Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Индуцированные человеком индуцированные плюрипотентные кардиоиды, полученные из стволовых клеток, в качестве модели для оценки доставки олигонуклеотида

219 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/72013

⸱

11 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Gulbenkian Institute for Molecular Medicine, 2Novo Nordisk Center for Optimized Oligo Escape, University of Copenhagen, 3Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол позволяет создавать самоорганизующиеся кардиоиды на основе кардиомиоцитов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток для микроскопической оценки флуоресцентно маркированного олигонуклеотида.

Аннотация

Терапии на основе олигонуклеотида представляют собой быстро развивающийся класс препаратов с значительным потенциалом для лечения сердечно-сосудистых заболеваний; Однако достижение эффективной доставки в сердечную ткань остаётся критической и нерешённой задачей. Ключевым препятствием является ограниченная доступность надёжных, физиологически значимых человеческих in vitro моделей, способных поддержать количественную оценку поглощения и внутриклеточного распределения олигонуклеотидами. Представлен подробный, пошаговый протокол для создания самоорганизующихся 3D-кардиоидов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) и их применения в качестве платформы для оценки поглощения флуоресцентно маркированных олигонуклеотидов. Протокол направляет пользователей через направленную дифференцировку сердца в суспензионной культуре путём временной модуляции сигнализации Wnt/β-катенина, что позволяет последовательно спецификовать iPSC на этапах мезодермы, сердечной мезодермы и кардиомиоцитов. В таких условиях клетки спонтанно собираются в трёхмерные структуры, содержащие полости, которые экспрессируют канонические маркеры кардиомиоцитов. Полученные кардиоиды предоставляют масштабируемую, экспериментально управляемую платформу для оценки эффективности поглощения олигонуклеотида на основе визуализации, поддерживая разработку и оптимизацию стратегий доставки для кардиологических приложений.

Введение

Терапевтические средства на основе олигонуклеотидов, преимущественно антисенсовые олигонуклеотиды (ASO) и малые интерферирующие РНК (siRNA), быстро развиваются как трансформирующий и высокоспецифический подход к лечению широкого спектра заболеваний, включая как наследственные, так и приобретённыесостояния 1,2,3. Эти методы обеспечивают прямую модуляцию экспрессии генов на уровне мРНК через последовательно-специфическое связывание с целевой транскриптой, что позволяет заглушать или корректировать сплайсингом генов, связанных с заболеваниями, которые часто недоступны для традиционных малых молекулярныхтерапий 4,5. Таким образом, генная терапия на основе олигонуклеотида предоставляет универсальную платформу для воздействия различных патогенных механизмов в различных областях заболеваний, включая сердечно-сосудистыезаболевания 6. На сегодняшний день несколько терапевтических средств на основе олигонуклеотидов, включая ASO, siRNA и агенты для переключения сплайсов, были одобрены дляклинического применения 7. Несмотря на этот прогресс, их терапевтическая эффективность как в доклинических, так и в клинических условиях остаётся ограниченной неэффективной внутриклеточнойподачей 8. Текущие оценки показывают, что менее 1% интернеротизированных олигонуклеотидов выходят из эндосомных компартментов, чтобы добраться до цитозолея и активировать целевой РНК, тем самым ограничивая функциональнуюактивность 9,10. Это ограничение особенно заметно в сердечной ткани, где поглощение и внутриклеточный трафик плохо изучены.

Исторически доклиническая оценка сердечно-сосудистых средств в значительной степени опиралась на животные модели, которые остаются незаменимыми для оценки фармакокинетики, биораспределения, эффективности и безопасности in vivo. Однако важные межвидовые различия в физиологии сердца, регуляции генов и клеточных ответах часто ограничивают их способность точно предсказывать терапевтическую эффективность и токсичность у человека. Эти ограничения способствовали разработке моделей in vitro, основанных на человеке, с повышенной физиологической значимостью. Среди них технология индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) революционизировала моделирование сердечно-сосудистых заболеваний, предоставив практически неограниченный источник клеток, которые можно дифференцировать в сердечно-сосудистые линии. Кардиомиоциты, полученные от iPSC человека (iPSC-CMs), воспроизводят многие молекулярные, структурные и функциональные свойства человеческого миокарда и стали широко используемой платформой для изучения механизмов заболеваний, ответов на лекарства и новых терапевтическихметодов 11. Однако традиционные двумерные культуры человеческих iPSC-CM имеют важные ограничения. Большинство протоколов дифференцировки генерируют кардиомиоциты, похожие на эмбриональные, а не взрослые клетки, обладающие незрелыми структурными, электрофизиологическими, метаболическими и сократительнымисвойствами 12.

