Влияние Туины на экспрессию гипоталамического орексина-А и поведение во сне в модели первичной бессонницы у крыс

Краткое содержание

В данном исследовании изучается, облегчает ли Туина бессонницу в модели крыс, регулируя экспрессию гипоталамического орексина-А с помощью поведенческих анализов, иммуногистохимии и количественного ПЦР в реальном времени.

Аннотация

Бессонница — это распространённое нарушение сна, которое приводит к нарушению дневной функции и повышению риска сопутствующих заболеваний, значительно сказываясь на качестве жизни пациентов. Современные методы лечения, в основном когнитивно-поведенческая терапия и фармакотерапия, ограничены такими проблемами, как наркотическая зависимость, толерантность и восстановление после отмены. Терапия Туина доказала свою эффективность в регулировании нервной, эндокринной и иммунной систем, а орексиновая система является ключевым регулятором цикла сна и бодрствования. Это побудило исследовать вопрос, облегчает ли Туина бессонницу, модулируя гипоталамическую орексиновую систему. Этот протокол описывает методы вмешательства Туины в модели первичной бессонницы у крыс, вызванной модифицированным методом многоплатформенной водной среды. Мы рандомизировали 64 крысы Wistar на четыре группы: контрольная, модельная, туина и антагонист орексина. Проводились поведенческие оценки (тест на открытом поле, тест на сон, индуцированный пентобарбиталом), а экспрессия Orexin-A в гипоталамусе была обнаружена с помощью количественного ПЦР и иммуногистохимии в реальном времени. Протокол направлен на оценку эффективности Туины и изучение её возможного механизма, связанного с системой орексина, предоставляя справочник для применения и механистического изучения Туины при нарушениях сна.

Введение

Бессонница, характеризующаяся неудовлетворённостью длительностью или качеством сна, приводящей к нарушениям дневного дня, является распространённой глобальной проблемой здравоохранения с значительной нагрузкой на отдельных людей и системы^{здравоохранения 1,2}. В Китае распространённость бессонницы заметно высока, что ещё больше усугубляет её влияние на общественное^{здоровье 3}. Это расстройство связано с нарушением когнитивных функций, повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний и высокой сопутствующей формой психических состояний, таких как депрессия и^{тревожность 4,5}. Современное клиническое ведение в основном опирается на когнитивно-поведенческую терапию и фармакотерапию, в частности на бензодиазепины и небензодиазепиновые седативно-гипнотики. Однако их долгосрочное применение ограничено зависимостью, толерантностью, остаточными дневными эффектами и симптомами отмены, что подчёркивает необходимость эффективных нефармакологических альтернатив⁶. В клинической практике Туина особенно подходит для пациентов с хронической первичной бессонницей, ищущих нефармакологические вмешательства, особенно для пожилых людей с высоким риском медикаментозной зависимости, а также для беременных или кормящих женщин⁷.

Как краеугольный камень внешней терапии традиционной китайской медицины, Туина продемонстрировала уникальные преимущества в лечении^{бессонницы 8}. Метааналитические данные показывают, что Туина значительно превосходит только лекарства или акупунктуру по общему эффективному показателю (OR = 4,12), качеству сна и тревожно-депрессивным состояниям, с высокой^{безопасностью 9}. Специфические протоколы Туина имеют явные преимущества: традиционный Туина достигает эффективности 89,5% при бессоннице типа мокроты и тепла, а массаж живота снижает уровень рецидива до 14,7% (против 38,2% у традиционного Туина)¹⁰. Трёхэтапный метод Туина повышает эффективность травяной терапии с 80,49% до 92,68%, одновременно улучшая архитектуру сна и профили нейротрансмиттеров¹¹. Клинические исследования и систематические обзоры подтвердили, что Туина может значительно улучшать качество сна, снижать показатели тревоги и депрессии, а также модулировать уровень нейромедиаторов в сыворотке, таких как 5-гидрокситриптамин (5-HT)¹². Считается, что его терапевтические эффекты опосредованы целостной регуляцией нейроэндокринно-иммунной сети. Недавние исследования всё больше сосредоточены на системе орексина — ключевой нейропептидной системе, возникшей из латерального гипоталамуса, которая имеет решающее значение для поддержания бодрствования^{и бодрствования.} Аномальная гиперактивность нейронов орексина связана с патофизиологией бессонницы, в то время как ингибирование этого пути показало терапевтический^{потенциал 14}. Предварительные данные свидетельствуют о том, что манипуляции, такие как растирание живота, могут влиять на уровень Orexin-A в мозге у крыс, страдающих от недосыпания¹², однако систематического исследования того, оказывает ли Туина противобессонный эффект именно за счёт модуляции системы орексина, отсутствует.

Таким образом, основываясь на модели первичной бессонницы у крыс, данное исследование нацелено: (1) Оценить улучшение поведения во сне после стандартизированного вмешательства Туина с помощью поведенческих тестов; и (2) Исследовать основной механизм, изучая, связан ли эффект Туины с понижением экспрессии Orexin-A в гипоталамусе, сравнивая его эффективность с эффективностью антагониста рецептора орексина. Данное исследование направлено на предоставление экспериментальных доказательств центрального механизма болезни Туины при лечении бессонницы.

