Методическая статья

Сила и продолжительность TCR-сигнала при активации и дифференцировке первичных CD8+ T-клеток мыши: стандартизированный подход in vitro

83 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/71979

⸱

25 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Guangdong Province Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute for Immunology and Pathogenesis, College of Basic Medicine, Chongqing Medical University, 4Center for Immune Ageing and Rejuvenation, Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном протоколе описывается систематический метод активации первичных наивных CD8+ T-лимфоцитов мыши+ Т-клетки с использованием подхода градуальной стимуляции TCR, позволяющего провести комплексный анализ пролиферации, активации и продукции цитокинов CD8+ Т-лимфоцитов+ Т-клетки при различных интенсивностях передачи сигнала через TCR.

Аннотация

Интенсивность и продолжительность сигнала Т-клеточного рецептора (TCR) являются критическими детерминантами активации, пролиферации и функциональной дифференцировки CD8⁺ Т-клеток. Однако количество стандартизированных моделей in vitro, которые систематически сравнивают влияние различных входных сигналов TCR на судьбу Т-клеток, остается ограниченным. В данном исследовании представлен воспроизводимый метод активации первичных Т-клеток мыши in vitro с использованием иммобилизованных на планшете анти-CD3 и растворимых анти-CD28 в дополнение к интерлейкину-2 (IL-2), а также исследуется влияние модуляции концентрации анти-CD3 (сила сигнала) и времени стимуляции (продолжительность сигнала) на результаты активации Т-клеток. Мы подробно описываем протокол выделения наивных Т-клеток из мышей линии C57BL/6 с последующей стимуляцией в диапазоне концентраций анти-CD3 (0.1–10 µg/mL) и временных интервалов (6–48 h). Был проведен анализ методом проточной цитометрии для оценки ранней TCR-индуцированной передачи сигнала по уровню внутриклеточного фосфорилированного рибосомального белка S6 (p-S6) как показателя активности комплекса 1 мишени рапамицина в клетках (mTORC1), после чего оценивались последующие события, включая экспрессию поверхностных маркеров активации (CD69, CD25, ICOS, PD-1), клеточную пролиферацию по разведению фиолетового красителя для отслеживания пролиферации (CTV) и экспрессию эффекторных молекул (Гранзим B, TNF-α) в качестве индикаторов функциональной дифференцировки. Метод представляет собой четкое пошаговое визуальное руководство по проведению воспроизводимой стимуляции Т-клеток, позволяющее исследователям детально изучить, как конкретные параметры сигнала TCR определяют судьбу Т-клеток. Данный подход не только поддерживает механистические исследования активации и дифференцировки Т-клеток, но и предлагает платформу для оптимизации кондиционирования Т-клеток для адаптивной иммунотерапии и анализов прайминга in vitro. Интеграция видеодемонстрации с подробным описанием протокола повысит методологическую прозрачность и воспроизводимость исследований в области иммунологии Т-клеток.

Введение

Т-клетки незаменимы для формирования защитных иммунных ответов против патогенов и опухолей. Наивные Т-клетки активно поддерживаются в состоянии покоя для обеспечения их долгосрочного выживания и персистенции1. При стимуляции антигеном Т-клетки выходят из состояния покоя, подвергаясь клональной экспансии и эффекторной дифференцировке2. Сигналинг Т-клеточного рецептора (TCR) является основным процессом инициации и регуляции адаптивного иммунного ответа3. После специфического распознавания молекул пептида-главного комплекса гистосовместимости (pMHC), представленных на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК), запускается каскад сигнальных событий, который стимулирует клональную экспансию и функциональную дифференцировку Т-клеток4,5,6.

Интенсивность стимуляции TCR, определяемая такими ключевыми факторами, как аффинность, авидность и концентрация антигена, играет критическую роль в регулировании степени активации T-клеток, приобретения ими эффекторных функций и траектории дифференцировки в различные подмножества эффекторных T-клеток или T-клеток памяти7,8,9. Современные модели in vitro для исследования TCR-зависимой активации T-клеток преимущественно используют антитела к CD3 и CD28, иммобилизованные на планшете или конъюгированные с микросферами, что обеспечивает одновременное получение сигналов лигации TCR и костимуляции10,11. Несмотря на широкое применение таких систем, в них обычно используется только одна, зачастую насыщающая концентрация антител к CD3, что позволяет проводить лишь бинарное сравнение активации T-клеток по принципу «все или ничего», а не фиксировать динамический диапазон силы сигналов TCR, достижимый при использовании титрованного градиента стимулов12,13.

Описанный здесь протокол предоставляет стандартизированную и воспроизводимую систему in vitro для систематической оценки того, как градуальная сила сигнала TCR модулирует активацию, пролиферацию и функциональный фенотип первичных CD8+ T-клеток мышей с использованием титрованных градиентов анти-CD3 (0.1–10 µg/mL) и постоянной концентрации анти-CD28 (1 µg/mL). В основе данного подхода лежит многопараметрическая проточная цитометрия, которая позволяет фиксировать как вышележащие сигнальные пути — через внутриклеточный фосфорилированный рибосомальный белок S6 (p-S6) в качестве индикатора активности комплекса 1 мишени рапамицина в клетке (mTORC1), — так и нижележащие клеточные эффекты, включая пролиферацию, отслеживаемую по разведению CTV, поверхностные маркеры активации (CD69, CD25, индуцибельный костимулирующий молекульный маркер T-клеток [ICOS], программируемый белок смерти 1 [PD-1]) и экспрессию эффекторных молекул (гранузим B, фактор некроза опухоли-альфа [TNF-α]) в течение периода времени от 6 до 48 h.

В нашем протоколе используется градиент концентрации иммобилизованных на планшете антител к CD3 для точного модулирования интенсивности стимуляции, что позволяет имитировать различную авидность связывания TCR, наблюдаемую в физиологических условиях. Данный метод обеспечивает высокую эффективность кросс-линкинга TCR и устойчивую активацию первичных покоящихся Т-клеток. Стандартизированная процедура покрытия гарантирует равномерное распределение антител по поверхности планшета, что приводит к единообразной стимуляции клеток в пределах одной партии и отличной воспроизводимости экспериментов. Такой формат представляет собой экономически выгодный и операционно простой подход к активации Т-клеток.

Тем не менее, следует признать определенные ограничения данного подхода. Стимуляция, опосредованная антителами к CD3/CD28, существенно отличается от физиологического контекста in vivo. Хотя экспериментальные методы, использующие только агонистические антитела к CD3 и CD28 для оценки активации Т-клеток, могут обеспечить эффективный мониторинг активации, они не позволяют в полной мере воспроизвести взаимодействия между антигенпрезентирующими клетками и Т-клетками, а также костимулирующее микроокружение, характерное для физиологических условий14.

Несмотря на эти ограничения, данный протокол представляет собой систематическую и воспроизводимую платформу, которая служит ценным и доступным инструментом для исследования Т-клеточных ответов, зависящих от силы сигнала TCR, и может дополнять более сложные антигенспецифические модели.

Протокол

Все эксперименты с животными в данном исследовании были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Третьего военного медицинского университета.

1. Приготовление реагентов и планшетов

  1. Приготовьте раствор анти-CD3 для покрытия планшета в стерильном PBS в концентрациях 0.1, 0.5, 1, 5 и 10 µg/mL.
  2. Добавьте по 50 µL раствора для покрытия анти-CD3 в каждую лунку плоских 96-луночных планшетов.
  3. Герметизируйте планшеты с помощью sealing film и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
  4. Аспирируйте раствор для покрытия и дважды промойте каждую лунку 200 µL стерильного PBS перед добавлением клеток.

2. Выделение наивных CD8+ T-клеток из селезенки мыши

  1. Выберите самцов мышей линии C57BL/6 в возрасте 6–8 недель (приобретенных в Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.) и подвергните их эвтаназии путем вдыхания CO2 с последующим вывихом шейного позвонка. Мышей содержат в условиях, свободных от специфических патогенов, при 12-часовом цикле свет/темнота и свободном доступе к корму и воде. Для каждого независимого эксперимента используют минимум 3 мыши.
  2. Осторожно рассеките брюшину хирургическими ножницами, чтобы обнажить селезенку, захватите и извлеките селезенку с помощью пинцета, затем поместите ее в чашку для сбора, содержащую предварительно охлажденную среду RPMI 1640 с добавлением 2% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (R2). Держите чашку на льду до начала диссоциации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все трупы животных и отходы клеточных культур следует собирать в специальные пакеты для биоопасных отходов и автоклавировать при 121 °C в течение 20 мин перед утилизацией.
  3. Извлеките селезенку из чашки для сбора и перенесите ее в чашку диаметром 60 мм, содержащую 3 mL 1× лизирующего буфера аммоний-хлорид-калий (ACK).
  4. Приготовьте суспензию одноклеточных клеток, аккуратно протирая селезенку через клеточный фильтр с размером пор 70 µm с помощью поршня шприца объемом 3 mL.
  5. Инкубируйте суспензию в течение 1 мин при комнатной температуре (RT), затем добавьте 3 mL предварительно охлажденной среды R2, чтобы нейтрализовать лизирующий буфер аммоний-хлорид-калий (ACK).
  6. Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 mL и центрифугируйте при 500 × g в течение 5 мин при 4 °C.
  7. После центрифугирования аспирируйте супернатант и ресуспендируйте осадок в 10 mL буфера для окрашивания при проточной цитометрии (PBS с 2% FBS).
  8. Профильтруйте суспензию через клеточный фильтр 70 µm в новую коническую пробирку объемом 15 mL, затем снова центрифугируйте при 500 × g в течение 5 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Азид натрия следует исключить из буфера для окрашивания при проточной цитометрии, чтобы сохранить жизнеспособность клеток для функциональных анализов. Все образцы следует хранить при 4 °C и анализировать незамедлительно.
  9. Аспирируйте супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 200 µL коктейля биотинилированных антител на селезенку одной мыши (содержащего анти-CD16/32 (Fc-блок), анти-TER-119, анти-CD19, анти-CD4, анти-B220, анти-NK1.1, анти-Ly-6G, анти-CD11b, анти-CD11c, анти-CD49b, анти-CD44 и анти-F4/80).
  10. Инкубируйте на льду в течение 25 мин, осторожно переворачивая пробирку каждые 5 мин для обеспечения тщательного перемешивания.
  11. Промойте клетки большим объемом буфера для окрашивания при проточной цитометрии, центрифугируйте при 500 × g в течение 5 мин и удалите супернатант.
  12. Ресуспендируйте осадок в том же объеме буфера для окрашивания при проточной цитометрии, который использовался для коктейля биотинилированных антител, добавьте магнитные бусины, покрытые стрептавидином, в объеме в два раза меньше объема суспензии, и инкубируйте на льду в течение 15 мин, осторожно переворачивая пробирку каждые 5 мин для обеспечения тщательного перемешивания.
  13. Кратковременно центрифугируйте пробирку, поместите ее на магнитную подставку на 2–3 мин и осторожно перенесите супернатант (обогащенный наивными CD8+ T-клетками) в новую коническую пробирку объемом 15 mL.
  14. Однократно промойте собранные клетки буфером для окрашивания при проточной цитометрии, затем снова центрифугируйте при 500 × g в течение 5 мин.
  15. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS (R10) для последующего использования.

3. Маркировка фиолетовым красителем для отслеживания пролиферации (CTV) для мониторинга пролиферации

  1. Приготовьте 2 × свежий рабочий раствор CTV (10 µM) непосредственно перед использованием. Тщательно перемешайте исходный 5 мМ раствор CTV (в диметилсульфоксиде [ДМСО]) с помощью вортекса, затем разведите его стерильным фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) до получения конечной концентрации 10 µM.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Работа с основным раствором CTV (приготовленным в DMSO) должна проводиться в вытяжном шкафу с использованием нитриловых перчаток, так как DMSO способствует проникновению токсичных соединений через кожу. Избегайте вдыхания и контакта с кожей.
  2. Ресуспендируйте половину изолированных наивных CD8+ Т-клетки в предварительно охлажденном PBS с плотностью 8 × 107 клеток/мл
  3. Быстро добавьте равный объем 2 × рабочий раствор CTV (10 µM) к клеточной суспензии и тщательно перемешайте путем пипетирования, чтобы получить конечную концентрацию CTV, равную 5 µM.
  4. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в темноте в течение 20 мин, осторожно переворачивая пробирки каждые 5 мин для обеспечения тщательного перемешивания.
  5. Добавьте к клеткам 5 объемов культуральной среды (содержащей не менее 10% FBS) и инкубируйте в течение 5 минут на льду, чтобы удалить избыток свободного красителя.
  6. Центрифугируйте клетки при 500 г × г в течение 5 мин, затем ресуспендируйте осадок в свежеподогретой полной среде R10 с добавлением анти-CD28 (конечная концентрация: 1 µg/mL) и ИЛ-2 (конечная концентрация: 10 нг/мл).
  7. Добавьте 250 µL суспензии клеток (содержащей 6 × 105клеток) в каждую лунку предварительно покрытых 96-луночных планшетов.
  8. Культивируйте клетки при 37 °C с 5% CO₂ в течение до 48 ч.