Кроме того, монослойные культуры не имеют трёхмерной (3D) структуры тканей, многоклеточных взаимодействий и внеклеточного матриксового состава, влияющих на функцию кардиомиоцитов in vivo. Для решения этих задач были разработаны всё более сложные 3D-кардиологическиемодели 13. Среди них инженерные сердечные ткани (EHT), образованные путём встраивания iPSC-CMs в каркасы биоматериалов и применения механической и электрической стимуляции, способствуют структурному и функциональному созреванию, при этом более точное воспроизведение биомеханической среды родногомиокарда 13. Хотя EHT предоставляют высоко физиологически значимые платформы для моделирования заболеваний и тестирования лекарств, их генерация обычно требует специализированных знаний в биоинженерии и специализированного оборудования. С другой стороны, экс-виво срезы сердечной ткани наиболее точно сохраняют нативную структуру тканей и клеточный состав, но зависят от доступа к первичной сердечной ткани, имеют ограниченную жизнеспособность в культуре и не являются легко масштабируемыми.

В последнее время сердечные органоиды появились как доступные трёхмерные модели, которые воспроизводят ключевые аспекты организации и функций сердечнойткани 14. Кардиоиды — это самособирающиеся сердечные органоиды, состоящие преимущественно из кардиомиоцитов, которые проходят внутреннюю спецификацию, пространственное формирование и морфогенез, формируя камерообразные, содержащие полостиструктуры 15,16. Методы формирования кардиоидов обычно опираются на начальную активацию Wnt-сигнализации для индуцирования мезодермической спецификации, а затем на последующее ингибирование для стимулирования связки сердечной линии. Кардиоиды могут генерироваться как в статических, так и в перемешиваемых суспензионных культурах, которые поддерживают масштабируемое производство и улучшают самоорганизациютканей 15,16,17,18,19. Более сложные многолинейные кардиорганоиды, включающие эндотелиальные, эпикардиальные или другие типы клеток, дополнительно повышают физиологическую значимость, но требуют более сложных протоколов дифференцировки, более длительных периодов культурирования и обширнойоптимизации 13,14.

Представлен простой, воспроизводимый и эффективный протокол для получения самоорганизующихся кардиоидов на основе кардиомиоцитов из человеческих iPSC и их применения для оценки поглощения флуоресцентно маркированных олигонуклеотидов. Протокол должен оказаться ценным для исследователей, стремящихся оптимизировать химию олигонуклеотидов и стратегии доставки для сердечно-сосудистых целей. Все материалы, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культивирование и подготовка iPSC для дифференциации

ВНИМАНИЕ: Выполняйте все открытые контакты с клетками и средами в сертифицированном шкафу класса II по биобезопасности. Наденьте халат и перчатки. Дезинфицируйте рабочие поверхности и жидкие отходы соответствующим дезинфицирующим средством.

  1. Поддерживайте iPSC.
    1. Покрытие посевных пластин соответствующей матрицей базальных мембран согласно инструкциям производителя.
    2. Подавайте iPSC определённой, свободной от кормления плюрипотентной стволовой клеточной средой и заменяйте её каждые 24 часа.
    3. Поддерживайте культуры ниже перекрытий и проходящих клеток, когда они достигают 70–80% совпадения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что iPSC сохраняют высококачественную, недифференцированную морфологию и подтверждают отсутствие микоплазмы перед началом дифференцировки.
  2. Переход до дифференциации.
    1. Размораживайте iPSC и расширяйте клетки как минимум на два прохода перед началом дифференцировки сердца.
    2. Проходные клетки с использованием метода диссоциации без ферментов PBS-EDTA, совместимого с поддержанием iPSC.
      ТОЧКА ПАУЗЫ: Поддерживайте iPSC в культуре до достижения 70–80% слияния и сохраняйте типичную морфологию без признаков спонтанной дифференцировки.