Протокол

Все экспериментальные процедуры и оценки благополучия животных были одобрены Комитетом по этике животных Синьцзянского медицинского университета (номер одобрения: IACUC-20020158). Протокол следует институциональным рекомендациям по уходу и использованию животных. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Приготовление животных

1. Содержат 64 специфических крыс Wistar без патогенов (SPF) (вес тела 250 г ± 50 г, равномерное распределение пола) в системе барьера SPF при температуре 18–22 °C с 12-часовым циклом светло-тёмный. Обеспечивайте едой и водой на свободе.
2. После недели адаптивного кормления случайным образом разделите крыс на 4 группы (n = 16 на группу): контрольные (группа A), модель (группа B), туина (группа C) и антагонист (группа D).

2. Создание первичной модели бессонницы

ПРИМЕЧАНИЕ: За исключением группы A, крысы из групп B, C и D проходят следующую процедуру моделирования.

1. Подготовьте пластиковый цилиндрический контейнер (верхний диаметр: 30 см, высота: 40 см) в качестве крысиного ящика.
2. Закрепите цилиндрическую платформу (диаметр: 6 см, высоту: 10 см) на дне контейнера.
3. Добавьте воду в ёмкость до тех пор, пока уровень воды не окажется на 1 см ниже поверхности платформы. Поддерживайте температуру воды на уровне 20 °C.
4. Поместите круглую железную сетку (диаметр: 25 см, размер сетки: 1 см) горизонтально внутри контейнера, на 15 см выше платформы. Закрепите сетку на краю контейнера тонкими железными проводами.
5. Положите питьевую воду и еду на железную сетку. Меняйте воду ежедневно, а также очищайте и дезинфицируйте контейнер.
6. Помещайте по одной крысе на каждый контейнер на платформу в течение 8 дней подряд.

3. Оценка модели с помощью теста синергетического сна с пентобарбитала натрия

1. Раствор пентобарбитала натрия готовится путём прямого введения сверхчистой воды. Взвесьте 1,0 г порошка, добавьте стерилизованную сверхчистую воду до 100 мл, растворите и отфильтруйте при 0,22 мкм, чтобы получить раствор 1% (10 мг/мл).
2. На 9-й день вводите всем крысам внутрибрюшинно раствор пентобарбитала натрия в минимальной пороговой дозе, вызывающей сон (определённой в предварительных экспериментах).
3. Зафиксируйте латентность сна (время от инъекции до первой потери рефлекса выпрямления) и продолжительность сна (время от потери до восстановления рефлекса выпрямления). Определите потерю рефлекса выпрямления на 1 минуту как начало сна, а его восстановление — как конец сна.

4. Вмешательство Туина

ПРИМЕЧАНИЕ: Вмешательства начинаются на следующий день после успешной оценки модели и продолжаются один раз в день в течение 14 дней подряд. Группы А и В проходят фиксационную рамку по 10 минут в день. Операторы проходят тщательное обучение перед экспериментом для обеспечения стабильности силы, частоты и ритма.

1. Для группы C зафиксируйте крысу в положении лежа на операционном столе.
2. Аккуратно фиксируйте четыре конечности крысы пятью пальцами левой руки, полностью выпрямляя живот.
3. Выполняйте пресс-туина правой рукой: используйте пульпу дистальной фаланги среднего пальца, чтобы приложить силу в точке Гуаньюань (CV4, расположенная на 25 мм ниже пупка). Оставшиеся четыре пальца держите вытянутыми естественным путём.
4. Двигайте средний палец небольшими переднебоковыми круговыми движениями от плечевого сустава, выполняя круговое трансляционное трение против часовой стрелки на животе.
5. Следуйте замкнутому круговому пути, образованному Цзювэй (CV15, на 5 мм ниже отростка от ксифовидного отростка), Гуаньюань (CV4) и двусторонними точками Даймай (GB26, середина между свободным концом^12-го ребра и верхним краем подвздошного гребня).
6. Поддерживайте плавное, равномерное, непрерывное круговое движение со скоростью 5–7 циклов в минуту.
7. Выполняйте манипуляции против часовой стрелки в течение 5 минут, затем по часовой стрелке 5 минут.
8. Убедитесь, что сила устойчива и твёрдая, чтобы крыса оставалась спокойной и не сопротивлялась. Применяйте интервенцию один раз в день в течение 14 дней.

5. Администрация антагониста

1. Для группы D вводите MK-4305 (10 мг/кг) через внутрижелудочный раствор один раз в день в течение 14 дней. Растворите MK-4305 в обычном физиологическом растворе для приготовления раствора объёмом 5 мл.