4. Детекция CTV методом проточной цитометрии

  1. Соберите клетки в 96-луночный планшет с круглым дном через 6, 36 и 48 ч. Центрифугируйте при 500 × g в течение 5 мин и дважды промойте буфером для окрашивания при проточной цитометрии.
  2. Для окрашивания поверхностных маркеров инкубируйте клетки с 50 µL коктейля антител, содержащего anti-CD8, фиксируемый краситель жизнеспособности и anti-CD44, в течение 30 мин на льду в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Собирайте все супернатанты, содержащие конъюгированные с флуорофором антитела, в специальные контейнеры для отходов, дополненные 0,5% гипохлоритом натрия для деконтаминации, и утилизируйте их в соответствии с институциональными протоколами по обращению с биоопасными отходами.
  3. Дважды промойте клетки буфером для окрашивания при проточной цитометрии и ресуспендируйте в 200 µL буфера для окрашивания при проточной цитометрии для последующего анализа на проточном цитометре.
  4. Проанализируйте образцы на проточном цитометре, оснащенном тремя лазерами. Подготовьте контрольные пробы с одним красителем, используя окрашенные клетки, для настройки параметров компенсации.
  5. Примените следующую стратегию гейтирования: исключите клеточный дебрис с помощью гейтирования по прямому (FSC) и боковому (SSC) рассеянию, удалите дублеты с помощью гейтирования по синглетам и выберите жизнеспособные (отрицательные по фиксируемому красителю жизнеспособности) CD8+ T-клетки для анализа.
  6. Соберите не менее 1 × 104 событий гейтированных CD8+ T-клеток на образец. Проанализируйте данные с помощью программного обеспечения для анализа проточной цитометрии и рассчитайте долю клеток, подвергшихся одному или нескольким делениям, используя модуль анализа пролиферации.

5. Поверхностное и внутриклеточное окрашивание для анализа активации и сигналинга

  1. Ресуспендируйте оставшуюся половину наивных CD8+ Т-клеток в среде R10, дополненной анти-CD28 в концентрации 1 µg/mL и IL-2 в концентрации 10 ng/mL, до плотности 2.4 × 106 клеток/mL.
  2. Добавьте по 250 µL клеточной суспензии (6 × 105 клеток) в каждую лунку предварительно покрытых 96-луночных планшетов.
  3. Культивируйте клетки при 37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение периода до 48 ч.
  4. В указанные моменты времени (6, 10, 12, 24 и 36 ч) соберите клетки в 96-луночный планшет с круглым дном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: точка 6 ч позволяет зафиксировать ранний TCR-сигналинг (фосфо-S6) и экспрессию CD69; последний дополнительно оценивается через 12, 24 и 36 ч для изучения полной кинетики. Экспрессия CD25, PD-1 и ICOS контролируется через 10, 12, 24 и 36 ч; временная точка 48 ч зарезервирована для анализа пролиферации (Раздел 4) и детекции цитокинов (Раздел 6).
  5. Центрифугируйте при 500 × g в течение 1 мин и ресуспендируйте клеточный осадок в 200 µL буфера для окрашивания при проточной цитометрии.
  6. Центрифугируйте при 500 × g в течение 1 мин и аспирируйте супернатант. Промойте клетки дважды 200 µL буфера для окрашивания при проточной цитометрии.
  7. Для поверхностного окрашивания инкубируйте клетки с 50 µL коктейля антител, содержащего анти-CD69, анти-CD25, анти-CD8, анти-PD-1, анти-ICOS и фиксирующий краситель жизнеспособности, в течение 30 мин на льду в темноте.
  8. Промойте клетки трижды буфером для окрашивания при проточной цитометрии, чтобы удалить несвязавшиеся антитела.
  9. Ресуспендируйте клеточный осадок в 200 µL 1% параформальдегида и фиксируйте клетки при RT в темноте в течение 15 мин.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Выполняйте все этапы с использованием параформальдегида в вытяжном шкафу во избежание вдыхания паров. Собирайте все жидкие отходы, содержащие фиксатор, в отдельный контейнер с маркировкой для утилизации опасных химических веществ.
  10. Центрифугируйте при 500 × g в течение 1 мин и один раз промойте буфером для окрашивания при проточной цитометрии.
  11. Предварительно нагрейте 5 × буфер для лизиса/фиксации до RT и приготовьте 1 × рабочий раствор с помощью дистиллированной воды.
  12. Добавьте по 200 µL рабочего раствора (1 × буфер для лизиса/фиксации) в каждую лунку, инкубируйте клетки при RT в темноте в течение 30 мин.
  13. Промойте дважды 1 × буфером для пермеабилизации/промывки для окрашивания фосфо-эпитопов. Ресуспендируйте осадок в 1 × буфере для пермеабилизации/промывки для окрашивания фосфо-эпитопов и инкубируйте при RT в темноте в течение 10 мин.
  14. Центрифугируйте при 500 × g в течение 1 мин и удалите супернатанты.
  15. Для внутриклеточного окрашивания инкубируйте клетки с 50 µL коктейля антител, содержащего анти-p-S6, в течение 60 мин при RT в темноте.
  16. Промойте клетки трижды 1 × буфером для пермеабилизации/промывки для окрашивания фосфо-эпитопов.
  17. Для окрашивания вторичными антителами инкубируйте клетки с 50 µL коктейля антител, содержащего вторичные антитела против кролика, в течение 30 мин на льду в темноте.
  18. Промойте клетки трижды 1 × буфером для пермеабилизации/промывки для окрашивания фосфо-эпитопов и один раз буфером для окрашивания при проточной цитометрии.
  19. Ресуспендируйте клеточный осадок в 200 µL буфера для окрашивания при проточной цитометрии и проанализируйте образцы на том же проточном цитометре.
  20. Примените ту же стратегию гейтирования, что описана в Разделе 4.5, и соберите не менее 1 × 104 CD8+ Т-клеток на образец.
  21. Проанализируйте медианную интенсивность флуоресценции (MFI) для каждого маркера с помощью программного обеспечения для анализа данных проточной цитометрии.