2. Подготовка iPSC заполнителей в микроскважинных пластинах

  1. Диссоциировать iPSC в суспензию с одной ячейкой.
    1. Аспирируйте среду и один раз промывайте клетки с 1 мл 1× PBS.
    2. Добавьте раствор для отслоения клеток (Аккутазу) при 500 мкл на одну лунку шестиколочной пластины и инкубировать при 37 °C в течение 5–7 минут.
    3. Добавьте 1,5 мл промывального материала на каждую скважину и аккуратно подвесьте для создания суспензии с одной ячейкой.
    4. Перенесите подвеску в коническую трубку объёмом 15 мл и центрифугу при 200 × г на 3 минуты при комнатной температуре.
    5. Аспирировать супернатант и ресуспензировать клеточную гранулу в iPSC без питания и дополняемую ингибитором ROCK (последние 10 мкм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Корректируйте время диссоциационной инкубации для каждой линии iPSC, проверяя отселение на 5 минут и при необходимости увеличивая небольшие шаги.
  2. Посчитайте клетки и подготовьте плотность брони.
    1. Считать жизнеспособные клетки с помощью стандартного метода подсчёта клеток.
    2. Подготовьте суспензию с одной ячейкой с температурой 0,9 × 106 клеток/мл для каждой ямы агрегационной пластины с микроколодцами диаметром 800 мкм (формат на 24 ямы, ~300 микроскважин/скважину).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте количество ячеек на одну скважину, так как размер агрегата или эффективность дифференцировки различаются между линиями iPSC.
  3. Заготовьте пластину Microwell и удалите пузырьки.
    1. Добавьте в каждую скважину 500 мкл iPSC среды без питания с ингибитором породы (финальные 10 мкм).
    2. Центрифугуйте пластину микроколодца при 300 × г в течение 3 минут при комнатной температуре, чтобы удалить пузырьки воздуха из микроколодцев.
      ВАЖНО: Полностью удалите все пузырьки, чтобы обеспечить равномерное отложение клеток на дне каждой микроскважины и эффективное формирование агрегата.
  4. Засеять iPSC в микроколодцы.
    1. Добавьте 1,0 мл подготовленной одноклеточной суспензии (0,9 × 106 клеток/мл) в каждую скважину, что соответствует 0,9 × 106 элементов на яму.
    2. Аккуратно подвешивайте в колодце 3–5 раз с помощью P1000 и избегайте появления пузырьков воздуха.
    3. Центрифугуйте пластину при температуре 200 × г в течение 3 минут при комнатной температуре, чтобы клетки погрузили в микроколодцы.
    4. Проверьте под микроскопом, что клетки осели в микроколодцах, прежде чем поместить пластину при температуре 37 °C с 5% CO₂ на 24 часа.
      ВАЖНО: Аккуратно обращайтесь с пластиной после центрифуга. Не перемешивайте и не трясите пластину, так как это может привести к выходу клеток из микроколодцев.

3. Расширение iPSC заполнителей в микроскважинах

  1. Аккуратно аспирируйте и заменяйте среду, не нарушая и не смещая заполнители.
    1. Наклоните пластину и медленно аспирируйте примерно 1,0 мл среды из каждой скважины с помощью пипетки P1000, чтобы заполнители оставались сидящими в микроколодцах.
    2. Оставшиеся ~500 мкл среды медленно аспирируйте с помощью пипетки P1000.
    3. Добавьте 1,5 мл iPSC среды без питания в каждую скважину, медленно наливая его по стороне с помощью серологической пипетки.
    4. Инкубировать при 37 °C, 5% CO₂ и повторять замену среднего вещества ежедневно.
      КРИТИЧНО: Наносите среду на стенку скважины и избегайте прямого потока на заполнители.

