Надёжное создание модели аневризмы аорты брюшной аорты у мышей с использованием сенсибилизации эластина и периваскулярной эластазы

Краткое содержание

Этот протокол обеспечивает повторяемый и надёжный метод индуцирования аневризм брюшной аорты (AAA) у мышей с C57BL/6 с помощью сенсибилизации эластина и применения периваскулярной эластазы в качестве модели AAA, включающей компонент иммунной сенсибилизации.

Аннотация

Деградация эластичного ламеллярного матрикса в стенке брюшной аорты является гистопатологическим признаком аневризм брюшной аорты (AAA). Растущие данные указывают на деградацию эластина и связанные с ним иммунные ответы хозяина в патогенезе AAA. Эффективное моделирование этих процессов важно для улучшения понимания и лечения этого распространённого заболевания. В то время как предыдущие модели AAA использовали методы, нарушающие эластин, для индукции аневризмы, однократное применение эластазы во многих из этих моделей не учитывает продолжающийся иммунный ответ на эластин и его продукты деградации (ЭДП). Для моделирования этого продолжающегося иммунного ответа мы разработали модель, которая сенсибилизирует мышей C57BL/6 к ЭДП путём подкожного введения ЭДП за 7 дней до операции по индукции аневризмы. Операция по индукции аневризмы проводится с экспонированием брюшной аорты и нанесением топической эластазы в периаортальный отдел с целью экспонирования эластина и ЭДП на аорте мыши. При воздействии этих групп животное должно сформировать иммунный ответ против этих антигенов, к которым оно ранее было чувствительно. Повторная «бустерная» инъекция ЭДП через 7 дней способствует распространению этого иммунного ответа. Здесь мы описываем протокол для надёжного создания AAA у мышей C57BL/6 посредством множественной сенсибилизации с помощью EDP, а затем индукционной операции AAA с применением периваскулярной эластазы. Эту модель можно создать быстро и с умеренными затратами, вызывая >30% расширения аорты у 82% мышей с помощью видеомикрометрии, 73% — ультразвуковым измерением, а также >50% дилатации у 64% с помощью видеомикрометрии и 27% ультразвуковой дилатации, измеренной на 21-й день после индукции. Эта техника также связана с 95% интраоперационной выживаемостью.

Введение

Аневризма брюшной аорты (AAA) поражает >35 миллионов человек по всему миру, и 4–8% мужчин в возрасте 65-80^{лет 1,2}. Разрыв, самое разрушительное осложнение AAA, обычно возникает, когда механическое напряжение стенки аневризмы превышает силу аортальной ткани, что приводит к массивному кровоизлиянию и общей смертности 80−90%^3,4. Текущее лечение направлено на профилактику, с ультразвуковым скринингом пациентов из группы высокого риска и хирургической операцией, когда риск разрыва превышает риск восстановления, обычно^{при диаметре} 5,5 см. Однако большинство ААА бессимптомны, и многие диагностируются^{случайно 6}. В связи с этим следует прилагать усилия по выявлению пациентов из группы высокого риска и разработке нехирургических методов лечения для снижения роста AAA и, следовательно, риска разрыва.

Для разработки медицинских методов лечения AAA патогенез должен быть лучше изучен. В настоящее время используются несколько экспериментальных моделей, включая мелкие животные с использованием инфузии ангиотензина^{II 7},^{ксенотрансплантации 8}, нанесения хлорида^{кальция 9} и^{инфузии 10} и/или местного применения^{эластазы 11}. Каждая из этих моделей использует разное понимание патологической основы AAA, и большинство из них были модифицированы, улучшены или комбинированы с другими методами с момента появления.

