте шланг, подключенный к маске, чтобы индукционный газ и кислород направлялись исключительно в камеру.
  4. Достаньте крысу из клетки и поместите ее в индукционную камеру.
  5. Закройте крышку индукционной камеры, следя за тем, чтобы хвост или лапы крысы не были зажаты.
  6. Установите концентрацию изофлурана на уровне 3% (в зависимости от системы шлангов) и поддерживайте ее до тех пор, пока у животного не исчезнут спонтанные движения и поддерживающий рефлекс.
  7. Осторожно покачайте камеру вперед-назад, чтобы подтвердить потерю поддерживающего рефлекса.
  8. Перекройте шланг, подключенный к камере, чтобы перенаправить газ и кислород в маску.
  9. Откройте крышку камеры и извлеките крысу.
  10. Поместите крысу в положение на спине на грелку (38 °C), расположив нос в маске (Рисунок 1).
  11. Очистите хвост водой и просушите бумажной салфеткой.
  12. Дезинфицируйте хвост спиртом.
  13. Подтвердите отсутствие межпальцевого рефлекса, зажав кожу между пальцами задней конечности крысы и убедившись в отсутствии реакции отдергивания.

Подготовка к анестезии крыс; шприц, флакон, марля; используется в лабораторном эксперименте для биомедицинских исследований.
Рисунок 1Положение крысы. Крысу помещают на спину, расположив нос в анестезиологической маске. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Забор крови

ПРИМЕЧАНИЕ: Артерия расположена на вентральной стороне хвоста. Оптимальное место пункции находится между средней и дистальной частями хвоста. Артерию определяют прежде всего по ее анатомическому расположению, однако у крыс с легкой пигментацией (например, Sprague Dawley) вентральная артерия хвоста иногда может быть видна как слабый голубоватый сосуд. В таком случае вентральную артерию хвоста обычно легко идентифицировать у основания хвоста по ее анатомическому положению по вентральной срединной линии. После идентификации можно проследить ее ход дистально до намеченного места пункции.

  1. Проследите ход артерии от проксимального к дистальному концу.
  2. Ориентируйте срез иглы вверх.
  3. Введите иглу под углом примерно 30 ° (Рисунок 2).
  4. Проведите иглу в краниальном направлении, а затем параллельно хвосту (Рисунок 2).
  5. Соберите кровь в шприц (Рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла вводится легко, заберите необходимый объем крови в соответствии с применимыми рекомендациями. Если артериальное давление слишком низкое для забора проб, снизьте концентрацию изофлурана до 2.5% и повторите процедуру, не вынимая иглу из места пункции. Каждую последующую пробу крови следует брать из места пункции, расположенного краниальнее предыдущего.
  6. Перед извлечением иглы прижмите место инъекции ватным тампоном.
  7. Отключите газовый наркоз и проверьте место введения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После прекращения кровотечения верните крысу в домашнюю клетку.

Техника проведения инъекций змее, ветеринарная процедура, использование шприца, манипуляции с рептилиями, медицинское оснащение.
Рисунок 2Место пункцииМесто пункции находится на вентральной стороне хвоста между средней и дистальной третью; иглу следует вводить под углом 30°. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Обработка крови

  1. Перелейте собранную кровь в пробирку.
  2. Храните кровь на льду до центрифугирования.

Результаты

Данные, представленные в данной методической работе, были получены в ходе фармакокинетического исследования. Были использованы только самцы крыс линии Sprague Dawley в возрасте 6–8 недель с массой тела от 393 g до 429 g. В день 0 из хвостовой артерии была взята одна проба крови (0.3 mL). Масса тела регистрировалась непосредственно перед забором крови и повторно через 24 h после процедуры. Анестезирующий газ быстро выдыхался, и животные быстро восстанавливались. Вскоре после этого они начали питаться и не проявляли признаков нарушения общего самочувствия. Крысы не проявляли признаков стресса или страха при извлечении из клетки для последующего забора крови. Также в последующие дни после процедуры не наблюдалось защитного поведения. При правильном выполнении процедуры на хвосте не было видно гематом. Животные не проявляли признаков боли ни сразу после забора крови, ни в последующие дни, а места забора крови на хвостах также были безболезненными прикосновении. В течение 24 h после забора крови потери массы тела не наблюдалось. Средняя масса тела увеличилась с 409 g в день 0 до 419 g в день 1, что соответствует среднему приросту массы тела 2.6% ±± 1.1%, свидетельствуя о хорошей переносимости процедуры забора крови (Рисунок 3).