6. Блокирование и детектирование внутриклеточных цитокинов

  1. За 5 ч до сбора добавьте в каждую лунку 100 µL свежей среды R10, дополненной PMA (50 ng/mL), иономицином (1 µg/mL), ингибиторами транспорта белков (монензином) (1:1000) и ингибиторами транспорта белков (на основе брефельдина A) (1:1000). Осторожно перемешайте и верните планшеты в инкубатор при 37 °C, чтобы заблокировать секрецию цитокинов и обеспечить их внутриклеточное накопление.
  2. В нужный момент времени соберите клетки в круглодонный 96-луночный планшет.
  3. Центрифугируйте при 500 × g в течение 1 мин и ресуспендируйте клеточный осадок в 200 µL буфера для окрашивания при проточной цитометрии.
  4. Центрифугируйте при 500 × g в течение 1 мин и аспирируйте супернатант. Промойте дважды 200 µL буфера для окрашивания при проточной цитометрии.
  5. Для окрашивания поверхностных маркеров инкубируйте клетки с 50 µL коктейля антител, содержащего anti-CD44, anti-CD8 и фиксируемый краситель жизнеспособности, в течение 30 мин на льду в темноте.
  6. Промойте трижды буфером для окрашивания при проточной цитометрии, чтобы удалить несвязавшиеся антитела.
  7. Пермеабилизуйте клетки, добавив 200 µL раствора для фиксации и пермеабилизации, и инкубируйте в течение 30 мин на льду в темноте.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Все этапы с использованием раствора для фиксации/пермеабилизации (содержащего параформальдегид) следует проводить в вытяжном шкафу во избежание вдыхания паров. Собирайте все жидкие отходы, содержащие фиксатор, в отдельный контейнер с маркировкой для утилизации опасных химических веществ.
  8. Центрифугируйте при 500 × g в течение 1 мин и слейте супернатант в контейнер для опасных химических отходов.
  9. Промойте клетки трижды 1 × буфером для пермеабилизации/промывки.
  10. Для внутриклеточного окрашивания цитокинов инкубируйте с 50 µL коктейля антител, содержащего anti-TNF-α и anti-Granzyme B, в течение 30 мин на льду в темноте.
  11. Промойте клетки трижды 1 × буфером для пермеабилизации/промывки, чтобы удалить несвязавшиеся антитела, и выполните одну финальную промывку буфером для окрашивания при проточной цитометрии.
  12. Ресуспендируйте клеточный осадок в 200 µL буфера для окрашивания при проточной цитометрии и проанализируйте образцы на том же проточном цитометре.
  13. Примените ту же стратегию гейтирования, что описана в разделе 4.5, и соберите не менее 1 × 104 CD8+ T-клеток на образец. С помощью программного обеспечения для анализа данных проточной цитометрии определите процент положительных клеток и MFI для каждого маркера.

Результаты

Чтобы исследовать влияние различной интенсивности анти-CD3 стимуляции на активацию Т-клеток, мы выделили спленоциты мышей и очистили CD8+ Т-клетки для культивирования in vitro, после чего провели анализы активации Т-клеток и проточно-цитометрический анализ. Для анализа данных лимфоциты сначала выделяли (гейтировали) с помощью комбинации FSC-A и SSC-A, затем выделяли синглеты с помощью FSC-H и FSC-W, а затем SSC-H и SSC-W. Живые CD8+ Т-клетки далее выделяли по маркеру CD8 в сочетании с фиксируемым красителем жизнеспособности для последующего анализа (Рисунок 1A).

Чтобы подтвердить, что система стимуляции с использованием иммобилизованных на планшете антител эффективно активирует Т-клетки in vitro, мы изучили фосфорилирование рибосомального белка S6 (p-S6) — общепризнанного downstream-показателя активности mTORC1 и точки схождения путей PI3K-mTOR и MEK-ERK MAPK ниже по каскаду сигнализации TCR15,16. В соответствии с этими данными, мы наблюдали дозозависимое увеличение уровней p-S6 через 6 ч после стимуляции при повышении концентраций анти-CD3 (0.1–10 µg/mL) (Рисунок 1B), что подтверждает активацию оси TCR-mTORC1-S6 системой иммобилизованных анти-CD3 в зависимости от силы сигнала. Это раннее событие фосфорилирования согласуется с задействованием mTORC1-зависимых метаболических путей, которые обеспечивают последующую пролиферацию Т-клеток и их эффекторную дифференцировку.

Пролиферацию клеток оценивали с помощью проточной цитометрии по разведению CTV после стимуляции TCR градиентными концентрациями анти-CD3 (0.1–10 µg/mL) в трех временных точках после стимуляции: через 6, 36 и 48 h. В ранней временной точке сигналинга (6 h) во всех условиях стимуляции наблюдалось лишь минимальное пролиферативное разведение. К 36 h в группе с низкой дозой стимуляции (0.1 µg/mL) всё еще не наблюдалось значимой клональной экспансии, тогда как в группах со средними и высокими дозами (5 и 10 µg/mL) были видны четко разделенные пики разведения CTV, что указывало на начало прогрессии клеточного цикла. Через 48 h различия в пролиферативных фенотипах в зависимости от концентрации стимулятора были наиболее выражены. Слабая стимуляция TCR (0.1 µg/mL) привела к появлению всего 1.25% пролиферирующих клеток и одного неразведенного пика CTV, что свидетельствует о субоптимальной активации. Средняя стимуляция (1–5 µg/mL) индуцировала три раздельных пика деления, при этом доля пролиферирующих клеток увеличилась с 70.8% до 84.0%. При сильной стимуляции (10 µg/mL) была достигнута самая высокая доля пролиферирующих клеток (89.5%), зафиксировано максимальное количество поколений деления и выявлено насыщение пролиферации (Рисунок 2).

Далее мы изучили экспрессию ранних маркеров активации CD69 и CD25. Примечательно, что в настоящем исследовании было выявлено быстрое и дозозависимое повышение экспрессии CD69, основанное на медианной интенсивности флуоресценции (MFI). При промежуточной и сильной стимуляции (5 и 10 µg/mL) уровень CD69 быстро повышался к 24 ч, после чего следовало постепенное снижение в интервале между 24 и 36 ч. Однако при слабой стимуляции (0.1, 0.5 и 1 µg/mL) экспрессия CD69 прогрессивно возрастала на протяжении всего окна стимуляции. Описанный выше кинетический профиль экспрессии CD69 согласуется с его ролью в качестве раннего маркера активации Т-клеток (Рисунок 3A)17. Интересно, что экспрессия CD25 демонстрировала прогрессивное увеличение дозо- и времязависимым образом (Рисунок 3B). В соответствии с предыдущими исследованиями, повышение уровня CD25 происходило медленнее, чем CD69, особенно при оптимальной стимуляции18,19.

Чтобы дополнительно изучить регуляторное влияние силы стимуляции TCR на экспрессию ингибирующих рецепторов и костимулирующих молекул в CD8+ T-клетках, мы исследовали уровни экспрессии PD-1 и ICOS. Индуцибельная экспрессия PD-1 зависит от высокоинтенсивной стимуляции TCR. В группе с низкой интенсивностью стимуляции (0.5–1 µg/mL) PD-1 экспрессировался на низком уровне на протяжении всего периода стимуляции. Напротив, в группе со средней и высокой интенсивностью стимуляции (5–10 µg/mL) экспрессия PD-1 постепенно увеличивалась с 10 ч и достигла пика к 36 ч (Рисунок 4A). Экспрессия ICOS также соответственно возрастала при увеличении силы стимуляции и достигла максимального уровня при 5–10 µg/mL к 36 ч (Рисунок 4B). Эти результаты свидетельствуют о том, что высокоинтенсивная стимуляция TCR может значительно повышать уровни экспрессии PD-1 и ICOS.