4. Кардиальная дифференцировка агрегатов iPSC (с 0 по 12-й день)

  1. Индукция мезодермы (День 0).
    1. Удалите среду с помощью метода мягкой аспирации, описанного в шагах 3.1.1–3.1.2.
    2. Добавьте 1,5 мл на каждую лунку базальной среды с добавлением 2% B27 минус инсулина и активатором пути Wnt/β-катенина (CHIR99021, итоговая концентрация: 11 мкм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 10 мМ стандартного раствора CHIR99021 — маломолекулярного ингибитора гликогенсинтазакиназы-3 (GSK-3). Для достижения конечной концентрации 11 мкм добавьте 1,65 мкл стандартного раствора к 1,5 мл среды.
  2. Средняя смена после индукции (первый день).
    1. Через 24 часа после добавления CHIR99021 аккуратно аспирируйте среду из каждой колодцы.
    2. Добавьте 1,5 мл свежей базальной среды на каждую лунку, дополненную 2% B27 минус инсулин, затем инкубировать 48 часов.
      КРИТИЧНО: Строго соблюдайте тайминг шагов модуляции Wnt, так как отклонения могут снизить эффективность дифференцировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После воздействия активатора пути Wnt/β-катенин ожидается некоторая гибель клеток. Если наблюдаются масштабные потери агрегата, рассмотрите возможность снижения концентрации активатора в будущих экспериментах.
  3. Кардиологическая активность через ингибирование WNT (день 3).
    1. Подготовьте кондиционированную среду, передав 760 мкл отработеной среды из каждой скважины в стерильную коническую трубку объёмом 50 мл.
    2. Для каждой скважины добавьте 760 мкл свежей базальной среды с добавлением 2% B27 минус инсулин в пробирку с облегченным кондиционированным материалом и аккуратно перемешайте.
    3. Добавьте ингибитор пути Wnt, IWP4, в смешанную среду до конечной концентрации 5 мкм и несколько раз аккуратно инвертируйте трубку для смешивания.
    4. Аккуратно аспирируйте оставшуюся среду из каждой скважины, затем добавляйте 1,5 мл в каждую ямку кондиционированной среды с дополнением IWP4.
    5. Инкубировать при 37 °C с 5% CO₂ в течение 48 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте запасной раствор ингибитора пути Wnt IWP4 объемом 1 мм. Для достижения конечной концентрации 5 мкм добавьте 7,6 мкл стандартного раствора на 1,52 мл общей среды (760 мкл кондиционированной среды + 760 мкл свежей базальной среды) для каждой скважины.
  4. Среднее изменение микроколодцев (день 5).
    1. Заменить среду с помощью метода мягкой аспирации, описанного в шагах 3.1.1–3.1.2.
    2. Добавьте в каждую скважину 1,5 мл базальной среды с добавлением 2% B27 минус инсулин, затем инкубировать при 37 °C с 5% CO₂ в течение 48 часов.
  5. Перемещение агрегатов из микроскважин в пластины с 6 колодцями (день 7).
    1. Аккуратно аспирируйте среду из каждой ямы, используя метод мягкой аспирации, описанный в шагах 3.1.1–3.1.2.
    2. Добавьте 1,0 мл базальной среды с добавлением 2% B27 с инсулином в каждую яме пластины микроколодца. Используя пипетку P1000, аккуратно протяните среду вверх и вниз пять раз, одновременно двигая кончик пипетки по кругу по поверхности скважины, чтобы вытеснить заполнители из микроскважины и перевести их в суспензию.
    3. Переместить суспензию агрегата в одну скважину необработанной 6-колодцевой культурной плиты.
    4. Промыйте каждую яду, добавляя 1,0 мл свежей среды два-три раза, чтобы восстановить оставшиеся заполнительницы, перенеся каждый промыватель в ту же яму, что и пластина с 6 колодцами.
    5. Инкубировать при 37 °C с 5% CO₂ в течение 72 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается наличие мёртвых клеток и клеточного мусора после переноса агрегата. Большая часть мусора будет удалена во время последующего изменения среды.
  6. Среднее изменение во время культуры подвешивания (день 10).
    1. Аккуратно перемешайте пластину, чтобы убрать слабо прикреплённые заполнятели.
    2. Наклоните пластину, чтобы заполнители оселились на дне скважины под действием силы тяжести.
    3. Аккуратно вдыхайте отработанную среду, не нарушая и не аспирируя заполнители.
    4. Добавьте 2,0 мл свежей базальной среды с добавлением 2% B27 с инсулином в каждую скважину и инкубировать при 37 °C с 5% CO₂ в течение 48–72 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Спонтанное избиение обычно наблюдается примерно с 10-го дня.
      ТОЧКА ПАУЗЫ: Отбивающие кардиоиды можно поддерживать в суспензионной культуре для длительного созревания, заменяя среду каждые 2–3 дня.