Линейный график изменения массы тела 12 субъектов, отслеживающий вес с 0-го по 1-й день в граммах.
Рисунок 3Изменение массы телаМасса тела (г) до (д0) и через 24 ч после (д1) забора крови у крыс (n = 12). После забора крови потери массы тела не наблюдалось. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Представленный метод забора крови из хвостовой артерии особенно подходит для исследований, требующих многократного отбора проб или сравнительно больших объемов крови. По сравнению с забором из хвостовой вены, данная техника облегчает получение больших объемов крови из одной точки пункции и может иметь практические преимущества при повторном заборе, так как многократная венопункция может стать более затруднительной из-за образования гематом и снижения доступности вены. Согласно рекомендациям Die Gesellschaft für Versuchstierkunde / Society of Laboratory Animal Science (GV-SOLAS) и Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA), однократный забор крови не должен превышать 10% от объема циркулирующей крови, в то время как ежедневный повторный забор должен быть ограничен примерно 1% от объема циркулирующей крови за 24 h с последующим соответствующим периодом восстановления. Описанный метод позволяет надежно и воспроизводимо получать рекомендуемые объемы проб, что делает его подходящим как для однократных, так и для повторных протоколов забора крови.

Идеальный метод забора крови должен обеспечивать достаточный объем крови для запланированных анализов при минимальном процедурном стрессе и гарантировать высокое качество образцов. Забор крови из ретроорбитального венозного сплетения и подязычной вены может привести к проблемам со свертываемостью из-за травмирования тканей8,9, что нежелательно для исследований коагуляции. Аналогично, методы «выжимания» — например, "milking" из хвостовой вены — также могут привести к коагуляции, вызванной процессом отбора проб. По сравнению с этими методами, артериальная кровь, полученная из хвоста, оказывается менее склонной к преждевременному свертыванию. Это может быть связано с высокой скоростью забора, отсутствием травм тканей и непосредственным контактом крови с цитратом в шприце, что эффективно предотвращает коагуляцию. Другие методы, такие как пункция яремной вены, сопряжены с риском повреждения органов1,6, а рекомендуемые процедуры катетеризации требуют общего наркоза с последующим послеоперационным уходом и обработкой раны. Для предотвращения закупорки необходима регулярная промывка катетера, при этом всегда существует риск того, что животное удалит катетер самостоятельно.

Забор крови из хвостовой артерии требует кратковременной седации, так как животных необходимо поместить в положение лежа на спине, а пункция является болезненной, что может вызвать защитные движения. Использование изофлурановой анестезии сводит к минимуму защитные реакции, позволяя проводить процедуру контролируемо и эффективно. В результате забор крови может быть выполнен быстро, что снижает общую нагрузку на животное по сравнению с методами венепункции хвоста, при которых сбор необходимого объема крови может занять больше времени. Отсутствие защитных движений также снижает вероятность повторных проколов иглой. Важно отметить, что животные не осознают проведения процедуры, быстро восстанавливаются и обычно возвращаются к нормальному поведению вскоре после отбора проб1. После забора крови животные быстро выходили из изофлурановой анестезии и, как правило, вскоре возобновляли нормальную активность. В настоящем исследовании масса тела, измеренная через 24 h после забора крови, показала незначительное увеличение по сравнению с исходным уровнем, что свидетельствует об отсутствии негативного влияния процедуры на потребление пищи и подтверждает благополучный краткосрочный период восстановления.

Известно, что изофлуран снижает артериальное давление10,11, что может осложнить забор венозной крови из-за уменьшения наполнения вен. Напротив, забор венозной крови без анестезии требует фиксации животного1,2, что может вызвать значительный стресс и потенциально повлиять на результаты эксперимента. Кроме того, стресс вызывает вазоконстрикцию, что также может затруднить сбор крови. Снижение артериального давления может повлиять и на забор артериальной крови; однако, по нашему опыту, эту проблему можно легко решить путем регулировки концентрации изофлурана, поддерживая тем самым достаточный кровоток для забора проб.

Однако известно, что изофлуран также влияет на физиологические параметры, в частности на показатели газов в крови, из-за угнетения дыхания12,13. Изофлуран может воздействовать на функцию дыхания и газообмен, потенциально изменяя уровни кислорода и углекислого газа в артериальной крови. В ряде исследований было показано, что изофлуран также может изменять метаболические и эндокринные параметры, включая уровни глюкозы в крови, лактата, инсулина, кортикостерона, а также липидный обмен14,15,16. Тем не менее, было продемонстрировано, что изофлуран вызывает меньше изменений стресс-индуцированных параметров, чем некоторые другие режимы анестезии, и обладает такими преимуществами, как быстрая индукция, короткое время восстановления и точный контроль глубины наркоза, что делает его подходящим для процедур рутинного забора крови14. Следовательно, при планировании и интерпретации экспериментов следует учитывать потенциальное влияние изофлурана, поскольку образцы артериальной крови, полученные под анестезией, могут неточно отражать исходные физиологические условия. Однако для фармакокинетических исследований эти эффекты зачастую имеют второстепенное значение по сравнению с преимуществами получения воспроизводимых проб крови при минимизации стресса, связанного с манипуляциями.

Дополнительным аспектом является профессиональное воздействие изофлурана на экспериментатора. Поскольку система не является полностью замкнутой, существует риск воздействия анестезирующего газа во время процедуры. Работа под ламинарным потоком воздуха или с использованием соответствующих систем эвакуации газов позволила бы минимизировать воздействие, однако такое оборудование может быть доступно не во всех экспериментальных условиях.