Важно, что гистология AAA демонстрирует потерю нормального ламеллярного эластинового матрикса, который также наблюдается в ткани лёгких при хронической обструктивной болезни^{лёгких 12,13}. Деградация эластина за счёт активности матрикс-металлопротеиназы обеспечивает важную связь между патогенезом AAA и курением — самым важным модифицируемым фактором риска образования^{AAA 12,14}. В частности, у человека наблюдается снижение аортального эластина, нарушение эластиновых волокон и увеличение циркулирующего эластинового пептида у человека, что связано с повышенной растяжённостью стенок^{AAA 15,16}. Поэтому стимулирование деградации эластина имеет решающее значение для создания переводимой модели AAA. Существующие модели AAA, основанные на деградации эластина, хотя и эффективны, могут осложняться высоким уровнем смертности животных, особенно в моделях с использованием аортальной^{каннуляции 17}, а также неравномерным образованием аневризмы, особенно в моделях, основанных исключительно на топическом применении^{эластазы 18}. Кроме того, все модели, основанные на индукционных операциях, подвержены кривым обучения оператора и техническим вариациям.

Для решения этих проблем мы используем иммунный ответ хозяина, чтобы повысить чувствительность животных к эластину путём инъекции продуктов разложения эластина (EDP). Через неделю проводится операция по индукции аневризмы в стандартизированном поэтапном порядке, с использованием периаортального применения эластазы для создания ЭДП-групп, против которых сенсибилизированный хозяин может вызвать иммунный ответ. Последующая «бустерная» сенсибилизация EDP через неделю после индукционной операции обеспечивает продолжение иммунного ответа хозяина. Повторяющаяся иммунная сенсибилизация обеспечивает надёжную дилатацию аорты. Мы используем мышиную AAA-модель благодаря более низкой стоимости, простоте обслуживания, быстрому развитию заболевания и технической стабильности.

Эта модель ненадёжно приводит к разрыву аорты и, следовательно, не предназначена для изучения факторов, связанных с разрывом AAA. Однако эта модель надёжно вызывает прогрессирующую расширение аорты в течение 21 дня после индукции. Таким образом, модель лучше всего подходит для изучения терапевтических методов, которые могут уменьшать или обратить обратное расширение аорты по мере формирования аневризмы.

Протокол

1. Ультразвуковая визуализация

1. Готовь мышь
   1. Поместите мышь в камеру для анестезии.
   2. Вводить вдыхаемый изофлуран в концентрации 1,8−2% и кислород до тех пор, пока мышь не будет анестезирована. Убедитесь, что баллончики с газом анестетики подключены к аппарату для анестезии, чтобы снизить воздействие летучих анестетиков на оператора при использовании изофлурана.
   3. Положите мышь в положение лежа на сцене, нагреваемой до 37 °C, а нос мыши находится в носовой конус для анестезии.
   4. Приклейте задние конечности к сцене этикеткой.
   5. Нанесите средство для удаления волос с аппликатором с хлопковым наконечником на живот и подождите 30 секунд.
   6. Удалите брюшные волосы с помощью хлопковой марлевой прокладки размером 5 см x 5 см.
   7. Нанесите подогретый гель для ультразвуковой фильтрации на живот мыши.
2. Установите ультразвуковой зонд с частотой 38 МГц на брюшной полости и определите тазовый пояс.
3. Определите аорту как трубчатую среднюю линию, несжимающуюся при умеренном заднем давлении, приложенном через ультразвуковой зонд.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нижняя полая вена (IVC) выглядит как световая структура справа от аорты мыши и сжимается при умеренном заднем давлении, приложенном через ультразвуковой зонд.
4. Измерьте передне-задний диаметр брюшной аорты только на голове до точки бифуркации.
5. Переместите зонд проксимально вдоль аорты и определите левую почечную вену, проходящую впереди аорты и входящую в IVC.
6. Измерьте передне-задний диаметр брюшной аорты, расположенной чуть выше, до точки, где левая почечная вена пересекает спереди брюшную аорту.
7. Переместите зонд по проксимальности и определите диафрагму.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Диафрагма может быть идентифицирована как гиперэхообразная полоса, расположенная непосредственно от голова к печени.
8. Измерьте передне-задний диаметр брюшной аорты, расположенной только на хвосте, до точки её входа в брюшную полость.
9. Поместите мышь в клетку или в корзину для восстановления, выстланную полотенцами, и поставьте на сцену, нагреваемую до 37 °C.
10. Следите за мышью, пока она не выйдет из наркоза.

2. Начальная сенсибилизация эластина

1. Готовьте средства для разложения эластина (EDP), используя средства индивидуальной защиты, включая перчатки, защиту для глаз и маски.
   1. Получить формулу эластазы поджелудочной железы мыши в суспензии PBS в концентрации 0,475 единиц/мл (белок 4,75 единиц/мг).
   2. Возьмите 168 мкл эластазы и добавьте его к 5 мг мышиного эластина. Добавьте в эту смесь ещё 200 мкл физиологического раствора с 1X фосфат-буфером (PBS), затем пипетку для смешивания.
   3. Инкубировать смесь эластазы и эластина при 37 °C в течение 20 минут с периодическим мягким перемешиванием.
   4. Добавьте 632 мкл холодного 1X PBS в смесь эластазы и эластина.
   5. Добавьте 1 мл полного адъюванта Фройнда.
2. Поместите мышь в камеру для анестезии.
3. Вводить вдыхаемый изофлуран в концентрации 1,8−2% и кислород до тех пор, пока мышь не будет анестезирована.
4. Положите мышь в положение лежа на сцене, нагретой до 37 °C, а нос мыши находится в носовой конус для анестезии.
5. Введите 50 мкл ЭДП подкожно в каждую сторону, в общей сложности 100 мкл ЭДП в каждой мыши.
6. Положите мышь в корзину для восстановления, выстланную полотенцами, и поставьте на сцену, нагреваемую до 37 °C.
7. Следите за мышью, пока она не выйдет из наркоза.

3. Подготовка к операции

1. Подготовьте хирургические инструменты.
   1. Соберите хирургический набор с двумя зубчатыми щипцами, 1 острым прямым щипцем, 1 острым щипцом под углом, 1 игольным драйвером, ножницами, минимум 3 самоудерживающимися магнитными ретракторами, 1 скоблером для кожи и 1 полипропиленовой крышкой от бутылочки.
   2. Добавьте в набор 4-0 полигликолевой кислоты швы в стерильном виде непосредственно перед операцией.
   3. ПРИМЕЧАНИЕ: также достаточно размеров шва 3-0 или 5-0.
   4. Наполните крышку полипропиленовой бутылки стерильно нагретым 1X PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Бутылка стерильного 1X PBS хранится в тёпле при 37 °C для пополнения.
2. Приготовьте эластазу.
   1. Разбавить 27 мкл 5,1 мг/мл (≥4,0 единиц/мг) свининской эластазы поджелудочной железы до 73 мкл 1X PBS для итогового объёма 100 мкл для операции на 10 мышах (10 мкл/мышь).
   2. Подготовьте операционную.
   3. Автоклав составят стакан с аппликаторами с хлопковыми наконечниками, с сужающимися наконечниками и марлей размером 5 см x 5 см, и поставьте их рядом с хирургическими лотками перед операцией.
   4. Разместите магнитную хирургическую стадию на грелке, установленной на 37 °C, на стадии микроскопа. Приклейте грелку скотчем на этапе микроскопа, но магнитную компоненту не привязывайте для перестановки во время операции.
   5. Положите на грелку впитывающую прокладку или бумажное полотенце. Сложите марлю размером 5 см на 5 см пополам и положите её под носовой конус для анестезии.
   6. Поместите стакан объемом 30 мл, наполненный средством для удаления волос, стакан объемом 30 мл с 5% повидон-йодом, тюбик смазки для глаз, хирургическую ленту, нестерильную марлю размером 5 см x 5 см, нестерильные хлопковые аппликаторы с наконечниками, герметичные спиртовые мазки размером 5 см x 5 см, рулон клеящейся плёнки и распылитель с 70% этанолом рядом с операционной зоной.
   7. Забирайте 1,3 мг/мл бупренорфина с пролонгированным высвобождением в шприц объёмом 75 мкл на мышь, при дозе 3,25 мг/кг у мыши весом 30 г.
3. Подготовьте мышь к операции.
   1. Измерьте и запишите вес мыши в граммах.
   2. Поместите мышь в камеру для анестезии.
   3. Вводить вдыхаемый изофлуран в концентрации 1,8−2% и кислород до тех пор, пока мышь не будет анестезирована.
   4. Положите мышь в положение лежа на сцене, нагреваемой до 37 °C, а нос мыши находится в носовой конус для анестезии.
   5. Введите 75 мкл бупренорфина подкожно.
   6. Приклейте задние конечности к сцене этикеткой.
   7. Нанесите средство для удаления волос с аппликатором с хлопковым наконечником на живот и подождите 30 секунд.
   8. Удалите брюшные волосы с помощью хлопковой марлевой прокладки размером 5 см x 5 см.
   9. Нанесите глазную смазку на глаза мыши.
   10. Нанесите повидон-йод на брюшной полости мыши с помощью марлевой прокладки размером 5 см x 5 см и дайте ей высохнуть.
   11. Протрите живот спиртовыми мазками размером 5 см на 5 см. Нанесите повидон-йод снова и дайте ему высохнуть.
   12. Проверьте анестезию, ущипнув палец мыши и убедившись, что реакции нет.
   13. Положите лист клейкой пищевой плёнки на операционный этап.
   14. Распылите хирургическую стадию 70% этанола и дайте ей высохнуть.
   15. Мойте руки и надевайте стерильные хирургические перчатки.