5. Микроскопическая характеристика кардиоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод предоставляет рабочий процесс для гистологической характеристики кардиоидов с использованием криосечений. Полученные срезы могут использоваться для различных гистологических анализов, включая окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) для оценки общей структуры тканей и маркировку иммунофлуоресценцией для оценки идентичности кардиомиоцитов.

  1. Фиксация и криосекция.
    1. Зафиксируйте кардиоиды в 4% параформальдегиде на ночь при 4 °C.
      ВНИМАНИЕ: Параформальдегид токсичен и, вероятно, является канцерогеном; Держите его в вытяжном контейнере с химическими парами, надевая соответствующие средства индивидуальной защиты. Соберите все отходы, содержащие параформальдегид (фиксаторы и промывки), в чётко маркированный контейнер для альдегидов/химических опасных отходов и утилизировать их в соответствии с институциональными процедурами по опасным отходам.
      БЕЗОПАСНОСТЬ: Выполняйте всю фиксацию и обращение с параформальдегидами в вытяжке с химическим паром, надевая соответствующие средства индивидуальной защиты.
    2. Три раза промывайте с помощью PBS и криопротектируйте фиксированные кардиоиды в 30% сахарозы в PBS на ночь при 4 °C.
    3. Внедрить кардиоиды в желатин, заморозить и вырезать криосекции толщиной 10 мкм на микроскопические стекла. Храните секции при −20 °C до использования.
  2. Иммуномаркировка.
    1. Разморозьте секции 15 минут при комнатной температуре.
    2. Промывайте секции в PBS при 37 °C в течение 10 минут, дважды.
    3. Обведите интересующую область на каждом слайде гидрофобной ручкой, чтобы создать колодцу, сохранившую растворы блокировки и антитела.
    4. Регидратировать срезы на 2–3 минуты в буфере проницаемости (PB; PBS содержит 0,1% Tween-20) в банке Coplin.
    5. Снимите затворы из PB, слейте лишний раствор и поместите затворы в влажную камеру.
      КРИТИЧНО: С этого момента крайне важно не давать разделам высохнуть.
    6. Блокируйте срезы 200–300 мкл PB с 5% плодовой сывороткой бычьей крупной рогатой рогатости на 90 минут при комнатной температуре в влажной камере.
    7. Удалять блокирующий раствор и инкубировать секции ночью при 4 °C с 100 мкл первичного антитела (анти-cMYBP-C; 1:50), разбавленных в блокирующем растворе (PB содержит 1% FBS).
    8. Промыйте стекла три раза с PB и инкубируете 2 часа при комнатной температуре с зелёным флуоресцентным антителом против мышей (1:200), фар-красным флуоресцентным фаллоидином (1:400) и DAPI (1 мкг/мл).
    9. Три раза промывайте в PB и крепите с помощью антифейдного крепления.
      ВНИМАНИЕ: Соберите все растворы, содержащие флуоресцентные красители (вторичные антитела, фаллоидин, растворы для окрашивания DAPI, а также соответствующие промывки) в контейнер и утилизируйте их как химические отходы согласно институциональным рекомендациям.
  3. Получение изображений.
    1. Получите конфокальные изображения с помощью лазерно-сканирующего конфокального микроскопа с массивным детектором для сверхразрешения с использованием масляного погружения объектива 10× и 63×/1,40.
    2. Возбудить дальнокрасную фторофорную, зелёную фторофорную и ядерную окрашивание с помощью лазерных линий диаметром 639 нм, 488 нм и 405 нм при передаче лазеров 4,0%, 4,0% и 1,0% соответственно.
    3. Получите отдельные оптические секции с размером пикселей 0,0353 × 0,0353 мкм2, однонаправленное сканирование, скорость сканирования 6, зум 1,7, среднее значение линии 1 и время задержки пикселей 0,935 мкм на пиксель.
    4. Применяйте обработку изображений с сверхразрешением с помощью детектора массива с использованием автоматической фильтрации Винера.

6. Анализ на поглощение флуоресцентных олигонуклеотидов

  1. Приготовьте стандартный раствор флуоресцентно маркированного олигонуклеотида, конъюгированного с пальмитиновой кислотой, чтобы повысить липофильность.
    1. Восстановить лиофилизированный флуоресцентно маркированный олигонуклеотид в воде без нуклеазы до конечной концентрации 1 мМ. Кратковременно вихрь и центрифуга при 3 000 × г в течение 30 секунд, чтобы собрать раствор на дне трубки.
    2. Приготовьте одноразовые аликвоты раствора запаса на 1 мм и храните при −20 °C, защищённых от света.
    3. В день эксперимента добавьте 1 мкл из 1 мМ запаса в 1 мл кардиоидной культурной среды, чтобы получить итоговую концентрацию олигонуклеотида 1 мкм. Смешивайте с помощью мягкого перемешивания пластинами.
  2. Инкубировать кардиоиды флуоресцентно маркированным олигонуклеотидом (конечная концентрация 1 мкм) в безсывороточной среде при 37 °C с 5% CO₂ в течение 24 часов.
  3. Промыйте кардиоиды три раза фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для удаления внеклеточных олигонуклеотидов.
  4. Зафиксируйте кардиоиды в 4% параформальдегиде на 20 минут при комнатной температуре, затем три раза промывайте PBS и продолжайте флуоресцентную маркировку перед снимком.
  5. Инкубировать целые фиксированные кардиоиды ночью при 4 °C, защищённые от света, в PBS, содержащем 5 мкг/мл агглютинина из зародышей пшеницы (WGA), конъюгированном с зелёным флуорофором и 1 мкг/мл DAPI. Три раза постирайте в PBS и крепите с помощью антифейдного крепления.
    ВНИМАНИЕ: Соберите все среды и промывки, содержащие олигонуклеотиды и флуоресцентные красители, включая маркированную олигонуклеотидную инкубационную среду с шага 6.2 и раствор для окрашивания WGA/DAPI, в отдельный контейнер и утилизируйте их как химические/биологически опасные отходы в соответствии с институциональными рекомендациями.
  6. Получите конфокальные изображения поглощения и распределения олигонуклеотида.
    1. Получите конфокальные изображения с помощью лазерно-сканирующего конфокального микроскопа с массивным детектором для сверхразрешающей съёмки и 40× водяным погружением объективом. Получайте изображения в виде 8-секционных z-стеков с размером z-step 2 мкм, общей глубиной 16 мкм.
    2. Возбудить ядерную окраску, мембранный маркер и дальний красный флуоресцентно маркированный олигонуклеотид с помощью лазерных линий 405 нм, 488 нм и 639 нм с лазерной передачей 0,9%, 0,2% и 3,0% соответственно.
    3. Получите изображения с размером вокселей 0,0449 × 0,0449 × 2 мкм3, двусторонним сканированием, скоростью сканирования 5, средним уровнем линии 1 и временем задержки пикселя 1,51 мкм на пиксель. Применяйте обработку изображения Airyscan/сверхразрешения с использованием автоматической фильтрации Винера.
    4. Сохраняйте все настройки обнаружения (мощность лазера, усиление детектора, z-шаг и размер вокселя) постоянными во всех z-позициях и по всем образцам, чтобы позволить достоверное сравнение сигнала олигонуклеотида между условиями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 1 обобщает рабочий процесс дифференцировки и иллюстрирует характерные морфологические изменения, ожидаемые на каждом этапе протокола — от агрегации iPSC до формирования самоорганизующихся кардиоидов. Агрегация микроскважин на основе подвески предоставляет простой и стандартизированный подход к параллельной генерации большого числа кардиоидов с контролем размера. Успешная дифференциация характеризуется образованием заполнителей равномерного размера, з...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Терапевтические средства на основе олигонуклеотидов стали мощным классом генно-таргетных методов, поддерживаемых десятилетиями достижений в химии олигонуклеотидов, которые улучшили специфическую мишень, метаболическую стабильность и иммуногеннуюпереносимость 7,8. Несмотря на растущее число клинически одобренных РНК-терапевтических средств, их широкое применение остаётся ограниченным неэффективной внутриклеточной...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