Наконец, мы изучили функциональную активность стимулированных Т-клеток после повторной стимуляции PMA и иономицином через 24 ч и 48 ч после первоначальной стимуляции. Через 24 ч мы количественно определили продукцию TNF-α и гранзима B и обнаружили, что частота TNF-α+, гранзима B+ и TNF-α+гранзима B+ клеток постепенно повышалась дозозависимым образом в зависимости от концентрации анти-CD3 (Рисунок 5A, B). Соответственно, MFI TNF-α и гранзима B также демонстрировали концентрационно-зависимое увеличение и достигали максимума при высокоинтенсивной стимуляции (10 µg/mL) (Рисунок 5C), что отражает дозозависимую раннюю дифференцировку эффекторов, обусловленную градиентом силы сигнала TCR. Однако через 48 ч эта тенденция заметно изменилась. Более высокие концентрации анти-CD3 значительно снижали процент TNF-α+гранзима B+ клеток и приводили к снижению уровней экспрессии эффекторных молекул в пересчете на одну клетку.

Все представленные данные являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов. Статистический анализ проводили с использованием однофакторного или двухфакторного ANOVA с последующим апостериорным тестом Тьюки; данные представлены как среднее ± SEM. Жизнеспособность клеток стабильно превышала 90%, и для каждого образца было зарегистрировано не менее 1 × 104 событий живых CD8+ T-клеток.

Данные проточной цитометрии: диаграммы гейтирования популяций клеток, гистограммы количественного определения белков и столбчатая диаграмма.
Рисунок 1: Активация in vitro и анализ CD8+ T-клеток методом проточной цитометрии. (A) Очищенные CD8+ T-клетки из спленоцитов мыши стимулировали in vitro различными концентрациями анти-CD3 (0.1–10 µg/mL) в сочетании с фиксированной концентрацией анти-CD28 (1 µg/mL) в течение от 6 до 48 ч с последующим анализом клеточной активации методом проточной цитометрии. Клеточный дебрис исключали путем гейтирования по прямому светорассеянию (FSC) и боковому светорассеянию (SSC), дублеты исключали путем гейтирования синглетов, и, наконец, для последующего анализа выделяли CD8+ T-клетки, отрицательные по фиксируемому красителю жизнеспособности. (B) Фосфорилирование рибосомального белка S6 (p-S6) в CD8+ T-клетках через 6 ч после стимуляции указанными концентрациями анти-CD3 (0.1–10 µg/mL) и постоянной концентрацией анти-CD28 (1 µg/mL). Репрезентативная гистограмма (слева) и сводная диаграмма MFI (справа). Графики проточной цитометрии являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов. Данные представлены как среднее ± SEM. Статистика: однофакторный ANOVA с повторными измерениями и апостериорный тест Тьюки. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns — статистически не значимо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Анализ пролиферации клеток, гистограмма, показывающая зависимость CTV от процента пролиферации во времени.
Рисунок 2: Анализ пролиферации первичных CD8+ T-клеток мыши при градиентной стимуляции TCR с использованием фиолетового красителя для отслеживания пролиферации (CTV). CD8+ T-клетки, помеченные CTV и стимулированные in vitro анти-CD3 в градиентных концентрациях 0,1–10 µg/mL в течение 6–48 ч. Пролиферация клеток оценивалась на основе разведения и ослабления флуоресценции CTV в CD8+ T-клетках с помощью проточной цитометрии. Гистограммы показывают распределение флуоресценции CTV для каждой группы концентраций с указанием процента клеток, претерпевших одно или более делений. Графики проточной цитометрии являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Проточный цитофлуориметрический анализ, экспрессия CD69 и CD25, гистограмма и линейный график, активация иммунных клеток.
Рисунок 3: Кинетика экспрессии ранних маркеров активации CD69 и CD25 на CD8+ T-клетках после стимуляции анти-CD3. Наивные CD8+ T-клетки стимулировали иммобилизованными на планшете анти-CD3 в указанных концентрациях (0.1–10 µg/mL) в сочетании с постоянной концентрацией анти-CD28 (1 µg/mL). Экспрессию CD69 измеряли через 6, 12, 24 и 36 h; экспрессию CD25 — через 10, 12, 24 и 36 h с последующим анализом методом проточной цитометрии. На левых панелях представлены репрезентативные гистограммы в указанные моменты времени; на правых панелях — динамика изменения MFI с течением времени. (A) CD69. (B) CD25. Графики проточной цитометрии являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов. Данные представлены как среднее ± SEM. Статистика: двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с повторными измерениями и последующим апостериорным тестом Тьюки. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns — статистически незначимо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Анализ методом проточной цитометрии, экспрессия PD-1 и ICOS, гистограммы и графики, клеточный ответ с течением времени.
Рисунок 4: Кинетика экспрессии ингибирующего рецептора PD-1 и костимулирующей молекулы ICOS на CD8+ T-клетках после стимуляции анти-CD3. Наивные CD8+ T-клетки стимулировали иммобилизованными на планшете анти-CD3 в указанных концентрациях (0.1–10 µg/mL) в сочетании с постоянной концентрацией анти-CD28 (1 µg/mL). Клетки собирали через 10, 12, 24 и 36 h и анализировали методом проточной цитометрии. На левых панелях представлены репрезентативные гистограммы в указанные моменты времени; на правых панелях показана динамика изменений MFI с течением времени. (A) PD-1. (B) ICOS. Графики проточной цитометрии являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов. Данные представлены как среднее ± SEM. Статистика: двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с повторными измерениями и апостериорным тестом Тьюки. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns — статистически не значимо. Нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

Результаты анализа методом проточной цитометрии, экспрессия TNF-α и гранзима B, столбчатые диаграммы и диаграммы рассеяния, иммунологическое исследование.
Рисунок 5: Внутриклеточная продукция цитокинов CD8+ T-клетками зависит от силы сигнала TCR. Наивные CD8+ T-клетки стимулировали возрастающими концентрациями анти-CD3 (0.1–10 µg/mL) в сочетании с постоянной концентрацией анти-CD28 (1 µg/mL). Через 24 ч и 48 ч после стимуляции клетки собирали после 5-часовой инкубации с ингибиторами транспорта белков (монензином и брефелдином A) в присутствии PMA и иономицина для блокирования секреции цитокинов и обеспечения их внутриклеточного накопления. (A) Контурные графики показывают частоту TNF-α- и гранзим B-положительных клеток при каждой указанной концентрации и временной точке. Нестимулированные клетки служили отрицательным контролем. (B) Доли TNF-α+, гранзим B+ и TNF-α+ гранзим B+ клеток. (C) MFI TNF-α и гранзима B. Графики проточной цитометрии являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов. Данные представлены как среднее ± SEM. Статистика: двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с повторными измерениями и апостериорным тестом Тьюки. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; ns — статистически не значимо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Данный протокол представляет собой систематический и воспроизводимый метод изучения ответов Т-клеток, зависящих от силы сигнала TCR. Стратегия градиентного покрытия анти-CD3 позволяет точно контролировать интенсивность стимуляции, что дает исследователям возможность проанализировать количественную взаимосвязь между входным сигналом TCR и последующими функциональными результатами. Ключевые этапы процедуры включают очистку наивных CD8⁺ Т-клеток, точный контроль градиента концентрации покрытия анти-CD3 и строгую нормализацию количества клеток на лунку. Для обеспечения сопоставимости данных между экспериментами мы также рекомендуем использовать одинаковые настройки приборов, матрицы компенсации и стратегии гейтирования, а также применять одни и те же лоты антител и партии фиксируемых красителей жизнеспособности, где это возможно. Надежность этих критических этапов напрямую определяет, смогут ли результаты эксперимента точно отразить влияние различной интенсивности стимуляции TCR на фенотипическую динамику Т-клеток.