6. Открытые полевые испытания

1. После периода вмешательства проводите тест на открытом поле с использованием черного кубического ящика (основание: 100 см × 100 см, высота: 40 см). Разделите пол на 25 равных квадратов серыми линиями (16 периферийных, 9 центральных).
2. Поставьте крысу в центральный квадрат и начните отсчёт времени.
3. Зафиксировать общее пройденное расстояние, количество эпизодов выращивания и время, проведённое в центральной зоне более 3 минут с помощью системы получения изображений.
4. После каждого теста удаляйте фекалии и очищайте пол и внутренние стены 75% этанолом.
5. Работа системы получения изображений
   1. Настройте систему получения изображений. Установите цифровую CCD-камеру (разрешение: 1280 × 720 пикселей; частота кадров: 25 кадров в секунду) вертикально на высоте 1,5 м над открытым полем. Подключите камеру к компьютеру через USB-интерфейс.
   2. Настройте программное обеспечение отслеживания и настройки анализа. Выполняйте автоматическое отслеживание с помощью программного обеспечения для анализа поведенческих видео. Настройте параметры отслеживания следующим образом:
      1. Определите фокус отслеживания как центральную точку (центр масс) крысы.
      2. Установите частоту кадров на 25 кадров в секунду как для получения изображения, так и для анализа.
      3. Калибруйте пространственное разрешение так, чтобы каждый пиксель соответствовал 1,5 мм фактическому расстоянию на основе размеров открытого поля и разрешения видео.
      4. Установите порог вычитания фона на 15 уровней серого (диапазон: 0–255), чтобы отличить крысу от фона.
      5. Установите минимальную продолжительность события на 0,2 с (5 кадров), чтобы минимизировать обнаружение ложноположительных результатов, вызванных шумом.
      6. Разделите открытое поле практически на 5 × 5 квадратов равной площади (зоны 1–25). Определите центральную зону как Зоны 7, 8, 9, 12, 13, 14, 17, 18 и 19 (центральная 3 × 3 квадратов, что составляет 36% от общей площади). Определите периферийную зону как оставшиеся квадраты.
   3. Запишите следующие параметры выхода: общее пройденное расстояние (мм), средняя скорость (мм/с), время неподвижности (с), время передвижения (с), время, проведённое в каждой зоне, расстояние в каждой зоне (мм), количество входов в каждую зону и количество эпизодов выращивания. Проверяйте эпизоды выращивания вручную.

7. Перфузия для иммуногистохимии

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте по 4 крысы из каждой группы для иммуногистохимии.

1. Приготовьте 0,9% физиологического раствора (предварительно прогрета до 37 °C) и 4% раствора параформальдегидов (хранится при 4 °C).
2. Глубоко анестезируйте крыс внутрибрюшинным уретаном (25% раствора, 0,6 мл/100 г массы тела). Подтвердите потерю педалей, роговицы и рефлексов выпрямления.
3. Закрепите крысу на спине на поролоновой доске. Быстро раскройте грудную полость, прорезая кожу, фасцию и грудину.
4. Аккуратно уберите сердце, чтобы открыть аорту. Введите иглу через левую вершину желудочка в аорту, пока кончик иглы не станет виден в просвете аорты. Убедитесь, что игла, левый желудочек и аорта расположены горизонтально.
5. Зажмите аорту и иглу гемостатическими щипцами. Немедленно перережьте правое предсердие, чтобы обеспечить кровоток.
6. Перфузия с 150–200 мл предварительно подогретого солёного раствора 0,9% (37 °C). Успешная перфузия характеризуется бланшированием печени, брыжейки и передних конечностей, а также чистой жидкостью из правого предсердия.
7. Переключитесь на холодный параформальдегид 4% (4 °C) и перфузию 400 мл. Проведите первичную перфузию быстро, пока не появятся фасцикуляции мышц всего тела и затвердевшие конечности. Затем уменьшите расход до 2 капель в секунду, пока все фиксативы не будут перфузированы.
8. Подтверждайте успешную фиксацию, когда мозг кажется бледным и упругим.

8. Вскрытие мозга

1. После перфузии обезглавите крысу и аккуратно извлеките весь мозг из черепа.
2. Разрезайте череп вдоль сагиттального шва ножницами. Отдельте теменные и затылочные кости костными ронжерами.
3. Аккуратно поднимите мозг лопаткой, перерезая черепные и зрительные нервы тонкими ножницами.
4. Для иммуногистохимии: немедленно перевести весь мозг в 4% параформальдегид и постфиксировать при 4 °C в течение 24 часов.
5. Для количественного ПЦР в реальном времени: прополосните поверхность мозга предварительно охлаждённым физиологическим раствором, промокните фильтрующей бумагой, заморозите в жидком азоте на 5–10 минут и храните при -80 °C. Выполняйте все шаги на льду.

9. Иммуногистохимическое окрашивание

1. Внедрить гипоталамическую ткань в парафин и разрезать коронные срезы толщиной 4–5 мкм с помощью микротома. Крепите секции на противодропные затворы, выпекайте при 65 °C в течение 1,5–2 часа.
2. Девосковые срезы в ксилоле I и II (по 10 минут каждая). Регидратировать с помощью сортируемого этанола: безводный этанол I и II (по 5 минут каждый), затем 95%, 90%, 80%, 70% этанола (по 5 минут), затем дистиллированную воду (5 мин).
3. Проведите извлечение антигена, поместив срезы в кипящий буфер цитратов 0,01 м (pH 6,0) в скороварке. Нагревайте, пока клапан давления не поднимется, затем выключите отопление. Замочите 10 минут, затем естественным образом охладите до комнатной температуры.
4. Инактивировать эндогенную пероксидазу путём погружения в свежие 3% H₂O₂ на 10 минут при комнатной температуре. Постирайте 3× с PBS (по 5 минут каждая).
5. Круговые ткани с помощью ручки иммуногистохимии. Нанесите поликлональное антитело кролика против HCRT/Orexin-A (разбавление 1:50, ~50 мкл на слайд). Инкубировать ночь при 4 °C в увлажнённой коробке.
6. На следующий день прогрейте при комнатной температуре 20 минут. Постирайте 3× с PBS (по 5 минут каждая).
7. Примените вторичные антитела, маркированные пероксидазой хрена. Инкубировать 20 минут при комнатной температуре. Постирайте 3× с PBS (по 3 минуты каждая).
8. Нанесите рабочий раствор стрептавидина, маркированный пероксидазой хрена. Инкубировать 20 минут при комнатной температуре. Постирайте 3× с PBS (по 5 минут каждая).
9. Приготовьте раствор хромогена DAB (по 0,85 мл дистиллированной воды + по 50 мкл реагентов A, B, C). Наносите на срезы и прорабатывайте 3–10 минут при комнатной температуре, контролируя под микроскопом. Остановите реакцию, погрузив в воду из-под крана на 3 минуты.
10. Контрокрашивайте гематоксилином в течение 3 минут. Дифференцировать в 1% солянокислотном спирте в течение 1–2 секунд. Синие в водопроводной воде 5 минут.
11. Обезвоживайте с помощью дистиллированной воды (3 мин), 70%, 80%, 90%, 95% этанола (по 3 минуты каждый) и безводного этанола I и II (по 5 минут каждый). Прозрачные в ксилоле I и II (по 5 минут каждая).
12. Нанесите нейтральный бальзам и наносите покрывающий скольжение. Сухой ночью при 37 °C.
13. Наблюдайте и фотографируйте участки с помощью светового микроскопа (40×, 100×, 200×, 400×). Подсчитайте положительные клетки Orexin-A (коричневый гранулярный осад в цитоплазме) с помощью ImageJ.
14. Вычислите общий балл (0–12) как балл интенсивности окрашивания (0 = отрицательный, 1 = светло-жёлтый, 2 = светло-коричневый, 3 = тёмно-коричневый) умноженный на положительный процент клетки (0 = 0%, 1 = 1–25%, 2 = 26–50%, 3 = 51–75%, 4 = 76–100%). Определите 1–5 как низкую экспрессию, 6–12 — как высокую экспрессию.

10. Количественная ПЦР в реальном времени для мРНК Orexin-A

1. Обработка РНК после размораивания тканей должна проводиться в условиях без РНаз. Конкретные требования к РНаз-безсодержащим следующим образом:
   1. Рабочая среда: используйте специальную рабочую зону с РНК, протерённую деконтаминантом РНазы и подвергнувшуюся воздействию ультрафиолетового излучения.
   2. Расходники: используйте сертифицированные центрифугные трубки и наконечники пипеток без РНаз, или, альтернативно, замочите их в воде с 0,1% DEPC, после чего проводите автоклавирование.
   3. Реагенты: используйте буфер лизиса без РНазы и воду, обработанную DEPC.
   4. Операция: Носите перчатки без порошка на протяжении всей процедуры, часто меняйте перчатки и избегайте прямого контакта с внутренней поверхностью расходников и образцами.
   5. Экспериментальная процедура
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этапов экстракции РНК и обратной транскрипции все расходные материалы и инструменты, контактирующие с РНК или реагентами обратной транскрипции, должны быть свободны от РНаз. На стадии амплификации ПЦР, поскольку кДНК является двухцепочечной структурой, а РНаза не может разлагать двухцепочечную ДНК, расходные материалы и инструменты на этом этапе должны быть лишены только ДНКазы и других примесей, которые могут подавлять реакции ПЦР; дополнительное лечение без РНазы не требуется. Измельчить замороженную гипоталамическую ткань под жидким азотом. Взвешивайте 50–100 мг тканевого порошка в пробирку с 1 мл Тризола. Перемешайте и постояте при комнатной температуре 15 минут.
2. Добавьте 200 мкл хлороформа, перемешайте инверсией и выдержите при комнатной температуре 5 минут. Центрифуга при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C.
3. Перенесите верхнюю водную фазу в новую трубку. Добавьте равный объём изопропранола, перемешайте и настайте при –20 °C в течение 35 минут. Центрифуга при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C. Отбросьте супернатант.
4. Промыйте осад с 75% этанолом, центрифугите при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C. Сбросьте супернатант и повторите стирку один раз.
5. Осадка на воздухе при комнатной температуре. Растворить в воде без РНаз.
6. Измерьте концентрацию и чистоту РНК (соотношение A260/A280 1,8–2,1). Оценить целостность с помощью 1% агарозного гелевого электрофореза (чёткие полосы 28S и 18S, слабая или отсутствующая 5S-полоса).
7. Подготовьте реакцию обратной транскрипции (20 мкл): 800 нг общей РНК, 1 мкл случайного праймера (0,1 мкг/мкл), 10 мкл 2× TS Reaction Mix, 1 мкл ферментов TransScript RT/RI Mix, 1 мкл гДНК-удалителя и воду, свободную от РНазы воды до объёма.
8. Инкубировать при 25 °C в течение 10 минут, затем при 85 °C в течение 5 секунд для синтеза кДНК первой цепочки. Разведите cДНК в соотношении 1:1 водой без РНаз.
9. Подготовьте qPCR-реакцию (10 мкл): 5 мкл EvaGreen 2× qPCR MasterMix, 0,3 мкл прямой праймер (10 мкМ), 0,3 мкл обратного праймера (10 мкМ), 1 мкл кДНК-шаблона, РНаз-безсодержательную воду до объёма. Запустите в три экземпляжа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры: Orexin-A-F: 5'-CGCCAGAAGACGTGTTCCT-3'; Orexin-A-R: 5'-GCCGCTTTCCCAGAGTGAG-3' (длина продукта 88 bp); β-Actin-F: 5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'
   β-Actin-R: 5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (длина продукта 150 bp).
10. Запустите программу qPCR: 95 °C в течение 30 секунд (предденатурация); 40 циклов по 95 °C в течение 5 с (денатурация) и 60 °C за 30 секунд (отжиг/удлинение).
11. Проверьте кривые усиления и плавления. Пропустите 5 мкл продукта на 2% агарозном геле для подтверждения специфичности.
12. Вычислите относительную экспрессию мРНК Orexin-A с использованием метода 2^⁻ΔΔCt с β-актином в качестве внутреннего контроля.

11. Статистический анализ

1. Используйте SPSS 26.0 для анализа данных. Выражайте все данные в виде среднего ± стандартного отклонения. Для сравнения двух групп используйте независимые выборки t-теста , если данные распределены в норме; в противном случае используйте тест Манна-Уитни U.
2. Для сравнения между несколькими группами используйте односторонний ANOVA с пост-хок тестом ЛСД на однородные дисперсии или тест Тамхане для гетерогенных дисперсий. Если данные обычно не распределены, используйте тест Kruskal-Wallis H. Рассмотрим P < 0,05 как статистически значимым.

Результаты

Таблица 1 показывает, что по сравнению с группой A латентность сна в группах B, C и D была значительно увеличена, а продолжительность сна — значительно сокращалась после моделирования, что свидетельствует о успешном установлении первичной модели крыс с бессонницей. Результаты в таблице 2 и 3 дают предварительное подтверждение терапевтического эффекта Туины при лечении бессонницы. Открытый полевой тест (OFT) — одна из самых классических и часто используемых парадигм в поведенческой нейронауке для оценки тревожного поведения у^{грызунов 15}. Исследования показали, что предпочтение четырёх углов является чувствительным индикатором для измерения поведения, похожего на тревогу, и при умеренном или низком уровне тревожности оно может быть более разборчивым, чем индикатор центральной области. Крысы модели бессонницы проявляли значительные тревожные проявления поведения и изменения^16,17 в исследовательском поведении, в то время как вмешательство Туины эффективно облегчило тревожное поведение у этих крыс. Результаты молекулярной биологии, представленные в таблице 4, 5 и рисунке 1, дополнительно демонстрируют, что Туина эффективно понижает сверхэкспрессию Orexin-A в гипоталамусе у крыс-моделей бессонницы.

Рисунок 1: Результаты иммуногистохимического окрашивания Orexin-A в гипоталамусе крыс каждой группы (40×, 100×, 200×, 400×). (A) Положительные нейроны Orexin-A были обнаружены в гипоталамической ткани крысы, проявляясь в виде тёмно-коричневых гранулярных сигналов. Балл интенсивности окрашивания составлял 3 балла, процент положительных клеток — 40% (в диапазоне 26–50%, набрав 2 балла), а общий балл — 6 баллов, что соответствует диапазону высокой экспрессии. (B) Количество нейронов, положительных к Orexin-A, в гипоталамической ткани крысы значительно увеличилось по сравнению с нормальной группой, при более плотном распределении положительных клеток. Балл интенсивности окрашивания составлял 3 балла (тёмно-коричневый), процент положительных клеток достиг 80% (в диапазоне 76–100%, набрав 4 балла), а общий балл — 12 баллов, что входит в диапазон высокой экспрессии. (C) Количество нейронов, положительных к Orexin-A, в гипоталамиальной ткани крыс было уменьшено по сравнению с модельной группой. Балл интенсивности окрашивания составлял 3 балла (тёмно-коричневый), процент положительных клеток — 75% (в диапазоне 51–75%, набрав 3 балла), а общий балл — 9 баллов, что входит в диапазон высокой экспрессии. (D) Количество нейронов, положительных к Orexin-A, в гипоталамической ткани крысы также было уменьшено по сравнению с модельной группой. Балл интенсивности окрашивания составлял 3 балла (тёмно-коричневый), процент положительных клеток — 60% (в диапазоне 51–75%, набрав 3 балла), а общий балл — 9 баллов, что входит в диапазон высокой экспрессии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Группа	Задержка сна / минимум	Продолжительность сна / минута
A	4.13 ± 1.80	49.75 ± 38.46
B	6.31 ± 2.80*	22.13 ± 11.41*
C	6.33 ± 2.60*	24.93 ± 14.43*
D	6.53 ± 1.90*	24.73 ± 17.59*

Таблица 1: Сравнение тестов на сон, вызванных пентобарбитом, натрием, среди групп после моделирования. * указывает на P < 0,05 по сравнению с контрольной группой.

Группа	Частота выращивания	Время неподвижности	Время передвижения	Расстояние передвижения (м)	Время в центральной зоне	Расстояние в центральной зоне (м)	Время в угловой зоне	Расстояние в угловой зоне (м)	Время в угловой зоне	Расстояние в боковой зоне (м)
A	1,875 ± 0,835	76 700 ± 34 324	103.350 ± 34.307	18.318 ± 16.314	8.750 ± 7.718	2.937 ± 5.112	103 000 ± 28 582	6.315 ± 3.893	56 600 ± 27 772	6.705 ± 3.666
B	7.125 ± 5.668	31.513 ± 10.964	148.488 ± 10.964	22.399 ± 9.159	16.275 ± 10.703	3.244 ± 2.991	75.088 ± 21.561	6.578 ± 1.972	85.463 ± 23.374	11.724 ± 4.959
T-значение	-2.592	3.547	-3.545	-0.617	-1.613	-0.146	2.205	-0.171	-2.249	-2.302
P-значение	0.035	0.007*	0.007*	0.547	0.129	0.886	0.045*	0.867	0.041*	0.037*

Таблица 2: Анализ влияния каждого уровня индикатора между контрольной группой (A) и модельной группой (B).* показывает , что P < 0,05 по сравнению с контрольной группой.

Группа	Частота выращивания	Время неподвижности	Время передвижения	Расстояние передвижения (м)	Время в центральной зоне	Расстояние в центральной зоне (м)	Время в угловой зоне	Расстояние в угловой зоне (м)	Время в угловой зоне	Расстояние в боковой зоне (м)
B	5.875 ± 2.295	29 819 ± 12 871	150.219 ± 12.867	19.165 ± 8.054	24.838 ± 13.068	3.178 ± 2.438	69.075 ± 13.992	5.823 ± 1.422	83.019 ± 15.464	9.878 ± 4.393
C	6.357 ± 0.627	35.993 ± 32.237	144.021 ± 32.246	23.291 ± 4.873	14.321 ± 3.774	3.106 ± 2.214	87.057 ± 12.658 △	8.087 ± 1.496 △	68.943 ± 9.240	10.420 ± 1.225
D	6.667 ± 1.633	30.808 ± 15.389	149.200 ± 15.380	18.584 ± 4.969	27.792 ± 12.460	3.085 ± 1.114	74.600 ± 22.248	5.744 ± 1.291▲	74.192 ± 17.011	9.465 ± 3.380

Таблица 3: Анализ влияния каждого уровня индикатора между модельной группой (B), группой Туина (C) и группой антагониста (D). ^△P < 0,05 по сравнению с модельной группой (B); ^▲P < 0,05 по сравнению с группой Туина (C).

Группа	Orexin-A
A	1.011 ± 0.173
B	10.436 ± 2.512△
C	2.392 ± 0.998▲
D	3.227 ± 1.703▲

Таблица 4: Уровни экспрессии мРНК Orexin-A в гипоталамусической ткани. ^△P < 0,05 по сравнению с контрольной группой (A); ^▲P < 0,05 по сравнению с модельной группой(B).

Группа	Orexin-A
	Интенсивность окрашивания	Процент положительных клеток	Процентный результат	Партитура
A	3	40%	2	6
B	3	80%	4	12
C	3	75%	3	9
D	3	60%	3	9

Таблица 5: Оценки иммуногистохимического окрашивания Orexin-A в гипоталамусе крыс каждой группы. Критерии оценки интенсивности окрашивания: 0 = отрицательное окрашивание (бесцветное), 1 = светло-жёлтый, 2 = светло-коричневый, 3 = тёмно-коричневый. Критерии оценки положительных клеток: 0 = 0%, 1 = 1%–25%, 2 = 26%–50%, 3 = 51%–75%, 4 = 76%–100%. Общий балл = балл интенсивности окрашивания × процент. Общие оценки от 1 до 5 были определены как низкая экспрессия, а баллы от 6 до 12 — как высокая.

Обсуждение

Целью данного исследования было оценить эффективность Туины в модели первичной бессонницы крыс и изучение её потенциального механизма, связанного с гипоталамической орексиновой системой. Текущие результаты показывают, что стандартизированный протокол Туина значительно улучшил латентность и продолжительность сна, облегчал тревожное поведение и эффективно снижал гиперэкспрессию Orexin-A как на уровнях мРНК, так и белка в гипоталамусе. Примечательно, что эффект Туины был сопоставим с эффектом антагониста рецептора орексина MK-4305, что позволяет предположить, что модуляция системы орексина может быть ключевым механизмом, посредством которого Туина облегчает бессонницу.

По сравнению с фармакологическими вмешательствами, Туина, как неинвазивная внешняя терапия, предлагает преимущества в безопасности, минимальных побочных эффектах и соблюдении требований^{пациентов 12,18}. Его терапевтические преимущества при бессоннице подтверждаются клиническими данными улучшения качества сна и психологического^{состояния 18,19}. Механизм многогранен, включая регуляцию гипоталамо-гипофиз-надпочечниковой оси, гомеостаза вегетативной нервной системы и ключевых нейромедиаторов, таких как 5-HT^18,20. Результаты расширяют это понимание, определяя систему орексина как конкретную цель. Нейроны орексина являются центральными факторами бодрствования, и их гипервозбудимость связана с нестабильностью^сна 21,22,23. Снижение дозы орексина-А, наблюдаемое после Туины, похоже соответствует действию нового препарата для бессонницы — антагониста двух рецепторов орексина, что подчёркивает возможный конвергентный путь между фармакологическими и нефармакологическими^{вмешательствами 24,25}.

Хотя данное исследование основано на нашей ранее опубликованной работе по абдоминальной Туина и^{регламенту 25} по орексину-А, текущая рукопись представляет собой значительное расширение и методологическое уточнение, выходящее за рамки исходного отчёта. В частности, это исследование расширяет размер выборки до 64 крыс для повышения статистической мощности и вводит комплексный набор поведенческих оценок, включая открытый полевой тест и тесты сна, вызванные пентобарбиталом, для систематической оценки архитектуры сна и тревожного поведения, которые не были рассмотрены в предыдущем исследовании. В отличие от предыдущей работы, которая была сосредоточена на окислительном стрессе и классических нейромедиаторах, эта статья уделяет приоритетное внимание функциональной валидации системы орексина через интегрированные поведенческие результаты и молекулярные анализы, выступая как самостоятельное механистическое исследование, которое дополняет, а не воспроизводит предыдущие результаты.

Экспериментальная конструкция придерживалась теории ТКМ, сосредоточившись на брюшной полости и специфических акупунктурных точках, таких как Гуаньюань (CV 4), которая, как считается, тонизирует первобытную Ци и регулирует висцеральную функцию, в рамках замкнутого контура^{манипуляции 26,27}. Параметры (частота, продолжительность, ход) были стандартизированы на основе предварительных работ для обеспечения согласованности и воспроизводимости, что является ключевым аспектом для механистических исследований на^{животных 12}.

Однако у этого протокола есть ограничения. Во-первых, вмешательство проводилось в одну точку времени после моделирования. В будущих исследованиях следует изучать разные продолжительности и частоты вмешательств, чтобы установить оптимальную связь «доза-ответ» для Туины. Во-вторых, это исследование является наблюдательным дизайном. Хотя была обнаружена корреляция между Туиной и снижением экспрессии Орексина-А и улучшением поведения, до сих пор неясно, является ли эта связь прямым или косвенным эффектом Туины или других факторов. Будущие исследования могут использовать экспериментальные стратегии, такие как нокаут гена, хемогенетическое ингибирование или блокада антагониста, чтобы дополнительно проверить, улучшает ли Туина поведение при бессоннице за счёт регуляции экспрессии Orexin-A, тем самым проясняя её причинный механизм. Наконец, это исследование не выявило фиктивную операцию или контрольную группу плацебо-вмешательства. Однако это было учтено при проектировании, и все группы животных получили одинаковый уровень операций захвата и фиксации, которые в определённой степени контролировали влияние неспецифических факторов стресса. Кроме того, частота, интенсивность и путь действия программы Туина в этом исследовании были стандартизированы на основе предварительных экспериментов для обеспечения последовательности и воспроизводимости вмешательства. Будущие исследования должны быть сосредоточены на разработке более строгих методов управления, таких как бесконтактное моделирование или минимальная тактильная стимуляция, чтобы уточнить конкретные эффекты операций Туина.

Ключевые шаги, критически важные для успеха этого протокола, включают: во-первых, строгий контроль температуры воды и размеров платформы в модифицированном методе многоплатформенной водной среды; во-вторых, предэкспериментальное титрование субпороговой дозы пентобарбитала натрия; в-третьих, стандартизация параметров манипуляции Туина (частота 5–7 циклов в минуту, против часовой стрелки, затем по часовой стрелке по 5 минут каждая) и обучение оператора; и в-четвертых, быстрое замораживание гипоталамической ткани в жидком азоте с последующим использованием без РНазы для обеспечения стабильности мРНК Orexin-A.

Возможные модификации включают: во-первых, разработку автоматизированного механического устройства Туина для снижения изменчивости между операторами; во-вторых, использование телеметрии ЭЭГ/ЭМГ для замены теста на пентобарбиталь натрия для сна, что позволяет непрерывно отслеживать стадию сна; и в-третьих, сочетание хемогенетических или оптогенетических подходов для проверки необходимости использования нейронов орексина в опосредовании эффектов Туина.

Воспроизводимость этого протокола основана на детальных рабочих траекториях и параметрах, использовании положительного контрольного препарата, обнаружении двойных измерений на уровнях белков и мРНК, а также строгой статистической отчетности. Его практическая удобство отражается в следующих аспектах: низкие требования к оборудованию для поведенческих тестов без необходимости в дорогих телеметрических системах; Общий экспериментальный цикл составляет всего 8 дней для моделирования и 14 дней для вмешательства Туина, завершающийся в течение 4 недель, что хорошо соответствует циклам финансирования и лабораторным графикам большинства рутинных исследовательских проектов, способствуя быстрому сбору данных и методологической валидации. Кроме того, протокол манипуляции Tuina чётко измеряется с точки зрения рабочей траектории (CV15 → CV4 → двусторонней GB26 → возвращения к CV15), частоте (5–7 циклов в минуту), направленной последовательности (против часовой стрелки, затем по часовой стрелке) и продолжительности (10 мин на сеанс). Эти спецификации позволяют разным операторам освоить технику после краткого обучения, снижая риск низкой воспроизводимости, вызванной индивидуальными различиями, часто встречающимися при ручных манипуляциях.

В процессе внедрения этого протокола могут возникнуть несколько распространённых проблем, и рекомендуются соответствующие меры по устранению неполадок. Во-первых, крысы могут упасть с платформы во время модифицированной процедуры с многоплатформенной водной средой. Обычно это происходит из-за чрезмерно скользкой поверхности платформы. Решение — слегка огрубить поверхность платформы мелкой наждачной бумагой для увеличения трения. Кроме того, в каждом контейнере должна быть только одна крыса, чтобы избежать взаимного беспокойства. Во-вторых, тест на сон с пентобарбитом и натрием может не выявить значимых различий между группами. Решением является повторная титрация минимальной субпороговой дозы шагами по 5 мг/кг во время пилотных экспериментов с использованием отдельной когорты животных (3–4 на группу). Инъекции следует проводить в одно и то же время каждый день (желательно между 9:00 и 11:00 утра), чтобы минимизировать циркадные вариации. В-третьих, крысы могут испытывать трудности или издавать звуки во время манипуляции Туиной, что обычно указывает на чрезмерную силу или неправильное удержание. Оператор должен уменьшить приложенную силу, пока крыса не останется спокойной без сопротивления. Рекомендуется предварительное обучение с манекеном с датчиком давления для стандартизации применения силы. Крыса должна лежать на спине, аккуратно, но надёжно закрепляя все четыре конечности, обеспечивая полное открытие живота. В-четвёртых, большая вариабельность процента положительных клеток Orexin-A в одной экспериментальной группе часто возникает из-за несогласованных плоскостей сечений гипоталамуса, субъективного искажения подсчёта или вариаций окрашения от партии к партии. Рекомендуемое решение — стандартизировать анатомический уровень с помощью атласа мозга крыс (например, Paxinos & Watson), собирая корональные срезы от брегмы –1,8 мм до –3,3 мм для гипоталамусического анализа. Два независимых наблюдателя, ослеплённых к распределению групп, должны выполнять подсчёт ячеек, и использовать среднее значение. Все образцы для данного показателя результата должны быть окрашены в одной партии, а полуавтоматический пороговый анализ с использованием ImageJ рекомендуется для снижения субъективности наблюдателей.