Мы благодарим членов Центра вызовов Фонда Ново Нордиск по оптимизированному побегу олиго, в частности Кнуду Йенсену за проектирование и синтез олигонуклеотидов, а также Никоса С. Хацакиса и Томаса Кирххаузена за ценные рекомендации по количественной визуализации и анализу внутриклеточного трафика. Эта работа была профинансирована Центром вызовов Фонда Ново Нордиск по оптимизированному побегу от олиго (NNF23OC0081287). М.Ф. получил стипендию от Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Португалия (2020.04836.BD). Мы благодарим GIMM Bioimaging и GIMM Histopathology Platforms (Лиссабон, Португалия) за техническую помощь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochlorideThermo Scientific62248DAPI
10× dry objectiveZeissEC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objectiveZeissLD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objectiveZeissPlan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 
800-µm microwell aggregation plateSTEMCELL Technologies34815AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera AndorAndor Neo 5.5 
Antifade mounting mediumVector LaboratoriesH-1000-10VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×GibcoA18956-01B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×Gibco17504-044B27 Supplement 50×
Basal MediumGibco21875-034RPMI 1640
Basement-membrane matrixGibco / CorningA14132-02 / 354230Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope EVOSEVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solutionSTEMCELL Technologies07922ACCUTASE
confocal microscopeZEISSZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance mediumSTEMCELL Technologies100-0276mTeSR Plus
DMEM/F12Gibco31331-028DMEM/F12
Non-treated 6-well plateAvantor (VWR)734-2777Untreated 6-well Plate
PhalloidinThermo ScientificA22287Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)Gibco14190-144DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3Santa Cruzsc-137181MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitorSTEMCELL Technologies72304ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)Thermo ScientificA-11017F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplementGibco10828028KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugateInvitrogen W11261WGA
widefield microscopeNikonNikon Eclipse Ti 
WNT pathway inhibitorSTEMCELL Technologies72552IWP4
Wnt/β-catenin pathway activatorSigmaSML1046CHIR99021