В данном протоколе мы использовали стимуляцию антителами, иммобилизованными на поверхности планшета, при которой антитела к CD3 напрямую наносятся на поверхность культурального планшета для сшивания комплекса TCR-CD3. Этот подход отличается экономичностью, равномерным распределением антител, минимальной вариабельностью между лунками и отличной воспроизводимостью. Примечательно, что титрование концентраций наносимых антител позволяет осуществлять точную ступенчатую модуляцию интенсивности стимуляции; эта особенность отличает данную систему от стимуляции с использованием конъюгированных микросфер, где плотность лиганда обычно фиксирована на насыщающем уровне, что ограничивает возможность тонкой настройки сигнала14. Однако стимуляция иммобилизованными на планшете антителами обеспечивает супрафизиологическое и длительное сшивание TCR, что принципиально отличается от транзиторного, аффинити-зависимого взаимодействия, индуцируемого комплексами pMHC на антигенпрезентирующих клетках. Стимуляция на основе pMHC более физиологична, но технически сложна, требует специальных знаний для получения мультимеров и сопряжена со значительно более высокими затратами. Для изоляции клеток мы применили негативную иммуномагнитную селекцию, которая является простым, быстрым и экономичным методом. Несмотря на более низкую чистоту по сравнению с FACS, этот метод позволяет избежать механического стресса и флуоресцентного мечения, которые могут нарушить физиологическое состояние сортированных клеток20,21.

Основные проблемы, которые могут возникнуть при выполнении протокола, включают низкую чистоту сортировки, слабую пролиферацию, цитотоксичность, индуцированную CTV, низкую жизнеспособность после культивирования и неоднородное окрашивание. При низкой чистоте обеспечьте достаточное перемешивание клеток с коктейлем биотинилированных антител и магнитно-стрептавидиновыми бусинами, при необходимости увеличьте время магнитной сепарации и оптимизируйте соотношение бусин и антител для каждой новой партии реагентов. Если наблюдается минимальная пролиферация даже при самой высокой концентрации анти-CD3, проверьте жизнеспособность и чистоту (особенно загрязнение клетками CD44hi) изолированных наивных клеток, подтвердите правильность процедуры нанесения анти-CD3 (герметизируйте планшеты sealing-пленкой во время инкубации в течение ночи при 4 °C и обеспечьте равномерное покрытие антителами), а также проверьте концентрацию IL-2, так как этот цитокин необходим для поддержки экспансии Т-клеток. При цитотоксичности, индуцированной CTV, снизьте концентрацию красителя, сохраняя при этом четкое разрешение пиков деления, и убедитесь, что этап гашения проводится строго на льду в течение полных 5 min для удаления остаточного свободного красителя22,23. При низкой жизнеспособности после культивирования контролируйте плотность клеток, обеспечьте достаточный объем среды и соблюдайте правила стерильности. Если наблюдается неоднородное окрашивание или высокая вариабельность при проточной цитометрии, готовьте коктейли антител в виде мастер-миксов, защищайте все окрашенные образцы от света и используйте одни и те же партии антител и фиксируемых красителей жизнеспособности во всех повторностях.

Тем не менее, данный протокол имеет определенные ограничения. Будучи системой in vitro, он не может воспроизвести сложную микросреду тканей, клеточные взаимодействия или цитокиновый фон вторичных лимфоидных органов. Окно культивирования ограничено 48 h, что сужает возможности анализа событиями ранней активации и исключает оценку дифференцировки на поздних стадиях, истощения или формирования памяти. Кроме того, протокол в значительной степени опирается на данные проточной цитометрии, что требует строгой стандартизации настроек приборов, матриц компенсации и стратегий гейтирования в независимых экспериментах. Более того, результаты, полученные с помощью этой системы на основе anti-CD3/CD28, получены исключительно на CD8+ T-клетках и могут быть не полностью применимы к CD4+ T-клеткам, поскольку их пороги активации, потребности в костимуляции и траектории последующей дифференцировки, как известно, различаются12,24,25. Кроме того, базальный уровень активации T-клеток может варьироваться между отдельными колониями мышей из-за различий в составе комменсальной микробиоты, что представляет собой потенциальный источник межлабораторной вариабельности, который следует учитывать при интерпретации результатов различных исследований.

Описанная здесь система градиентной стимуляции позволяет исследователям адаптировать силу сигнала TCR под конкретные экспериментальные цели, основываясь на различных паттернах ответа, наблюдаемых при разных показателях. Эти данные показывают, что выбор концентрации анти-CD3 и времени сбора образцов должен определяться конкретным биологическим вопросом. Для маркеров ранней активации повышение экспрессии CD69 обнаруживается уже через 6–12 h при всех концентрациях, но характеризуется разной кинетикой: высокие концентрации (5–10 µg/mL) вызывают быстрый пик с последующим снижением, тогда как низкие концентрации (0.5–1 µg/mL) приводят к постепенному и устойчивому росту. Для анализов на пролиферацию концентрации ниже 1 µg/mL являются субоптимальными и могут служить внутренним отрицательным контролем, в то время как 5–10 µg/mL надежно индуцируют выраженную клональную экспансию, определяемую по разведению CTV через 48 h. Экспрессия ко-ингибиторного рецептора PD-1 и ко-стимулирующей молекулы ICOS требует интенсивной стимуляции (5–10 µg/mL) и достигает пика к 36 h, что указывает на необходимость избегать более ранних временных точек или более низких доз при изучении этих молекул. Для оценки эффекторных функций (TNF-α и Granzyme B) взаимосвязь между силой стимуляции и выработкой цитокинов зависит от времени и следует характерному двухфазному паттерну. Через 24 h выработка эффекторных молекул положительно коррелирует с концентрацией анти-CD3, при этом более высокие дозы приводят к большему выходу цитокинов. Однако к 48 h, хотя абсолютные уровни цитокин-продуцирующих клеток существенно повышены во всех условиях по сравнению с 24 h, зависимость «доза-ответ» меняется на противоположную: более низкие концентрации стимуляции (0.5–1 µg/mL) дают относительно более высокую частоту клеток TNF-α⁺ Granzyme B⁺, чем высокие дозы (5–10 µg/mL). Эта инверсия позволяет предположить, что длительная сильная сигнализация TCR, несмотря на стимулирование начальной дифференцировки эффекторов, может ограничивать поддержание способности каждой клетки к продукции цитокинов, что, вероятно, отражает начало активационно-индуцированного истощения или гипореактивности.