4. Операция (через 7 дней после первоначальной сенсибилизации эластина)

1. Обнажите брюшную аорту.
   1. Сделайте кожный разрез ножницами или скальпелем вдоль средней линии брюшной поверхности на ~3 см, начиная от голова 0,5−1 см от пениса и до 0,5 см хвоста к ксифовидной кости.
   2. Захватите кожу зубчатыми щипцами и аккуратно подтяните вверх, чтобы определить linea alba, которая будет выглядеть как аваскулярная плоскость между прямыми мышцами.
   3. С помощью ножниц разрезайте linea alba, продолжая подтягивать кожу. Следите за тем, чтобы резать только linea alba, избегая внутрибрюшных структур.
   4. Разместите магнитные самоудерживающие ретракторы: один убирает правую сторону брюшной стенки, другой втягивает левую сторону брюшной стенки, а третий убирает структуры в хвостовой стороне разреза, такие как мочевой пузырь и семенные пузырьки.
   5. С помощью увлажнённых аппликаторов с хлопковыми наконечниками выпотрошите кишечник от себя и накройте его влажной марлей размером 5 см на 5 см. В качестве альтернативы наместите кишечник свернутой влажной марлей размером 5 см на 5 см в левую сторону живота мыши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от анатомии мыши и расположения ретракторов, кишечник может быть выпотрошен или упакован в противоположную сторону для оптимальной визуализации.
   6. Определите IVC и брюшную аорту в средней линии сзади.
   7. С помощью аппликаторов с хлопковыми наконечниками входите в ретробрюшин, аккуратно открывая тканевую плоскость, покрывающую задние сосудистые структуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Давление назад, направленное на интересующую ткань, затем разъём кончиков хлопковых аппликаторов друг от друга, обеспечивает большую степень сцепления. Для более мягкого сцепления поверните кончики хлопковых аппликаторов в противоположных направлениях.
   8. Разместите боковые ретракторы глубже, чтобы лучше сцепить и визуализировать аорту.
   9. Продолжайте использовать аппликаторы с хлопковыми наконечниками, чтобы аккуратно разделить IVC и инфраренальную брюшную аорту, избегая освобождения боковых прикреплений аорты на этом этапе.
   10. Продолжайте развивать плоскость между IVC и аортой, пока между аортой и IVC не станет видимым треугольное пространство (рисунок 1).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап обычно проще всего выполнить только от левой почечной вены.
   11. Используя тупую диссекция или острые щипцы, освободите латеральные аортыальные прикрепления, отдёрнув аорту от соединительной ткани и поясничной мускулатуры слева от мыши.
   12. Поместите наклонные острые щипцы в промежутке, образовавшееся между аортой и IVC, и аккуратно открывайте и закрывайте щипцы многократно, чтобы открыть задние аортальные крепления.
   13. Используя ту же технику открытия и закрытия, развивайте заднюю плоскость вдоль аорты, переходя от голова к хвостовой.
   14. Получите видеомикрометрическое изображение всей аорты и сохраните его для анализа.
2. Примените периваскулярную эластазу.
   1. С помощью пипетки капите 10 мкл раствора эластазы вдоль длины открытой аорты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассекивая только ткани медиально и латерально от аорты, образуется желоб, в котором собирается эластаза.
   2. Положите влажные марлевые подушечки размером 5 см на 5 см на открытую брюшку и дайте раствору эластазы инкубировать 10 минут.
   3. Снимите марлевое покрытие и трижды промите брюшную полость стерильным 1X PBS, чтобы удалить остаточный раствор эластазы.
3. Закройте брюшко.
   1. Вернуть органы брюшной полости в исходное положение. Следите за возможными скручиваниями и сгибанием кишечника.
   2. С помощью зубчатых щипцов откройте прямую мышцу и фасцию от кожи, чтобы создать кожный лоскут размером 0,25 см.
   3. Закройте брюшную фасцию с помощью шва с полигликолевой кислотой 4-0 (или аналогичной) простым бегом, закрывая углы разреза и проходите не более 2 мм между укусами.
   4. Скрепляйте верхнюю кожу скобой с помощью скоб 3−4.