Ссылки

  1. Kulkarni JA, Witzigmann D, Thomson SB, Chen S, Leavitt BR, Cullis PR, et al. The current landscape of nucleic acid therapeutics. Nat Nanotechnol. 2021;16(6):630-43.
  2. Lauffer MC, van Roon-Mom W, Aartsma-Rus A, Collaborative N. Possibilities and limitations of antisense oligonucleotide therapies for the treatment of monogenic disorders. Commun Med (Lond). 2024;4(1):6.
  3. Lee HG, Kim J, Jang CY, Shin M. Antisense Oligonucleotide Therapeutics Targeting Age-Related Diseases. BioDrugs. 2026;40(2):237-61.
  4. Roberts TC, Langer R, Wood MJA. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(10):673-94.
  5. Corey DR, Damha MJ, Manoharan M. Challenges and Opportunities for Nucleic Acid Therapeutics. Nucleic Acid Ther. 2022;32(1):8-13.
  6. Gotthardt M, Badillo-Lisakowski V, Parikh VN, Ashley E, Furtado M, Carmo-Fonseca M, et al. Cardiac splicing as a diagnostic and therapeutic target. Nat Rev Cardiol. 2023;20(8):517-30.
  7. Liu M, Wang Y, Zhang Y, Hu D, Tang L, Zhou B, et al. Landscape of small nucleic acid therapeutics: moving from the bench to the clinic as next-generation medicines. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):73.
  8. Sun X, Setrerrahmane S, Li C, Hu J, Xu H. Nucleic acid drugs: recent progress and future perspectives. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):316.
  9. Dowdy SF, Setten RL, Cui XS, Jadhav SG. Delivery of RNA Therapeutics: The Great Endosomal Escape! Nucleic Acid Ther. 2022;32(5):361-8.
  10. Patra C, Hussein Z, Ace VD, Misnik EV, Rybalko DS, Salimova AA, et al. The efficacy of oligonucleotide-based gene therapeutics in gene silencing. Theranostics. 2026;16(2):599-616.
  11. Lyra-Leite DM, Gutierrez-Gutierrez O, Wang M, Zhou Y, Cyganek L, Burridge PW. A review of protocols for human iPSC culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 2022;3(3):101560.
  12. Karbassi E, Fenix A, Marchiano S, Muraoka N, Nakamura K, Yang X, et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nat Rev Cardiol. 2020;17(6):341-59.
  13. Kim YH, Son YH, Choi Y, Kim MS, Park SJ, Lee KY. Advanced in vitro cardiac models for drug evaluation: integration of organoids, engineered tissues, and microphysiological systems. Microsyst Nanoeng. 2026;12(1).
  14. Mendjan S, Deyett A, Yelon D. Coordination of cardiogenesis in vivo and in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27(1):19-34.
  15. Lewis-Israeli YR, Wasserman AH, Gabalski MA, Volmert BD, Ming Y, Ball KA, et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 2021;12(1):5142.
  16. Hofbauer P, Jahnel SM, Papai N, Giesshammer M, Deyett A, Schmidt C, et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 2021;184(12):3299-317 e22.
  17. Silva AC, Matthys OB, Joy DA, Kauss MA, Natarajan V, Lai MH, et al. Co-emergence of cardiac and gut tissues promotes cardiomyocyte maturation within human iPSC-derived organoids. Cell Stem Cell. 2021;28(12):2137-52 e6.
  18. Drakhlis L, Biswanath S, Farr CM, Lupanow V, Teske J, Ritzenhoff K, et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat Biotechnol. 2021;39(6):737-46.
  19. Prondzynski M, Berkson P, Trembley MA, Tharani Y, Shani K, Bortolin RH, et al. Efficient and reproducible generation of human iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac organoids in stirred suspension systems. Nat Commun. 2024;15(1):5929.
  20. Buntz A, Killian T, Schmid D, Seul H, Brinkmann U, Ravn J, et al. Quantitative fluorescence imaging determines the absolute number of locked nucleic acid oligonucleotides needed for suppression of target gene expression. Nucleic Acids Res. 2019;47(2):953-69.
  21. Branco MA, Cotovio JP, Rodrigues CAV, Vaz SH, Fernandes TG, Moreira LM, et al. Transcriptomic analysis of 3D Cardiac Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reveals Faster Cardiomyocyte Maturation Compared to 2D Culture. Sci Rep. 2019;9(1):9229.
  22. Grimm JB, English BP, Chen J, Slaughter JP, Zhang Z, Revyakin A, et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat Methods. 2015;12(3):244-50, 3 p following 50.
  23. Lavaee A, Jain A, Scanavachi G, Costa-Filho JI, Ingemansson A, Kirchhausen T. SpatialDINO: A Self-Supervised 3D Vision Transformer that enables Segmentation and Tracking in Crowded Cellular Environments. bioRxiv. 2026.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Индуцированные плюрипотентные стволовые клеткимодель кардиоидакардиальная дифференцировкаWnt-сигналингкардиальная мезодермапредшественники кардиомиоцитовфлуоресцентные олигонуклеотидыклеточный захваттрехмерные кардиоиды

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.