В совокупности эти эмпирические наблюдения позволяют рассматривать наш протокол как базовую систему, которая дает возможность пользователям предварительно выбирать условия стимуляции исходя из конкретных конечных точек анализа, тем самым повышая эффективность планирования эксперимента и интерпретируемость данных. Помимо базовых механистических исследований, данная система может быть использована для оптимизации протоколов экспансии T-клеток для адаптивной иммунотерапии, где точная регуляция силы сигнала TCR может помочь направить дифференцировку в сторону благоприятных эффекторных или мнестических фенотипов26,27,28.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.

Благодарности

Данное исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (№ T2394504, LY) и Стартовым фондом исследований главного ученого Lilin Ye (№ R2045, LY).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
коническая пробирка объемом 15 млLabgicCD-002-15AСтерильная коническая центрифужная пробирка объемом 15 мл
4% параформальдегидBeyotimeP00994% водный фиксатор для консервации клеток перед окрашиванием
чашка диаметром 60 ммLabgic12211чашка для культивирования клеток диаметром 60 мм
70 µm клеточный фильтрLabgicBS-70-CS70 µm нейлоновое сито для приготовления суспензий одноклеточных клеток
96-луночный планшет с круглым дномBeyotimeFPT01696-луночный планшет с круглым дном для культивирования и окрашивания клеток
лизирующий буфер ACKBeyotimeC3702Буфер для лизиса эритроцитов на основе хлорида аммония
антитела к мышиному CD25Biolegend101910антитело к мышиному CD25, конъюгированное с APC, клон 3C7, для проточной цитометрии
антитела к CD28 мышиBio X CellBE0015-1Очищенные антитела к мышиному CD28, клон 37.51, для костимуляции Т-клеток
антитела к CD3 мышиBio X CellBP0001-1Очищенные антитела к CD3 мышиε антитело, клон 145-2C11, для активации Т-клеток
антитела к мышиному CD69BD Biosciences553237Конъюгированные с PE антитела к мышиному CD69 для окрашивания маркера активации
антитела к мышиному CD8Invitrogen17-0081-82антитело к мышиному CD8a, конъюгированное с APC, клон 53-6.7, для проточной цитометрии
антитела к мышиному GZMBBiolegend372212антитело к гранзиму B человека/мыши, конъюгированное с PerCP/Cyanine5.5, клон QA16A02, для внутриклеточной проточной цитометрии
антитела к мышиному ICOSBD Biosciences565886Конъюгированные с BV421 антитела к мышиному ICOS (CD278) для проточной цитометрии
антитела к мышиному PD-1Biolegend135220конъюгированные с BV605 антитела к мышиному PD-1 (CD279), клон 29F.1A12, для проточной цитометрии
анти-мышиный TNF-αInvitrogen46-7321-82конъюгированные с PerCP-eFluor 710 антитела к мышиному TNF-α антитело, клон MP6-XT22, для внутриклеточной проточной цитометрии
антитела к CD44 мыши/человекаBiolegend103030антитело к мышиному/человеческому CD44, конъюгированное с PE/Cyanine7, клон IM7, для проточной цитометрии
биотинилированные антитела к CD11b мышиBiolegend101204Биотинилированные антитела к мышиному CD11b для деплеции клеточных линий
биотинилированные антитела к мышиному CD11cBiolegend117304Биотинилированные антитела к мышиному CD11c для деплеции клеточных линий
биотинилированные антитела к мышиному CD16/32Biolegend156604Биотинилированные антитела к мышиному CD16/32 для делеции определенных линий клеток
биотинилированные антитела к мышиному CD19Biolegend115504Биотинилированные антитела к CD19 мыши для деплеции клеточных линий
биотинилированные антитела к CD4 мышиBiolegend100508Биотинилированные антитела к CD4 мыши для делеции клеточных линий
биотинилированные антитела к мышиному CD44BioLegend103004Биотинилированные антитела к мышиному CD44 для деплеции клеточных линий
биотинилированные антитела к мышиному CD45RBiolegend103204Биотинилированные антитела против мышиного CD45R/B220 для делеции клеточных линий
биотинилированные антитела к мышиному CD49bInvitrogen13-5971-85Биотинилированные антитела к мышиному CD49b для деплеции клеточных линий
биотинилированные антитела против мышиного F4/80BioLegend123106Биотинилированные антитела против мышиного антигена F4/80 для деплеции клеточных линий
биотинилированные антитела к мышиному Ly6GBiolegend127604Биотинилированные антитела к мышиному Ly6G для деплеции клеточных линий
биотинилированные антитела к мышиному антигену NK1.1Biolegend108704Биотинилированные антитела против мышиного антигена NK1.1 для деплеции клеточных линий
биотинилированные антитела к мышиному антигену TER119Biolegend116204Биотин-конъюгированные антитела против мышиного антигена TER-119 для деплеции клеток определенной линии
мыши линии C57BL/6Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.Нет данных6–Для экспериментов использовали самцов мышей в возрасте 8 недель
Диоксид углерода (CO2) инкубаторThermo Fisher3120Увлажненный CO22 инкубатор для культивирования клеток млекопитающих
краситель CellTrace VioletInvitrogenC34557Фиолетовый флуоресцентный краситель для мониторинга пролиферации клеток
ДМСОSigmaD2650Диметилсульфоксид; растворитель для приготовления основных растворов реагентов
Вторичные антитела ослиные к IgG кролика (H+L) с высокой степенью перекрестной адсорбции, Alexa Fluor™ 488InvitrogenA-21206вторичные антитела (ослиные) к IgG (H+L) кролика, конъюгированные с Alexa Fluor 488
D-PBSVivaCell BiosciencesC3590-0500Дульбекко’фосфатно-солевой буфер для промывки и приготовления реагентов
Фетальная бычья сыворотка (ФБС)GibcoC11995500BTСывороточная добавка для среды культивирования клеток млекопитающих
Фиксируемый краситель для определения жизнеспособности клетокInvitrogen65-0865-14Краситель жизнеспособности с возможностью фиксации для исключения мертвых клеток при проточной цитометрии
Раствор для фиксации и пермеабилизацииBD Biosciences51-2090KZРеагент для фиксации и пермеабилизации для внутриклеточного окрашивания
96-луночный планшет с плоским дномLabgic1151096-луночный планшет с плоским дном для культивирования клеток и анализов по стимуляции
Проточный цитометрBD Biosciencesлазер LSRFortessa-3Трехлазерный проточный цитометр для многоцветного флуоресцентного анализа
Пробка ГольджиBD Biosciences51-2301KZИнгибитор транспорта белков на основе брефелдина А для внутриклеточного окрашивания цитокинов
Гольджи-стопBD Biosciences51-2092KZИнгибитор транспорта белков на основе монензина для внутриклеточного окрашивания цитокинов
Кальциевая соль иономицинаSigmaI3909-1MLИонофор кальция, используемый совместно с PMA для стимуляции клеток
Буфер для пермеабилизации и промывкиBD Biosciences51-20911KZБуфер для пермеабилизации и промывки для внутриклеточного окрашивания
Буфер для лизиса и фиксации PhosflowBD Biosciences5580495× буфер для одновременного лизиса эритроцитов и фиксации лейкоцитов
Буфер для пермеабилизации и промывки Phosflow IBD Biosciences557885Буфер для пермеабилизации на основе метанола для окрашивания внутриклеточных фосфопротеинов
Кроличьи моноклональные антитела к фосфо-рибосомальному белку S6 (Ser235/236) (D57.2.2E)Клеточная сигнализация4858SКроличьи моноклональные антитела к фосфорилированному рибосомальному белку S6 (Ser235/236), клон D57.2.2E
ПМАSigmaP1585-1MGФорбол-12-миристат-13-ацетат; активатор, используемый для стимуляции клеток ex vivo
Рекомбинантный интерлейкин-2 мышиGibco200-02-50UGРекомбинантный интерлейкин-2 мыши для культивирования и экспансии Т-клеток
RPMI 1640Life-LabAC01L064Среда Roswell Park Memorial Institute 1640 для культивирования клеток млекопитающих
Магнитные частицы со стрептавидиномБобер22307Магнитные бусины с покрытием из стрептавидина для обеднения клеточного состава на основе биотинилированных антител
Буфер для окрашивания при проточной цитометрииПожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода.Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода.Буфер для окрашивания при проточной цитометрии; поставщик или формула приготовления не указаны
лабораторная пленка Parafilm MAmcorPM996Гибкая самозатягивающаяся лабораторная пленка для герметизации планшетов, пробирок и культуральных сосудов
Буфер для лизиса и фиксацииBD Biosciences5580495× буфер для одновременного лизиса эритроцитов и фиксации лейкоцитов
FlowJoBD Biosciencesv10.8.1Программное обеспечение версии 10.8.1 для анализа данных проточной цитометрии

Ссылки

  1. De Boer RJ, Yates AJ. Modeling T cell fate. Annu Rev Immunol. 2023;41:513–32.
  2. Chapman NM, Boothby MR, Chi H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nat Rev Immunol. 2020;20(1):55–70.
  3. Liu D, et al. Key links in the physiological regulation of the immune system and disease induction: T cell receptor-CD3 complex. Biochem Pharmacol. 2024;227:116441.
  4. Mariuzza RA, Agnihotri P, Orban J. The structural basis of T-cell receptor (TCR) activation: an enduring enigma. J Biol Chem. 2020;295(4):914–25.
  5. Smith-Garvin JE, Koretzky GA, Jordan MS. T cell activation. Annu Rev Immunol. 2009;27:591–619.
  6. Brownlie RJ, Zamoyska R. T cell receptor signalling networks: branched, diversified and bounded. Nat Rev Immunol. 2013;13(4):257–69.
  7. Au-Yeung BB, et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 2014;15(7):687–94.
  8. Daniels MA, et al. Thymic selection threshold defined by compartmentalization of Ras/MAPK signalling. Nature. 2006;444(7120):724–9.
  9. Snook JP, Kim C, Williams MA. TCR signal strength controls the differentiation of CD4+ effector and memory T cells. Sci Immunol. 2018;3(25):eaas9103.
  10. Flaherty S, Reynolds JM. Mouse naïve CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into T cell subsets. J Vis Exp. 2015;(98):e52739.
  11. Trickett A, Kwan YL. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 2003;275(1–2):251–5.
  12. Kaech SM, Wherry EJ, Ahmed R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nat Rev Immunol. 2002;2(4):251–62.
  13. Gottschalk RA, et al. Distinct NF-κB and MAPK activation thresholds uncouple steady-state microbe sensing from anti-pathogen inflammatory responses. Cell Syst. 2016;2(6):378–90.
  14. Gjergjova F, et al. A fine-tuned comprehensive overview of antibody-driven ex vivo assays for primary murine T cell activation. J Immunol Methods. 2026;548:114055.
  15. Rosenlehner T, et al. Reciprocal regulation of mTORC1 signaling and ribosomal biosynthesis determines cell cycle progression in activated T cells. Sci Signal. 2024;17(859):eadi8753.
  16. Salmond RJ, Emery J, Okkenhaug K, Zamoyska R. MAPK, phosphatidylinositol 3-kinase, and mammalian target of rapamycin pathways converge at the level of ribosomal protein S6 phosphorylation to control metabolic signaling in CD8 T cells. J Immunol. 2009;183(11):7388–97.
  17. Motamedi M, Xu L, Elahi S. Correlation of transferrin receptor (CD71) with Ki67 expression on stimulated human and mouse T cells: the kinetics of expression of T cell activation markers. J Immunol Methods. 2016;437:43–52.
  18. Kalia V, et al. Prolonged interleukin-2Ralpha expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo. Immunity. 2010;32(1):91–103.
  19. Caruso A, et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 1997;27(1):71–6.
  20. Sutermaster BA, Darling EM. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 2019;9(1):227.
  21. Llufrio EM, Wang L, Naser FJ, Patti GJ. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox Biol. 2018;16:381–7.
  22. Quah BJ, Parish CR. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 2012;379(1–2):1–14.
  23. Lemieszek MB, Findlay SD, Siegers GM. CellTrace Violet flow cytometric assay to assess cell proliferation. Methods Mol Biol. 2022;2508:101–14.
  24. Whitmire JK, Ahmed R. Costimulation in antiviral immunity: differential requirements for CD4+ and CD8+ T cell responses. Curr Opin Immunol. 2000;12(4):448–55.
  25. Seder RA, Darrah PA, Roederer M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):247–58.
  26. Carbone F, et al. Cellular and molecular signaling towards T cell immunological self-tolerance. J Biol Chem. 2024;300(4):107134.
  27. Daniels MA, Teixeiro E. TCR signaling in T cell memory. Front Immunol. 2015;6:617.
  28. Knudson KM, et al. Cutting edge: the signals for the generation of T cell memory are qualitatively different depending on TCR ligand strength. J Immunol. 2013;191(12):5797–801.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD8 Tin vitroanti CD3anti CD28TmTORC1T
Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.