В заключение, в этом исследовании был установлен стандартизированный протокол вмешательства Туина и многоуровневая система оценки в первичной модели бессонницы. Она предоставляет убедительные доказательства того, что Туина улучшает поведение при бессоннице, возможно, через механизм, связанный с подавлением гипоталамусической гиперэкспрессии Orexin-A. Эта методологическая основа не только предлагает воспроизводимую парадигму для изучения центральных механизмов Туина, но и служит ориентиром для механистических исследований других нефармакологических вмешательств при расстройствах сна.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
5x All-In-One RT MasterMix	abm	G492	синтез cDNA
Ацетилхолин (Ach)	Nanjing Jiancheng	A105-1	реагент для ELISA
Микросkopические слайды для адгезионного микроскопа	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	монтаж тканевых секций
Агароз	Sangon Biotech (Shanghai)	A811BA0014	гель-электрофорез
Безводный этанол	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	дегидратация тканей
Буфер для разбавления антител	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9029	разбавление первичного антитела
Корзинка	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	N/A	держатель для слайдов
Цитратный порошок	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	MVS-0066	приготовление буфера для извлечения антигена
Покрывное стекло	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	микроскопия
DAB хромогенный набор	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	DAB-1031	хромогенная детекция
DEPC	Sangon Biotech (Shanghai)	B417BA0001	обработка без RNase
Допамин (DA)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08660r	реагент для ELISA
Электрофорезная камера	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYCZ-21	гель-электрофорез
Питание электрофорезной камеры	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYY-6C	гель-электрофорез
EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix-Low Rox	abm	G891 / MasterMix-EL	реагент для qPCR
Гамма-аминомасляная кислота (γ-GABA)	AMOKE	AE91068Ra	реагент для ELISA нейромедиаторов
Система визуализации гелях	Shanghai Tanon	2500	документация гелях
H2O2 (30%)	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	блокирование эндогенной пероксидазы
Раствор гематоксилина для окрашивания	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	CTS-1097	контрастное окрашивание
Высокоскоростный охлаждаемый центрифуг	Shanghai Lishen Scientific Equipment Co., Ltd.	Nefuqe 15R	центрифугирование образцов
Гистамин (HIS)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	EH171-1	реагент для ELISA
Сушилка с горячим воздухом	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	DHG series	сушка образцов
Чаша влажности для IHC окрашивания	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	BOX-1001	влажная инкубационная камера
Комплект для иммуногистохимического окрашивания	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	SP9000	IHC окрашивание
Инкубатор	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	DNP-9272	инкубация с контролем температуры
Индукционная плита	Guangdong Midea Living Electric Manufacturing Co., Ltd.	C21-RK2101	источник тепла
Микроплитковый анализатор	Bio-Rad, China	xMark	измерение оптической плотности
Микроскоп	Nikon	E200	микроскопическое изображение
MK-4305	Meilun Bio	MB3773	экспериментальный реагент
Нейтральный бальзам	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9555	монтажное средство
Норэпинефрин (NA)	Nanjing Jiancheng	H096	реагент для ELISA
Квантификатор нуклеиновых кислот и белков	Beijing Kaiao	K5500	количественное определение нуклеиновых кислот
Орексин А	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08860r	реагент для ELISA
ПЦР термоциклер	Bio-Rad, USA	MyCycler Thermal Cycler	амплификация ПЦР
Фосфатный буферный раствор (PBS)	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PBS-0060/0061	буфер для промывания
Пипетка	Eppendorf, Germany	Dragon lab	обработка жидкостей
Автоклав	Zhejiang Supor Co., Ltd.	YW20F1	извлечение антигена
Комплект для определения количества белка	TransGen Biotech	DQ111-01	комплект для определения количества белка BCA
Кроликовое поликлональное антитело против HCRT (Орексин-А)	Sangon Biotech (Shanghai)	D163595	первичное антитело
Инструмент для реального времени ПЦР	ABI (Thermo Fisher)	QuantStudio 6 Flex	анализ qPCR
Холодильник	Hefei Meiling Co., Ltd.	BCD-249LCK	хранение образцов
Серотонин (5-HT)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08364r	реагент для ELISA
Банка для окрашивания	Generic	N/A	контейнер для окрашивания слайдов
Перо для супер иммуногистохимии	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PEN-0002	гидрофобная барьерная ручка
Trans2K DNA маркер	TransGen Biotech	BM101	DNA лестница
TRIzol реагент	Ambion	15596026	экстракция РНК
Вортекс-миксер	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.	GL-88B	лабораторный миксер
Ксилол	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/