В целом, описанный метод представляет собой ценную альтернативу традиционным способам забора крови, сочетая в себе ожидаемое высокое качество образцов со снижением уровня стресса и улучшением условий обращения с животными. Он дает явные преимущества с точки зрения благополучия животных и эффективности процедуры. Его применимость в конечном итоге зависит от конкретной исследовательской задачи, однако данный метод особенно выгоден в тех экспериментальных условиях, где критически важны достоверные показатели крови и минимальное физиологическое воздействие.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Автор выражает благодарность Катарине Тильманн за вдохновение при публикации данного метода.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Система анестезии Д-рäПожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. https://www.draeger.com/en-us_us/Productfinder/Anaesthesia/Anaesthesia-Machines#products Поиск продуктов / Анестезия / Анестезиологические аппараты Анестезиологические аппараты Инновационные решения для обеспечения безопасности и комфорта пациентов, а также оптимизации рабочих процессов для врачей-анестезиологов. Наши анестезиологические аппараты объединяют в себе передовые технологии вентиляции, точность подачи анестетиков и интуитивно понятные интерфейсы управления, что позволяет адаптировать настройки под индивидуальные потребности каждого пациента — от новорожденных до взрослых. Основные характеристики: * Высокоточная подача газов и испарители нового поколения. * Расширенные режимы вентиляции для защиты легких. * Интегрированные системы мониторинга показателей пациента. * Эргономичный дизайн для повышения эффективности работы в операционной. * Соблюдение строгих международных стандартов безопасности. Найдите решение, которое идеально подходит для вашего клинического учреждения.Газовая анестезия
Пробирка Vacuette с цитратом (цитрат натрия 3,2%)Greiner Bio-One454332Антикоагулянты
Пробирка Eppendorf 1,5 млEppendorf 3,01,25,150Хранение крови
Изофлуран жидкий (Isospire)DechraГазовая анестезия
Игла (25 G) ´ 5/8'')BD Microlance300600Забор крови
Шприц 1 мл (туберкулинный, Luer)Chirana CHTUB01Забор крови
Thermomaquet 2000MaquetThermomaquet 2000Система нагрева
Целлюлозный тампон Zelletten 5 см ´ 4 смLohmann&РаушерГемостаз

Ссылки

  1. Toft, M., Peterson, M. H., Dragsted, N., Hansen, A. K. The impact of different blood sampling methods on laboratory rats under different types of anaesthesia. Laboratory Animals. 40, 261-274 (2006).
  2. Hem, A., Smith, A. J., Solberg, P. Saphenous vein puncture for blood sampling of the mouse, rat, hamster, gerbil, guineapig, ferret and mink. Laboratory Animals. 32, 364-368 (1998).
  3. Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
  4. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  5. National Institutes of Health, Office of Animal Care and Use. . Guidelines for survival blood collection in mice and rats. , (2025).
  6. Xu, Y., Zhu, Y., Lin, J., Borlak, J. Serial blood collection in anaesthetised rats: Enhancing animal welfare without the need for jugular vein catheterisation. Regul Toxicol Pharmacol. 164, 105988 (2026).
  7. Fluttert, M., Dalm, S., Oitzl, M. S. A refined method for sequential blood sampling by tail incision in rats. Laboratory Animals. 34, 372-378 (2000).
  8. Salemink, P. J. M., Korsten, J., de Leeuw, P. Prothrombin times and activated partial thromboplastin times in toxicology: a comparison of different blood withdrawal sites for Wistar rats. Comp Haematol Int. 4, 173-176 (1994).
  9. Seibel, J., et al. Comparison of haematology, coagulation and clinical chemistry parameters in blood samples from the sublingual vein and vena cava in Sprague-Dawley rats. Laboratory Animals. 44, 344-351 (2010).
  10. Albrecht, M., et al. Influence of repeated anaesthesia on physiological parameters in male Wistar rats: a telemetric study about isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl. BMC Vet Res. 10, 310 (2014).
  11. Janssen, B. J. A., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, H1618-H1624 (2004).
  12. Flecknell, P. . Laboratory animal anaesthesia. , (2009).
  13. Tsukamoto, A., et al. Combining isoflurane anesthesia with midazolam and butorphanol in rats. Exp Anim. 65 (3), 223-230 (2016).
  14. Arnold, M., Langhans, W. Effects of anesthesia and blood sampling techniques on plasma metabolites and corticosterone in the rat. Physiol Behav. 99, 592-598 (2010).
  15. Rauch, E., Ari, C., D'Agostino, D. P., Kovács, Z. Exogenous ketone supplement administration abrogated isoflurane-anesthesia-induced increase in blood glucose level in female WAG/Rij rats. Nutrients. 16 (10), 1477 (2024).
  16. Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comp Med. 67 (2), 122-132 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи