Индуцированные человеком индуцированные плюрипотентные кардиоиды, полученные из стволовых клеток, в качестве модели для оценки доставки олигонуклеотида

Краткое содержание

Этот протокол позволяет создавать самоорганизующиеся кардиоиды на основе кардиомиоцитов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток для микроскопической оценки флуоресцентно маркированного олигонуклеотида.

Аннотация

Терапии на основе олигонуклеотида представляют собой быстро развивающийся класс препаратов с значительным потенциалом для лечения сердечно-сосудистых заболеваний; Однако достижение эффективной доставки в сердечную ткань остаётся критической и нерешённой задачей. Ключевым препятствием является ограниченная доступность надёжных, физиологически значимых человеческих in vitro моделей, способных поддержать количественную оценку поглощения и внутриклеточного распределения олигонуклеотидами. Представлен подробный, пошаговый протокол для создания самоорганизующихся 3D-кардиоидов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) и их применения в качестве платформы для оценки поглощения флуоресцентно маркированных олигонуклеотидов. Протокол направляет пользователей через направленную дифференцировку сердца в суспензионной культуре путём временной модуляции сигнализации Wnt/β-катенина, что позволяет последовательно спецификовать iPSC на этапах мезодермы, сердечной мезодермы и кардиомиоцитов. В таких условиях клетки спонтанно собираются в трёхмерные структуры, содержащие полости, которые экспрессируют канонические маркеры кардиомиоцитов. Полученные кардиоиды предоставляют масштабируемую, экспериментально управляемую платформу для оценки эффективности поглощения олигонуклеотида на основе визуализации, поддерживая разработку и оптимизацию стратегий доставки для кардиологических приложений.

Введение

Терапевтические средства на основе олигонуклеотидов, преимущественно антисенсовые олигонуклеотиды (ASO) и малые интерферирующие РНК (siRNA), быстро развиваются как трансформирующий и высокоспецифический подход к лечению широкого спектра заболеваний, включая как наследственные, так и приобретённые^{состояния 1,2,3}. Эти методы обеспечивают прямую модуляцию экспрессии генов на уровне мРНК через последовательно-специфическое связывание с целевой транскриптой, что позволяет заглушать или корректировать сплайсингом генов, связанных с заболеваниями, которые часто недоступны для традиционных малых молекулярных^{терапий 4,5}. Таким образом, генная терапия на основе олигонуклеотида предоставляет универсальную платформу для воздействия различных патогенных механизмов в различных областях заболеваний, включая сердечно-сосудистые^{заболевания 6}. На сегодняшний день несколько терапевтических средств на основе олигонуклеотидов, включая ASO, siRNA и агенты для переключения сплайсов, были одобрены для^{клинического применения 7}. Несмотря на этот прогресс, их терапевтическая эффективность как в доклинических, так и в клинических условиях остаётся ограниченной неэффективной внутриклеточной^{подачей 8}. Текущие оценки показывают, что менее 1% интернеротизированных олигонуклеотидов выходят из эндосомных компартментов, чтобы добраться до цитозолея и активировать целевой РНК, тем самым ограничивая функциональную^{активность 9,10}. Это ограничение особенно заметно в сердечной ткани, где поглощение и внутриклеточный трафик плохо изучены.

Исторически доклиническая оценка сердечно-сосудистых средств в значительной степени опиралась на животные модели, которые остаются незаменимыми для оценки фармакокинетики, биораспределения, эффективности и безопасности in vivo. Однако важные межвидовые различия в физиологии сердца, регуляции генов и клеточных ответах часто ограничивают их способность точно предсказывать терапевтическую эффективность и токсичность у человека. Эти ограничения способствовали разработке моделей in vitro, основанных на человеке, с повышенной физиологической значимостью. Среди них технология индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) революционизировала моделирование сердечно-сосудистых заболеваний, предоставив практически неограниченный источник клеток, которые можно дифференцировать в сердечно-сосудистые линии. Кардиомиоциты, полученные от iPSC человека (iPSC-CMs), воспроизводят многие молекулярные, структурные и функциональные свойства человеческого миокарда и стали широко используемой платформой для изучения механизмов заболеваний, ответов на лекарства и новых терапевтических^{методов 11}. Однако традиционные двумерные культуры человеческих iPSC-CM имеют важные ограничения. Большинство протоколов дифференцировки генерируют кардиомиоциты, похожие на эмбриональные, а не взрослые клетки, обладающие незрелыми структурными, электрофизиологическими, метаболическими и сократительными^{свойствами 12}.

Кроме того, монослойные культуры не имеют трёхмерной (3D) структуры тканей, многоклеточных взаимодействий и внеклеточного матриксового состава, влияющих на функцию кардиомиоцитов in vivo. Для решения этих задач были разработаны всё более сложные 3D-кардиологические^{модели 13}. Среди них инженерные сердечные ткани (EHT), образованные путём встраивания iPSC-CMs в каркасы биоматериалов и применения механической и электрической стимуляции, способствуют структурному и функциональному созреванию, при этом более точное воспроизведение биомеханической среды родного^{миокарда 13}. Хотя EHT предоставляют высоко физиологически значимые платформы для моделирования заболеваний и тестирования лекарств, их генерация обычно требует специализированных знаний в биоинженерии и специализированного оборудования. С другой стороны, экс-виво срезы сердечной ткани наиболее точно сохраняют нативную структуру тканей и клеточный состав, но зависят от доступа к первичной сердечной ткани, имеют ограниченную жизнеспособность в культуре и не являются легко масштабируемыми.

В последнее время сердечные органоиды появились как доступные трёхмерные модели, которые воспроизводят ключевые аспекты организации и функций сердечной^{ткани 14}. Кардиоиды — это самособирающиеся сердечные органоиды, состоящие преимущественно из кардиомиоцитов, которые проходят внутреннюю спецификацию, пространственное формирование и морфогенез, формируя камерообразные, содержащие полости^{структуры 15,16}. Методы формирования кардиоидов обычно опираются на начальную активацию Wnt-сигнализации для индуцирования мезодермической спецификации, а затем на последующее ингибирование для стимулирования связки сердечной линии. Кардиоиды могут генерироваться как в статических, так и в перемешиваемых суспензионных культурах, которые поддерживают масштабируемое производство и улучшают самоорганизацию^тканей 15,16,17,18,19. Более сложные многолинейные кардиорганоиды, включающие эндотелиальные, эпикардиальные или другие типы клеток, дополнительно повышают физиологическую значимость, но требуют более сложных протоколов дифференцировки, более длительных периодов культурирования и обширной^{оптимизации 13,14}.

Представлен простой, воспроизводимый и эффективный протокол для получения самоорганизующихся кардиоидов на основе кардиомиоцитов из человеческих iPSC и их применения для оценки поглощения флуоресцентно маркированных олигонуклеотидов. Протокол должен оказаться ценным для исследователей, стремящихся оптимизировать химию олигонуклеотидов и стратегии доставки для сердечно-сосудистых целей. Все материалы, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов.

Протокол

1. Культивирование и подготовка iPSC для дифференциации

ВНИМАНИЕ: Выполняйте все открытые контакты с клетками и средами в сертифицированном шкафу класса II по биобезопасности. Наденьте халат и перчатки. Дезинфицируйте рабочие поверхности и жидкие отходы соответствующим дезинфицирующим средством.

1. Поддерживайте iPSC.
   1. Покрытие посевных пластин соответствующей матрицей базальных мембран согласно инструкциям производителя.
   2. Подавайте iPSC определённой, свободной от кормления плюрипотентной стволовой клеточной средой и заменяйте её каждые 24 часа.
   3. Поддерживайте культуры ниже перекрытий и проходящих клеток, когда они достигают 70–80% совпадения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что iPSC сохраняют высококачественную, недифференцированную морфологию и подтверждают отсутствие микоплазмы перед началом дифференцировки.
2. Переход до дифференциации.
   1. Размораживайте iPSC и расширяйте клетки как минимум на два прохода перед началом дифференцировки сердца.
   2. Проходные клетки с использованием метода диссоциации без ферментов PBS-EDTA, совместимого с поддержанием iPSC.
      ТОЧКА ПАУЗЫ: Поддерживайте iPSC в культуре до достижения 70–80% слияния и сохраняйте типичную морфологию без признаков спонтанной дифференцировки.

2. Подготовка iPSC заполнителей в микроскважинных пластинах

1. Диссоциировать iPSC в суспензию с одной ячейкой.
   1. Аспирируйте среду и один раз промывайте клетки с 1 мл 1× PBS.
   2. Добавьте раствор для отслоения клеток (Аккутазу) при 500 мкл на одну лунку шестиколочной пластины и инкубировать при 37 °C в течение 5–7 минут.
   3. Добавьте 1,5 мл промывального материала на каждую скважину и аккуратно подвесьте для создания суспензии с одной ячейкой.
   4. Перенесите подвеску в коническую трубку объёмом 15 мл и центрифугу при 200 × г на 3 минуты при комнатной температуре.
   5. Аспирировать супернатант и ресуспензировать клеточную гранулу в iPSC без питания и дополняемую ингибитором ROCK (последние 10 мкм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Корректируйте время диссоциационной инкубации для каждой линии iPSC, проверяя отселение на 5 минут и при необходимости увеличивая небольшие шаги.
2. Посчитайте клетки и подготовьте плотность брони.
   1. Считать жизнеспособные клетки с помощью стандартного метода подсчёта клеток.
   2. Подготовьте суспензию с одной ячейкой с температурой 0,9 × 10⁶ клеток/мл для каждой ямы агрегационной пластины с микроколодцами диаметром 800 мкм (формат на 24 ямы, ~300 микроскважин/скважину).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте количество ячеек на одну скважину, так как размер агрегата или эффективность дифференцировки различаются между линиями iPSC.
3. Заготовьте пластину Microwell и удалите пузырьки.
   1. Добавьте в каждую скважину 500 мкл iPSC среды без питания с ингибитором породы (финальные 10 мкм).
   2. Центрифугуйте пластину микроколодца при 300 × г в течение 3 минут при комнатной температуре, чтобы удалить пузырьки воздуха из микроколодцев.
      ВАЖНО: Полностью удалите все пузырьки, чтобы обеспечить равномерное отложение клеток на дне каждой микроскважины и эффективное формирование агрегата.
4. Засеять iPSC в микроколодцы.
   1. Добавьте 1,0 мл подготовленной одноклеточной суспензии (0,9 × 10⁶ клеток/мл) в каждую скважину, что соответствует 0,9 × 10⁶ элементов на яму.
   2. Аккуратно подвешивайте в колодце 3–5 раз с помощью P1000 и избегайте появления пузырьков воздуха.
   3. Центрифугуйте пластину при температуре 200 × г в течение 3 минут при комнатной температуре, чтобы клетки погрузили в микроколодцы.
   4. Проверьте под микроскопом, что клетки осели в микроколодцах, прежде чем поместить пластину при температуре 37 °C с 5% CO₂ на 24 часа.
      ВАЖНО: Аккуратно обращайтесь с пластиной после центрифуга. Не перемешивайте и не трясите пластину, так как это может привести к выходу клеток из микроколодцев.

3. Расширение iPSC заполнителей в микроскважинах

1. Аккуратно аспирируйте и заменяйте среду, не нарушая и не смещая заполнители.
   1. Наклоните пластину и медленно аспирируйте примерно 1,0 мл среды из каждой скважины с помощью пипетки P1000, чтобы заполнители оставались сидящими в микроколодцах.
   2. Оставшиеся ~500 мкл среды медленно аспирируйте с помощью пипетки P1000.
   3. Добавьте 1,5 мл iPSC среды без питания в каждую скважину, медленно наливая его по стороне с помощью серологической пипетки.
   4. Инкубировать при 37 °C, 5% CO₂ и повторять замену среднего вещества ежедневно.
      КРИТИЧНО: Наносите среду на стенку скважины и избегайте прямого потока на заполнители.

4. Кардиальная дифференцировка агрегатов iPSC (с 0 по 12-й день)

1. Индукция мезодермы (День 0).
   1. Удалите среду с помощью метода мягкой аспирации, описанного в шагах 3.1.1–3.1.2.
   2. Добавьте 1,5 мл на каждую лунку базальной среды с добавлением 2% B27 минус инсулина и активатором пути Wnt/β-катенина (CHIR99021, итоговая концентрация: 11 мкм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 10 мМ стандартного раствора CHIR99021 — маломолекулярного ингибитора гликогенсинтазакиназы-3 (GSK-3). Для достижения конечной концентрации 11 мкм добавьте 1,65 мкл стандартного раствора к 1,5 мл среды.
2. Средняя смена после индукции (первый день).
   1. Через 24 часа после добавления CHIR99021 аккуратно аспирируйте среду из каждой колодцы.
   2. Добавьте 1,5 мл свежей базальной среды на каждую лунку, дополненную 2% B27 минус инсулин, затем инкубировать 48 часов.
      КРИТИЧНО: Строго соблюдайте тайминг шагов модуляции Wnt, так как отклонения могут снизить эффективность дифференцировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После воздействия активатора пути Wnt/β-катенин ожидается некоторая гибель клеток. Если наблюдаются масштабные потери агрегата, рассмотрите возможность снижения концентрации активатора в будущих экспериментах.
3. Кардиологическая активность через ингибирование WNT (день 3).
   1. Подготовьте кондиционированную среду, передав 760 мкл отработеной среды из каждой скважины в стерильную коническую трубку объёмом 50 мл.
   2. Для каждой скважины добавьте 760 мкл свежей базальной среды с добавлением 2% B27 минус инсулин в пробирку с облегченным кондиционированным материалом и аккуратно перемешайте.
   3. Добавьте ингибитор пути Wnt, IWP4, в смешанную среду до конечной концентрации 5 мкм и несколько раз аккуратно инвертируйте трубку для смешивания.
   4. Аккуратно аспирируйте оставшуюся среду из каждой скважины, затем добавляйте 1,5 мл в каждую ямку кондиционированной среды с дополнением IWP4.
   5. Инкубировать при 37 °C с 5% CO₂ в течение 48 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте запасной раствор ингибитора пути Wnt IWP4 объемом 1 мм. Для достижения конечной концентрации 5 мкм добавьте 7,6 мкл стандартного раствора на 1,52 мл общей среды (760 мкл кондиционированной среды + 760 мкл свежей базальной среды) для каждой скважины.
4. Среднее изменение микроколодцев (день 5).
   1. Заменить среду с помощью метода мягкой аспирации, описанного в шагах 3.1.1–3.1.2.
   2. Добавьте в каждую скважину 1,5 мл базальной среды с добавлением 2% B27 минус инсулин, затем инкубировать при 37 °C с 5% CO₂ в течение 48 часов.
5. Перемещение агрегатов из микроскважин в пластины с 6 колодцями (день 7).
   1. Аккуратно аспирируйте среду из каждой ямы, используя метод мягкой аспирации, описанный в шагах 3.1.1–3.1.2.
   2. Добавьте 1,0 мл базальной среды с добавлением 2% B27 с инсулином в каждую яме пластины микроколодца. Используя пипетку P1000, аккуратно протяните среду вверх и вниз пять раз, одновременно двигая кончик пипетки по кругу по поверхности скважины, чтобы вытеснить заполнители из микроскважины и перевести их в суспензию.
   3. Переместить суспензию агрегата в одну скважину необработанной 6-колодцевой культурной плиты.
   4. Промыйте каждую яду, добавляя 1,0 мл свежей среды два-три раза, чтобы восстановить оставшиеся заполнительницы, перенеся каждый промыватель в ту же яму, что и пластина с 6 колодцами.
   5. Инкубировать при 37 °C с 5% CO₂ в течение 72 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается наличие мёртвых клеток и клеточного мусора после переноса агрегата. Большая часть мусора будет удалена во время последующего изменения среды.
6. Среднее изменение во время культуры подвешивания (день 10).
   1. Аккуратно перемешайте пластину, чтобы убрать слабо прикреплённые заполнятели.
   2. Наклоните пластину, чтобы заполнители оселились на дне скважины под действием силы тяжести.
   3. Аккуратно вдыхайте отработанную среду, не нарушая и не аспирируя заполнители.
   4. Добавьте 2,0 мл свежей базальной среды с добавлением 2% B27 с инсулином в каждую скважину и инкубировать при 37 °C с 5% CO₂ в течение 48–72 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Спонтанное избиение обычно наблюдается примерно с 10-го дня.
      ТОЧКА ПАУЗЫ: Отбивающие кардиоиды можно поддерживать в суспензионной культуре для длительного созревания, заменяя среду каждые 2–3 дня.

5. Микроскопическая характеристика кардиоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод предоставляет рабочий процесс для гистологической характеристики кардиоидов с использованием криосечений. Полученные срезы могут использоваться для различных гистологических анализов, включая окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) для оценки общей структуры тканей и маркировку иммунофлуоресценцией для оценки идентичности кардиомиоцитов.

1. Фиксация и криосекция.
   1. Зафиксируйте кардиоиды в 4% параформальдегиде на ночь при 4 °C.
      ВНИМАНИЕ: Параформальдегид токсичен и, вероятно, является канцерогеном; Держите его в вытяжном контейнере с химическими парами, надевая соответствующие средства индивидуальной защиты. Соберите все отходы, содержащие параформальдегид (фиксаторы и промывки), в чётко маркированный контейнер для альдегидов/химических опасных отходов и утилизировать их в соответствии с институциональными процедурами по опасным отходам.
      БЕЗОПАСНОСТЬ: Выполняйте всю фиксацию и обращение с параформальдегидами в вытяжке с химическим паром, надевая соответствующие средства индивидуальной защиты.
   2. Три раза промывайте с помощью PBS и криопротектируйте фиксированные кардиоиды в 30% сахарозы в PBS на ночь при 4 °C.
   3. Внедрить кардиоиды в желатин, заморозить и вырезать криосекции толщиной 10 мкм на микроскопические стекла. Храните секции при −20 °C до использования.
2. Иммуномаркировка.
   1. Разморозьте секции 15 минут при комнатной температуре.
   2. Промывайте секции в PBS при 37 °C в течение 10 минут, дважды.
   3. Обведите интересующую область на каждом слайде гидрофобной ручкой, чтобы создать колодцу, сохранившую растворы блокировки и антитела.
   4. Регидратировать срезы на 2–3 минуты в буфере проницаемости (PB; PBS содержит 0,1% Tween-20) в банке Coplin.
   5. Снимите затворы из PB, слейте лишний раствор и поместите затворы в влажную камеру.
      КРИТИЧНО: С этого момента крайне важно не давать разделам высохнуть.
   6. Блокируйте срезы 200–300 мкл PB с 5% плодовой сывороткой бычьей крупной рогатой рогатости на 90 минут при комнатной температуре в влажной камере.
   7. Удалять блокирующий раствор и инкубировать секции ночью при 4 °C с 100 мкл первичного антитела (анти-cMYBP-C; 1:50), разбавленных в блокирующем растворе (PB содержит 1% FBS).
   8. Промыйте стекла три раза с PB и инкубируете 2 часа при комнатной температуре с зелёным флуоресцентным антителом против мышей (1:200), фар-красным флуоресцентным фаллоидином (1:400) и DAPI (1 мкг/мл).
   9. Три раза промывайте в PB и крепите с помощью антифейдного крепления.
      ВНИМАНИЕ: Соберите все растворы, содержащие флуоресцентные красители (вторичные антитела, фаллоидин, растворы для окрашивания DAPI, а также соответствующие промывки) в контейнер и утилизируйте их как химические отходы согласно институциональным рекомендациям.
3. Получение изображений.
   1. Получите конфокальные изображения с помощью лазерно-сканирующего конфокального микроскопа с массивным детектором для сверхразрешения с использованием масляного погружения объектива 10× и 63×/1,40.
   2. Возбудить дальнокрасную фторофорную, зелёную фторофорную и ядерную окрашивание с помощью лазерных линий диаметром 639 нм, 488 нм и 405 нм при передаче лазеров 4,0%, 4,0% и 1,0% соответственно.
   3. Получите отдельные оптические секции с размером пикселей 0,0353 × 0,0353 мкм², однонаправленное сканирование, скорость сканирования 6, зум 1,7, среднее значение линии 1 и время задержки пикселей 0,935 мкм на пиксель.
   4. Применяйте обработку изображений с сверхразрешением с помощью детектора массива с использованием автоматической фильтрации Винера.

6. Анализ на поглощение флуоресцентных олигонуклеотидов

1. Приготовьте стандартный раствор флуоресцентно маркированного олигонуклеотида, конъюгированного с пальмитиновой кислотой, чтобы повысить липофильность.
   1. Восстановить лиофилизированный флуоресцентно маркированный олигонуклеотид в воде без нуклеазы до конечной концентрации 1 мМ. Кратковременно вихрь и центрифуга при 3 000 × г в течение 30 секунд, чтобы собрать раствор на дне трубки.
   2. Приготовьте одноразовые аликвоты раствора запаса на 1 мм и храните при −20 °C, защищённых от света.
   3. В день эксперимента добавьте 1 мкл из 1 мМ запаса в 1 мл кардиоидной культурной среды, чтобы получить итоговую концентрацию олигонуклеотида 1 мкм. Смешивайте с помощью мягкого перемешивания пластинами.
2. Инкубировать кардиоиды флуоресцентно маркированным олигонуклеотидом (конечная концентрация 1 мкм) в безсывороточной среде при 37 °C с 5% CO₂ в течение 24 часов.
3. Промыйте кардиоиды три раза фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для удаления внеклеточных олигонуклеотидов.
4. Зафиксируйте кардиоиды в 4% параформальдегиде на 20 минут при комнатной температуре, затем три раза промывайте PBS и продолжайте флуоресцентную маркировку перед снимком.
5. Инкубировать целые фиксированные кардиоиды ночью при 4 °C, защищённые от света, в PBS, содержащем 5 мкг/мл агглютинина из зародышей пшеницы (WGA), конъюгированном с зелёным флуорофором и 1 мкг/мл DAPI. Три раза постирайте в PBS и крепите с помощью антифейдного крепления.
   ВНИМАНИЕ: Соберите все среды и промывки, содержащие олигонуклеотиды и флуоресцентные красители, включая маркированную олигонуклеотидную инкубационную среду с шага 6.2 и раствор для окрашивания WGA/DAPI, в отдельный контейнер и утилизируйте их как химические/биологически опасные отходы в соответствии с институциональными рекомендациями.
6. Получите конфокальные изображения поглощения и распределения олигонуклеотида.
   1. Получите конфокальные изображения с помощью лазерно-сканирующего конфокального микроскопа с массивным детектором для сверхразрешающей съёмки и 40× водяным погружением объективом. Получайте изображения в виде 8-секционных z-стеков с размером z-step 2 мкм, общей глубиной 16 мкм.
   2. Возбудить ядерную окраску, мембранный маркер и дальний красный флуоресцентно маркированный олигонуклеотид с помощью лазерных линий 405 нм, 488 нм и 639 нм с лазерной передачей 0,9%, 0,2% и 3,0% соответственно.
   3. Получите изображения с размером вокселей 0,0449 × 0,0449 × 2 мкм³, двусторонним сканированием, скоростью сканирования 5, средним уровнем линии 1 и временем задержки пикселя 1,51 мкм на пиксель. Применяйте обработку изображения Airyscan/сверхразрешения с использованием автоматической фильтрации Винера.
   4. Сохраняйте все настройки обнаружения (мощность лазера, усиление детектора, z-шаг и размер вокселя) постоянными во всех z-позициях и по всем образцам, чтобы позволить достоверное сравнение сигнала олигонуклеотида между условиями.

Результаты

Рисунок 1 обобщает рабочий процесс дифференцировки и иллюстрирует характерные морфологические изменения, ожидаемые на каждом этапе протокола — от агрегации iPSC до формирования самоорганизующихся кардиоидов. Агрегация микроскважин на основе подвески предоставляет простой и стандартизированный подход к параллельной генерации большого числа кардиоидов с контролем размера. Успешная дифференциация характеризуется образованием заполнителей равномерного размера, за которым следует образование внутренних полостей и начало спонтанного биения, обычно начиная примерно с 10-го дня. Вместе эти морфологические особенности обеспечивают практические контрольные точки контроля качества для оценки эффективности и воспроизводимости генерации кардиоид.

Кардиоидную архитектуру и организацию тканей можно оценить с помощью гистологического анализа криосреций. Как показано на рисунке 2, окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) успешно дифференцированных кардиоидов выявляет хорошо организованные трёхмерные ткани с одной или несколькими внутренними полостями, окружёнными компактными клеточными слоями, что соответствует камерной организации. Успешные кардиоиды обычно не имеют некротических областей и минимальной структурной фрагментации. В отличие от этого, неоптимальные дифференциации часто приводят к нерегулярным или коллапсированным структурам без различимых полости, что свидетельствует о нарушенной самоорганизации тканей.

Дифференциация кардиомиоцитов может быть дополнительно оценена с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания криосечений. Как показано на рисунке 3A–B, успешные кардиоиды демонстрируют широкую экспрессию саркомического маркера cMYBP-C, организованную в высокоупорядоченные периодические полосы, характерные для саркомеров. Эти полосатые структуры широко распределены по всей ткани и часто выровнены вдоль продольной оси кардиомиоцитов, что отражает эффективную дифференцировку сердца. В отличие от этого, субоптимальные кардиоиды демонстрируют слабое, пятнистое или регионально ограниченное саркомическое окрашивание, часто ограниченное периферическими областями, с обширными участками, не обнаруживаемыми для обнаружения сигнала, что указывает на неэффективную дифференцировку кардиомиоцитов.

Поглощение флуоресцентно маркированных олигонуклеотидов можно оценить либо с помощью живых клеточной визуализации, либо конфокальной микроскопии фиксированных кардиоидов. Как показано на рисунке 4, успешное поглощение характеризуется легко обнаруживаемой внутриклеточной флуоресценцией, ассоциированной с олигонуклеотидом, распределённой как дискретные пункты, что соответствует эндосомной локализации. WGA определяет клеточные мембраны и DAPI контрокрашивает ядра, что позволяет подтвердить локализацию внутриклеточного олигонуклеотида. Помимо качественной визуализации поглощения олигонуклеотидами, стеки изображений могут использоваться для количественного анализа, включая интенсивность флуоресценции на пунктум, число пунктов на клетку и процент олигонуклеотидно-положительных клеток. Как показано на рисунке 5A–C, Z-стековая визуализация дополнительно позволяет оценить распределение олигонуклеотида по трёхмерной ткани, при этом флуоресценция обнаруживается в нескольких оптических секциях, простирающихся от поверхности к внутренней части кардиоида, что указывает на эффективное проникновение ткани.

Рисунок 1: Рабочий процесс для создания кардиоидов, полученных на основе iPSC, в человеке. Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) агрегируются в микроколодцах-пластинах (Day−2) и подвергаются направленной сердечной дифференцировке через временную модуляцию Wnt-сигнализации. Индукция мезодермы начинается на 0-й день лечением активатором Wnt-пути CHIR99021 в базальной среде с добавлением витамина B27 минус инсулина, после чего активатор удаляется в первый день. Спецификация сердца индуцируется на 3-й день лечением ингибитором пути Wnt IWP4, который удаляется на пятый день. На седьмой день агрегаты перемещаются на пластины с 6 колодцями и хранятся в базальной среде с добавлением B27, содержащего инсулин. К 14-му дню формируются самоорганизующиеся кардиоиды, которые подходят для последующих применений, включая анализы на поглощение олигонуклеотида. Это изображение создано авторами с использованием Biorender, и к нему прилагается необходимая лицензия на авторские права. Репрезентативные изображения ярких полей, полученные в указанные моменты времени, иллюстрируют ожидаемую морфологическую прогрессию от равномерного размера iPSC агрегатов к кавитированным, самоорганизующимся кардиоидам. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Гистологическая характеристика кардиоидов, полученных от iPSC, человека. Репрезентативные криосекции кардиоидов 14-го дня, окрашенные гематоксилином и эозином (H&E), показывают внутренние полости, окружённые компактными клеточными слоями, что соответствует структуре тканей в виде камер. Изображения были получены с помощью визуализирующего микроскопа. Количественная оценка результатов дифференцировки показала, что у 94,0 ± 2,6% кардиоидов наблюдалось спонтанное биение, а 60,3% ± 20,6% содержали одну или несколько видимых внутренних полости. Данные представлены как среднее ± SD по трём независимым дифференциациям, при этом анализируется примерно 115 кардиоидов на каждую дифференциацию. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Иммунофлуоресцентная характеристика дифференцировки кардиомиоцитов. Репрезентативные криосецки кардиоидов 14-го дня. (A) Окрашивание DAPI, показывающее распределение ядер клеток. (B) Иммунофлуоресцентное изображение, показывающее ядра, маркированные DAPI (синий) и саркомеры, помеченные антителами против сердечно-миозин-связывающего белка C (cMYBP-C, зелёный), демонстрируя организованные саркомические структуры в дифференцированных кардиомиоцитах. Изображения были получены лазерно-сканирующей конфокальной флуоресцентной микроскопией с использованием сухого объектива 10×/0,30 (слева) и масляного погружения объектива 63×/1,40 (справа). Шкалы = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Визуализация усвоения олигонуклеотида кардиоидами. Конфокальные изображения, показывающие внутриклеточную локализацию флуоресцентно маркированных антисенсовых олигонуклеотидов (ASO, жёлтый) в кардиоидах 14-го дня. Клеточные мембраны маркированы флуоресцентным аглютинином зародыша пшеницы (WGA, пурпурная), а ядра окрашены DAPI (синим). Флуоресценция, ассоциированная с ASO, обнаруживается в виде отдельных внутриклеточных пунктов (стрелок). Нижние панели показывают отрицательные контрольные кардиоиды, которые не инкубировались флуоресцентными ASO. Изображения в правых панелях соответствуют изображениям с большим увеличением коробчатых областей левых панелей. Репрезентативные изображения были получены лазерно-сканирующей конфокальной микроскопией с использованием сверхразрешения с помощью массивного детектора с использованием 40× водного погружения объектива. Шкалы = 10 мкм (слева) и 5 мкм (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Оценка проникновения олигонуклеотида во всех кардиоидах. (A) Схема, иллюстрирующая получение оптических срезов на возрастающей глубине внутри кардиоидной кости. Это изображение создано авторами с использованием Biorender, и к нему прилагается необходимая лицензия на авторские права. (B) Репрезентативные конфокальные изображения, показывающие распределение флуоресцентно маркированных ASO в z-позициях 0 мкм, 6 мкм и 10 мкм относительно поверхности ткани. Настройки изображения оставались постоянными во всех позициях Z. Шкала = 10 мкм. (C) Количественная оценка процента клеток, содержащих хотя бы один сигнал пунктата, ассоциированный с ASO, на каждой глубине визуализации показала сопоставимое поглощение олигонуклеотида по всей ткани: 83,1 ± 2,5%, 84,9 ± 4,5% и 84,0 ± 4,5% ASO-положительных клеток при 0 мкм, 6 мкм и 10 мкм соответственно. Данные представлены как среднее ± SD по трём кардиоидам, при этом на кардиоид анализируется три оптических сечения, а всего количественно оценивается 1 305 клеток. Репрезентативные изображения были получены лазерно-сканирующей конфокальной микроскопией с использованием сверхразрешения с помощью массивного детектора с использованием 40× водного погружения объектива. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Видео 1: Таймлапс-сцена. Видео, полученное со скоростью 40 кадров в секунду, демонстрирует спонтанную сокращающуюся активность кардиоидных мышц. Визуализация проводилась с помощью широкопольного микроскопа с камерой sCMOS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Обсуждение