5. Послеоперационный уход

1. Вынимите мышь с операционного этапа и положите её в корзину для восстановления, выстлатую полотенцами, и поставьте на сцену, нагреваемую до 37 °C.
2. Следите за мышью, пока она не выйдет из наркоза.
3. Следите за мышью ежедневно после операции в течение 4 дней, отмечая общее состояние здоровья и состояние разреза живота.
4. После операции проводите повторное УЗИ, как описано выше, чтобы отслеживать рост аневризмы.
5. Удалять скобы через неделю после операции или во время УЗИ первой недели.

6. Повторная сенсибилизация эластина (через 7 дней после операции по введению аневризмы)

1. Выполните те же шаги, что описаны выше для начальной сенсибилизации эластина, подготовив решение EDP аналогичным образом, с одной заменой неполного адъюванта Фройнда вместо полного адъюванта Фройнда.

7. Процедуры забора тканей

1. На 21-й день после операции забирайте ткани для различных анализов.
2. Подготовьте мышь так же, как при индукционной операции.
3. Снова экспонировать аорту так же, как и во время индукционной операции, с осторожностью, чтобы не повредить образцы, которые будут собираться для гистологического анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе у мыши появятся клейкие рубцы, поэтому может потребоваться больше применения резкого вскрытия щипцами, а не тупой вскрытия.
4. Получите видеомикрометрические изображения.
5. Проведите кардиологическую пункцию, чтобы собрать кровь для анализа и усыпить мышь.
6. Используйте мышь для анализа, используя соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки, защиту для глаз и маски.
   1. Если ткани назначены для анализа проточной цитометрии (или аналогичного), перфузируйте левый желудочек с 1X PBS без сосудистого дилататора при 100−120 мм рт. ст. при объёме 8 мл.
   2. Если ткани назначены для ПЦР-анализов, провести перфузию левого желудочка 1X PBS с сосудистым дилататором (0,1 мМ аденозина и 0,01 мМ нитропруссида натрия), после чего раствор стабилизации РНК.
   3. Если ткани назначены для гистологических анализов, перфузируйте левый желудочек 1X PBS с помощью сосудистого дилататора, затем 10% буферизованный формалинфосфат.
7. Берите необходимые ткани, стараясь не повредить структурно ткани, предназначенные для гистологического анализа. Отмечайте ориентацию швами или агентами для маркировки.