Терапевтические средства на основе олигонуклеотидов стали мощным классом генно-таргетных методов, поддерживаемых десятилетиями достижений в химии олигонуклеотидов, которые улучшили специфическую мишень, метаболическую стабильность и иммуногенную^{переносимость 7,8}. Несмотря на растущее число клинически одобренных РНК-терапевтических средств, их широкое применение остаётся ограниченным неэффективной внутриклеточной^{доставкой 7,8}. Из-за своих размеров, заряда и гидрофильности олигонуклеотиды не могут пассивно диффундировать через плазматическую мембрану и вместо этого внутреннее поглощаются через эндоцитарные^{пути 9,10}. После поглощения подавляющее большинство (~99%) внутренне изолированных олигонуклеотидов остаются секвестрированными в эндосомных^{компартментах 9,10}. Эндосомная торговля проходит через процесс созревания от ранних до поздних эндосом и, в конечном итоге, лизосом; Однако точные компартменты, из которых олигонуклеотиды выходят в цитозоль, остаются неполностью изученными и могут включать несколько эндосомных^{популяций 9}. Это ограниченное цитозольное высвобождение представляет собой критический барьер для ограничения скорости и подчеркивает необходимость физиологически значимых экспериментальных систем, позволяющих количественно оценивать поглощение олигонуклеотида, внутриклеточную транспортировку и эндосомный выход²⁰.

Описанный здесь протокол был разработан для решения этой потребности путём объединения кардиоидов, полученных на основе iPSC, с изображениями показаний усвоения олигонуклеотида. Надёжность этой системы зависит от нескольких критически важных этапов, которые напрямую влияют на воспроизводимость и результаты экспериментов. Во-первых, качество стартовых культур iPSC является ключевым фактором успешной дифференцировки сердца. Авторы рекомендуют периодический анализ кариотипов для обеспечения долгосрочной геномной стабильности и регулярной оценки морфологии, целостности и динамики роста колонии. Высококачественные культуры характеризуются компактными, чётко очерченными колониями с гладкими границами, минимальной спонтанной дифференциацией и последовательным размножением. Культуры с неправильными краями колоний, гетерогенной морфологией клеток или участками дифференцировки следует убрать и заменить низкопроходными замороженными запасами перед началом дифференцировки.

Второй критически важный этап — контролируемое формирование iPSC-агрегатов с помощью микроколодцевых пластин, что способствует формированию однородных, размерно определённых трёхмерных структур, необходимых для воспроизводимой дифференциации^{сердца 21}. Агрегация на основе микроколодцев генерирует эмбриоидные тела с определёнными диаметрами (оптимально 200–230 мкм), тем самым стандартизируя взаимодействие между клетками и клеточные взаимодействия и воздействие морфогенных градиентов во время временной модуляции Wnt-сигнализации. По нашему опыту, этот размер стабильно достигается за счёт засева примерно 3 000 клеток на каждую микроскважину (шаг 2.2), состояние, которое было эмпирически оптимизировано и подтверждено на нескольких линиях iPSC человека, включая коммерчески доступные линии и линии, перепрограммированные внутри компании. Однако, поскольку скорость пролиферации iPSC может варьироваться, оптимальная плотность посева может потребовать корректировки для поддержания желаемого размера агрегата. Неспособность контролировать эти параметры может привести к гетерогенным структурам, снижению жизнеспособности и снижению эффективности дифференцировки.

Гистологический анализ, как показано на рисунке 2, обеспечивает удобную оценку качества формирования кардиоидов. В частности, отсутствие внутренних полостей или наличие коллапсов или фрагментированных структур может указывать на неоптимальное формирование агрегатов или недостаточный временной контроль сигнализации Wnt на этапах дифференцировки (шаги 4.1–4.3). В некоторых неудачных дифференциациях внутри или вокруг кардиоидов образуются популяции неконтрактильных клеток. Эти клетки обычно выглядят желтоватыми при яркой микроскопии и склонны прикрепляться к плитам с низким уровнем прикрепления, тогда как кардиоиды, богатые кардиомиоцитами, как правило, серые, остаются компактными трёхмерными структурами и не прикрепляются легко. Если значительная часть агрегатов демонстрирует этот придерживающийся, неконтрактильный фенотип, дифференцировка должна считаться неоптимальной. В таком случае устранение неполадок следует начать с изучения морфологии колонии iPSC перед дифференциацией, подтверждения размера агрегата между Днём −1 и Днём 0 и, при необходимости, переоптимизации плотности посева и концентраций CHIR99021 и IWP4 для конкретной линии iPSC.

Низкое или отсутствующее спонтанное биение к 10–12 дням дней обычно отражает неэффективную индукцию мезодермы или кардиологическую специфику, чаще всего из-за неправильной концентрации или времени Wnt-модулятора, либо из-за чрезмерной гибели клеток после CHIR99021 лечения (Шаг 4.2). По нашему опыту, титрирование CHIR99021 в диапазоне 9–13 мкм для каждой линии iPSC и проверка концентрации и активности растворов для запасов значительно повышают эффективность дифференцировки. Иммунофлуоресцентный анализ организации саркомических белков, как показано на рисунке 3, обеспечивает удобную оценку дифференцировки кардиомиоцитов с контролем качества. Слабое или пятнистое окрашивание саркомических белков, особенно если оно ограничено периферическими областями кардиоида, обычно указывает на неполную или гетерогенную дифференцировку кардиомиоцитов. В таких случаях рекомендуется продлить период созревания в суспензионной культуре (шаг 4.6 и точка паузы) перед фиксацией, а также проверить условия фиксации и окрашивания антител.