Результаты

Всего 28 самцов мышей C57BL/6J прошли этот хирургический протокол, при этом одна периоперационная смерть от травмы IVC (3,6%). Было ещё три случая отсроченной смертности: одна из них была вызвана разрезной грыжей, а две — по неизвестным причинам, что обеспечило общую выживаемость за 21 день 85,7%. Среднее время от индукции анестезии до окончания анестезии составляло 46,4 ± 8,0 минуты. Мыши, подвергнувшиеся фиктивной хирургии, прошли почти идентичный протокол группе аневризмы, включая пер...

Обсуждение

С момента первого описания на крысах в 1990 году, модель AAA на основе эластазы несколько раз модифицировалась и использовалась на различных животных^{10, 19, 20, 21, 22, 23}. Некоторые из модификаций включают каннуляцию аорты, которая, вероятно, увеличит смертность и внесёт травматический компо...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1 mL Tuberculin Syringes	Becton Dickinson	309628
10% Buffered Formalin Phosphate	Fisher Chemical	SF100-4
70% Isopropyl Alcohol Swabs	Cardinal Health	S-16183
Angled sharp forceps	Dumont	I I25 I-35
AutoClip 9mm (Skin stapler)	MikRon	427630
Betadine	Atlantis Consumer Healthcare	67618-155-16
Cotton gauze pad	Dynarex Corporation	3223
Cotton tipped applicator	Puritan Medical Products	25-806 2WC
Elastase from porcine pancreas (≥4.0 units/mg protein)	Sigma-Aldrich	E1250	хранится в водном растворе при 4 °C
Elastase from mouse pancreas (4.75 units/mg protein)	Elastin Products Co., Inc.	MS838	хранится в водном растворе (0.1 мг в 1 мл PBS) при 4 °C
Elastin	MP Biomedicals	101636	хранится в водном растворе при 4 °C
Enersight Desktop Software	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/enersight/
Ethiqa XR (extended release buprenorphine)	Fidelis	NDC 86084-100-30
Eye lubricant	OptixCare	Opx-4242
Flexacam i5 (Stereo)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-cameras/p/12730536-leica/
Freund’s complete adjuvant	MP Biomedicals	642851	хранится в водном растворе при 4 °C
Freund’s incomplete adjuvant	MP Biomedicals	642861	хранится в водном растворе при 4 °C
Gloves (Sterile)	Encore	7824PF
Hypodermic Needles (23 G)	Becton Dickinson	305145
Hypodermic Needles (27 G)	Becton Dickinson	305109
Isospire (Isoflurane)	Dechra Veterinary	07-894-8943
Labeling Tape	Fisher Scientific	15959
Masks	Dukal Corp.	1540
Needle driver	Scanlan	6006-36
Omnicon F/air Anesthetic Gas Canister	A.M. Bickford Inc.	80120
Press'N Seal	Glad	12587704417
RC2 Rodent Circuit Controller	VetEquip Incorporated	922100
RNAlater Stabilization solution	ThermoFisher Scientific	AM7021
Scissors	Fine Science Tools	14005-12
Skin staples (clips)	MikRon	205016
Small Rodent Warmer Heater	Stoelting	53851
Small Rodent Warmer Stage	Stoelting	53812
Stereo Microscope M60	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m80/
Straight sharp forceps	Dumont	I I 25 I-30
SurgiSuite self-retaining magnetic retractor set and stage	Kent Scientific	13-005-180
Tahoe Portable Oxygen Concentrator	Vetland Medical	595-2300A
Toothed forceps	Fine Science Tools	11043-08, 11042-08
Vevo 2100 Ultrasound	FUJIFILM Visualsonics	EDU00496
Visorb polyglycolic acid suture	CP Medical	397A
VWR Absorbents	VWR	95057-860