Хотя эта кардиоидная модель обеспечивает трёхмерную человеческую кардиологическую микросреду, которая значительно превосходит традиционные двухмерные культуры кардиомиоцитов, она не полностью воспроизводит сложность сердца взрослого человека. Кардиоиды представляют собой раннюю стадию развития сердца человека, при этом кардиомиоциты сохраняют незрелый фенотип 14, похожий на^плод. Кроме того, ткани лишены сосудистой перфузии, иннервации, иммунных клеток и полной камерно-специфичной архитектуры зрелого миокарда. Следовательно, хотя эта платформа хорошо подходит для изучения клеточного поглощения и внутриклеточного распределения олигонуклеотидов в контролируемых экспериментальных условиях, следует проявлять осторожность при экстраполировании кинетики и механизмов доставки поглощения непосредственно в условиях in vivo . В будущем внедрение дополнительных типов сердечных клеток, сосудистых сетей и стратегий созревания тканей должно ещё больше повысить физиологическую значимость этой платформы.

Надёжная оценка усвоения олигонуклеотида кардиоидами, описанными в этом протоколе, требует оптимизации и стандартизации концентрации ASO, времени инкубации и параметров получения визуализации, как показано на рисунках 4 и рисунке 5. Выбор флуорофора особенно важен, так как красители отличаются яркостью, фотостабильностью и чувствительностью к воздействию окружающей среды. В этом исследовании мы использовали Janelia Fluor 646 (JF646)²² — флуорофор кремний-родаминового цвета с высокой яркостью и фотостабильностью, обеспечивающий надёжное обнаружение сигналов и минимизирующий аутофлуоресценцию тканей в трёхмерных образцах. Эти свойства делают его отлично подходящим для визуализации поглощения олигонуклеотида в живых или фиксированных кардиоидах. Примечательно, что конъюгация флюорофоров может влиять на поведение олигонуклеотида, включая поглощение и трафик, и поэтому должна быть валидирована для каждой экспериментальной системы.

В нынешнем виде этот протокол обеспечивает как качественную, так и количественную оценку поглощения олигонуклеотидами. Конфокальная визуализация внутриклеточных пунктов, ассоциированных с ASO, позволяет визуализировать локализацию олигонуклеотида внутри кардиоидов, тогда как эффективность поглощения измеряется вручную с помощью доли ASO-положительных клеток с помощью плагина Cell Counter в Fiji/ImageJ. Хотя этот подход хорошо подходит для анализов со средней пропускной способностью, представленных здесь, ручной анализ изображений требует трудоёмких усилий и может подвергаться смещению наблюдателей, особенно при применении к большим наборам данных. Недавние достижения в области самоконтролируемого глубокого обучения для трёхмерной микроскопии открывают многообещающие возможности для преодоления этих ограничений. Анализ изображений на основе искусственного интеллекта позволяет точно сегментировать, идентифицировать и отслеживать гетерогенные субклеточные структуры в сложных трёхмерных средах, позволяя автоматизировать количественную оценку поглощения олигонуклеотидов и внутриклеточного трафика, включая эндосомную^{динамику 23}. Внедрение этих подходов в будущие реализации протокола должно повысить пропускную способность, воспроизводимость и аналитическую точность.

В будущем интеграция кардиоидов, полученных на основе iPSC, с количественной визуализацией, анализом изображений на основе машинного обучения и методологиями отдельных частиц предлагает мощную основу для изучения механизмов, управляющих доставкой олигонуклеотида в сердечную ткань человека. Сочетание физиологически значимых трёхмерных кардиологических моделей с передовыми аналитическими инструментами, способными решать субклеточную организацию и динамику, позволит всестороннюю количественную характеристику поглощения олигонуклеотида, внутриклеточного трафика и, с соответствующими дополнительными анализами, эндосомного выхода. Ожидается, что такие интегрированные подходы облегчат систематическое выявление факторов, определяющих эффективность доставки, поддержат рациональную оптимизацию химии олигонуклеотидов и средств доставки, а также обеспечат масштабируемую платформу для оценки новых олигонуклеотидных терапевтических средств в контексте сердечно-сосудистых заболеваний.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochloride	Thermo Scientific	62248	DAPI
10× dry objective	Zeiss		EC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objective	Zeiss		LD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objective	Zeiss		Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27
800-µm microwell aggregation plate	STEMCELL Technologies	34815	AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera	Andor		Andor Neo 5.5
Antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000-10	VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×	Gibco	A18956-01	B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×	Gibco	17504-044	B27 Supplement 50×
Basal Medium	Gibco	21875-034	RPMI 1640
Basement-membrane matrix	Gibco / Corning	A14132-02 / 354230	Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope	EVOS		EVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solution	STEMCELL Technologies	07922	ACCUTASE
confocal microscope	ZEISS		ZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance medium	STEMCELL Technologies	100-0276	mTeSR Plus
DMEM/F12	Gibco	31331-028	DMEM/F12
Non-treated 6-well plate	Avantor (VWR)	734-2777	Untreated 6-well Plate
Phalloidin	Thermo Scientific	A22287	Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)	Gibco	14190-144	DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3	Santa Cruz	sc-137181	MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72304	ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)	Thermo Scientific	A-11017	F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplement	Gibco	10828028	KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugate	Invitrogen	W11261	WGA
widefield microscope	Nikon		Nikon Eclipse Ti
WNT pathway inhibitor	STEMCELL Technologies	72552	IWP4
Wnt/β-catenin pathway activator	Sigma	SML1046	CHIR99021